JPH08501628A

JPH08501628A - 免疫診断検査系およびその利用

Info

Publication number: JPH08501628A
Application number: JP6508173A
Authority: JP
Inventors: ブリッツギス，マリウス; ヒルガー，バーンド; シー．ディー．ヘングスト，ジェームズ; ウェブスター，デイヴィッド; バック，ハーヴェイ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムコーポレーション
Priority date: 1992-09-11
Filing date: 1993-09-09
Publication date: 1996-02-20
Anticipated expiration: 2016-02-13
Also published as: EP0660929A4; US5807752A; JP3135067B2; EP0660929A1; WO1994007136A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、診断アッセイを行なうのに有用な検査系に関する。この検査系の１構成成分は、目的の分析物に対する第１結合パートナーを浸透させた三次元構造を持つ検査担体である。第２の成分は、即時に可視的に検出可能な標識と結合した第２結合パートナーおよび阻止剤を含む結合試薬である。上記の検査系を利用することによって、迅速かつ正確なアッセイを行なうことができる。

Description

【発明の詳細な説明】免疫診断検査系およびその利用発明の分野本発明は免疫診断の分野に関する。より詳細には、特別の検査装置を用いた試料の分析による、一つまたは二つ以上の分析物、またはそうした分析物の性質の測定に関する。背景および先行技術数多くの方法において、分析物の測定に利用するために、免疫学の分野が取り入れられてきた。分析物またはその性質の測定のために免疫学の原理を応用することは、本文に記載される本発明にとって特に興味深い。臨床診断は、抗体が特異的な分子に結合するという、よく知られた抗体の能力を利用する。結果として得られる「プローブ」および「標的」の複合体（以下に説明する理由によりこの用語を使用する）は、多数の方法により測定される。診断法の一群をなす「均一系アッセイ」は溶液中で行なわれるが、本文に記載される本発明とは特に関係はない。不均一系アッセイの一群が関係を有する。不均一系アッセイにおいては、標的物質を同定および／または定量するために、なんらかの相の変化または相の分離が行なわれる。相の変化は、例えば固相に結合したプローブに標的分子を結合させることを包含することができる。ひとたびこうした結合が起これば、多くの場合第２の標的特異的標識プローブとの接触によって、固相に結合した複合体が同定される。プローブ上の標識は、酵素、蛍光分子、放射能標識などを包含する多数の選択枝から選択可能である。標識されたプローブが固相上で標的分子と結合する場合、標的と結合しないが固相には会合している標識プローブを除去することが通常行なわれる。一般に、これは固相を洗浄することによって行なわれる。この段階は、必要であるが時間がかかる。さらに、洗浄は幾分の不正確さをもたらすが、これは固相の洗浄が不十分であるか、十分すぎて標的に結合した物質を追い出してしまうかのいずれかに関係しているに違いない。いずれの場合も測定に不確かさをもたらし、コントロール実験を行なう必要がある。ある特定の標識がこの分野で広く用いられているが、それらに問題がないわけではない。例えば、放射能標識は、それが結合できるプローブ上のサイトを前提とする。そのようなサイトが存在しても、放射能標識は注意深く取り扱われなくてはならず、熟練した人員を必要とする。酵素はおそらく最も一般的な標識となっている。こうした標識を含むアッセイは、酵素基質の使用を必要とする。接触時に基質に作用し、検出可能なシグナルを生じる。一般に、そのシグナルは色または色の変化である。こうした方法は放射能標識よりも扱いが容易であるが、酵素と基質との反応は時間がかかる可能性がある。また、酵素は時間が過ぎると品質が低下し、酵素を使った検査系は在庫有効期間を限定している。蛍光色素や磁性極微粒子といった標識もさらに開発されているが、いずれも完全に満足できるものではないことが判明している。適当な検査系の開発は、アッセイを行う時間の長さ、必要な装置、試薬の安定性などを包含する、数多くの要点の考慮を要する。以前は、すべての免疫診断の中心となる反応は、標的とプローブとの反応とされた。「標的」は多数の基質のうちのいずれでもよいため、こうした用語が用いられる。ホルモン、サイトカイン、糖タンパク質などのような特異的な生化学的薬剤はすべて、細胞タイプ、ウイルス、抗体、細菌およびその他の物質がそうであったように、免疫診断によって測定されている。分析物という用語を以後使用するとき、それは免疫診断法によって測定されるべきあらゆる存在物を包含することを意図する。プローブ物質は、目的の分析物に結合する物質である。必ずしもすべてではないが多くの場合、このプローブは抗体であり、多クローン性または単クローン性である。また、このプローブは、Ｆａｂフラグメントのような、やはり分析物に結合する能力を有する抗体フラグメントであってもよい。分析物それ自体が抗体である場合、プローブも同様に抗体であってよいが、それは標的抗体と結合する分析物または分析物フラグメントであってもよい。便宜上、プローブを以後レセプターと称する。本文記載の本発明に包含されるアッセイの種類は、不均一系アッセイの中の一群であって、サンドイッチアッセイと称される。このようなタイプのアッセイは、少なくとも三つの構成員からなる固相結合複合体の形成に関する。三つの構成員のみが関わる場合には、分析物が中央にあって、固相に結合した捕捉レセプターおよび標識レセプターが両側面に位置する。上記を以後、第一および第二レセプターと称する。分析物を不均一系で定量するためにサンドイッチアッセイを応用することは新規ではない。こうしたアッセイの例は、例えばRi ngの米国特許第４，７２７，０３７号およびCampbellらの米国特許第４，０７３，０１７号に見られる。Ringの特許は、抗体のイソタイプを決定するための装置および方法を教示する（すなわち試料中の抗体の重鎖および軽鎖を確定する）。レセプター抗体を膜上に固定化し、試料と膜を混合してインキュベートする。洗浄後、酵素標識抗体を添加し、続いて酵素基質を添加する。アッセイを実施するのに要する時間は２時間より少ない。Campbellの特許は、やはりドットブロット法を用いる同様の検査系を教示する。リポソーム標識レセプターを用いるが、ここにおいてリポソームはローダミンのような色素を含む。免疫診断アッセイの実施に際して、当業者は本来のアッセイを行なう前に阻止剤を使用するのが通例である。阻止剤を用いて検査担体を処理することによって、分析物特異的な試薬を含まない試験紙部分を「遮断」し、それによって目的の分析物との非特異的結合を防止する。阻止剤およびその利用は、例えば欧州特許出願第２９１１９４号および第２９９４２８号に記載される。いずれの場合も、アッセイを実施する前に、試験紙を阻止剤溶液に軽く浸し、次に、すすぎ、乾燥させる。この段階はアッセイに最低３０分を追加する。米国特許第４，７２７，０３７号において、阻止段階は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液との一晩のインキュベーションを要する。米国特許第４，７０３，０１７号も、やはりＢＳＡを使用して、阻止のために３０分から１時間を要する。阻止段階は、追加の段階および試薬のみならず多大な時間をアッセイに追加する。検査アッセイを実施するのに要する時間を徹底的に短縮するために、検査担体を阻止剤とプレインキュベートする必要性を不要にする検査系を利用可能にすることが望ましい。しかしながら、得られた検査系はやはり正確な結果を与えなければならない。発明者らは、驚くべきことに、阻止段階がかつては必要であったがこれを取り除くことができることを発見した。その結果、アッセイは５分ほどの短時間に完了することができる。発明の要約本発明は、二つの分析物特異的な結合パートナーを利用する検査系を作成することが可能であり、ここにおいて阻止剤を第二の結合パートナーと混合することができ、時間のかかる別々の段階において使用するのではなく結合パートナーと共同して使用することができるという、驚くべき発見に基づく。結果として、本発明のアッセイは５分ほどの短時間で実行可能であり、別の阻止段階は不要である。以下の詳細な説明は本発明の有効性を示す。図面の簡単な説明第１図は、本発明の典型的なイソタイプ測定試験紙の表面および裏面を示す。第２図は、本発明のイソタイプ測定試験紙が上端からどの様に現れるかを示す。第３図は、本発明で作成された試験紙表面の走査顕微鏡写真である。望ましい実施態様の詳細な説明本発明は、試料中の一つまたは二つ以上の分析物を測定するために有用な検査系に関する。この方法は、少なくとも二つの要素を含む。第１の要素は担体であって、これは多孔質であり、そのなかに必要な数の、測定すべき一つまたは二つ以上の分析物に特異的なレセプターまたは結合パートナーを含んでいる。一つまたは二つ以上のパートナーは、第１図の横線のように、多孔質検査担体上に一定の空間配列で配置される。この検査系の第２の要素は、阻止剤と結合した、測定すべき分析物のための標識レセプターまたは結合パートナーである。標識レセプターは、即時に可視的に検出可能な標識によって標識されており、検査担体上の分析物と結合するが、それによって直接測定可能なシグナルを用いて結合部位を指示する。本文で用いられる「即時に可視的に検出可能な」および「直接検出可能な」の意味は、反応が行なわれた直後に肉眼で結合を検出でき、他の反応段階、洗浄、または装置を必要としないことである。したがって、標識は、金コロイド溶液のような目で見て検出できる大きさの金属粒子、または色のついたラテックス粒子であってよく、後者が特異的に望ましい。ラテックス粒子は０．１μｍから０．４μｍの平均直径を有することが望ましく、約０．２μｍの平均直径が特に望ましい。これは、酵素、蛍光分子、可視化するために媒染する必要のある指示薬、または即時に肉眼で検出可能ではない物質を包含しない。特に望ましい実施態様において、検査系は、抗体のイソタイプの決定に使用できるものである。また、この系は、酵素のイソタイプや他のタンパク質のイソタイプのような抗体ではないタンパク質のイソタイプを区別するためにも使用可能である。こうした分子の例には、クレアチンキナーゼおよびアルカリホスファターゼ酵素群（これらはいずれも様々なイソ型を有することが知られている）、およびトロポニンＴのようなタンパク質のイソ型を包含する。後者のタンパク質のイソ型を決定することの重要性は、例えば、Katusら、Clin．Chem．38(3)：386-393(1992)に認められる。本発明の多孔質検査担体は、試験紙製造に有用な当業者に公知の材料のいずれからも作成することができる。有用な材料の例としては、ニトロセルロース紙またはセルロース誘導体、ナイロン膜などがある。吸収性のある紙の孔径は、どこでも平均で直径で約１μｍから１２μｍまでであることが望ましく、特に５μｍが望ましい。孔径の望ましい範囲は３μｍ−１０μｍである。特に望ましい実施態様において、多孔質の二つの細片を合わせて表裏をなすように結合させるが、この細片はそれぞれ適当な免疫反応物質を含む。これらの材質は二つの面を持つ試験紙を作成するために当業者に公知のなんらかの手段にて結合され、積層薄片が特に望ましい。検査担体は一端に導入手段を載せ、もう一端には排液手段または「排液だめ」を有することが、必須ではないが望ましい。前者は、捕捉レセプターを含む担体の部分に液体を引き込む作用をする。後者は、装置を通過した液体を排出させる作用をし、それによって装置の自然のクロマトグラフィー的性質を促進する。免疫反応物質を担体に取り込むための、なんらかの公知の手段によって、捕捉レセプターを装置に浸透させる。特に望ましい実施態様において、検査担体の材質は、捕捉レセプターが担体に約０．０５μｇ／ｃｍ²から約０．１μｇ／ｃｍ²の濃度で浸透するように選択される。ここで用いる「浸透」とは、検査担体の三次元構造の全体にわたって結合パートナーを配置することを指す。Campbellらの米国特許第４，７０３，０１７号のような先行技術の系では、標識試薬は担体の上部および下部表面に濃縮されているが、担体の実際の内部マトリクスには浸透していないため、上記の点は重要である。したがって、先行技術の装置は、本発明の三次元担体よりむしろ二次元担体として、より良く説明される。上記のような低濃度であっても、本発明の検査担体は十分以上に機能する。検査担体の第２の部分、標識レセプターは、当業者に公知の即時に検出可能ななんらかの標識と結合した、上記の様々な反応物質のいずれであってもよい。捕捉および標識レセプターはいずれも、抗体、抗原、プロテインＡ、（ストレプト）アビジンまたはそれらのなんらかの反応性部分であってよい。抗体が望ましいが、最も望ましいのはポリクローン性抗体である。標識レセプターはそれぞれ異なっていてもよいが、単一の種類の標識レセプターのみを用いてもよい。第２結合パートナーまたはレセプターは阻止剤と結合している。上記のように、レセプター／結合パートナーと検査担体との誤った結合を避けることが阻止剤の働きである。こうした阻止剤はいつも第２のレセプターを添加する前に添加されたので、本発明のこの特徴が先行技術に対して顕著な対照をなす。使用される阻止剤は当業者に公知のいかなるものであってもよく、例えばポリエチレングリコールまたはウシ血清アルブミンがあるが、前者が特に望ましい。本発明にしたがって実行されるアッセイは、先行技術よりはるかに短い時間内に実施される。阻止段階の省略がこの理由であり、５分に満たない短時間に正確な読みを保証することができる。以下の限定的ではない実施例にみられるように、本発明の検査系は、免疫診断アッセイを実施するのに比類なく適している。実施例１微多孔性ニトロセルロース膜（Schleicher & Schull，AE-98）の細片を不活性な裏板に重ねることによって、一連の多孔質検査担体を調製した。セルロース紙とのポリエステル混紡から成る導入部分およびクロマトグラフィーセルロース紙（31-ET；Whatman Specialty Products）から成る貯水部分を細片に取り付けた。重鎖および軽鎖特異性を有する特異的ヤギ抗マウス抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＭ、カッパ’、ラムダ）の試料を、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ３−［Ｎ−モルフォリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（”ＭＯＰＳＯ”）、ｐＨ７．２に平衡化する。次に、微多孔性担体上にこの試料を、総量約１２５−２５０ｎｇ、１．２６ｕｌ／ｃｍの割合で、線状に分配する。四つの分析物特異的抗体および一つのコントロール、合わせて五つの線を細片の各々の側に塗布した。次に、細片を室温で１５分間風乾した特異的な重鎖または軽鎖に対する標識された第２の抗体、および阻止剤を結合させることによって結合試薬を調製した。第２抗体は、カルボキシル基を導入した平均粒径２２０ｎｍのブルーラテックスビーズに共有結合させた。阻止剤は１％ポリエチレングリコール２０，０００を含むバッファー溶液であった。阻止剤および標識された第２の抗体を結合し、凍結乾燥した。この実施例に関しては、リン酸緩衝塩類溶液に希釈された公知の重鎖および軽鎖からなるマウス単クローン性抗体である試料に、この試薬を再溶解した。１５０μｌの試料アリコートを、各々の場合において、凍結乾燥結合試薬を含む１０×７５ｍｍ試験管に添加した。この混合物を、クロマトグラフィー的に細片を上昇させると、５分経たないうちに、強い線が観察された。いずれの場合も、染色パターンは正しい重鎖または軽鎖が同定されたことを示した。実施例２唯一の相違点として、腹水を１：１０，０００−１：５０，０００の範囲でＰＢＳで希釈した以外は、実施例１に記載されたのと同様の方法で、マウス腹水試料をアッセイし、１５０μｌの混合物を試験管に添加した。最前のようにに、５分未満で正確な結果が保証された。実施例３マウス培養上清を実施例１および２の試料と同様の方法で検査した。１：５０ −１：１００の範囲で上清をＰＢＳで希釈し、そのほかの全段階は上記の通りである。やはり、５分未満で正確な結果が得られた。実施例４精製マウス抗体を、ＰＢＳで０．０１−１／μｇ／ｍｌの範囲で希釈し、上記のようにアッセイすることによって検査した。最前のように、５分未満ですべての結果が得られ、正確であった。実施例５検査担体の全体にわたる第１結合パートナーの分布を調べた。これを行なうために、実施例１に記載の方法で作成された担体を電子顕微鏡にかけた。この研究は、担体が直径約１μｍから約１０μｍの範囲の孔を有することを明らかにした。ラテックス粒子が上部および下部表面だけでなく担体全体にわたって分布することが観察された。したがって、ラテックス粒子が三次元構造に浸透していると言うことができる。担体におけるオープンスペースの総量を決定するために計算を行なった。これは約２４％であることが明らかになった。さらに計算によれば、結合パートナーは三次元構造の全体にわたって約０．０５μｇ／ｃｍ²から０．１０μｇ／ｃｍ² の範囲で分布していたことが示される。本発明は、複数の分析物の中のある分析物を測定するための独創的で有用な検査系を開示することがわかるだろう。広範な実施態様において、この検査系は二つの構成成分を含んでなる。第１は検査担体であって、これは多孔性である必要があり、さらにこの担体は目的の分析物に結合する第１のパートナーをその中に浸透させて含む。この第１結合パートナーは、一定のあらかじめ決められた配置で担体上に配置される。これは線、円、ドットまたはいかなる形でもよいが、それによって検査が終了したときに、当業者は即時に結果を検出することができる。上記のように、様々なセルロースおよびニトロセルロース紙および膜が検査担体として適しているが、これらは上記の範囲の孔径を有する。この検査系の第２の成分は、結合試薬である。この成分は、即時に可視的に検出可能な標識と結合した第２結合パートナーを、阻止剤とともに含む。この複合体は、必須ではないが、凍結乾燥することができる。溶液、粉末、錠剤などはすべて結合試薬の製剤として可能である。結合パートナーは目的の分析物に結合するいかなる物質であってもよく、抗体および抗体フラグメントが特に望ましい。本発明の検査系は、上記のように、特定の分析物を同定するために使用することができ、また、抗体のタイピングのように、分析物の属クラスの異なった型またはタイプを同定するために用いることもできる。検査系が単一の分析物を測定するために用意される場合には、当然、装置に浸透させた第１結合パートナーは一種類だけを必要とし、結合試薬中の第２結合パートナーも一種類だけが必要である。分析物の様々なタイプや型を区別する場合には、この数が増える。例えば、一般的な抗体イソタイプ測定試験紙には、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ、およびＩｇＧのすベての型（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）に対するすべての結合パートナー、ならびにカッパおよびラムダ軽鎖の両者に対する結合パートナーも存在する。しかしながら、通常、こうした完全な測定は必要でなく、例えばＩｇＤおよびＩｇＥ特異的結合パートナーを便宜的に試験紙から削除することができる。抗体イソタイプの区別のほかに、クレアチンキナーゼのような酵素を包含する様々なタンパク質のイソ型を本発明の検査系を用いてアッセイすることができる。抗体イソタイプ試験紙作成について説明された方法を常法により改変することによって、上記を達成することができる。さらに労力を必要とせず、当業者は容易に上述の明細書を応用して、必要とする検査系を作成することができる。そうであるから、例えば心臓の機能および異常の研究において、それに伴うタンパク質を測定することで、本発明の検査系を利用することができる。こうしたタンパク質の例は、例えばトロポニンＴのようなトロポニンのイソ型を包含する。明細書および実施例は、本発明を説明するが限定するものではなく、本発明の趣旨および範囲に含まれる他の実施態様が当業者に示唆されると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月２２日【補正内容】いずれの場合も測定に不確かさをもたらし、コントロール実験を行なう必要がある。ある特定の標識がこの分野で広く用いられているが、それらに問題がないわけではない。例えば、放射能標識は、それが結合できるプローブ上のサイトを前提とする。そのようなサイトが存在しても、放射能標識は注意深く取り扱われなくてはならず、熟練した人員を必要とする。酵素はおそらく最も一般的な標識となっている。こうした標識を含むアッセイは、酵素基質の使用を必要とする。接触時に基質に作用し、検出可能なシグナルを生じる。一般に、そのシグナルは色または色の変化である。こうした方法は放射能標識よりも扱いが容易であるが、酵素と基質との反応は時間がかかる可能性がある。また、酵素は時間が過ぎると品質が低下し、酵素を使った検査系は在庫有効期間を限定している。蛍光色素や磁性極微粒子といった標識もさらに開発されているが、いずれも完全に満足できるものではないことが判明している。適当な検査系の開発は、アッセイを行う時間の長さ、必要な装置、試薬の安定性などを包含する、数多くの要点の考慮を要する。以前は、すべての免疫診断の中心となる反応は、標的とプローブとの反応とされた。「標的」は多数の基質のうちのいずれでもよいため、こうした用語が用いられる。ホルモン、サイトカイン、糖タンパク質などのような特異的な生物材料はすべて、細胞型、ウイルス、抗体、細菌およびその他の物質がそうであったように、免疫診断によって測定されている。分析物という用語を以後使用するとき、それは免疫診断法によって測定されるべきあらゆる存在物を包含することを意図する。プローブ物質は、目的の分析物に結合する物質である。必ずしもすべてではないが多くの場合、このプローブは抗体であり、多クローン性または単クローン性である。また、このプローブは、Ｆａｂフラグメントのような、やはり分析物に結合する能力を有する抗体フラグメントであってもよい。分析物それ自体が抗体である場合、プローブも同様に抗体であってよいが、それは標的抗体と結合する分析物または分析物フラグメントであってもよい。便宜上、プローブを以後レセプターと称する。本文記載の本発明に包含されるアッセイの種類は、不均一系アッセイの中の一群であって、サンドイッチアッセイと称される。このようなタイプのアッセイは、少なくとも三つの構成員からなる固相結合複合体の形成に関する。三つの構成員のみが関わる場合には、分析物が中央にあって、固相に結合した捕捉レセプターおよび標識レセプターが両側面に位置する。上記を以後、第一および第二レセプターと称する。分析物を不均一系で定量するためにサンドイッチアッセイを応用することは新規ではない。こうしたアッセイの例は、例えばRingの米国特許第４，７２７，０３７号およびCampbellらの米国特許第４，７０３，０１７号に見られる。Ringの特許は、抗体のイソタイプを決定するための装置および方法を教示する（すなわち試料中の抗体の重鎖および軽鎖を確定する）。レセプター抗体を膜上に固定化し、試料と膜を混合してインキュベートする。洗浄後、酵素標識抗体を添加し、続いて酵素基質を添加する。アッセイを実施するのに要する時間は２時間より少ない。Campbellの特許は、やはりドットブロット法を用いる同様の検査系を教示する。リポソーム標識レセプターを用いるが、ここにおいてリポソームはローダミンのような色素を含む。免疫診断アッセイの実施に際して、当業者は本来のアッセイを行なう前に阻止剤を使用するのが通例である。阻止剤を用いて検査担体を処理することによって、分析物特異的な試薬を含まない試験紙部分を「遮断」し、それによって目的の分析物との非特異的結合を防止する。阻止剤およびその利用は、例えば欧州特許出願第２９１１９４号および第２９９４２８号に記載される。いずれの場合も、アッセイを実施する前に、試験紙を阻止剤溶液に軽く浸し、次に、すすぎ、乾燥させる。この段階はアッセイに最低３０分を追加する。米国特許第４，７２７，０３７号において、阻止段階は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液との一晩のインキュベーションを要する。米国特許第４，７０３，０１７号も、やはりＢＳＡを使用して、阻止のために３０分から１時間を要する。阻止段階は、追加の段階および試薬のみならず多大な時間をアッセイに追加する。検査アッセイを実施するのに要する時間を徹底的に短縮するために、検査担体を阻止剤とプレインキュベートする必要性を不要にする検査系を利用可能にすることが望ましい。しかしながら、得られた検査系はやはり正確な結果を与えなければならない。発明者らは、驚くべきことに、阻止段階がかつては必要であったがこれを取り除くことができることを発見した。その結果、アッセイは５分ほどの短時間に完了することができる。発明の要約本発明は、二つの分析物特異的な結合パートナーを利用する検査系を作成することが可能であり、ここにおいて阻止剤を第二の結合パートナーと混合することができ、時間のかかる別々の段階において使用するのではなく結合パートナーと共同して使用することができるという、驚くべき発見に基づく。結果として、本発明のアッセイは５分ほどの短時間で実行可能であり、別の阻止段階は不要である。以下の詳細な説明は本発明の有効性を示す。図面の簡単な説明第１図は、本発明の典型的なイソタイプ測定試験紙の表面および裏面を示す。第２図は、本発明のイソタイプ測定試験紙が上端からどの様に現れるかを示す。第３図は、本発明で作成された試験紙表面の走査顕微鏡写真である。望ましい実施態様の詳細な説明本発明は、試料中の一つまたは二つ以上の分析物を測定するために有用な検査系に関する。この方法は、少なくとも二つの要素を含む。第１の要素は担体であって、これは多孔質であり、そのなかに必要な数の、測定すべき一つまたは二つ以上の分析物に特異的なレセプターまたは結合パートナーを含んでいる。一つまたは二つ以上のパートナーは、第１図の横線のように、多孔質検査担体上に一定の空間配列で配置される。この検査系の第２の要素は、阻止剤と結合した、測定すべき分析物のための標識レセプターまたは結合パートナーである。標識レセプターは、即時に可視的に検出可能な標識によって標識されており、検査担体上の分析物と結合するが、それによって直接測定可能なシグナルを用いて結合部位を指示する。本文で用いられる「即時に可視的に検出可能な」および「直接検出可能な」の意味は、反応が行なわれた直後に肉眼で結合を検出でき、他の反応段階、洗浄、または装置を必要としないことである。したがって、標識は、金コロイド溶液のような目で見て検出できる大きさの金属粒子、または色のついたラテックス粒子であってよく、後者が特に望ましい。ラテックス粒子は０．１μｍから０．４μ ｍの平均直径を有することが望ましく、約０．２μｍの平均直径が特に望ましい。「即時に可視的に検出可能な」および「直接検出可能な」は、酵素、蛍光分子、可視化するために媒染する必要のある指示薬、または即時に肉眼で検出可能ではない物質を包含しない。特に望ましい実施態様において、検査系は、抗体のイソタイプの決定に使用できるものである。また、この系は、酵素のイソタイプや他のタンパク質のイソタイプのような抗体ではないタンパク質のイソタイプを区別するためにも使用可能である。こうした分子の例には、クレアチンキナーゼおよびアルカリホスファターゼ酵素群（これらはいずれも様々なイソ型を有することが知られている）、およびトロポニンＴのようなタンパク質のイソ型を包含する。後者のタンパク質のイソ型を決定することの重要性は、例えば、Katusら、Clin．Chem．38(3)：386- 393(1992)に認められる。本発明の多孔質検査担体は、試験紙製造に有用な当業者に公知の材料のいずれからも作成することができる。有用な材料の例としては、ニトロセルロース紙またはセルロース誘導体、ナイロン膜などがある。吸収性のある紙の孔径は、どこでも平均で直径で約１μｍから１２μｍまでであることが望ましく、特に５μｍが望ましい。孔径の望ましい範囲は３μｍ−１０μｍである。特に望ましい実施態様において、多孔質の二つの細片を合わせて表裏をなすように結合させるが、この細片はそれぞれ適当な免疫反応物質を含む。これらの材質は二つの面を持つ試験紙を作成するために当業者に公知のなんらかの手段にて結合され、積層薄片が特に望ましい。検査担体は一端に導入手段を載せ、もう一端には排液手段または「排液だめ」を有することが、必須ではないが望ましい。前者は、捕捉レセプターを含む担体の部分に液体を引き込む作用をする。後者は、装置を通過した液体を排出させる作用をし、それによって装置の自然のクロマトグラフィー的性質を促進する。免疫反応物質を担体に取り込むための、なんらかの公知の手段によって、捕捉レセプターを装置に浸透させる。特に望ましい実施態様において、検査担体の材質は、捕捉レセプターが担体に約０．０５μｇ／ｃｍ²から約０．１μｇ／ｃｍ² の濃度で浸透するように選択される。ここで用いる「浸透」とは、検査担体の三次元構造の全体にわたって結合パートナーを配置することを指す。Campbellらの米国特許第４，７０３，０１７号のような先行技術の系では、標識試薬は担体の上部および下部表面に濃縮されているが、担体の実際の内部マトリクスには浸透していないため、上記の点は重要である。したがって、先行技術の装置は、本発明の三次元担体よりむしろ二次元担体として、より良く説明される。上記のような低濃度であっても、本発明の検査担体は十分以上に機能する。検査担体の第２の部分、標識レセプターは、当業者に公知の即時に検出可能ななんらかの標識と結合した、上記の様々な反応物質のいずれであってもよい。捕捉および標識レセプターはいずれも、抗体、抗原、プロテインＡ、（ストレプト）アビジンまたはそれらのなんらかの反応性部分であってよい。抗体が望ましいが、最も望ましいのはポリクローン性抗体である。標識レセプターはそれぞれ異なっていてもよいが、単一の種類の標識レセプターのみを用いてもよい。第２結合パートナーまたはレセプターは阻止剤と結合している。上記のように、レセプター／結合パートナーと検査担体との誤った結合を避けることが阻止剤の働きである。こうした阻止剤はいつも第２のレセプターを添加する前に添加されたので、本発明のこの特徴が先行技術に対して顕著な対照をなす。使用される阻止剤は当業者に公知のいかなるものであってもよく、例えばポリエチレングリコールまたはウシ血清アルブミンがあるが、前者が特に望ましい。本発明にしたがって実行されるアッセイは、先行技術よりはるかに短い時間内に実施される。阻止段階の省略がこの理由であり、５分に満たない短時間に正確な読みを保証することができる。以下の限定的ではない実施例にみられるように、本発明の検査系は、免疫診断アッセイを実施するのに比類なく適している。実施例１微多孔性ニトロセルロース膜（Schleicher & Schull，AE-98）の細片を不活性な裏板に重ねることによって、一連の多孔質検査担体を調製した。セルロース紙とのポリエステル混紡から成る導入部分およびクロマトグラフィーセルロース紙（31-ET；Whatman Specialty Products）から成る貯水部分を細片に取り付けた。重鎖および軽鎖特異性を有する特異的ヤギ抗マウス抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＭ、カッパ’、ラムダ）の試料を、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ３−［Ｎ−モルフォリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（”ＭＯＰＳＯ”）、ｐＨ７．２に平衡化する。次に、微多孔性担体上にこの試料を、総量約１２５−２５０ｎｇ、１．２６ｕｌ／ｃｍの割合で、線状に分配する。四つの分析物特異的抗体および一つのコントロール、合わせて五つの線を細片の各々の側に塗布した。次に、細片を室温で１５分間風乾した特異的な重鎖または軽鎖に対する標識された第２の抗体、および阻止剤を結合させることによって結合試薬を調製した。第２抗体は、カルボキシル基を導入した平均粒径２２０ｎｍのブルーラテックスビーズに共有結合させた。阻止剤は１％ポリエチレングリコール２０，０００を含むバッファー溶液であった。阻止剤および標識された第２の抗体を結合し、凍結乾燥した。この実施例に関しては、リン酸緩衝塩類溶液に希釈された公知の重鎖および軽鎖からなるマウス単クローン性抗体である試料に、この試薬を再溶解した。１５０μｌの試料アリコートを、各々の場合において、凍結乾燥結合試薬を含む１０×７５ｍｍ試験管に添加した。この混合物を、クロマトグラフィー的に細片を上昇させると、５分経たないうちに、強い線が観察された。いずれの場合も、染色パターンは正しい重鎖または軽鎖が同定されたことを示した。実施例２唯一の相違点として、腹水を１：１０，０００−１：５０，０００の範囲でＰＢＳで希釈した以外は、実施例１に記載されたのと同様の方法で、マウス腹水試料をアッセイし、１５０μｌの混合物を試験管に添加した。最前のようにに、５分未満で正確な結果が保証された。実施例３マウス培養上清を実施例１および２の試料と同様の方法で検査した。１：５０ −１：１００の範囲で上清をＰＢＳで希釈し、そのほかの全段階は上記の通りである。やはり、５分未満で正確な結果が得られた。実施例４精製マウス抗体を、ＰＢＳで０．０１−１／μｇ／ｍｌの範囲で希釈し、上記のようにアッセイすることによって検査した。最前のように、５分未満ですべての結果が得られ、正確であった。実施例５検査担体の全体にわたる第１結合パートナーの分布を調べた。これを行なうために、実施例１に記載の方法で作成された担体を電子顕微鏡（electron microsc opy）にかけた。この研究は、担体が直径約１μｍから約１０μｍの範囲の孔を有することを明らかにした。ラテックス粒子が上部および下部表面だけでなく担体全体にわたって分布することが観察された。したがって、ラテックス粒子が三次元構造に浸透していると言うことができる。担体におけるオープンスペースの総量を決定するために計算を行なった。これは約２４％であることが明らかになった。さらに計算によれば、結合パートナーは三次元構造の全体にわたって約０．０５μｇ／ｃｍ²から０．１０μｇ／ｃｍ² の範囲で分布していたことが示される。本発明は、分析物または複数の分析物を測定するための独創的で有用な検査系を開示することがわかるだろう。広範な実施態様において、この検査系は二つの構成成分を含んでなる。第１は検査担体であって、これは多孔性である必要があり、さらにこの担体は目的の分析物に結合する第１のパートナーをその中に浸透させて含む。この第１結合パートナーは、一定のあらかじめ決められた配置で担体上に配置される。これは線、円、ドットまたはいかなる形でもよいが、それによって検査が終了したときに、当業者は即時に結果を検出することができる。上記のように、様々なセルロースおよびニトロセルロース紙および膜が検査担体として適しているが、これらは上記の範囲の孔径を有する。この検査系の第２の成分は、結合試薬である。この成分は、即時に可視的に検出可能な標識と結合した第２結合パートナーを、阻止剤とともに含む。この複合体は、必須ではないが、凍結乾燥することができる。溶液、粉末、錠剤などはすべて結合試薬の製剤として可能である。結合パートナーは目的の分析物に結合するいかなる物質であってもよく、抗体および抗体フラグメントが特に望ましい。本発明の検査系は、上記のように、特定の分析物を同定するために使用することができ、また、抗体のタイピングのように、分析物の属クラスの異なった型またはタイプを同定するために用いることもできる。検査系が単一の分析物を測定するために用意される場合には、当然、装置に浸透させた第１結合パートナーは一種類だけを必要とし、結合試薬中の第２結合パートナーも一種類だけが必要である。分析物の様々なタイプや型を区別する場合には、この数が増える。例えば、一般的な抗体イソタイプ測定試験紙には、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ、およびＩｇＧのすベての型（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）に対するすべての結合パートナー、ならびにカッパおよびラムダ軽鎖の両者に対する結合パートナーも存在する。しかしながら、通常、こうした完全な測定は必要でなく、例えばＩｇＤおよびＩｇＥ特異的結合パートナーを便宜的に試験紙から削除することができる。抗体イソタイプの区別のほかに、クレアチンキナーゼのような酵素を包含する様々なタンパク質のイソ型を本発明の検査系を用いてアッセイすることができる。抗体イソタイプ試験紙作成について説明された方法を常法により改変することによって、上記を達成することができる。さらに労力を必要とせず、当業者は容易に上述の明細書を応用して、必要とする検査系を作成することができる。そうであるから、例えば心臓の機能および異常の研究において、それに伴うタンパク質を測定することで、本発明の検査系を利用することができる。こうしたタンパク質の例は、例えばトロポニンＴのようなトロポニンのイソ型を包含する。明細書および実施例は、本発明を説明するが限定するものではなく、本発明の趣旨および範囲に含まれる他の実施態様が当業者に示唆されると理解される。請求の範囲１．（ａ）分析物に特異的な第１結合パートナーを一定の空間配置で浸透させ、三次元構造を有し、阻害剤で処理していない多孔質検査担体、ならびに；（ｂ）（ｉ）上記分析物と結合し、かつ即時に可視的に検出可能な十分なサイズを有する物質と結合した第２結合パートナー、および（ｉｉ）阻止剤の組み合わせを含む結合試薬とを含む分析物の測定に有用な検査系。２．多孔質検査担体が一つのニトロセルロース膜を含む、請求項１記載の検査系。３．多孔質検査担体は、その各々が特異的な分析物に特異的に結合する複数の異なる第１結合パートナーをその中に取り込んでおり、結合試薬は、その各々が異なる即時に可視的に検出可能な物質と結合し、分析物と特異的に結合する複数の異なる第２結合パートナーを含む、請求項１記載の検査系。４．即時に可視的に検出可能な物質が着色粒子である、請求項１記載の検査系。５．着色粒子がラテックス粒子である、請求項４記載の検査系。６．第２結合パートナーが抗体である、請求項１記載の検査系。７．第１結合パートナーが抗体である、請求項１記載の検査系。８．即時に検出可能な物質が金属粒子である、請求項１記載の検査系。９．金属粒子が金粒子である、請求項８記載の検査系。１０．結合試薬が溶液状態である、請求項１記載の検査系。１１．結合試薬が凍結乾燥品の状態である、請求項１記載の検査系。１２．第１結合パートナーが抗体、または分析物特異的抗体フラグメントである、請求項１記載の検査系。１３．第２結合パートナーが抗体、または分析物特異的抗体フラグメントである、請求項１記載の検査系。１４．多孔質担体が約１μｍから約１２μｍの平均直径を有する孔を含む、請求項１記載の検査系。１５．孔が約３μｍから約１０μｍの平均直径を有する、請求項１４記載の検査系。１６．孔が約５μｍの平均直径を有する、請求項１５記載の検査系。１７．第１結合パートナーが、担体の三次元構造の表面積当り、約０．０５μｇ／ｃｍ²から約０．１０μｇ／ｃｍ²の密度で多孔質検査担体に浸透している、請求項１記載の検査系。１８．複数の異なる第１結合パートナーが少なくとも二つの異なる抗体重鎖特異的結合パートナーを含む、請求項３記載の検査系。１９．少なくとも一つの軽鎖特異的結合パートナーをさらに含む、請求項１８記載の検査系。２０．複数の異なる第１結合パートナーが、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧおよびＩｇＭ特異的結合パートナーを含む、請求項１８記載の検査系。２１．複数の異なる第１結合パートナーが、さらにカッパ鎖およびラムダ鎖特異的結合パートナーを含む、請求項２０記載の検査系。２２．多孔質検査担体が表側と裏側を有し、各々の側に少なくとも一つの第１結合パートナーを浸透させた、請求項３記載の検査系。２３．複数の異なる第１結合パートナーの各々が、異なるタンパク質イソ型に特異的に結合する、請求項３記載の検査系。２４．タンパク質イソ型が酵素イソ型である、請求項２３記載の検査系。２５．タンパク質イソ型が心臓の異常に特徴的なイソ型である、請求項２３記載の検査系。２６．酵素イソ型がクレアチンキナーゼイソ型である、請求項２４記載の検査系。２７．第１結合パートナーがトロポニンのイソ型と特異的に結合する、請求項１記載の検査系。２８．トロポニンがトロポニンＴである、請求項２７記載の検査系。２９．阻止剤がポリエチレングリコールである、請求項１記載の検査系。３０．（ａ）分析物を含む試料を、（ｉ）当該分析物と結合し、かつ即時に可視的に検出可能な物質と結合した第２結合パートナー、および（ｉｉ）阻止剤の組み合わせを含む結合試薬に結合させて混合物を形成させること、（ｂ）三次元構造を有し、当該分析物に特異的な第１結合パートナーを一定の空間配置で浸透させた多孔質検査担体に上記混合物を接触させること（ここで当該多孔質検査担体は、当該接触前に阻害剤で処理していない）、および（ｃ）当該分析物の測定として、上記多孔質検査担体上の上記の即時に可視的に検出可能な物質を測定することを含む分析物を測定する方法。３１．即時に可視的に検出可能な物質が着色粒子である、請求項３０記載の方法。３２．着色粒子がラテックス粒子である、請求項３１記載の方法。３３．第１および第２結合パートナーのうち少なくとも一つが抗体である、請求項３０記載の方法。３４．第２結合パートナーが凍結乾燥品の状態である請求項３０記載の方法。３５．多孔質担体が約１μｍから約１２μｍの平均直径を有する孔を含む、請求項３０記載の方法。３６．孔が約３μｍから約１０μｍまでの平均直径を有する、請求項３５記載の方法。３７．第１結合パートナーが、三次元構造の表面積当り、約０．０５μｇ／ｃｍ² から約０．１０μｇ／ｃｍ²までの密度で多孔質検査担体に浸透している、請求項３０記載の方法。３８．着色粒子が約０．１μｍから約０．４μｍの直径を有する、請求項３１記載の方法。３９．着色粒子が約０．２μｍの平均直径を有する、請求項３８記載の方法。４０．多孔質検査担体が、表側と裏側を有し、各々の側に少なくとも一つの結合パートナーを浸透させた、請求項３０記載の方法。４１．分析物がタンパク質であって、そのタンパク質が試料中に存在することが心臓の異常を示す、請求項３０記載の方法。４２．タンパク質がトロポニンのイソ型である、請求項４１記載の方法。４３．イソ型がトロポニンＴである、請求項４２記載の方法。４４．試料および結合試薬を混合してから５分またはそれより短い時間で分析物を測定することを含む、請求項３０記載の方法

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヒルガー，バーンドアメリカ合衆国 46250 インディアナ州インディアナポリス，ヘイグロード 9115番地 (72)発明者ヘングスト，ジェームズシー．ディー. アメリカ合衆国 46250 インディアナ州インディアナポリス，ヘイグロード 9115番地 (72)発明者ウェブスター，デイヴィッドアメリカ合衆国 46250 インディアナ州インディアナポリス，ヘイグロード 9115番地 (72)発明者バック，ハーヴェイアメリカ合衆国 46250 インディアナ州インディアナポリス，ヘイグロード 9115番地

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）分析物に特異的な第１結合パートナーを一定の空間配置で浸透させた、三次元構造を有する多孔質検査担体、ならびに；（ｂ）（ｉ）上記分析物と結合し、かつ即時に可視的に検出可能な物質と結合した第２結合パートナー、および（ｉｉ）阻止剤の組み合わせを含む結合試薬とを含む分析物の測定に有用な検査系。２．多孔質検査担体がニトロセルロース膜を含む、請求項１記載の検査系。３．多孔質検査担体は、その各々が特異的な分析物に特異的に結合する複数の第１結合パートナーをその中に取り込んでおり、結合試薬は、その各々が即時に可視的に検出可能な物質と結合し、分析物と特異的に結合する複数の第２結合パートナーを含む、請求項１記載の検査系。４．即時に可視的に検出可能な物質が着色粒子である、請求項１記載の検査系。５．着色粒子がラテックス粒子である、請求項４記載の検査系。６．第２結合パートナーが抗体である、請求項１記載の検査系。７．第１結合パートナーが抗体である、請求項１記載の検査系。８．即時に検出可能な物質が金属粒子である、請求項１記載の検査系。９．金属粒子が金粒子である、請求項８記載の検査系。１０．結合試薬が溶液状態である、請求項１記載の検査系。１１．結合試薬が凍結乾燥品の状態である、請求項１記載の検査系。１２．第１結合パートナーが抗体、または分析物特異的抗体フラグメントである、請求項１記載の検査系。１３．第２結合パートナーが抗体、または分析物特異的抗体フラグメントである、請求項１記載の検査系。１４．多孔質担体が約１μｍから約１２μｍの平均直径を有する孔を含む、請求項１記載の検査系。１５．孔が約３μｍから約１０μｍの平均直径を有する、請求項１４記載の検査系。１６．孔が約５μｍの平均直径を有する、請求項１５記載の検査系。１７．第１結合パートナーが、担体の三次元構造の表面積当り、約０．０５μｇ／ｃｍ²から約０．１０μｇ／ｃｍ²の密度で多孔質検査担体に浸透している、請求項１記載の検査系。１８．複数の第１結合パートナーが少なくとも二つの抗体重鎖特異的結合パートナーを含む、請求項３記載の検査系。１９．少なくとも一つの軽鎖特異的結合パートナーをさらに含む、請求項１８記載の検査系。２０．複数の第１結合パートナーが、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧおよびＩｇＭ特異的結合パートナーを含む、請求項１８記載の検査系。２１．複数の第１結合パートナーが、さらにカッパ鎖およびラムダ鎖特異的結合パートナーを含む、請求項２０記載の検査系。２２．多孔質検査担体が表側と裏側を有し、各々の側に少なくとも一つの第１結合パートナーを浸透させた、請求項３記載の検査系。２３．複数の第１結合パートナーの各々が、タンパク質イソ型に特異的に結合する、請求項３記載の検査系。２４．タンパク質が酵素である、請求項２３記載の検査系。２５．タンパク質イソ型が心臓の異常に特徴的なイソ型である、請求項２３記載の検査系。２６．酵素がクレアチンキナーゼである、請求項２４記載の検査系。２７．第１結合パートナーがトロポニンのイソ型と特異的に結合する、請求項１記載の検査系。２８．トロポニンがトロポニンＴである、請求項２７記載の検査系。２９．阻止剤がポリエチレングリコールである、請求項１記載の検査系。３０．（ａ）分析物を含む試料を、（ｉ）当該分析物と結合し、かつ即時に可視的に検出可能な物質と結合した第２結合パートナー、および（ｉｉ）阻止剤の組み合わせを含む結合試薬に結合させて混合物を形成させること、（ｂ）三次元構造を有し、当該分析物に特異的な第１結合パートナーを一定の空間配置で浸透させた多孔質検査担体に上記混合物を接触させること、そして（ｃ）当該分析物の測定として、上記多孔質検査担体上の上記の即時に可視的に検出可能な物質を測定することを含む分析物を測定する方法。３１．即時に可視的に検出可能な物質が着色粒子である、請求項３０記載の方法。３２．着色粒子がラテックス粒子である、請求項３１記載の方法。３３．第１および第２結合パートナーのうち少なくとも一つが抗体である、請求項３０記載の方法。３４．結合パートナーが凍結乾燥品の状態である請求項３０記載の方法。３５．多孔質担体が約１μｍから約１２μｍの平均直径を有する孔を含む、請求項３０記載の方法。３６．孔が約３μｍから約１０μｍまでの平均直径を有する、請求項３５記載の方法。３７．第１結合パートナーが、三次元構造の表面積当り、約０．０５μｇ／ｃｍ² から約０．１０μｇ／ｃｍ²までの密度で多孔質検査担体に浸透している、請求項３０記載の方法。３８．着色粒子が約０．１μｍから約０．４μｍの直径を有する、請求項３１記載の方法。３９．着色粒子が約０．２μｍの平均直径を有する、請求項３８記載の方法。４０．多孔質検査担体が、表側と裏側を有し、各々の側に少なくとも一つの結合パートナーを浸透させた、請求項３０記載の方法。４１．分析物がタンパク質であって、そのタンパク質が試料中に存在することが心臓の異常を示す、請求項３０記載の方法。４２．タンパク質がトロポニンのイソ型である、請求項４１記載の方法。４３．イソ型がトロポニンＴである、請求項４２記載の方法。４４．試料および結合試薬を混合してから５分またはそれより短い時間で分析物を測定することを含む、請求項３０記載の方法。