JPH08501213A

JPH08501213A - カチオン性ペプチド及びその製造方法

Info

Publication number: JPH08501213A
Application number: JP6505715A
Authority: JP
Inventors: イー．ハンコック，ロバート; エル．ピアーズ，ケヴィン; エイチ．ブラウン，メリッサ
Original assignee: ザユニバーシティーオブブリティッシュコロンビア
Priority date: 1992-08-21
Filing date: 1993-08-20
Publication date: 1996-02-13
Also published as: DE69332740T2; JP2003284578A; ATE233817T1; EP0656952B1; DE69332740D1; WO1994004688A3; HK1013316A1; EP0656952A1; WO1994004688A2; CA2142306A1

Abstract

(57)【要約】カチオン性ペプチド及びポリカチオン性抗菌性ペプチドの組換え産生法。

Description

【発明の詳細な説明】カチオン性ペプチド及びその製造方法発明の背景１．発明の分野本発明は、組換えベクター系に関し、より具体的には、これら系をカチオン性ペプチドの産生に用いることに関する。２．関連技術の説明緑膿菌内のポリカチオン性抗生物質の働きのメカニズムを説明するため、1981 年に自己促進取り込み(self-promoted uptake)説が初めて提案された。この説によれば、ポリカチオンは、二価カチオンが隣接するリポポリサッカライド分子を架橋しているグラム陰性菌の外膜上の部位と相互作用する。これら部位に対するそれらの高い親和性のために、ポリカチオンはこの二価カチオンを追い出し、このポリカチオンがその二価カチオンよりも嵩高いことから、外膜内に構造的動揺をもたらす。これら動揺は、β−ラクタム系抗生物質ニトロセフィン(nitrocefi n)、真核性非特異性防衛タンパク質ライソザイムの如き化合物及び疎水性物質への外膜透過性の増加をもたらす。類推して、この経路を通る分子がそれら自身の取り込みを促進することが提案されている。グラム陰性菌の外膜は、抗生物質及び宿主防衛分子がこの細菌細胞内のそれらの標的に接近するのを制限する半透過性分子“ふるい”であることが明確に証明された。従って、自己促進取り込み系に接近するカチオン及びポリカチオンは、この外膜透過バリヤーと相互作用してそれを破壊するそれらの能力によって、抗生物質及び宿主防衛分子に対するグラム陰性病原菌の感受性を増加することができる。ハンコック(Hancock)とウォン(Wong)は、かかる化合物の広範囲のものがこの透過バリヤーに打ち勝つことを証明し、それらを記載するのに“透過剤(perme abilizer)”という名称を造り出した（ハンコックとウォン，Antimicrob.Agents Chemother.，26:48，1984）。自己促進取り込み及び透過剤は緑膿菌について初めて記載されたが、今日では種々のグラム陰性菌について記載されている。ここ十年、昆虫及びヒトを含む多くの動物中の非特異性防衛分子が記載されている。これら分子の１サブセットは、次の特徴を共通して有する：(a)それらは通常１５〜３５アミノ酸長の小さなペプチドである、(b)それらは４又はそれ以上の正に荷電したリシン又はアルギニンのいずれかのアミノ酸残基を含有する、そして(c)それらはそれらが由来する生物中に非常に豊富に見出される。これら分子の幾つかが単離され、アミノ酸配列が決定され特許文献中に記載されている（例えば、セクロピン(cecropin)類：ＷＯ８９００１９９、ＷＯ８８０５８２６、ＷＯ８６０４３５６、ＷＯ８８０５８２６；デフェンシン類：ＥＰ１９３３５１、ＥＰ８５２５０、ＥＰ１６２１６１、ＵＳ４６５９６９２、ＷＯ８９１１２９１）。しかしながら、これらペプチドはその宿主種から限られた量しか単離することができない。例えば、ソーヤー(Sawyer)ら(Infect．Immun．56:693，1988 )は、１００〜２００ｍｇのウサギ好中球デフェンシン１及び２を、１０⁹個の活性化腹膜好中球又はリポポリサッカライド誘発肺胞マクロファージ（即ち、動物の全身に存在する数）から単離した。ヒトデフェンシンの遺伝子がクローン化されて配列決定されたが、未だにうまく発現できたことが証明されていない。更に、ペプチド合成技術を用いるこれらペプチドの合成では、限られた量のペプチドしか合成されず、スケールアップしたり又は多くの変異体ペプチドを産生させなければならない場合には費用がかかる。また、アミノ酸合成技術を用いる¹⁵Ｎ及び¹³Ｃ標識アミノ酸の特異的取り込みなしでは構造分析が困難であるが、これは費用がかかり過ぎてできない。従って、小さなカチオン性ペプチド、特にポリカチオン性ポリペプチドを商業的に実施可能な量で製造する方法が必要とされる。この発明は、大腸菌及び黄色ブドウ球菌内で組換えＤＮＡ法を用いるそのような方法を開示することによってそのような必要性を扱うものである。この方法は、これらポリカチオン性ペプチドが細菌性プロテアーゼ分解を受け易いという難しさのために、本発明までは細菌内で達成されたことがなかった。発明の要旨この発明は、カチオン性ペプチドとアニオン性ペプチドから構成される融合ペプチドを組換え法で産生させることによってカチオン性ペプチドを製造する新規な方法を提供する。好ましくは、この融合ペプチドを後で開裂してカチオン性ペプチドを解放することができ、このカチオン性ペプチドを精製することができる。天然物からの多数のポリカチオン性ペプチド構造体が報告され、外膜透過剤として作用することが証明されるか又は仮定されている。本発明の方法により製造されるカチオン性ペプチドを古典的な抗生物質と共働的に用いて、グラム陰性菌に対する抗生物質活性における主要な制限因子の１つである外膜透過バリヤーを破ることができる。かかる透過剤は、非常に広い範囲のアミノ酸配列、鎖長、及び予測３次元構造を見せる。本発明までは、細菌内で意味ある量のポリカチオン性ペプチドの産生を可能にする一般的方法が記載されたことはなかった。もう１つの態様においては、本発明は、選択されたセクロピン配列とメリチン配列間の追加の修飾を有する融合体である新規なカチオン性ペプチドを提供する。この新規なペプチドは、これまでに記載されたカチオン性ペプチドに比較して高い抗菌活性を有する。図面の簡単な説明図１は、本発明で用いられるプラスミドの概略図である。Ａ，ｐＧＳＴ−ペプチド；Ｂ，ｐＰＡ−ペプチド；Ｃ，ｐＥＺＺ−ペプチド；Ｄ，ｐＯｐｒＦ−ペプチド。図２は、融合タンパク質ベクターに用いられる構築体の概略図である。図３は、ヒト好中球ペプチド−１（ＨＮＰ−１）、セクロピンＡ／メリチンハイブリッドペプチド（ＣＥＭＥ）及び（ＣＥＭＡ）のアミノ酸配列を示す。正に荷電したアミノ酸を太字にしてある。図４は、ＣＥＭＥで処理した緑膿菌についての死滅曲線を示す。図５は、ポリミキシンＢ（Ｐｘ）、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ、又はメリチンで処理した緑膿菌についてのライソザイム溶菌アッセイを示す。図６は、ポリミキシンＢ（Ｐｘ）、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ、又はメリチンで処理したＥ．クロアカエ(E.cloacae)についてのライソザイム溶菌アッセイを示す。図７は、ポリミキシンＢ（Ｐｘ）、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ、又はメリチンでの処理後の緑膿菌における１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）取り込みを示す。図８は、ポリミキシンＢ（Ｐｘ）、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ、又はメリチンでの処理後のＥ．クロアカエにおける１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）取り込みを示す。図９は、ポリミキシンＢ（Ｐｘ）、ゲンタマイシン（Ｇｍ）、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ、又はメリチンによる緑膿菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）へのダンシルポリミキシン（ＤＰｘ）結合の阻害を示す。図１０は、図９に示した結果の二重逆数プロットである。図１１は、Ｐｘ、Ｇｍ、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ、又はメリチン存在下の無傷緑膿菌細胞へのＤＰｘの阻害を示す。図１２は、図１１に示した結果の二重逆数プロットである。発明の詳細な説明この発明の方法は、アニオン性ペプチド及びカチオン性ペプチドを含む融合タンパク質の製造方法を提供する。初めに、アニオン性キャリヤーペプチドをコードするアミノ末端配列がないか又はシグナル配列コーディング領域若しくはプレプロデフェンシンコーディング領域（即ち、それぞれ細菌又は真核生物内への輸送をもたらす領域）だけがある発現ベクター内にカチオン性ペプチドをコードする配列を入れても、細胞質内に測定できるレベルのｍＲＮＡが存在するにも拘らずペプチドは認められなかった。この知見は、幾つかの細胞質内メカニズムが、どうもｍＲＮＡの翻訳を妨害するか又はその翻訳産物を分解しているのではないかということを示唆した。この問題は、本発明において、安定化が起こって細菌性プロテアーゼによる分解が避けられるようにアニオン性キャリヤーペプチドをカチオン性ペプチドに融合させることによって解決された。ここで用いる場合“カチオン性ペプチド”という用語は、約５〜約５０アミノ酸長、好ましくは約１５〜約３５アミノ酸長のアミノ酸の配列のことをいう。９．０より大きいｐＫａを有する十分に正に荷電したアミノ酸を有する場合、そのペプチドは“カチオン性”である。典型的には、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも４つ、例えば、リシン又はアルギニンが正に荷電することができる。“正に荷電する”とは、ｐＨ７．０で正味正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖のことをいう。本発明に従って組換え法で産生させることができる、天然に存在するカチオン性ペプチドの例には、デフェンシン類、マガイニン(magainin) 類、メリチン、及びセクロピン類、並びにそれらの類縁体が含まれる。本発明の方法によれば、融合ペプチドは、発現ベクター内に存在するヌクレオチド配列によりコードされる“キャリヤーペプチド”を含む。この“キャリヤーペプチド”は、好ましくは融合ペプチド配列のアミノ末端の端に位置している。このキャリヤーペプチドは、カチオン性ペプチドに付随している正電荷に打ち勝てるほど十分にアニオン性である。その結果として、この融合ペプチドは、本質的に中性か又は負でさえある正味電荷を有する。このアニオン性キャリヤーペプチドは、天然に存在するタンパク質から誘導しても完全に人工のものであってもよい。機能的には、このキャリヤーペプチドは、カチオン性ペプチドを安定化して細菌性プロテアーゼからそれを保護する。本発明の方法のキャリヤーペプチドは、更に、融合ペプチドを封入体、周縁質、外膜、又は好ましくは外部環境に輸送するように機能することができる。本発明に従って用いることができるキャリヤーペプチドのカテゴリーには、アニオン性プレプロペプチド及びアニオン性外膜ペプチドが含まれる。具体的には、本発明のキャリヤーペプチドには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（スミス(Smith)ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:8703(1986)）、黄色ブドウ球菌からのプロテインＡ（ニルソン(Nilsson)ら，EMBO 4:1075(1985)）、プロテインＡの２つの合成ＩｇＧ−結合ドメイン（ＺＺ）（レーベンアドラー Low enadler)ら，Gene，58:87，1987）及び緑膿菌からの外膜プロテインＦ（デュッヘン(Duchene)ら，J.Bacteriol.，170:155，1988）が含まれるがこれらに限定されない。本発明は、これらペプチドのキャリヤーとしての用途に限定されない。ここに記載したキャリヤーとして類似の特性を有する他のものは、当業者に知られているか又は不当な実験を重ねることなしに容易に確認できる。本発明の微生物発現ポリペプチドの単離及び精製のための技術は、例えば、分取クロマトグラフィー分離法、及びモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を包含するものの如き免疫学的分離法のような、あらゆる従来の手段によることができる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をキャリヤータンパク質として用いると、グルタチオンアガロースアフィニティカラムで精製できる。プロテインＡ又は黄色ブドウ球菌からのＺＺドメインのいずれかをキャリヤータンパク質として用いると、例えば、ＩｇＧ −セファロースアフィニティカラムを用いて１工程の精製をすることができる。緑膿菌外膜プロテインＦのＮ−末端の半分であるｐＯｐｒＦ−ペプチドを用いるのが有利である。というのは、それは外膜試料中に見出される突出したタンパク質バンドであり、従って簡単に精製もできるからである。また、この融合ペプチドを、融合ペプチドのカチオン性ペプチド部分と特異的に反応する試薬を用いることによって単離することができる。これら系列に沿って、カチオン性ペプチド中に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体を、例えば、標準的な固相アフィニティ精製法を用いることによって利用してもよい。本発明の１態様においては、シグナル配列が発現ベクター内に含まれ、具体的にはキャリヤータンパク質のＮ−末端の端に隣接して位置する。このシグナル配列は、融合タンパク質が膜の方に向けられるようにする。このシグナル配列は、通常、約１６から約２９アミノ酸のリーダーからなり、２又は３の極性残基で始まって高含有量の疎水性アミノ酸が続く。そこには他に検出できる既知配列の保存はない。本発明において例として用いられるベクターは、スタフィロコッカス属のプロテインＡシグナル配列又は緑膿菌内のＯｐｒＦシグナル配列を用いるが、融合タンパク質の細胞膜までの輸送手段を提供する他のシグナル配列が本発明の方法を実施するのに等しく有効であろう。かかるシグナル配列は、当業者に知られている。本発明によれば、本発明の方法に用いるベクター内に“スペーサーＤＮＡ配列 ”を含ませるのが有利であり得る。ここで用いる場合“スペーサーＤＮＡ配列” とは、融合ペプチドベクターの、キャリヤーペプチドＤＮＡ配列とカチオン性ペプチドＤＮＡ配列との間に位置するあらゆるＤＮＡ配列のことをいう。特定の理論に拘束されることを欲しないが、翻訳に際してこのスペーサーＤＮＡ配列が“ ちょうつがい様”領域を造り、これが、アニオン性キャリヤーペプチドの負に荷電した残基と、本題のカチオン性ペプチドの正に荷電した残基とが相互作用し、それによって正電荷効果及びタンパク質分解酵素による分解の如き関連する障害現象を阻害するのを可能にすると考えられる。安定性に加えて、スペーサーＤＮＡ配列は、融合ペプチドの合成後にそのペプチドからキャリヤーペプチドを切り離すための部位を提供することができる。例えば、かかるスペーサーＤＮＡ配列には、因子Ｘａプロテアーゼの開裂配列の如きプロテアーゼ開裂配列、メチオニン、トリプトファン及びグルタミン酸コドン配列、並びにプレプロデフェンシン配列が含まれるがこれらに限定されない。因子Ｘａは、因子Ｘａプロテアーゼ開裂配列におけるタンパク質分解性開裂に用いられ、臭化シアン処理による化学的開裂は、メチオニン又は関連コドンのところでこのペプチドを解放する。加えて、この融合産物は、トリプトファン（ｏ−ヨードソ安息香酸による開裂）又はグルタミン酸（スタフィロコッカス属プロテアーゼによる開裂）のコドンの挿入によって開裂することができる。かかるスペーサーＤＮＡ配列の挿入は、機能性カチオン性ペプチドの産生の要件ではないが、特定の配列はこの融合ペプチドの安定性を高めるであろう。プレプロデフェンシン配列は負に荷電している。従って、負に荷電したペプチドをコードする他のＤＮＡ配列をスペーサーＤＮＡ配列として用いて融合ペプチドを安定化し、かつ、細菌性タンパク質分解の如き分解事象を阻止できるとすると、それは本発明の範囲内と考えられる。プレプロデフェンシンアミノ末端配列の如きスペーサーＤＮＡ配列は、宿主細胞膜の外側に融合ペプチドを輸送するのにも有効である。本発明においては、カチオン性配列を組換え“発現ベクター”内に挿入してもよい。“発現ベクター”という用語は、カチオン性遺伝子配列の挿入又は取り込みによって操作されたプラスミド、ウィルス又は当該技術分野で知られている他のビヒクルのことをいう。本発明のかかる発現ベクターは、好ましくは、宿主内に挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含有するプラスミドである。この発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、並びにその形質転換細胞の表現型選択を可能にする特有の遺伝子を含有する。例えば、本発明の融合ペプチドの発現は、酵素β−ガラクトシダーゼを作ることによってラクトース利用を媒介するラクトース又はｌａｃオペロンを含む大腸菌染色体ＤＮＡの制御下に置かれてもよい。このｌａｃ制御系はＩＰＴＧによって誘発され得る。プラスミドをｌａｃｌｑレプレッサー遺伝子を含有するように構築することができ、そうすればＩＰＴＧを添加するまではｌａｃプロモーターを抑制することができる。当該技術分野で知られている他のプロモーター系には、ペニシリナーゼ、λ−プロモーター類、プロテインＡプロモーター、及びトリプトファンプロモーター系が含まれる。これらは最も一般的に用いられるが、誘導性及び構成的なものの両方の他の微生物プロモーターをも用いることができる。このベクターは、宿主細胞と適合性の種から誘導されるレプリコン部位及び制御配列を含有する。加えて、このベクターは、形質転換細胞内に表現型選択をもたらすことができる特有の遺伝子を有していてもよい。例えば、ペニシリナーゼ遺伝子は、このペニシリナーゼ遺伝子を有するベクターを含有する形質転換細胞にアンピシリン耐性を付与する。組換えＤＮＡでの宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来技術により行うことができる。例えば、宿主が大腸菌の如き原核性のものである場合は、ＤＮＡを取り込めるコンピテント細胞を指数増殖させてから当該技術分野で周知の操作を用いるＣａＣｌ₂法により処理した後に採取された細胞から調製することができる。また、ＭｇＣｌ₂又はＲｂＣｌも使用できるであろう。従来の化学的形質転換方法に加えて、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションの如き物理的手段により、本発明のプラスミドベクターを宿主細胞に導入してもよい。エレクトロポレーションは、高圧電流インパルスによりベクターの送り込みを可能にするもので、宿主の原形質膜に細孔を生じさせるものであって、当該技術分野で周知の方法に従って行われる。更に、当該技術分野で周知の方法を用いる原形質融合により、クローン化したＤＮＡを宿主内に導入することができる。カチオン性ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞内へのＤＮＡ送り込みによりin vivo で発現することができる。本発明の“宿主細胞”は、そこでベクターが増殖してそのＤＮＡを発現できるものである。この用語は、本題宿主細胞のあらゆる子孫も包含する。全ての子孫が親細胞と必ずしも同一ではないということが理解される。というのは、複製の間に突然変異が起こり得るからである。しかしながら、上の用語が用いられるときはかかる子孫が含まれる。本発明の好ましい宿主細胞には大腸菌、黄色ブドウ球菌及び緑膿菌が含まれるが、発現ベクターが複製起点を含有しておりその宿主内での発現を可能にしている限り、当該技術分野で知られている他のグラム陰性菌及びグラム陽性菌も用いることができる。本発明の方法に従って用いられるカチオン性ペプチドＤＮＡ配列は、生物から単離しても研究室で合成してもよい。興味の対象であるカチオン性ペプチドをコードする特有のＤＮＡ配列は、１）ゲノミックＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；２）興味の対象であるカチオン性ペプチドに必要なコドンを供給するＤＮＡ配列の化学的合成；及び３）ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成によって得ることができる。この最後の場合には、ｍＲＮＡに相補的な一般にｃＤＮＡと言われる二本鎖ＤＮＡが最終的に形成される。所期ペプチド産物のアミノ酸残基の全縁配列が分かっているときは、ＤＮＡ配列の合成が選り抜きの方法であることが多い。本発明においては、ＤＮＡ配列の合成は、細菌宿主によってより認識されそうなコドンが加わることを可能にし、それによって翻訳の困難性なしに高いレベルの発現を可能にするという利点を有している。加えて、天然カチオン性ペプチドをコードするもの、その変異体、又は合成ペプチドを含む殆どあらゆるペプチドを合成することができる。所期のペプチドの全縁配列が不明であるときは、ＤＮＡ配列の直接合成はできないので、選り抜きの方法はｃＤＮＡ配列の形成である。興味の対象であるｃＤＮＡ配列を単離する標準的操作には、高いレベルの遺伝子発現を有するドナー細胞内に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写から誘導したｃＤＮＡライブラリーを含有するプラスミド又はファージの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いれば、僅かな発現産物でもクローン化することができる。カチオン性ペプチドのアミノ酸配列の相当な部分が分かっている場合には、標的ＤＮＡ内に推定上存在する配列と二重構造になる標識一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、一本鎖型に変性されたｃＤＮＡのクローン化複製体上で行われるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション操作に用いてもよい（ジェイ (Jay)ら，Nuc．Acid Res.，11：2325，1983）。本発明は、配列番号：２４を含む単離ペプチド及びその保存的変異体も提供する。このペプチド、つまりＣＥＭＡは、セクロピンの最初の１８アミノ酸とメリチンの最後の８アミノ酸を含有する。ＣＥＭＡは、ＣＥＭＥのカルボキシ末端アミノ酸配列を更に２つのリシン残基を含むように変えることによって変異させたものである。意外にも、この修飾が、多くの細菌種に対して２倍向上した抗生物質活性、並びに細菌外膜を透過してリポポリサッカライド（ＬＰＳ）に結合する相当に増進した能力を有する配列を生み出した。一方、他の正に荷電したアミノ酸を、それらの電荷がｐＨ７．０で正である限りは、リシンと置換することができるかも知れない。本発明のペプチドの一次アミノ酸配列に重要でない修飾をすると、ここに記載した特有のペプチドと比較して実質的に等しい活性を有するペプチドをもたらすことができる。かかる修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような故意のものであっても自発的なものであってもよい。これら修飾によって生成する全てのペプチドは、もとのペプチドの生物活性が依然として存在する限りここに含まれる。更に、１又は２以上のアミノ酸の欠失も、その生物活性を大きく変化させることのない生成分子の構造の修飾をもたらすことができる。これにより、やはり有用性を有するであろうより小さな活性分子を開発することができる。例えば、この特有のペプチドの生物活性に要求されないであろうアミノ又はカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。本発明のペプチドには、ここに具体的に例示したペプチドの保存的変種であるペプチドが含まれる。ここで用いる“保存的変種”という用語は、生物学的に類似した別の残基によるアミノ酸残基の置換体を表す。保存的変種の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの如き１つの疎水性残基の別の残基との置換体、又はアルギニンのリシンとの、グルタミン酸のアスパラギン酸との、若しくはグルタミンのアスパラギンとの置換体の如き、１つの極性残基の別の残基との置換体、及びそれらに類したものが含まれる。“保存的変種”という用語には、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いたものも含まれる。但し、この置換ポリペプチドに対して生じた抗体が、その未置換ポリペプチドにも免疫反応することを条件とする。本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。ここで用いる場合“ポリヌクレオチド”という用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーのことをいい、分離したフラグメントの形態にあっても大きな構築体の成分としてであってもよい。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡフラグメントから組み立てても組換え転写装置内で発現できる合成遺伝子を供給するオリゴヌクレオチドから組み立ててもよい。本発明のポリヌクレオチド配列には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列が含まれる。ポリヌクレオチド配列はその遺伝子コードから推定できるものであるが、コードの縮重を考慮しなければならない。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝子コードの結果としての縮重物である配列が含まれる。本発明は、細菌を阻害有効量の本発明のＣＥＭＡペプチドに接触させることを含む細菌の増殖を阻害する方法も提供する。“接触させる”という用語は、細菌をＣＥＭＡに曝した結果、ＣＥＭＡが細菌を阻害し、死滅させ、又は溶菌し、エンドトキシン（ＬＰＳ）に結合し、又はグラム陰性菌外膜を透過することが効果的にできることをいう。接触は、例えば、ペプチドに対する細菌の感受性を試験するためにＣＥＭＡを細菌培養物に添加する invitroのものであってもよい。接触は、例えば、敗血症性ショックの如き細菌性障害を有する被験者にＣＥＭＡを投与する invivoのものであってもよい。“阻害”又は“阻害有効量”とは、鎮菌(bacteriastatic)作用又は殺菌作用を生ずるのに要求されるＣＥＭＡの量のことをいう。阻害され得る細菌の例には、大腸菌、緑膿菌、Ｅ．クロアカエ、Ｓ．タイフィムリウム(typhimurium)及び黄色ブドウ球菌が含まれる。細菌の増殖を阻害するこの方法は、併用療法又は共働的治療用に抗生物質の添加を更に含んでもよい。投与される適切な抗生物質は、典型的には、細菌がグラム陰性であるかグラム陽性であるかというような細菌の感受性に依存するであろうが、当業者により容易に決められるであろう。本発明のペプチドは、注射により又は時間をかけて徐々に注入することにより非経口で投与することができる。このペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、洞内、又は経皮的に投与することができる。このペプチドの送達の好ましい方法には、マイクロスフェア又はプロテイノイド内への被包、肺へのエアゾール送達による経口投与、又はイオン導入若しくは経皮的エレクトロポレーションによる経皮投与が含まれる。他の投与方法は、当業者に知られているであろう。本発明のペプチドの非経口投与用製剤には、滅菌した水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、及び乳剤が含まれる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の如き植物油、及びオレイン酸エチルの如き注射可能な有機エステルである。水性キャリヤーには、食塩水及び緩衝媒質を含む水、アルコール／水性の溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、又は固定油が含まれる。静脈内用賦形剤には、流体及び栄養補液、電解質補液（例えば、リンガーのデキストロースを主成分としたもの）、及びそれらに類したものが含まれる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス、及びそれらに類したものの如きものが存在してもよい。以下の実施例は、本発明を説明することを意図したものであって本発明を限定することを意図したものではない。それらは使用し得るもののうち典型的なものであるが、当業者に知られている他の操作を代わりに用いてもよい。実施例１ｐＧＳＴ−ペプチドプラスミドの構築このプラスミドは、ｐＧＥＸ−３Ｘ（スミスら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，83:8703(1986)）から組換えＤＮＡ技術を用いて誘導した。因子Ｘ開裂部位及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子の一部を含むｐＧＥＸ−３Ｘからの５００ｂｐＢｃII−ＢａｍＨＩフラグメントを単離した。このフラグメントを、エリコンプ・セモサイヤー (Ericomp themocyier)中で、このフラグメントの両末端のプライマーを用いて、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃で１分間、５０ ℃で１分間、７２℃で１分間）に付した。この末端において用いたＢａｍＨＩで開裂したプライマーは、突き出た５’末端を有し、これに、ＰＣＲ反応後にＳｐｈＩ、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩ制限部位を付加した。このＳｐｈＩ部位は、因子Ｘ開裂部位に対して平坦(flush)であった。得られたＰＣＲフラグメントをクレノウフラグメントを用いて平滑末端にして、安定なコピーを得るためにｐＴＺ１８ＵのＳｍａＩ部位内に連結した。ＢｃII及びＥｃｏＲＩを用いてこのフラグメントをｐＴＺ１８Ｕから切り出し、ＥｃｏＲＩ及び部分的にＢｃIIで切断したｐＧＥＸ−３Ｘ内に連結した。得られたプラスミド、つまりｐＧＥＸ−ＫＰは、これでｐＧＥＸ−３Ｘ中のＢａｍＨＩ −ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩに変えてＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ多クローニング部位を有した。ＧＳＴ−ペプチド遺伝子のクローニング及び発現ＣＥＭＥ（表１，Ａ，Ｂ）、ＣＥＭＡ（表１，Ｖ，Ｗ）及びＨＮＰ−１をコードする合成ＤＮＡ（表１，Ｃ〜Ｈ）をオーバーラップオリゴヌクレオチドとして合成し、ｐＧＥＸ−ＫＰ内にアニーリングして連結した。ＨＮＰ−１はヒト好中球ペプチド１であり、ＣＥＭＥは昆虫デフェンシンセロピン(ceropin)Ａとハチ毒液ペプチド、つまりメリチンの部分から作った融合ペプチドであり、ＣＥＭＡはカルボキシ末端の端に追加の２つのリシン残基を有するＣＥＭＥの変異体である（図３）。しかしながら、これら遺伝子は完全合成したものであるので、ＣＥＭＥ及びＨＮＰ−１の殆どあらゆるペプチド配列又は変異体を組み入れることができる（図２）。陽性クローンをスロット細胞溶解(slot lysis)ゲル電気泳動によって同定し、そしてアプライド・バイオシステムズ自動ＤＮＡ配列分析装置で、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド（表１，Ｔ〜Ｕ）を用いてＤＮＡ配列決定するこによって確認した。この組換えベクターを含有する株を融合タンパク質発現について試験した。簡単に説明すると、細胞をルリア肉汁中でＯＤ₆₀₀＝１．０まで増殖させた。ＩＰＴＧを０．２ｍＭまで添加して発現を誘発した。未誘発及び誘発細胞のサンプルを展開緩衝液中に再懸濁してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付したところ、この融合タンパク質が全細胞タンパク質の１５％も占めることが明らかになった。ＨＮＰ−１の場合には、得られた融合タンパク質は、タンパク質分解のために不安定であった。合成プレプロデフェンシンコーディングＤＮＡカセットを含めたことが、この融合タンパク質をタンパク質分解に対して安定にした。ＧＳＴ−ペプチドタンパク質の精製及び開裂融合タンパク質の産生を誘発した細胞を採取し、フレンチ圧力セル(1054.5 kg /cm² (15000 psi))に通すことによって細胞溶解した。その溶解産物を３０００ ×ｇでの遠心分離によって分画したところ、融合タンパク質は沈殿物（封入体として）にも上澄み液にも見出された。可溶性上澄み液画分中に見出されたものについては、融合タンパク質をグルタチオン−アガロース又はグルタチオン−セファロースビーズ（硫黄結合，シグマ）とインキュベートした。これらビーズは融合タンパク質と結合し、そして数倍の容量の緩衝液で洗浄して未結合タンパク質を除いた。次いで、この結合融合タンパク質を完全に回収するために０．５％ＳＤＳで溶離した。図５は、典型的な単離操作の結果を示す。ＳＤＳ分離は、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ（２：１）抽出又はタンパク質のエタノール沈降によって行い、その後凍結乾燥を行った。不溶性沈殿物画分中に見出されたものについては、タンパク質を３％オクチル−ポリオキシエチレン（Ｏ−ＰＯＥ）で抽出して封入体試料中の主要な不純種である膜タンパク質を除去することにより単離した。検出可能なレベルの全ての膜タンパク質をＯ−ＰＯＥで可溶化すると、比較的純粋な封入体のサンプルが残る。このサンプルを８Ｍ尿素で抽出して封入体を可溶化した後、尿素を透析によって除去する。この段階で、本発明者らは、因子Ｘａプロテアーゼ開裂を用いてペプチドの解放を試みたが、これは極端に非効率的であることが分かった。従って、合成メチオニン残基コドンをポリカチオン性ペプチド配列のすぐ隣に入れて、化学的開裂ができるようにした。この場合には、封入体試料をＯ−ＰＯＥで抽出した後に、その封入体を７０％ギ酸中に直接可溶化した。融合タンパク質からポリカチオン性ペプチドを解放するためにＣＮＢｒをこれに添加した。本発明の最終的なものでは、このメチオニン残基が常に存在する。実施例２ＣＥＭＥ及びＨＮＰ−１を含有するｐＰＡベクターの構築ＣＥＭＥ遺伝子（図２Ａ）のクローン化コピーを用い、オリゴヌクレオチドＮ＋Ｏ（表１）をこの遺伝子（図２Ａ）の５’末端のＳｐｈＩ部位内にアニーリングしてクローン化した。方向をＤＮＡ配列決定によって確認して、ＳａｌＩ部位が因子Ｘａ認識部位に対して５’側であることを確かめた。オリゴヌクレオチドＭ（表１）を用い、ＳａｌＩ部位を３’ＨｉｎｄIII部位内に挿入した。得られた構築体（図２Ｂ）はＳａｌＩカセットを有し、これをｐＲＩＴ５のＳａｌＩ部位内にクローン化して、ｐＰＡ−ＣＥＭＥ（図１Ｂ）を作ることができた。この挿入物の方向を非対称制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて確かめた。ＣＥＭＡ遺伝子のクローン化コピーを、ＣＥＭＥについて説明したようにしてｐＰＡベクター内にクローン化した。ＨＮＰ−１遺伝子（図２Ｃ）を、オリゴヌクレオチドＱ＋Ｒ（５’ＳｐｈＩ部位内への挿入用）及びオリゴヌクレオチドＰ（３’ＥｃｏＲＩ部位内への挿入用）を用いて同じようにして変化させた。得られた構築体（図２Ｄ）はＢａｍＨＩカセットを有し、これをｐＲＩＴ５のＢａｍＨＩ部位内にクローン化してｐＰＡ −ＨＮＰ１を得た。この融合タンパク質系内のプレプロカートリッジの作用を調べるために、次の構築体を作らなければならなかった。このＳｐｈＩ部位を用いて、プレプロカセット（図２Ｅ）をＨＮＰ−１遺伝子（図２Ｃ）の５’末端に挿入した。この構築体の３’末端をオリゴヌクレオチドＰ（表１）を用いて変化させ、５’末端をオリゴヌクレオチドＳ（表１）を用いて変化させた。得られた構築体（図２Ｆ）をＢａｍＨＩを用いてｐＰＡ−ペプチド内にクローン化してｐＰＡ−プロＨＮＰ１を作った。やはり、対称制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてこのＤＮＡフラグメントの方向を確認した。ｐＰＡ−ペプチドからの融合タンパク質の産生と精製プラスミドｐＰＡ−ＣＥＭＥを大腸菌ＤＨ５α内に形質転換した。しかしながら、この株内で発現を試みたところ、この異種タンパク質がタンパク質分解で分解することが明らかになった。従って、このプラスミドを、エレクトロポレーションを用いて制限修飾突然変異株である黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０（カーン (S.Kahn)氏から譲り受けたもの）に移した。細胞を１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地中でＯＤ₆₀₀＝１．０まで増殖させ、その時点でそれらを採取した。培養上澄み液をＮａＯＨでｐＨ７．６に調節して、ＴＳＴ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭＮａＣｌ＋０．０５％ツィーン２０）緩衝液で予め平衡にしたＩｇＧセファロースカラム（ファルマシア）に通した。カラムを１０倍容量のＴＳＴと５倍容量の１５ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ５．０）で続けて洗浄した。最後に、タンパク質を０．５ＭＨＡｃ（ｐＨ３．４）で溶出させて直接凍結乾燥し、非常に純粋な試料を得た。本発明者らは、ＨＮＰ−１の合成遺伝子（プレプロカートリッジを有するもの及び有しないもの）が、この系で殆どタンパク質分解を伴わずにうまく発現できることも示した。融合タンパク質の開裂及びＣＥＭＥの精製ＩｇＧセファロースカラムで単離された凍結乾燥異種タンパク質を１ＭＣＮＢｒを含有する７０％ギ酸中に再懸濁して、反応を２５℃で暗所で１８時間進めた。サンプルを５％ギ酸まで希釈することによって反応を止め、それを凍結乾燥した。このサンプルを０．１％トリフルオロ酢酸中に再懸濁して、ＰｒｏＲＰＣＦＰＬＣカラム（ファルマシア）に充填し、そして０〜４０％勾配のアセトニトリル＋Ｔ０．１ＴＦＡで溶出した。３０〜３５％の間に溶出したＣＥＭＥペプチドから部分的に精製されたサンプルが得られた。ＣＥＭＥの抗菌活性部分精製ＣＥＭＥタンパク質のサンプルを１５％酸性尿素ゲルで電気泳動した。このゲルは、電荷と大きさに基づいて分離するものである（パニーム(Panyim) とカルキイ(Chalkey)，Arch．Biochem．Biophys.，130:337，1969）。この緩衝液のｐＨは酸性（＝ｐＨ５．０）であり、極性はタンパク質が陽極に移動するように逆にしてある。従って、小さなカチオン性ペプチドは、比較的速くこのゲルを移動するので容易に同定することができる。抗菌活性は、以前に記載されたようにして試験した（ハルトマーク(Hultmark)，Eur．J．Biochem.，106:7，1980 ）。このゲルをミュラー・ヒントン肉汁＋０．２ＭＮａＰＯ₄ （ｐＨ７．４）中で１時間インキュベートした。それを０．６％アガー及び＝１０⁵大腸菌株ＤＣ２を含有する５ｍｌの同じ培地で覆い、次いで再度０．６％アガーだけを含有する５ｍｌの同じ培地で覆った。この覆ったゲルを３７℃で一晩インキュベートすると、メリチン（正のコントロール）とこの研究で産生したＣＥＭＥの移動部位に対応する透明帯ができた。メリチンは、その抗菌活性及び大きさとＰＩ値の類似性の故に正のコントロールとして用いたものである。ＣＥＭＥの抗菌活性を死滅アッセイをも用いて定量した。このアッセイでは、このペプチドを１０⁶細胞／ｍｌの緑膿菌と２０〜６０分間インキュベートしてから、これら細胞を生育可能性についてプレートした（図４）。その結果から、２．５μｇ／ｍｌ（０．９μＭ）のＣＥＭＥが緑膿菌の生育可能数を２０分間で対数表示で３だけ低下させたことが分かった。ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ及びメリチンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を幾つかの異なる細菌について測定した（表２）。簡単に説明すると、細胞をＬＢ−Ｓ（如何なる塩も補充していないルリア肉汁）中で３７℃で一晩増殖させ、同じ培地で１０，０００分の１に希釈して約１０⁴〜１０⁵ＣＦＵ／ｍｌの濃度にした。これら肉汁希釈液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに、開始濃度の抗生物質又は化合物を含有する２００μｌのＬＢ−Ｓを第１列に入れ、１００μｌの同じ培地を第２〜１２列に入れた。第１列から１００μｌの肉汁を取ってそれを第２列と混合して２分の１に希釈することによってこれら化合物を希釈した。これを第１０列まで続けた。最後に１０μｌの細菌を第１〜１１列にピペッティングして、このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日にこのプレートをウェル中での増殖について評価してＭＩＣを出した。一般に、ＣＥＭＥとＣＥＭＡは類似のＭＩＣ値を有したが、メリチンよりも一貫して低かった。これらペプチドのＭＩＣは、通常はポリミキシンＢ、ゲンタマイシン（アミノグリコシドの１種）及びセフタジダイム(ceftazi dime)（β−ラクタムの１種）のものよりも高かった。両抗生物質感受性株（Ｈ１８８及びＤＣ２）は、それらの親株と比較して、これらカチオン性ペプチドに対して２〜４倍感受性であった。驚いたことに、ポリミキシンＢ、セフタジダイムに高い耐性を示し、ゲンタマイシンにはより低い程度の耐性を示した突然変異株ＳＣ９２５２は、これらカチオン性ペプチドには耐性がなかった。Ｓ．タイフィムリウム・デフェンシン感受性株（Ｃ５９０）も、ＣＥＭＥ、ＣＥＭＡ及びポリミキシンＢに対して４倍感受性であり、ゲンタマイシン及びメリチンに対して２倍感受性であった。β−ラクタムであるセフタジダイムのＭＩＣがこの株では変わらなかったという事実は、おそらくその外膜の表面上での初期抗生物質接触部位の変化によるものであろうが、その突然変異が自己促進取り込み経路に影響を与えていることを示唆した。これらカチオン性ペプチドは、Ｅ．クロアカエ臨床単離株（２１８Ｓ）及びそのβ−ラクタム耐性突然変異株（２１８Ｒ１，ペニシリナーゼ過剰産生株）に対しても等しく活性であった。これらペプチドのＭＩＣ値は、黄色ブドウ球菌について僅かにより高いだけであったが、それらの分子量がずっと高いので、モル基準では実際のところそれらは殆どの化合物よりも活性である。二価のカチオンは、隣接するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）分子を架橋することによってグラム陰性菌の外膜を安定化することが分かっているので、それらはＬＰＳと相互作用する化合物のＭＩＣ値を高めることができる。このＭＩＣアッセイを５ｍＭＭｇ⁺⁺及び８０ｍＭＮａ⁺の存在下で繰り返して、この効果がこれらカチオン性ペプチドに当てはまるか否かを確認した（表３）。その結果から、３つ全てのペプチドの抗菌活性は、Ｍｇ⁺⁺の存在により劇的に阻害され、そしてＮａ⁺によりほんの僅かだけ阻害されることが分かった。これらデータは、カチオン性ペプチドの抗菌メカニズムにおける初期段階は、ＬＰＳ分子上の負に荷電した部位との結合であるという説と一致する。ＭＩＣに満たないレベルのカチオン性ペプチドの存在下で、普通に用いられる幾つかの抗生物質についてＭＩＣ値を測定することによって、共働的に作用するカチオン性ペプチドの能力を調べた（表４）。概して、これらペプチドは、ポーリン(porins)を介して吸収されると提案されている抗生物質（セフタジダイム、イミペネム(imipenem)及びテトラサイクリン）のＭＩＣに殆ど効果を持たなかったが、１／２ＭＩＣレベルのＣＥＭＡは、それらのＭＩＣを２倍低下させた。これはＣＥＭＡの高い膜透過活性のためであり得る（以下を参照のこと）。しかしながら、これらペプチドはポリミキシンＢのＭＩＣを下げなかったが、おそらくそれら全てが同じ経路によって吸収されるので、お互いの取り込みを助けるためであろう。興味深いのは、弱い膜透過活性しか持たないメリチンがポリミキシンＢのＭＩＣに対して有している影響である。これは、ポリミキシンＢが膜を破壊して、あべこべにメリチンがその標的部位に接近できるようになることを示唆している。これのＭＩＣがＣＥＭＥ及びＣＥＭＡの存在下のものよりも低いという事実は、メリチンがその標的部位において他の２つのペプチドよりも大いに活性であり、かつその抗菌活性の律速段階がその外膜を通り抜ける段階であることを示唆しているといえる。実施例３ｐＥＺＺ−ペプチドプラスミドの構築ペプチドＣＥＭＥ及びＣＥＭＡの合成遺伝子を別々にプラスミドｐＥＺＺ１８（ファルマシア）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII部位内にクローン化した（図１Ｃ）。これにより指向性挿入が起こるようにした。ｌａｃ大腸菌株内でのＩＰＴＧ −ＸＧａｌ培地での増殖による青色／白色選択(blue/white selection)を用いてクローンを選択した。適切なクローンをプラスミドＤＮＡの制限分析によって同定し、次いで大腸菌株ＨＢ１０１内に形質転換した。この株は、ファルマシアにより推奨されたもので、外部培地内への融合タンパク質の放出を可能にすることが以前に示されている（レーベンアドラーら，Gene，58:87，1987）。これらクローンを保持する細胞を対数増殖期まで増殖して採取した。全細胞溶解産物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そしてタンパク質をニトロセルロースに移した。これらペプチドに特異的な抗血清を用いて、これら融合タンパク質を同定した。ｐＯｐｒＦ−ペプチドプラスミドの構築ここでは、ｐＰＡ−ＣＥＭＥの構築に用いたＳａｌＩフラグメントを用いた。ｐＯｐｒＦＤＮＡ（図１Ｄ）を単離しＳａｌＩで消化して線状フラグメントを作り、その中にＣＥＭＥカセットを連結した。このＣＥＭＥＤＮＡが正しい方向であることをチェックするために、非対称制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてクローンをＤＮＡレベルで分析した。次いで、タンパク質レベルで分析を行った。細胞を１ＭＩＰＴＧを含有する選択培地で増殖させた。全細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、ウェスタンブロッティングに付した。用いた抗血清は、(a)ＣＥＭＥに特異的なポリクローナル血清、及び(b)ＯｐｒＦのモノクローナル抗体であった。結果は、両エピトープが同一分子上に発現されたことを示した。実施例４膜透過活性ポリカチオン性化合物による膜透過を２種の異なるアッセイで測定した。第１アッセイでは、周縁質に達して細胞溶解を起こすライソザイムの能力による膜破壊を測定した。このアッセイは、それが共通な現象であることを証明するために２種の異なる微生物について行った。種々の化合物による膜透過を原因とする全細胞内へのライソザイムの取り込みは、以前にハンコックら，Antimicrobial Ag ents and Chemo.，19:777，1981に記載された。ＬＢ−Ｓ中で増殖させた緑膿菌Ｈ３０９又はＥ．クロアカエ２１８Ｒ１の一晩培養物を新鮮な培地で５０分の１に希釈して、ＯＤ₆₀₀＝０．５〜０．６まで増殖させた。それら細胞をサイレンサ−Ｈ−１０３Ｎ臨床用遠心分離器内に採取して１８００ｇで１０分間遠心分離し、１倍容量のアッセイ用緩衝液（５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２），５ｍＭＫＣＮ）で１回洗浄し、そして同じ緩衝液中に０．５のＯＤ₆₀₀に再懸濁した。分析物は、５０μｇ／ｍｌのニワトリ卵白ライソザイム及び種々の濃度のカチオン性化合物を含む６００μｌの細胞からなるものであった。パーキン−エルマー二光線分光光度計でのＯＤ₆₀₀の低下量として細胞溶解量を測定した。ライソザイムなしで行った並行実験により、これら化合物自体の溶菌活性を測定することができた。ライソザイムの透過性が二価カチオンによって阻害されるか否かを試験するために、ライソザイムの添加後であって試験化合物の添加前に、種々の濃度のＭｇＣｌ₂を分析物に添加した。その結果から、ＣＥＭＡはＣＥＭＥと同じく、低濃度でもポリミキシンＢより強力なライソザイムのための透過剤であることが分かった（図５及び６）。ペプチドの濃度を増加すると、ライソザイムが存在しなくても、特にＣＥＭＥ及びメリチンで細胞溶解が起こった（緑膿菌データのみ）。このことを考慮すると、メリチンは、ゲンタマイシンよりも５〜１０倍良好であるとはいえ、他のペプチドと比較して良好な透過剤であるように思われなかった。第２アッセイでは、小さな蛍光プローブである１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）それ自体を膜内に挿入する能力により膜透過性を測定した。通常は、殆どのＮＰＮは外膜に侵入することができないが、膜透過剤の存在下では疎水性膜の中に入って蛍光を増す（図７及び８）。このＮ−フェニルナフチルアミン取り込みアッセイは、以前にロー(Loh)らにより AntimicrobialAgents and Chem o.，26:546，1984に記載された。ライソザイム溶菌アッセイと同じようにして、正確に細胞を調製した。１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）をアセトン中に５００μＭの濃度に溶解した。ＮＰＮの蛍光は、パーキン−エルマー６５０−１０Ｓ蛍光分光光度計でそれぞれ３５０ｎｍ及び４２０ｎｍに設定した励起及び発光波長を用いて５ｎｍのスリット幅で測定した。１ｍｌの細胞中に、２０ μｌのＮＰＮ（最終濃度１０μＭ）及び１０μｌの０．６４ｍｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（最終濃度６．４μｇ／ｍｌ）を添加し、生成する蛍光を９０％偏向（９０任意単位）を読み取るように調節することによって分析物を標準化した。１ｍｌの細胞及び１０μＭＮＰＮを含有するキュベットに種々の化合物を異なる濃度で１０μｌ添加することによって試験した。透過活性を（総蛍光）−（ＮＰＮ単独による蛍光）とした。蛍光測定後、それら細胞のＯＤ₆₀₀を測定して有意な細胞溶解が起こっていなかったことを確かめた。コントロール実験で、アセトン及び試験化合物のいずれもＮＰＮの不存在下では単独で蛍光を増加しないことが示された。これら実験で、ポリミキシンＢ及びＣＥＭＡが、ＮＰＮに対して膜を開くことに等しく活性であることが分かったが、ＣＥＭＥとメリチンは（緑膿菌について）あまり活性ではなかった。要するに、これらカチオン性ペプチドが外膜の強力な透過剤であることが分かった。このことは、それらの抗菌活性メカニズムに疑いなく寄与している。実施例５カチオン性ペプチドのＬＰＳとの相互作用二価カチオンの存在下でのＭＩＣアッセイは、カチオン性ペプチドが、ＬＰＳ上の負に荷電した部位に結合することを示唆した。このことを更に定量的に証明するために、精製した緑膿菌ＬＰＳを用いて、ダンシルポリミキシン（ＤＰｘ）排除アッセイを行った。ＤＰｘは、ＬＰＳと結合したときは強く蛍光を発するが、溶液中でフリーのときは弱くしか発しないポリミキシンの誘導体である。このアッセイでは、ＤＰｘをＬＰＳとインキュベートして結合部位を飽和させ、そしてその反応液中にポリカチオン性化合物を滴定しながら、ＤＰｘの追い出しを蛍光の減少により追跡した（図９）。緑膿菌ＬＰＳは、以前に記載された（ダービュー(Darveau)ら，J．of Bacteriol ogy，155:831，1983）通りに単離したものであり、ダンシルポリミキシンは、シンドラー(Schindler)ら，B．Antimicrobial Agents and Chemo.，8:95,1975に記載された通りに合成した。簡単に説明すると、４０ｍｇのポリミキシンＢ及び１０ｍｇの塩化ダンシルを、２ｍｌの６０ｍＭＮａＣＯ₃と４０％アセトン中で混合して、暗所で９０分間インキュベートした。未反応塩化ダンシルをセファデックスＧ−５０カラムでのゲル濾過によってダンシルポリミキシンと分離した。ダンシルポリミキシンを含有する画分を１／２倍容量のｎ−ブタノールで抽出してから、デシケーター中で３７℃で濃縮乾固した。このダンシルポリミキシンを５ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）中に再懸濁し、ジニトロフェニル化により定量し、そして−２０℃で分割保存した。モーア(Moore)らの方法(Antimicrobial Agents and Chemo．，29:496，1987）を用いてＬＰＳ上の結合部位を飽和するのにどれ位のＤＰｘが必要であるかを試験した。簡単に説明すると、１００μＭＤＰｘの５μｌサンプルを、最大蛍光に達するまで１ｍｌの３μｇ／ｍｌのＬＰＳ中に連続的に滴定した。蛍光は、パーキン−エルマー６５０−１０Ｓ蛍光分光光度計で３４０ｎｍの励起波長と４８５ｎｍの発光波長とで５ｎｍのスリット幅を用いて測定した。９０〜１００％最大蛍光を与えるＤＰｘの最終濃度（２．５μＭ）を選んで、その後の全ての実験に用いた。結合阻害アッセイ（モーアら，Antimicrobial Agents and Chemo. ，29:496，1987）には、２．５μＭＤＰｘを、５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）中のＨ１０３ＬＰＳ３μｇ／ｍｌに添加した。試験化合物をある時点で５ μｌ添加して、ＬＰＳからのＤＰｘの追い出しによる蛍光の減少を記録した。化合物の添加は、蛍光の減少が小さくなるまで（＜５％）続けた。データを１−｛（最大蛍光−試験蛍光）／最大蛍光｝ｖｓ化合物濃度（ｌ）としてプロットした。ＬＰＳ上の結合部位に対するこれら化合物の相対的親和性を決めるために二重逆数プロットを行い、１／（最大蛍光−試験蛍光）／最大蛍光ｖｓｌ／ｌをプロットした。計算したＸ切片は−１／ｌ₅₀に等しかった。ここで、ｌ₅₀はＬＰＳに結合したＤＰｘの５０％を追い出す化合物の濃度に等しい。全ての実験は最低で３回行った。精製ＬＰＳの代わりに全細胞を用いるＤＰｘ結合阻害アッセイ用に、Ｈ３０９細胞をライソザイム溶菌アッセイと同じようにして調製した。この分析物は、ＯＤ₆₀₀が０．５の１０μｌの細胞、９９０μｌの５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）及び５ｍＭＫＣＮ、並びに９０〜１００％結合飽和度を付与する濃度のＤＰｘからなるものであった。この濃度は日によって変動したが、通常、２．５μ Ｍと３．５μＭとの間であった。上記の通りに化合物を滴定し、そしてｌ₅₀値を測定した。これらデータで、これらカチオン性ペプチドは、ポリミキシンＢのものに匹敵するがゲンタマイシンのものより大いに高い濃度でＤＰｘを追い出すことが示された。これは、ＬＰＳに対する強い親和性を示すものである。これらデータを二重逆数プロットとしてプロットすると（図１０）、Ｘ切片から−１／ｌ₅₀に等しい値が得られた。ｌ₅₀は、ＬＰＳに対する化合物の親和性の指標であって５０％極大ＤＰｘ排除が起こる化合物の濃度に等しい（表５）。これらデータは、ＣＥＭＡがＬＰＳに対して（μＭ基準で）ポリミキシンＢよりも高い親和性を有し、ＣＥＭＥ及びメリチンは僅かに低い親和性を有することを示した。これら親和性が生物学的に関連しているか否かを確認するために、無傷緑膿菌細胞で実験を繰り返した（図１１及び１２）。これら実験からのｌ₅₀値（表５）は、３種全てのカチオン性ペプチドが全細胞からＤＰｘを追い出すのにポリミキシンＢよりも良好であることを示した。これは、ＣＥＭＡだけ（及び低濃度でＣＥＭＥ）がポリミキシンＢよりも良好な膜透過剤であることを示しているので興味深い。これらＬＰＳ結合親和性とそれに続く膜透過活性との間の差は、二価カチオンと競合するレベル又はこれらペプチドが一旦ＬＰＳと相互作用すると、コンフォメーションをとることを示すものであるといえる。配列表配列番号：１は表１のＡであってＣＥＭＥのプライマーである。配列番号：２は表１のＢであってＣＥＭＥのプライマーである。配列番号：３は表１のＣであってＨＮＰ−１のプライマーである。配列番号：４は表１のＤであってＨＮＰ−１のプライマーである。配列番号：５は表１のＥであってＨＮＰ−１のプライマーである。配列番号：６は表１のＦであってＨＮＰ−１のプライマーである。配列番号：７は表１のＧであってＨＮＰ−１のプライマーである。配列番号：８は表１のＨであってＨＮＰ−１のプライマーである。配列番号：９は表１のＩであってプレプロカートリッジのプライマーである。配列番号：１０は表１のＪであってプレプロカートリッジのプライマーである。配列番号：１１は表１のＫであってプレプロカートリッジのプライマーである。配列番号：１２は表１のＬであってプレプロカートリッジのプライマーである。配列番号：１３は表１のＭであってＨｉｎｄIIIからＳａｌＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：１４は表１のＮであって因子Ｘ認識部位及びＳｐｈＩからＳａｌＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：１５は表１のＯであって因子Ｘ認識部位及びＳｐｈＩからＳａｌＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：１６は表１のＰであってＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：１７は表１のＱであってメチオニン残基及びＳｐｈＩからＢａｍＨＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：１８は表１のＲであってメチオニン残基及びＳｐｈＩからＢａｍＨＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：１９は表１のＳであってＮｄｅＩからＢａｍＨＩまでのアダプターのプライマーである。配列番号：２０は表１のＴであって配列決定用プライマーである。配列番号：２１は表１のＵであって配列決定用プライマーである。配列番号：２２はＨＮＰ−１のアミノ酸配列である。配列番号：２３はＣＥＭＥのアミノ酸配列である。配列番号：２４はＣＥＭＡのアミノ酸配列である。配列番号：２５は表１のＶであってＣＥＭＡのプライマーである。配列番号：２６は表１のＷであってＣＥＭＡのプライマーである。配列表 (2)配列番号：１の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：104塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..104 (xi)配列；配列番号：１： (2)配列番号：２の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：112塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：3..112 (xi)配列；配列番号：２： (2)配列番号：３の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：81塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..81 (xi)配列；配列番号：３： (2)配列番号：４の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：55塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..55 (xi)配列；配列番号：４： (2)配列番号：５の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：65塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..65 (xi)配列；配列番号：５： (2)配列番号：６の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：64塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：3..64 (xi)配列；配列番号：６： (2)配列番号：７の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：50塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：3..50 (xi)配列；配列番号：７： (2)配列番号：８の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：76塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA (Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..76 (xi)配列；配列番号：８： (2)配列番号：９の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：110塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..110 (xi)配列；配列番号：９： (2)配列番号：10の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：91塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA (Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：3..91 (xi)配列；配列番号：10： (2)配列番号：11の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：109塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..109 (xi)配列；配列番号：11： (2)配列番号：12の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：92塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置： 1..92 (xi)配列；配列番号：12： (2)配列番号：13の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：12塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..12 (xi)配列；配列番号：13： (2)配列番号：14の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：24塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..24 (xi)配列；配列番号：14： (2)配列番号：15の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：24塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..24 (xi)配列；配列番号：15： (2)配列番号：16の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：12塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..12 (xi)配列；配列番号：16： (2)配列番号：17の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：15塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..15 (xi)配列；配列番号：17： (2)配列番号：18の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：15塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..15 (xi)配列；配列番号：18： (2)配列番号：19の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：12塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：2..12 (xi)配列；配列番号：19： (2)配列番号：20の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：23塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..23 (xi)配列；配列番号：20： (2)配列番号：21の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：20塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..20 (xi)配列；配列番号：21： (2)配列番号：22の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：タンパク質 (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：Protein （Ｂ）存在位置：1..30 (xi)配列；配列番号：22： (2)配列番号：23の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：26アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：タンパク質 (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：Protein （Ｂ）存在位置：1..26 (xi)配列；配列番号：23： (2)配列番号：24の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：28アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (vii)直接の起源：（Ｂ）クローン名：CEMA (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：Peptide （Ｂ）存在位置：1..28 (xi)配列；配列番号：24： (2)配列番号：25の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：27塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (vii)直接の起源：（Ｂ）クローン名：CEMA 変異株プライマー (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..27 (xi)配列；配列番号：25： (2)配列番号：26の情報： (i)配列の特性：（Ａ）配列の長さ：31塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：DNA(Genomic) (vii)直接の起源：（Ｂ）クローン名：CEMA 変異株プライマー (ix)配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1..31 (xi)配列；配列番号：26：現時点で好ましい態様に言及しながら本発明を説明してきたが、本発明の精神から逸れることなく多様な変更を行えることが理解されるべきである。従って、本発明は次の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (72)発明者ピアーズ，ケヴィンエル. カナダ国ブイ７イー３ビー２ブリティッシュコロンビア，リッチモンド, モンクトンストリート 5555番地 (72)発明者ブラウン，メリッサエイチ. カナダ国ブイ６ケイ１ワイ３ブリティッシュコロンビア，バンクーバーウエスト７ティーエイチアベニュー 202―2267番地【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．カチオン性ペプチド部分及びアニオン性ペプチド部分を有する融合ペプチドを製造する方法であって、ａ）興味の対象である該カチオン性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、発現ベクター内に該アニオン性キャリヤーペプチドをコードするＤＮＡ配列の隣に挿入し；ｂ）宿主細胞をａ）のベクターで形質転換し；そして該形質転換宿主細胞を培養し；ｃ）融合ペプチドを回収することを含む方法。２．融合ペプチドからアニオン性ペプチド部分を切り離すことを更に含む、請求項１の方法。３．カチオン性ペプチドが約５〜約５０アミノ酸である、請求項１の方法。４．カチオン性ペプチドが少なくとも４アミノ酸残基を含有し、それぞれがｐＨ７．０で正味正電荷を有する側鎖を有する、請求項３の方法。５．アニオン性キャリヤーペプチドが、プレプロペプチド又は外膜タンパク質ペプチドである、請求項１の方法。６．アニオン性キャリヤーペプチドが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ及び外膜プロテインＦからなる群から選ばれる、請求項１の方法。７．発現ベクターが、アニオン性キャリヤーペプチドをコードするＤＮＡ配列とカチオン性ペプチドをコードするＤＮＡ配列との間にスペーサーＤＮＡ配列を更に含有する、請求項１の方法。８．スペーサーＤＮＡ配列がタンパク質分解酵素認識部位をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項７の方法。９．タンパク質分解認識部位が因子Ｘａにより認識される、請求項８の方法。 10．スペーサーＤＮＡ配列が、メチオニン、トリプトファン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項７の方法。 11．発現ベクターが表現型選択マーカーＤＮＡ配列を含有する、請求項１の方法。 12．表現型選択マーカーが、ペニシリナーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる、請求項11の方法。 13．発現ベクターがシグナル配列を含有する、請求項１の方法。 14．形質転換がエレクトロポレーションによる、請求項１の方法。 15．宿主細胞が原核細胞である、請求項１の方法。 16．原核細胞が、大腸菌、黄色ブドウ球菌及び緑膿菌からなる群から選ばれる、請求項１５の方法。 17．融合ペプチドの発現が、誘導性又は構成的プロモーターにより行われる、請求項１の方法。 18．誘導性プロモーターがｌａｃＺ遺伝子のプロモーターである、請求項17の方法。 19．構成的プロモーターが、プロテインＡ遺伝子のプロモーター及びＯｐｒＦ遺伝子のプロモーターからなる群から選ばれる、請求項17の方法。 20．配列番号：２４を含む単離されたペプチド。 21．配列番号：２４のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。 22．細菌を阻害有効量の請求項２０のペプチドに接触させることを含む細菌の増殖を阻害する方法。 23．細菌がグラム陽性である、請求項22の方法。 24．細菌が黄色ブドウ球菌である、請求項23の方法。 25．細菌がグラム陰性である、請求項22の方法。 26．細菌が、大腸菌、緑膿菌、Ｓ．タイフィムリウム、及びＥ．クロアカエからなる群から選ばれる、請求項25の方法。 27．ペプチドが少なくとも１種の抗生物質と組み合わせて投与される、請求項22 の方法。