JPH08501146A - 消失性波光学的バイオセンサ分析における測定精度の向上方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試料内の配位子を分析する光学的バイオセンサにおける測定精度の向上方法を記載する。本発明は、適切な基準試薬で、光学導波管を標識化することにより人工的に背景レベルを上げて分析を基準化する技術を含む。かかる方法に使用する装置も含む。

Description

【発明の詳細な説明】消失性波光学的バイオセンサ分析における測定精度の向上方法 発明の背景 本発明は、消失性波検出を用いる光学的バイオセンサ分析における測定精度の 向上方法、かかる方法のために使用する装置、及びかかる装置の使用方法に関す る。先行技術の説明 解析或いは分析に使用される多様な種類の化学的また生化学的技法の中で、特 に有効且つ精度の高いものに、内部反射分光の原理を用いた光学的な方法がある 。特に有効な免疫分析は、例えば試料溶液中の検定すべき配位子に対する特異の 結合パートナなどの，表面の一部分が不動化された試料を一般的に担持する光学 導波管を用いる。導波管内に向けられた光線は、導波管の密な媒質中で全て内部 反射し、導波管の表面における消失性波成分として公知の電磁波形を発生する。 この成分は、導波管と試料溶液間の界面と交差する部分のみを特有に拡張する。 この貫通（penetration）は、しかしながら導波管表面に近接するかまたは表面 の消失性波成分とエンティティーとの間の実質的な光学的相互作用、及びバルク 溶液中における種の微小な相互作用を可能にするに足るものである。それゆえ、 配位子に対する特異の結合パートナが導波管上に不動化された配位子についての 免疫分析の例では、消失性波成分は、この不動化された種及びそれに複合化した いずれの種とも相互作用するであろう。存在する配位子量の関数として不動化さ れた種と複合する光学的に標識化された試料をその分析において採用することに よって、消失性波成分のこの標識化試料との相互作用を測定することができる。 バルク溶液では、標識化試料との相互作用はわずかに存在するのみであるため、 関連する配位子の分析を行うことができる。使用されてきた光学的検出の２つの 主な形は、測定すべき種の吸光度または蛍光特性、即ち減水総反射度（Attenuat ed Total Reflection ;ATR）及び総内部蛍光反射度（Total Internal Reflectio n Fluorescence,TIRF）である。 かかる技術とそれらの分析への応用は例えば、I. ChabayによるAnalyticalChe mistry, Vol.54 No.9,(1982)やEP-A-103426に記載され、またかかる技術を採用 するバイオセンサは例えば、“Biosensors; fundamentals andapplications”(T urner,Karube及びWilson編著作，pp.655-678,OUP,1987，Biosensors Vol.1,321- 353,(1985)，EP-A-171148 及びWO-90/14590等に記載されている。 しかし、かかる光学分析法には、減少させるかまたは無くすのが望ましい不正 確さを生む二つの特殊な要因がある。例えば表面の粗さ、導波管の全体の平坦さ 、その縦軸に相対する導波管表面の傾斜レベル等の、導波管の表面特質における 欠陥が消失性信号を変えることになる。これらの作用を、以下「エッジ作用（ed ge effect）」と称する。これらの欠陥はまた拡散作用を招くであろう。その上 ，導波管材料の内因的性質や、例えば導波管におけるバルク異種物の存在もまた 励起光、バルク溶液中の種よりの信号、及び導波管表面上かまたはその近隣の種 よりの信号もまた拡散作用を引き起こすことになろう。それゆえに、以下「導波 管作用」と総称するかかるエッジ作用は、分析システムの背景信号及び分析シス テムの感度範囲に有意に影響し、それゆえ誤差を招く。 このように、観察された分析測定の水準を変化させ得ると思われる前述のよう な種々の因子を補償するために、分析工程に取り入れることのできる基準測定を 行う分析方法を開発することが望ましい。かかる原理の例はEP-A-093613におい て明示されており、そこには、測定ゾーンに近接する分離したゾーン内の適切な 試料から基準信号が得られると記載されている。 しかし、かかる方法を適用することは、これらの作用がゾーンに依存するであ ろうから、エッジ作用の基準化と言う点で、適用の可能性はわずかに限定される 。従って、高い精度を要する分析には、バイオセンサの測定信号と同一のゾーン 内から基準信号を得る方法を工夫することが望ましい。 原則としてこれを達成する１つの可能な方法は、分析の動力学を監視すること である。これは、導波管作用とは無関係の分析信号の変化率を記録すること で達成される。しかし、ある種の分析工程には、平衡が達成される速度（例えば WO-90/14590に記述されているバイオセンサによれば、競合免疫分析は典型的に ５分以下以内で平衡に達する）は、信号変化速度の査定において誤差を招き得る ものである。何故なら、その信号片か速度が試料の粘性及び温度等の因子に重要 に依存するからである。それゆえ、実際にこの方法は、分析の平衡信号を単に測 定するよりもより精度が低いことが判っている。 分析を基準化するもう１つの可能性は、所望のゾーンからの基準測定を、分析 の開始時間になる前に行うことである。例えば、WO-90/14590に記述されている バイオセンサ装置を使用し、蛍光標識化された特異の試料の導波管より離れた毛 管の間隙の表面からの溶解を遅延することにより実行できる。しかし、この最初 の測定は必然的に非常に低い強度のものとなるであろう。前述の例では、分析に おいて使用した蛍光体が、試料の添加以前に導波管から離れた表面に残存し、付 着しているため、このような結果となろう。ある特定の例、及び特に500nm以上 の波長では、試料マトリックスからの信号の寄与がかなり減少し、検出された背 景信号を、光拡散が背景信号に大きく寄与する領域へ導く。この拡散信号は、終 局の分析信号と同一の機構によって発生するのではないため、それはエッジ作用 により異なる変調を被り、基準化はそれゆえ信頼しえないものとなるであろう。発明の概要 本発明者は、上記に略述した諸問題を克服するエヴァネッセント波検知を採用 し、光学的バイオセンサ分析における測定精度を向上させる方法を発案した。ま た、バイオセンサの精度が、適切な試料で光学導波管を標識化することにより人 工的に上昇させた背景レベルを用いた分析の基準化によって大幅に向上できるこ とを発見した。 従って、本発明の一つの特徴によれば、試料中の配位子の光学的バイオセンサ 分析における測定制度の改良方法として以下の工程からなる方法を提案する。 i）表面（「測定面」）に接触する試料を恒温保持する；その表面は、採用する 分析方法に適した不動化試薬（「測定試薬」）を直接または間接的に担持し、ま たその表面は、試料中に存在する配位子の量とは無関係に、検出可能な信号（「 基準信号」）を測定面上に、また採用する分析技術に適した方法により前記の基 準信号を測定する試料の前記イキュベーションに先だって、その間または引き続 いて生じる直接的にまたは間接的に不動化された種（「基準試薬」）のある量を 更に担持し； ii）採用する分析技術に適した１種または２種の補助試薬をもたらす）における 試料の恒温保持と同時に或いは引き続いて、それによって試料中に配位子が存在 するならば、前記測定試薬及び前記配位子及び場合によっては前記補助試薬を包 含する複合体が、試料中の（存在すれば）配位子の量の第１の関数となる検出可 能な信号を発生させ； iii）引き続いて、採用する分析技術に適した方法により、測定面から発生する 信号を監視し、基準信号と分析信号を比較し、分析対象の配位子が試料中に存在 するか否か及び場合によってはどの程度存在するかを、適切なアルゴリズムを使 用して判断する。 基準試薬はこのように、導波管上に直接或いは間接的に不動化される光学的標 識となる。この不動化は、当業者に公知の技法により同様に測定試薬の不動化と いう点で達成される。好適な実施例において、標識化した特異の結合パートナ（ 即ち基準試薬に結合した測定試薬）と、分析対象の配位子に対する標識化してい ない特異の結合パートナ（即ち測定試薬のみ）との混合物が測定面に固定され、 それによって不動化される基準試薬の量の良好なコントロールが可能となる。 従って、基準信号はａ）装置による試料の恒温保持前に得られたもの、或いは ｂ）装置による試料の恒温保持中または後、測定面における複合体が大量に生成 する前に得られたものである。ａ）の場合は、得られる信号が導波管より発生す る前述した光学的作用（エッジ作用及び拡散作用）のみに影響されるこ とから、より有用である。即ち、存在する試料及び場合によってはいずれの補助 試薬より発生するいずれの作用によっても影響されない。それゆえ、ａ）の利用 により所定の装置から得られる基準信号の変動は、ｂ）の利用により得られるも のより少ないであろう。即ち、基準信号はより再生しやすく、また基準としたい それらの不正確さの根源に特に向けられるであろう。しかし、ｂ）に固有の変動 がほんのわずかであるとすれば，ｂ）もまた有効な結果を生じるであろう。ｂ） に関しては、理想的な場合に、基準信号は測定面におけるいずれの複合体の生成 にも先だって得られるであろう。しかし、上記の工程ii）における補助試薬の同 時導入の場合では、これを達成することは困難であると思われる。この場合にお いて、基準信号の測定時にとるに足らない量、即ち測定信号に大きく寄与しない 量の複合体が生成されていたとしても、かかる基準信号は有効な結果を生むであ ろう。分析信号は、基準信号と、測定面において生成する何らかの複合体から生 じる信号との連合と同等である。基準信号はこのように、分析信号、即ち測定面 において有意な量の複合体が生成した後の信号を含む信号の基準（reference） にとして使用される。基準信号は、その後の分析信号と同様の過程でエッジ作用 によって変調するであろう。更に、背景信号として作用する基準信号は、拡散が 優性な作用である領域外から発生し、この拡散は、それ故全般的な分析精度にと ってはあまり重要ではない。 本分析方法は、多くのやり方で実施することができる。２工程法では、第１工 程は基準信号を測定する。第２工程で、既に補助試薬を含有する試料に接触して 測定面及び続行する測定信号を測定する。代わりに、第１工程では、試料と接触 して測定面と続行する基準信号を測定し、第２工程で、補助試薬の導入及び続行 する分析信号を測定しても良い。１工程法では、既に補助試薬を含有する試料を 測定面に接触させることができる。基準信号はこのことが起こった直後、しかし 大量の複合体が分析反応の結果として生成する前に測定される。その後、分析信 号の測定を行ってよい。 都合の良いことに、基準及び分析信号の時間遅延測定も利用することができ る。例えば、蛍光染色で標識した種を使用する場合には、基準信号に含まれるも のは、導波管の内因的蛍光、及び（基準信号賀測定された時間によっては）試料 の内因的蛍光から発生する成分と共に基準試薬より発生する成分であろう。同様 に分析信号は、基準試薬、標識した補助試薬及び導波管／試料の内因的蛍光より なる成分を含んでいるであろう。これらの成分の全ては、時間と共に衰退するで あろう。しかし、導波管／試料の内因的蛍光から発生する成分は、蛍光で標識し た基準試薬及び補助試薬から発生する成分よりも強度が大幅に低いはずである。 従って、信号の実際の測定を遅延する（しかし当然それらを発生させる励起を遅 延するのではない）ことにより、標識試薬より単独に発生する基準及び分析信号 を得ることができ、これは即ち導波管／試料の内因的蛍光化ら発生する成分がゼ ロまで衰退した時である。 基準信号による分析信号の較正には種々の方法を用いることができる。これら の方法は、減算、比率法、または減算／比率法の併用の何れかとして要約するこ とができる。しかしながら単純比率法修正が好ましい。 本発明の方法は、広く種々の間接光学分析法、即ち競合分析及びサンドイッチ 分析などの光学的標識を用いるものに応用が可能である。 サンドイッチ分析では、生成した複合体より発生する検出可能な信号は、総じ て試料内に存在する配位子の量に比例するであろう。競合分析では、試料内に配 位子が存在するしないにかかわらず測定試薬と補助試薬間の複合が生成するが、 この複合物から発生する検出可能な信号は、複合した補助試薬の量に依存する。 これは総じて試料内に存在する配位子の量と反比例する。 本発明の更に別の実施例による競合分析では、前記工程ｉ）及びｉｉ）におい て、ａ）補助試薬として標識化された配位子アナログが存在すると共に、前記測 定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬と予め複合されているか或いは該 測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子の特異の結合 パートナであるか、或いは、ｂ）分析対象の配位子に特異の標識化された結合パ ートナが補助試薬として存在すると共に前記測定試薬（或いはオプ ションとして、該測定試薬と予め複合されているか或いは該測定試薬を含む複合 体を形成可能な補助試薬）が配位子アナログであるか、の何れかである。 本発明の更に別の実施例によるサンドイッチ分析では、前記工程ｉ）及びｉｉ ）において、分析対象の配位子に特異の標識化された結合パートナが補助試薬と して存在すると共に、前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬と予 め複合されているか或いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分 析対象の前記配位子に特異の別の結合パートナであり、その別の結合パートナは 前記オプションとして標識化された特異の結合パートナの向けられたエピトープ とは異なる分析対象の配位子のエピトープに向けられている。 ここで使われている「配位子アナログ」という用語は、分析対象の配位子と同 じ特異の結合パートナの同じエピトープの部位に結合出来る種を意味し、特に、 分析対象の配位子の既知量或いはその配位子の標識化されたアリクウオットをそ の範囲に含む。 本発明の方法を実行するためには、例えば計量棒或いは「試験片」を用いたバ イオセンサ、「試料通過」構造を用いた装置、或いは試料を内部に封入した装置 等の多種の装置を使用することができる。本発明の方法を実行するのに好ましい 装置は毛管フィル装置、特に蛍光毛管フィル装置、例えばEP-A171148やWO-90/14 590に記載される型の装置である。このような毛管フィル装置は単独で使用して も良いし、WO-90/1830に記載されるような適切なホルダに入れて使用しても良い 。 EP-A-171148に記載されるように、毛管フィル装置（capillary filldevice） は典型的には、例えばガラス等の透明な材料でできた２枚のプレートの間を狭い 間隙或いはキャビティで互いに隔離して構成される。一方のプレートは光学導波 管として関数し、装置内で実行される試験に適した不動化された試薬を担持する 。WO-90/14590に記載されるように、他方の透明プレートはキャビティから離れ た面に光を吸取する或いは不透明な材料の層を担持することができる。競合分析 で使用する再には、不動化された試薬は例えば検出を希 望する配位子に特異の結合パートナであっても良く、またプレートの一方は蛍光 で標識化された配位子アナログよりなる可溶性試薬（補助試薬）を担持しても良 い。 毛管フィル装置の一端に試料を配置すると、試料は毛管作用により間隙内へ吸 入されて補助試薬を溶解する。抗原を対象とする競合分析では、蛍光標識化され た抗原アナログが、導波管に不動化された限られた数の抗体結合部位と結合すべ く試料の抗原と競り合う。毛管の間隙は狭いため（典型的には１００ミクロン） 、反応は概ね短時間で終了し、試料マトリクス及び抗体の親和性により通常は５ 分未満で終了する。従って、競合分析では、複合体形成により導波管に間接的に 結合する蛍光標識化された抗原の量は試料内の濃度と反比例する。サンドイッチ 分析では、導波管が検出する希望する配位子に特異の結合パートナを担持し、何 れか一方のプレートが蛍光で標識化された別の特異の結合パートナよりなる可溶 性試薬（補助試薬）を担持することになる。抗原を対象とするサンドイッチ式免 疫分析では、試料の抗原は蛍光標識化された抗体とサンドイッチ複合体を形成す る。従って、サンドイッチ式免疫分析では、複合体形成により導波管に間接的に 結合する蛍光標識化された抗体の量は試料内の抗原の濃度に直接比例する。 ここで使用する「抗原」という用語は、抗原性の種（例えば、プロテイン、バ クテリア、バクテリアの断片、セル、セルの断片、及びウィルス等）、及び適切 な条件下で抗原性になるハプテンの両方を含むものと理解されたい。 本発明の別の側面によれば、前記装置は、１つ或いは複数のキャビティを有す る、前記で定義した配位子の分析に使用するための特に反応性の高い試料の取集 及び試験装置であり、前記キャビティの１つの面はゾーンＩ、IIを有し、これら 各ゾーンは所望の分析に適した離脱可能な試薬からなる層を担持し、前記面は透 明な材料で形成された第１個体プレート面であり、該第１個体プレートに対向す る前記キャビティーの壁部は透明な材料より形成されて光透過性の導波管として 関数する第２プレートからなり、該第２プレートの前記キャビ ティーに隣接する面は前記ゾーンＩ、IIに対応して配向させられたゾーンIIを有 し、これらの各ゾーンＩ、IIは共に前記に定義したように所望の分析に適した無 作意に配布した不動化測定試薬及び不動化基準試薬からなる層を担持し、第１の プレートの外面には不透明なコーティングを施すのが好ましい。 それ故かかる装置では、ゾーンＩが担持する試薬は可溶性の、離脱可能な形の 補助試薬であり、ゾーンIIが担持する試薬は不動化測定試薬と基準試薬の混合物 である。 希望するのであれば、本発明の方法で使用する毛管フィル装置には、同一試料 内の異なる配位子を同時に或いは順次に分析することを可能にすべく多数の分析 ゾーンを設けてもよい。 また、定量的較正の目的で、多くの分析ゾーンに種々の既知量の分析の対象と なる配位子を含めるべく構成しても良い。例えば、配位子に関する競合分析では 、本装置が３つの分析ゾーンを包含する状態において、第１のゾーンは、例えば 補助試薬として標識量の配位子アナログを含有してもよい。第２及び第３のゾー ンは、例えば、既知量（２つのゾーンでそれぞれ異なる）の分析対象の配位子と 共に、補助試薬として標識量の配位子アナログを含有しても良い。測定試薬及び 基準試薬は３つのゾーンについて全て同様であろう。従って第１ゾーンからの分 析信号は、試料内の配位子の量の関数となるであろう。第２及び第３ゾーンから の分析信号は、余分な量の配位子が存在するために、第１のゾーンからのものと 比較して減少するであろう。この減少は、各ゾーンにおいて補助試薬として使用 した配位子の量に関連するであろう。それ故これは実施すべき定量的較生を可能 にするであろう。サンドイッチ分析に関しては、第２及び第３ゾーンに補助試薬 としての配位子が存在することにより、これらのゾーンからの分析信号は第１ゾ ーンと比較して増加する。 使用される試薬の同一性は、分析すべき配位子及び分析の方法に依存する。こ れは、熟練した者には明瞭であろう。上記に示した通り、基準試薬は最初の信号 を発し、例えば蛍光標識などの単なる標識となる。基準試薬は測定試薬に 直接付される蛍光標識であるのが好ましい。 測定領域における補助試薬は、適切な材料の可溶性の層に含まれるのが好まし い。可溶性試薬の付着後に、例えばボリビニルアルコール（PVA）などのキャッ ピング層を前記試薬に付けても良い。このキャッピング層は、装置への試料の添 加後試薬の溶解を２，３秒間遅延させる。測定領域という点では、この遅延した 補助試薬の離脱が基準信号測定の理想的な機会を与え、従ってこの実施例によれ ば導波管作用基準化の、補助試薬が試料内に最初に存在した場合よりも正確な基 準化を達成できる。 本発明による毛管フィル装置は、EP-A-171148に記載されているものに類似し た方法により製造しても良い。 従って、本発明によれば、（ａ）多数の前記装置の一部を提供するシート材の 表面に、ゾーンＩにより坦持される適切な試薬のパッチを形成する工程と；（ｂ ）別の構造体の表面に、請求の範囲第１項に記載の測定試薬及び基準試薬の不動 化を含めて、ゾーンＩＩに坦持される適切な試薬のパッチを形成し、前記別の構 造体は、適切な試薬の前記層と接触させて或る容積の試料液体を取集・保持すべ く、前記シート材と共に、前記多数の装置のそれぞれに好ましくは毛管作用をな す寸法のキャビティを提供する工程と；（ｃ）前記シート材を、それぞれが１つ 或いは複数の前記試料取集及び試験装置を提供する複数の部分に分離する工程と ；よりなる製造方法が提供される。 これまで特に蛍光標識について述べてきたが、本発明は他の性質を示す標識（ 例えば燐光または発光）に結合する試薬にも適用できることを理解されたい。 本発明による分析方法において使用し得る蛍光体の例としては、フルオレセイ ンとその誘導体（例えばイソチオシアネン酸フルオレセイン(FITC)）、ロ−ダミ ンとその誘導体（例えばXRITC,TRAP,TRITC）、リシフェルイエロー、２，４−ジ ニトロフルオロベンゼン、フェニルイソチオシアネート、ダンシルクロライド、 フィコビリプロテイン（例えばアロフィコシアニン及びフィコエリチリン）及び イドシアニン等があるが、これらに限定されない。 基準試薬に使用する標識は、補助試薬に担持されるものとは異なっても良い。 しかしこの特定の実施例では、ある種の欠点が明かである。特に、二組の交換フ ィルター、或いは２つの単色ライトの電源の何れかが必要であるため、経費と機 器編成の複雑さはより増す。また、２種の標識は両方共分析のために要求される 同じ特性、例えばペーハーの安定性及び温度安定性を有していなければないない 。分析信号の感度もまた、２種の標識のスペクトルのオーバーラップにより基準 標識からの信号混信によって低下することがある。これらの欠点の存在しないか 或いは最小である二種の異なる標識を選択することは可能である。しかし、基準 試薬及び補助試薬の両方について同一の標識を使用することが望ましい。 本発明の更に別の利点は、基準試薬を測定面で使用することにより、バイオセ ンサ装置の品質保証／品質管理チェックが可能になることである。特に、基準試 薬、言い換えれば測定試薬の不動化の出来、不出来は、存在する試料が無くとも 装置から発生する信号の測定により評価することができる。その後特定の信号値 の再現性を使用して不動化が不完全であった装置を排除することができる。 上述のように、本発明による方法は、原則的に導波管作用の補整に向けられた ものである。しかし、観察する信号の値に影響するような分析システムにおける 別の因子を更に補整すれば有益であろう。現在の分析技術は、温度、試薬の安定 性、インキュベション及び発展時間またその他の状態、及び観察する信号の値を 阻害する要因に対して非常に敏感である。この更に別の補整は、別の較正工程を 実行するという前述の方法により達成される。かかる方法では、測定試薬及び基 準試薬を含む領域とは別の１つ或いは複数の領域（較正領域）に配置され装置が 使用される。かかる補整に較正をもちいる概念は、国際出願No.PCT/GB91/02058 に詳細に記載されている。 このような別の較正工程は、２つの主な目的に使用される。即ちｉ）分析工程 において使用する種々の試薬がそれらの仕様に従って使用されていることを 確認するため、及びｉｉ）試験試料のある濃度を限定し、背景妨害因子（例えば 背景蛍光）、温度及びペーハーの変化、観察する背景信号の値を変動させるかも 知れない試料のマトリックスから発せられるその他の因子を補整するためである 。 従って、前述の分析方法の実施例は更に： 工程ｉｖ）前記工程ｉ）の恒温保持と同時に或いはその後に、使用する分析技術 に適した試薬（「較正試薬」）が不動化された１つ或いは複数の別の表面（較正 面）で試料を（望むのであれば１つ或いは複数の補助試薬と共に）恒温保持する 工程と；前記較正試薬はゼロ或いはゼロでない信号を発生させるか、或いは前記 配位子及び／或いは補助試薬を含む複合体を形成するものであり、これにより前 記複合体はゼロでない信号を発生させ（かかる複合体が存在しない場合には配位 子が存在すればかかる信号を発生させ）、前記信号は前記試料に存在する配位子 （存在すれば）の量の第２の関数、或いはその量から独立した信号であり；ｖ） 前記較正面から発生した信号（「較正信号」）を監視する工程と；ｖｉ）次いで 、前記較正信号を、前記分析信号及び基準信号の両方と比較し、前記分析信号及 び基準信号により得られた分析対象の配位子が試料内に存在する程度の測定値を アルゴリズムを用いて較正する工程と；を更に有する。 測定面に起こるものに類似した結合反応が較正表面に起こる（配位子が試料内 に存在すれば）という実施例では、上記目的ｉ）が達成される。即ち、信号を発 生させる複合体の試薬が劣化していないこと、結合反応が十分に起こっている、 即ちかかる反応における結合パートナが分解していないことを確認できる。目的 ｉｉ）もまたこれらの実施例で達成できる。 較正表面で較正試薬は、いかなる補助試薬に対する結合反応をなんら伴わずに 所望のゼロでない信号を発生させる方法の実施例により、上記目的ｉｉ）が達成 される。 前記工程ｉｖ）では、前記信号が試料内に存在する配位子の量の第２の関数 であれば、この第２の関数は工程ｉｉ）に明記された第１の関数とは異なる。 ２つ以上の較正表面が存在する場合には、各較正表面の較正試薬は、概してそ れぞれの較正表面から発生する信号が同一でないように選択される。かかる同一 でない信号は、各較正表面から発生する信号が試料内に存在する配位子量と同じ 関数であるところから発生しうる。１つの例として、各較正表面の較正試薬は同 じであるが、各表面に較正試薬と複合体を形成する補助試薬の量を異ならせた場 合がある。別の例として、各較正表面上の較正試薬が、補助試薬を必要とせずに 信号を発生させ、またその量が異なる場合がある。較正試薬のこのような選択に かかわらず、同一の信号が発生したとすれば、（例えば、試料のｐＨ値が極端で あったり、試料の背景信号が高すぎたり或いは試薬の劣化に起因する）装置の故 障が示され、分析を拒絶することができる。これは本発明の更に別の利点である 。 ここで使用する「ゼロ信号」という用語は関係する分析のための背景信号を意 味する。従って、「ゼロでない信号」という用語は対応して解釈すべきものであ る。 直接分析或いはサンドイッチ分析では、ゼロ信号は分析対象物が存在しない時 に得られる信号である。競合分析では、ゼロ信号は適切な分析曲線の下方の漸近 線に対応する信号であり、従ってこれは分析対象物が存在しない時に得られる信 号ではない。 較正信号による分析信号の較正には種々の方法を用いることができる。これら の方法は、加法、乗法、或いは加法／乗法併用のいすれかであると要約すること ができる。全ての方法は製造中の較正領域の指標化に依存する。従って分析時に 測定したいずれの差も測定領域のデータの修正に使用できる。 前述のごとく１つ或いは複数の工程の較正工程を実行する本発明の更に別の実 施例による競合分析では、前記工程ｉ）において、ａ）標識化した配位子アナロ グが補助試薬として存在すると共に、前記較正試薬（或いはオプションとして該 較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を含む複合体を形成 可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結合パートナであるか、或いは、 ｂ）分析対象の配位子に特異の標識化された結合パートナが補助試薬として存在 すると共に、較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されて いるか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が配位子アナログ であるか、或いはｃ）分析対象の配位子とは別の標識化された配位子が補助試薬 として存在すると共に、較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め 複合されているか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析 対象の配位子とは別の、配位子に特異の結合パートナであるか、或いはｄ）前記 較正試薬が存在する何れの補助試薬にも非特異の結合パートナであるか、或いは ｅ）前記較正試薬が補助試薬の存在を必要とせずに希望のゼロ或いはゼロでない 信号を発生させるか、の何れかである。 ａ）補助試薬及び前記較正試薬としての標識配位子アナログ（或いはオプション として、該較正試薬と予め複合されているか、或いは該較正試薬を含む複合体を 形成可能な補助試薬）は分析対象の配位子に特異の結合パートナであるか、或い はｂ）分析対象の配位子に特異に結合する標識化されたパーとなが補助試薬とし て存在すると共に、前記測定試薬（或いはオプションとして、前記較正試薬に予 め複合されているか或いはその較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が 配位子アナログであるか、或いはｃ）分析対象の配位子とは異なる標識化配位子 が補助試薬として存在すると共に前記較正試薬（或いはオプションとして該較正 試薬をと予め複合されているか、或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補 助試薬）が分析対象の配位子とは異なる配位子に特異のケツゴウパートナである か、ｄ）較正試薬が存在するいずれの補助試薬に対して非得意の結合パートナで あるか、ｅ）補助試薬の存在の必要性を伴わずに、前記較正試薬が希望するゼロ またはゼロでない信号を発生させる、分析方法が提供 される。 １つ或いは複数の別の較正工程を前述のごとく実行する、本発明の更に別の実 施例によるサンドイッチ分析では、前記工程ｉｖ）において、ａ）前記較正試薬 （或いはオプションとして該補助試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬 を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結合パートナ であるか、分析対象配位子の標識化された特異の結合パートナが補助試薬として 存在すると共に標識化された得意な結合パートナに予め複合された既知量の分析 対象の配位子が更に別の補助試薬として存在するか、或いはｂ）分析対象の配位 子に特異の標識化された結合配位子が補助試薬として存在すると共に、前記較正 試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較 正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が不動化された特異結パートナに予 め複合した既知量の分析対象配位子であるか、或いはｃ）分析対象の配位子とは 異なる配位子が補助試薬として存在すると共に、較正試薬（或いはオプションと して該較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可 能な補助試薬）が分析対象の配位子とは異なる配位子の標識化された特異の結合 パートナであるか、或いはｄ）前記較正試薬が補助試薬（存在すれば）に非特異 の標識化された結合パートナであるか、或いはｅ）前記補助較正試薬が補助試薬 の存在を必要とせずに希望のゼロ或いはゼロでない信号を発生させる。 本発明の方法において使用する較正領域の配置については、広範な可能性がそ れら自体に存在する。これらの可能性は、国際出願 No.PCT/GB91/02058に詳細 に説明されており、参考として本明細書に盛り込まれている。 本発明の別な側面によれば、前記装置は１つ或いは複数の更に別の較正工程を 実行するものである。この装置は上述のように、分析に使用するための特に反応 性の高い試料取集及び試験装置であり、第１プレートを１つ或いは複数のゾーン を担持し、これらのゾーンは希望の分析に適した離脱可能な試薬からなる層を担 持し、更に第２プレートを１つ或いは複数の別のゾーンに担持し、そ れらは第１プレート上の前記の別のゾーンにそれぞれ対応して配向させられると 共に前記に定義したごとく不動化された較正試薬からなる層を担持している。 従って、１つまたは複数の別の較正工程が行われる分析のために使用する毛管 フィル装置は、上述のものではあるが、既に述べたように１つまたは複数の較正 領域を有している。ここでも、かかる毛管フィル装置にはそれを使用する較正領 域の広範囲な可能性がある。これらの可能性は、国際出願No.PCT/GB91/02058に 詳細に説明されており、参考として本明細書に盛り込まれている。 前記のごとく１つまたは複数の較正領域を持つ毛管フィル装置の製造は、シー ト材の表面上の別のゾーン内の適切な試薬のパッチを更に形成すると共に別の構 造の表面上の別のゾーンに較正試薬を不動化することによって、ゾーンＩとIIの みを所有する前述の毛管フィル装置に類似した方法によって行われる。 本発明の方法は特に抗原または抗体の分析、即ち免疫分析に応用可能であり、 本発明の好適な実施例において、配位子は抗原であり、特異の結合パートナはそ の抗原に対する抗体である。しかし、本発明は抗体または抗原の分析だけに限定 されるものとは理解すべきではない。本発明の方法によって分析される配位子の 例は、以下の表１に各例に特異の適切な結合パートナと共に示される通りである 。 本発明の方法は非常に広い応用性を有するが、特に、ペプチドホルモン（例え ば、甲状腺剌激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、人体絨毛膜生 殖腺剌激ホルモン（ＨＣＧ）、小胞剌激ホルモン（ＦＳＨ），インシュリン及び プロラクチン）またはノンペプチドホルモン（例えば、コルチソル、エストラジ オール、プロゲステロン及び試験ステロン等のステロイドホルモン、またはチロ キシン（Ｔ４）及びトリヨードチロニン等の甲状腺ホルモン）；プロテイン（例 えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）とその抗体、及びアルフアフエトプロテイン（ＡＦ Ｐ）；薬剤（例えば、ジゴキシン、薬剤の乱用）；糖；毒素；ビタミン；インフ ルエンザ、パラインフルエンザ、アデノーウイルス、肝炎ウイルス；呼吸器官ウ イルス及びエイズウイルス等のウイルス；ウイルス状の粒子：または微生物を分 析するのに使用することができる。 ここで使用する「抗体」という用語は、以下のものをその範囲に含むと理解さ れたい。 （ａ）例えば、羊、うさぎ、やぎ、或いはマウス等の従来使用されている動物か ら得られる種々のクラスまたはサブクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ （ｂ）単一クローン系抗体 （ｃ）単一クローン系或いは多クローン性の抗体のそのままの分子または分子 片（かかる分子片は、抗体の結合分析、即ち、Ｆｃ部分（例えば、Ｆａｂ，Ｆａ ｂ’，Ｆ（ａｂ’）₂）を持たない断片や、そのまま抗体中の重鎖成分を連結す るジスルフィド結合分析の還元分割により得られるいわゆる「半分子」、剛性方 法で得た断片を含む） （ｄ）組換えＤＮＡ法により生成或いは修正された抗体。 抗体片の作成方法は本技術分野で良く知られているので、ここでは説明しない 。 ここで使用している「抗原」という用語は、恒久的抗原種（例えば、プロテイ ン、バクテリア、バクテリア断片細胞、細胞断片及びウイルス）、及び適当な条 件下で抗原化されるハプテンの両方を含むものと理解されたい。 更に、本発明は前述の分析方法に使用するのに適した装置を提供するものであ り、該装置は、使用時に放射線が前記装置に進入して、装置内の光学的に標識化 された種を励起するよう配置可能な放射線源と；放出される放射線を監視する手 段とからなる。 更に別の実施例において、本装置は、マスクを介して照射でき、それにより結 合反応が生じる装置の有効体積を規定する。その有効体積は、装置の上下プレー ト間の距離と、光学列においてマスクにより規定される照射ゾーンの面積との積 である。 本発明は更に、前述の装置及び適切な補助試薬よりなり、本発明を実行するた めのキットを提供する。図面の説明 本発明を深く理解するために、添付図面の説明を行う。 図１は、本発明の１実施例による蛍光毛管フィル装置の概略断面図である。 図２は、本発明の好適な実施例による競合分析用の測定領域の例の概略図であ る。 図３は、本発明の好適な実施例によるサンドイッチ分析用の測定領域の例の 概略図である。 図４は、本発明の１実施例による２つの較正領域を持つ蛍光毛管フィル装置の 例の概略図である。 図５は、本発明の１実施例による定量的較正用の多重の分析ゾーンを有する蛍 光毛管フィル装置の例の概略図である。 図２〜５における種々の記号は以下のエンテイテイーを表す。 ○ 分析対象の抗原 ＊ 蛍光標識 ＊ 蛍光で標識した抗原アナログ ◇ または 分析対象の抗原に対して特異の抗体 □ 分析対象の抗原とは異なる抗原 分析対象の抗原に特異の抗体に対する特異の抗体詳細な説明 図１を参照し、図示される装置は、透明な材料（例えばプラスチック材、石英 ，シリカ、またはガラス）で形成されて外面に光沢の無いコーティング８を担持 した上部プレート２と、透明な材料で形成された株プレート４とよりなる。両プ レートは共に約１ミリの厚さを有し、スペーサー手段を含む適切な結合トラック （図示せず）によって１ミリ以下の間隔を開けて課題に略並行に固定されている 。図示例では、セル間隙６が両端を周囲に開口し、これにより液体試料が毛管に よりキャビティーの一方の開口部から引き込まれた時に、他方の開口部から空気 を逃すことができる。図示例において、これら２枚のプレートは互いにずれてい るが、これは本装置に必要な特徴ではない。 上部プレート２の内側表面に担持されているのは、前記で定義したようにゾー ンＩ１２により担持される実施する試験に適切な試薬のパッチである。試薬は、 可溶性の離脱可能な形で装置内に含まれている。 下部プレート４の内側表面に胆持されているのは、前記で定義したようにゾー ンIIにより坦持された、実施する試験に適した試薬のパッチである。該ゾーン１ ０はプレート２上のゾーン１０の真下にある。免疫分析の場合には、例えばゾー ン１０は、例えば標識化した及びしない不動化された抗体或いは抗原、或いはハ プテンを担持する。 図１に示した本装置の実施例の使用に際しての操作について述べる。以下の説 明は、標識化した抗原フォーマット競合型免疫分析における装置の使用に関する が、本発明による装置はまた標識化抗体フォーマット・免疫分析（サンドイッチ 型と競合型の両方）或いは化学或いは生化学の型にも適していることを理解すべ きである。 試薬液は図１に示される矢印の方向で装置内に通過する。キャビティー６が試 料液で満たされた直後に、材料のパッチ１２が溶解し、そこに含まれる試薬を液 体中に放出する。 前記のように、パッチ１２は適切な可溶性物質によってプレート２上に担持さ せても良い。適切な可溶性物質としては、例えばスクロースーやソルビトールを 基材にした保湿性のコーティングなどがある。別のオプションとしての特徴は、 パッチ１２をパッチ内の試薬が遅れて放出されるような材料の薄層でコーティン グすることである。パッチのコーティングに適した材料としては、例えば、ポリ ビニルアルコール（ＰＶＡ）等がある。適したＰＶＡコーティングは、最初の試 料液の接触後から溶出まで２−１０秒かかる。 抗原を対象とした競合型免疫分析用に準備された図１に示される型の装置の１ つの実例では、パッチ１２は蛍光標識化された抗原アナログを含むものとしても よい。その場合、パッチ１０は蛍光標識化された及び標識化されない、分析対象 となる抗原に特異の抗体である一定量の不動化された特異の結合パートナよりな る。従って、試料液を入れると、パッチ１２は溶解して抗原アナログを試料液中 に放出する。試料液中に導入された抗原は、その抗原に特異の抗体エピトープ結 合部位を求めて抗原アナログと競い合う。パッチ１０における不 動化された特異の抗体はに結合してくる一定量の蛍光物質の量は、それ故試料液 中の抗原濃度の関数となる。従来の競合型の光学的免疫分析はこの種の競合平衡 化を含んでいる。特別な瞬間にパッチ１０に結合する蛍光物資の総量は、それ故 パッチ １２における試薬由来の基準試薬よりの最初にパッチ１０に存在したも のの合計である。 この第１の実施例に関して、含まれる測定領域及び試薬を図２に概略的に図示 する。 前記の本装置のサンドイッチ分析の実施例に関して、含まれる測定領域及び試 薬の例を図３に図示する。 前述した両方の実例において、標識すると述べられたそれらの試薬の蛍光標識 として同一の蛍光種を用いる。 従って、基準信号の測定は、試料液がキャビティー６を満たした後に行う。分 析信号の測定は分析平衡が一度確立されたの地に行う。ゾーン１０における蛍光 種から発生する光学信号は、光学エッジ１４から発生し、希望する方法で処理す る前に光学検出器で検出する。試料内に存在する配位子の量の測定値は適した方 法、むしろ基準信号を用いた分析信号の比率計算(ratiometric)修正によって得 られる。 図４において描いた本装置は、図１の本装置と同様、上部プレート２及び下部 プレート４からなる。プレート２の内部表面はゾーン１２を担持し、プレート４ の内部表面はゾーン１０を担持し、図１に前述したごとこれらのゾーン及び試薬 がそこに含まれる。ゾーン９及び１３、ゾーン８及び１４は、示したように前記 のごとく二つの較正領域からなる。使用に際しては、ゾーン９と１３の組合せに より結合される領域では、ゾーン１３の複合体とゾーン９の不動化試薬との結合 によりゾーン９から高い信号が発生する。この信号は、配位子がパッチ９の複合 体内の配位子アナログと競合するに従って増加する。使用に祭しては、ゾーン８ と１４の組合せと結合した領域では、ゾーン１４の標識化された種がゾーン８の 不動化された試薬と結合しないため、ゾーン８からゼロ信 号が発生する。ゾーン８及び９から発生する信号は、ゾーン１０からの信号の較 正に使用されるであろう。それ故、ＰＣＴ出願 No.PCT/GB91/02058の用語を使 用すると、ゾーン９と１３により結合した領域は高信号較正領域であり、ゾーン ８と１４で結合した領域はゼロ信号較正領域である。本発明による本装置の較正 領域の新たな可能性は、ＰＣＴ出願No.PCT/GB91/02058較正領域及び補助較正域 としてまとめて記載されている。 図５に示される装置は、図１の装置と同様上部プレート２及び下部プレート４ からなる。下部プレート４は、３つのゾーン、即ちゾーン１０ａ、１０ｂ、及び １０ｃを担持し、各ゾーン及び試薬は図１に関して前述したゾーン１０と同様含 まれる。上部プレートは１２ａ，１２ｂ及び１２ｂの３つのゾーンを担持し、図 １に関して前述したゾーン１２と同様に各ゾーンは試薬を担持する。ゾーン１２ ｂと１２ｃは更に既知の異なる量の配位子を担持する。それ故使用に祭しては、 １０ａ，１０ｂ及び１０ｃの各ゾーンからの信号を，試薬が１２ａ，１２ｂ及び １２ｂから放出される以前に記録する。続いてゾーン１２ａ，１２ｂ及び１２ｂ の試薬を放出し、１０ａ，１０ｂ，及び１０ｃの各ゾーンからの分析信号を記録 する。ゾーン１２ｂ及び１２ｃにおける一定量の配位子の存在のために、１０ｂ 及び１０ｃから発生する信号は、ゾーン１０ａから発生するものより強度が減少 したものになる。このことは達成すべき本装置の定量的較正を可能にする。 以下の例は本発明の方法の適応性を説明するためのものであるが、これに限定 されない。 例 １ ＦＩＴＣで標識したαＬＨ−抗体と標識しないものを種々の割合で、多数の蛍 光毛管フィル装置として作動するプレート上に不動化した。使用する標識化した 抗体の各濃度に１０個の装置を用いた。次に各装置を血清で満たし、基準信号を 記録した。次に各装置を予め混合しておいたαＬＨ−ＴＲＡＰ抱合体と１２５０ mIU/mlLHの混合溶液で洗浄し、平衡が確立された後に（約１５分間イ ンキュベション後）の分析信号を記録した。 測定はTRAP蛍光体に適合する波長で行った。この場合、ＦＩＴＣからの十分な 混信がみられ、特に高めの抱合比率では、この波長で測定しうる基準信号が得ら れた。結果を下記の表２に要約する。 これらの結果は、基準化した分析信号（基準信号と分析信号の比率によって測 定）の精度が個々の信号のそれより高かったことを示している。低い信号精度を 基準化する能力は、不動化した標識の比率に従って増加し、ガラス背景の変異性 の影響が減少する場合には劇的な向上がみられ、基準化信号の精度は４％以下の ％ｃｖまで向上した。減算修正（subtractive correction）よりも比率修正（ra tiometric correction）のほうがより有効であるという事実は、修正されるのは 導波管作用であって他の背景作用ではないことを示している。 標識化の２種の極端なレベルを試験した各装置による結果を図６及び７に示し 、基準化の方法を図示する。図６によれば、標識化の低いレベル（０．２％）、 即ち信号変異性は、本検出装置に入り込む励起の拡散によって支配的な影響を受 ける。拡散は測定から測定へと変動し、それ故、分析信号と基準信号間には真の 相関は無い。その結果、これらの信号の比率は２種の別個の信号とおよそ同様の 変化を示す。高い標識化のレベル（６％）では、図７によれば、信号が発生する と拡散はその信号の変異性にはあまり影響を与えない。エッジ作用は信号の精度 を支配し、基準及び分析信号の両方に等しく影響する。これら２種の信号は今や 相関し、これらの比率は、個々の信号の何れから得られる 物よりも良好な精度を示した。その精度はまた、以前の低い標識化レベルで達成 したものより良好であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料内の配位子の光学的バイオセンサ分析における測定精度の向上方法であ って、 ｉ）表面（「測定面」）に接触する試料を恒温保持する工程であって；該表面 は使用する分析技術に適した直接的或いは間接的に不動化した試薬（「測定試薬 」）を担持すると共に、試料中に存在する配位子の量から独立して検出可能な信 号を測定面で発生させる量の直接的或いは間接的に不動化された種（「基準試薬 」）を担持し、試料の前記恒温保持の前或いは恒温保持中或いは恒温保持後に、 使用する分析技術に適した方法により前記基準信号を測定してなる工程と； ｉｉ）上記工程ｉ）の試料の恒温保持と同時或いはその後に、使用する分析技 術に適した１つまたは複数の補助試薬を導入し、試料内に配位子が存在すれば、 前記測定試薬及び前記配位子及び／或いは前記補助試薬を含む複合体が形成され 、これにより試料内の配位子の量（存在した場合）の第１の関数と成る検出可能 な信号を発生させる工程と； ｉｉｉ）次いで、使用する分析技術に適した方法によって測定面から発生する 前記信号（「分析信号」）を監視し、前記基準信号を分析信号と比較し、それに より試料内に分析対象の配位子が存在するか否か、及び／或いはどの程度存在す るかを適切なアルゴリズムを用いて測定する工程と； よりなる、光学的バイオセンサ分析における測定精度の向上方法。 ２．ｉｖ）前記工程ｉ）の恒温保持と同時に或いはその後に、使用する分析技術 に適した試薬（「較正試薬」）が不動化された１つ或いは複数の別の表面（較正 面）で試料を（望むのであれば１つ或いは複数の補助試薬と共に）恒温保持する 工程と；前記較正試薬はゼロ或いはゼロでない信号を発生させるか、或いは前記 配位子及び／或いは補助試薬を含む複合体を形成するものであり、これにより前 記複合体はゼロでない信号を発生させ（かかる複合体が存在しない場合には配位 子が存在すればかかる信号を発生させ）、前記信号は前記試料 に存在する配位子（存在すれば）の量の第２の関数、或いはその量から独立した 信号であり； ｖ）前記較正面から発生した信号（「較正信号」）を監視する工程と； ｖｉ）次いで、前記較正信号を、前記分析信号及び基準信号の両方と比較し、 前記分析信号及び基準信号により得られた分析対象の配位子が試料内に存在する 程度の測定値をアルゴリズムを用いて較正する工程と；を更に有してなる、請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．前記分析は競合分析であって、 前記工程ｉ）及びｉｉ）において、 ａ）補助試薬として標識化された配位子アナログが存在すると共に、前記測定 試薬（或いはオプションとして、該測定試薬と予め複合されているか或いは該測 定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子の特異の結合パ ートナであるか、或いは、 ｂ）分析対象の配位子に特異の標識化された結合パートナが補助試薬として存 在すると共に前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬と予め複合さ れているか或いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が配位子アナ ログであるか、の何れかであり、 前記工程ｉｖ）において（該当する場合には）、 ａ）標識化した配位子アナログが補助試薬として存在すると共に、前記較正試 薬（或いはオプションとして該較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試 薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結合パート ナであるか、或いは、 ｂ）分析対象の配位子に特異の標識化された結合パートナが補助試薬として存 在すると共に、較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合され ているか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が配位子アナロ グであるか、或いは ｃ）分析対象の配位子とは別の標識化された配位子が補助試薬として存在す ると共に、較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されてい るか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子 とは別の、配位子に特異の結合パートナであるか、或いは ｄ）前記較正試薬が存在する何れの補助試薬にも非特異の結合パートナである か、或いは ｅ）前記較正試薬が補助試薬の存在を必要とせずに希望のゼロ或いはゼロでな い信号を発生させるか、の何れかであることを特徴とする、請求の範囲第１或い は２項記載の方法。 ４．前記分析はサンドイッチ分析であって、 前記工程ｉ）及びｉｉ）において、分析対象の配位子に特異の標識化された結 合パートナが補助試薬として存在すると共に、前記測定試薬（或いはオプション として、該測定試薬と予め複合されているか或いは該測定試薬を含む複合体を形 成可能な補助試薬）が分析対象の前記配位子に特異の別の結合パートナであり、 その別の結合パートナは前記オプションとして標識化された特異の結合パートナ の向けられたエピトープとは異なる分析対象の配位子のエピトープに向けられ、 前記工程ｉｖ）において（該当する場合には）、 ａ）前記較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されてい るか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子 に特異の結合パートナであり、分析対象の前記配位子の標識化された特異の結合 パートナが補助試薬として存在すると共に、標識化された特異の結合パートナと 予め複合した分析対象の既知量の配位子が更に別の補助試薬として存在するか、或いは ｂ）分析対象の配位子に特異の標識化された結合パートナが補助試薬として存 在すると共に、較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合され ているか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が不動化された 特異の結合パートナに予め複合した既知量の分析対象の配位子であるか、或いは ｃ）分析対象の配位子とは別の配位子が補助試薬として存在すると共に、較正 試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較 正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子とは別の配位子 に特異の標識化された結合パートナであるか、或いは ｄ）前記較正試薬が存在するいずれの補助試薬にも非特異の標識化された結合 パートナであるか、或いは ｅ）前記較正試薬が補助試薬の存在を必要とせずに希望のゼロ或いはゼロでな い信号を発生させるか、の何れかであることを特徴とする、請求の範囲第１項或 いは２項記載の方法。 ５．前記基準信号及び分析信号を遅延測定することを特徴とする、請求の範囲第 １項乃至４項の何れか―らに記載の方法。 ６．前記基準信号、分析信号及び較正信号は存在する場合には、蛍光、燐光或い は発光信号であることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至５項の何れか一つに 記載の方法。 ７．前記基準試薬に使用する標識は、補助試薬に担持されるものと同じであるこ とを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第６項の何れか一つに記載の方法。 ８．請求の範囲第１項に記載の方法への使用に適したバイオセンサ装置であって 、該装置は請求の範囲第１項で限定した測定試薬を担持する測定面よりなるバイ オセンサ装置。 ９．請求の範囲第２項に記載の方法への使用に適した請求の範囲第８項に記載の バイオセンサ装置であって、該装置は、測定面から離れた１つ或いは複数の較正 面を有し、前記各較正面は請求の範囲第２項に記載の適当な較正試薬を坦持して なる、バイオセンサ装置。 １０．前記装置は１つ或いは複数のキャビティーを有する、特有な反応を示す試 料の取集及び試験装置であり、前記各キャビティーの１つの面はゾーンＩを有し 、該ゾーンは所望の分析に適した離脱可能な補助試薬からなる層を坦持し、 前記面は透明な材料で形成された第１固体プレートの面であり、該第１固体プレ ートに対向する前記キャビティの壁部は透明な材料より形成されて透光性の導波 管として関数する第２プレートからなり、該第２プレートの前記キャビティに隣 接する面は前記ゾーンＩに対応して配向させられたゾーンＩＩを有し、ゾーンＩ Ｉは、所望の分析に適し、共に請求の範囲第１項に記載される、ランダムに分配 された、不動化測定試薬及び不動化基準試薬を坦時することを特徴とする、請求 の範囲第８項記載の装置。 １１．前記第１プレート上に、所望の分析に適した補助試薬を溶解及び離脱自在 な形態で有する層を坦持した１つ或いは複数の更に別のゾーンを坦持し、前記第 ２プレート上にも、１つ或いは複数の更に別のゾーンを坦持し、これら後者の各 ゾーンは、前記第１プレート上の前記更に別のゾーンの１つに対応して配向させ られると共に、請求の範囲第２項記載の不動化された較正試薬よりなる層を坦持 してなる、請求の範囲第２項に記載の方法への使用に適した請求の範囲第１０項 記載の装置。 １２．前記第１プレートは前記該キャビティーから離れた面に光吸取材料或いは 不透明材料の層を坦持してなる、請求の範囲第１０或いは第１１項記載の装置。 １３．（ａ）多数の前記装置の一部を提供するシート材の表面に、請求の範囲第 １０項記載のゾーンＩにより坦持される適切な試薬のパッチを形成する工程と； （ｂ）別の構造体の表面に、請求の範囲第１項に記載の測定試薬及び基準試薬の 不動化を含めて、請求の範囲第１０項に記載のゾーンＩＩに坦持される適切な試 薬のパッチを形成し、前記別の構造体は、適切な試薬の前記層と接触させて或る 容積の試料液体を取集・保持すべく、前記シート材と共に、前記多数の装置のそ れぞれに好ましくは毛管作用をなす寸法のキャビティを提供する工程と； （ｃ）前記シート材を、それぞれが１つ或いは複数の前記試料取集及び試験装 置を提供する複数の部分に分離する工程と；よりなり、 必要であれば、更に、前記シート材の表面上の前記更に別のゾーンに適切な試 薬のパッチを形成する工程と、前記別の構造体の前記表面上の前記更に別のゾー ンに、請求の範囲第２項記載の較正試薬を不動化する工程と、を有してなる、請 求の範囲第１０或いは１１項に記載の特有の反応を示す試料の取集及び試験装置 の製造方法。 １４．請求の範囲第１項乃至７項の何れか一つに記載の分析方法での使用に適し た装置であって、請求の範囲第８項乃至第１２項の何れか一つに記載の装置と； 使用時に放射線が前記装置に進入して、装置内の光学的に標識化された種を励起 するよう配置可能な放射線源と；放出される放射線を監視する手段と、を含む装 置。 １５．請求の範囲第８乃至１２項の何れか一つに記載の装置と、適切な補助試薬 とよりなり、請求の範囲第１乃至７項の何れか一つに記載の分析方法を実行する ためのキット。