JPH08502019A

JPH08502019A - サルモネラ菌抑制のためのプロバイオテック

Info

Publication number: JPH08502019A
Application number: JP5512652A
Authority: JP
Inventors: ジョンアールデローチ; ドナルドイーコリア; アーサージュニアヒントン
Original assignee: Government of the United States of America
Current assignee: Government of the United States of America
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-19
Publication date: 1996-03-05
Also published as: AU3472693A; WO1993013666A1; US5308615A; AU662601B2

Abstract

(57)【要約】家禽類のサルモネラ菌コロニー形成は、嫌気性バクテリアの特定の組成物（すなわちプロバイオテック）を用いて効果的に制御あるいは抑制できる。このプロバイオオテックは、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、および／または酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋な嫌気性バクテリアの第１の培養物を含む。炭水化物を発酵させて乳酸を生成するために有効な、少なくとも１種類の嫌気性バクテリアの第２の培養物もまた、上記第１の培養物に組み合わせて用いられる。第１の培養物に用いられる適切な有機体は、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属バクテリア、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属バクテリア、およびこれらの混合バクテリアを含む。これら第１および第２の培養物は、サルモネラ菌のコロニー形成を抑制するのに有効な分量だけ、家禽類被験体に投与される。実施例においては、上記プロバイオテックを従来の飼料に混合して新規の飼料を生成し、家禽類に経口的に摂取させてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】サルモネラ菌抑制のためのプロバイオテック発明の背景発明分野本発明は、家禽類、特に鶏におけるサルモネラ菌のコロニー形成抑制のための特定のプロバイオテックに関する。研究者や公共の保健機関の研究にもかかわらず、過去２０年にわたって人間のサルモネラ症の発病率は増加している。このようなサルモネラ菌の人体への感染症は、報告されている数だけで年間４万件を越えるが、伝染病センターは、米国での実際のサルモネラ感染症の発生率は年間２００万〜４００万件にも昇ると見ている。鶏肉などの動物性の食品は依然として、人間へのサルモネラ菌の主要な感染源である。従来の技術環境中の広範囲にわたるサルモネラ菌の存在を考えると、家禽類の食肉はサルモネラ菌から完全に保護されるとは思われない。それゆえ研究者たちは、サルモネラ菌にさらされた家禽類のコロニー形成に抗する、増強された抵抗手段の研究を継続してきた。このような研究では、ワクチンの評価や、正常な腸内寄生フローラの定着、サルモネラ菌の成長およびコロニー形成を抑制する食品添加物の発見などに焦点がおかれてきた。サルモネラ菌に対するホストの免疫の役割は明確ではなく、免疫反応の刺激が効果的にコロニー形成に対する抵抗を強化するかどうかも定かではない。また、試験的なワクチンが確実に効果的であるとは、まだ証明されていない。正常な腸内寄生ミクロフローラが、サルモネラ菌のコロニー形成に対する抵抗力を増加することは、十分に報告されている。若鳥に、成長した鶏の盲腸内容物または糞便から生成した、嫌気性バクテリア培養物のミクロフローラを経口接種すると、サルモネラ菌のコロニー形成が著しく低減されることも証明されている（Snoeyenbos et al.，Avian Dis.，23:904-913，(1979)，Schneitz et al.，Ac ta Pathol．Microbiol．Scand．Sect．B.，89:109-116，(1981)，and Stavric e t al.，J．Food Prot.，48:778-782，(1985)）。このような嫌気性バクテリアの培養物はプロバイオテックとして知られ、プロバイオテックとは、それを投与した動物に有益な効果をもたらすバクテリア培養物と定義される。これとは逆に、このような盲腸の嫌気菌で鶏のコロニー形成を防止する養鶏方法では、サルモネラ菌のコロニー形成に対する影響力を高めるという報告もある（Pivnick et al. ，J．Food Prot.，44:909-916，(1981)）。これらのプロバイオテックは、以下のようにして腸内でのサルモネラ菌のコロニー形成を低減することができる。すなわち、若鳥の腸管に、腸病原の成長を抑制する静菌性または殺菌性の揮発性短鎖脂肪酸を迅速にコロニー形成させる（Pivnick et al.，ibid）か、腸壁への付着部位を競合させる（Snoeyenbos et al.，ibid）か、あるいは生成する（Barne set al.，J．Hyg．Camb.，82:263-283，(1979) and Am．J．Clin．Nutr.，33:24 26-2433，(1980)，Corrier et al.，Avian Dis.，34:668-676，(1990) and Avia n Dis.，34:617-625，(1990)，and Hinton et al.，Avian Dis.，34:626-633，( 1990)）。しかしながら、数百種類の異なる微生物の混合集団を含む正常ミクロフローラの培養物のみがサルモネラ菌の成長を効果的に抑制することが証明され、ヨーロッパのいくつかの国では、サルモネラ菌のコロニー形成を抑制するために、微生物の混合培養物を用いて生後１日のひよこに正常な腸内フローラを定着させることが広く行われてきた。しかし、混合培養物の中には不特定の数および種類の微生物が存在するので、このシステムは合衆国では広く受け入れられなかった。この方法を広範囲に使用することの失点は、生成物の組成を規格化できず、したがって、組成と効果を一定に維持したまま大量に保存生成できない点にある。また、スタート物質は常に成長した家禽類の腸管内容物なので、病原性のウィルスやバクテリア、寄生体などを含み、鶏にとって有害となる可能性もある。さらに近年では、不特定の培養物はすべて米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認されねばならないことになった。養鶏用の飼料または水にラクトースやその他の乳糖が添加されるとサルモネラ菌のコロニー形成に対する抵抗が強化されることも最近報告された（Oyofo et a l.，Avian Dis.，33:531-534，(1989) and Poultry Sci.，68:1357-1360，(1989 )，Corrier et al.，ibid，and Hinton et al.，ibid．）。食用ラクトースは盲腸の内容物を活性化させ、正常腸内ミクロフローラの培養、発酵生成物に作用する。ラクトース添加飼料はまた、酢酸、プロピオン酸、酪酸など、正常腸内バクテリアによって生成される揮発性短鎖脂肪酸の細菌増殖抑制作用を増大させることによって、サルモネラ菌コロニー形成抵抗を強める（Corrier et al.，ibid， Hinton et al.，ibid）。また、食用ラクトースと、肉汁混合ラクトース中で培養された盲腸嫌気菌の培養物との混合物をひよこに与えることによっても、サルモネラ菌コロニー形成に対する抵抗力は増大される（Corrier et al.，ibid，Hinton et al.，ibid）。発明の概要本発明において、家禽類のサルモネラ菌のコロニー形成の制御または抑制に効果的な特定のプロバイオテック（または嫌気性バクテリアの組み合わせ）を発見した。このプロバイオテックは、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、および／または酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋な嫌気性バクテリアの第１の培養物を含む。炭水化物を発酵させて乳酸を生成するために有効な、少なくとも１種類の嫌気性バクテリアの第２の培養物も、上記第１の培養物に組み合わせて用いられる。第１の培養物で用いられる適切な有機体は、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属バクテリア、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属バクテリア、およびこれらの混合バクテリアを含む。これら第１および第２の培養物は、家禽類のサルモネラ菌のコロニー形成を抑制するのに効果的な分量だけ、家禽類被検体に投与される。実施例においては、上記プロバイオテックを従来の飼料に混合して新規の飼料を生成し、家禽類に経口的に摂取させてもよい。この発見にしたがって、本発明の目的は、家禽類におけるサルモネラ菌のコロニー形成を抑制するための改善された方法および組成物を提供することにある。本発明の別の目的は、家禽類のサルモネラ菌のコロニー形成を抑制するための、規格化が容易な、嫌気性バクテリアの特定の培養物を提供することにある。本発明のその他の目的および効果は、以下の実証的な記載から明白になるであろう。発明の詳細な説明本発明によれば、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、および／または酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋な嫌気性バクテリアの第１の培養物を含むプロバイオテックが提供される。この第１の培養物は、炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効な少なくとも１種類の嫌気性バクテリアの第２の培養物と組み合わせられる。このプロバイオテックは、家禽類に投与されると、サルモネラ菌のコロニー形成を抑制する効果を発揮する。本発明は、鶏、七面鳥、あひる、うずら、がちょうなどの食用飼鳥類を含む（が、これらに限定されない）あらゆる種類の家禽類に実施可能である。このプロバイオテックの第１の培養物に用いられる適切な有機体は、ヴェイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属バクテリア、メガスファーラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属バクテリア、およびこれらの混合バクテリアを含む。このようなバクテリアは、酢酸、プロピオン酸、および／または酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効である。用いられるバクテリアは、体内管から家禽類に入った公知のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ菌株やＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ菌株から得られるが、実施例では、成長した家禽類の糞便または盲腸の内容物から従来の方法で分離する。こうして得られたバクテリアは、その採集源に関係なく嫌気性の培養物によって増殖され、上述の揮発性有機酸の１種類または全種類を生成する能力に応じて選択される。このような有機酸生成能力に関しては、Hinton et al．（ J．Food Prot.，Vol．54，No．7．pages 496-501，(July 1991)，関連文献として記載）に記載される。特に、第１の培養物に使用される良好な嫌気性細菌は、ヴェイロネラパーヴェラ（Veillonella parvula）とメガスファーラエルスデニイ（Megasphaera elsdenii）である。プロバイオテックの第２の培養物は、炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効である。これら第２の培養物のバクテリアは、そのままの形態または混合した形態で用いてもよいが、実施例では、プロバイオテックの規格化を容易にするために十分に純粋な培養を用いる。第１の培養物と同様に、第２の培養物で用いられるバクテリアも、体内管から家禽類に入った公知の嫌気性バクテリアの細菌株から得られるが、好ましい実施例では、これらのバクテリアを成長した家禽類の糞便または盲腸の内容物から従来の方法で分離する。第２の培養物でも、バクテリアは嫌気性の培養物によって増殖され、Hinton et al．（1991 ibid）に記載されるように、炭水化物を発酵して乳酸を生成する能力に応じて選択される。第２の培養物に使用される良好なバクテリアは、ストレプトコッカス（Strept ococcus）属、エンターコッカス（Enterococcus）属、ラクトバシルス（Lactoba cillus）属であり、特に、ストレプトコッカスインターメディウム（Streptoc occus intermedius）、ストレプトコッカスモービリウム（Streptococcus mor billum）、エンターコッカスディランス（Enterococcus durans）、ラクトバシルスアシドフィウス（Lactobacillus acidophilus）が好ましいが、もちろんこれらだけに限定されるものではない。また、これらのバクテリアのうちの１種類だけがプロバイオテックの第２の培養物で使用されてもよいが、サルモネラ菌のコロニー形成の抑制を強化するために、上述の細菌株の少なくとも２、３種類、特に全種類を使用するのが好ましい。本発明のバクテリア細菌株の数種類または全種類が、Nurmi et al.の米国特許第４，６８９，２２６号（関連文献として記載）に開示される方法にしたがって、家禽類消化管の上皮細胞への付着能力に応じて任意に選択されてもよい。本発明のプロバイオテックは、従来の嫌気菌培養方法を用いて、適切な培養基中で第１および第２の培養物のバクテリアを培養することによって得られる。バクテリアを混合培養基中で培養してもよいが、規格化を容易にするために、好ましくは単独の培養基で培養する。混合前の各バクテリアの最終濃度は、１０⁸ 〜１０⁹ organisms/mlである。実施例では、第１の培養物に対する第２の培養物の比率が体積比で１：１〜１：１０^-8のとき、特に１：１０^-2のときにサルモネラ菌のコロニー形成の抑制が強化されることを発見した。しかしながら当業者にとっては、この体積比は使用する培養基、培養物の相対年数および生存力によって変化することは自明である。この培養の後、第１および第２の培養物を単独または混合して家禽類被検体に投与する。任意で、この培養物をラクトースやスキムミルク（脱脂乳）などの適切なキャリアと調整、または少量の飼料と混合して、プレミックスとして用いてもよい。また、保存や取扱いが容易となるようにフリーズドライ加工してもよい。このようなフリーズドライ培養物を、直接家禽類に投与してもよいし、投与前にもとに戻して使用してもよい。特に注記したいのは、バクテリアのうちの１種類または全種類、特に第１の培養物は、従来の方法でアルギン塩酸ゲルなど（これに限定されない）のカプセルに包んでもよい。理論に縛られたくはないが、このようなカプセル化によって第１の培養物内のバクテリアが上部腸管で乳酸濃度を好ましくないレベルに低減するのを防ぐと考えられる。また、バクテリアを保護し、第１の培養物による乳酸の使用が望まれる盲腸へ無事に到達させる役割を果たす。本発明のプロバイオテックを、既存の（または公知の）アジュバント（補助剤）と組み合わせて家禽類の治療や、特に腸病原菌の抑制に使用してもよい。適切なアジュバントとしては、モネンシンなどの、グラム陽性の有機物やラクトースに対して効力を示さないコクシジウム抑制剤がある。本発明のプロバイオテックが家禽類の飼料または水に混合されて口から摂取され、食管に導かれることを考えると、胃腸管に直接注入、または肛門から投与でき得る。後者の方法としては、プロバイオテックを直接家禽類の肛門にスプレーするか、養鶏舎の床わらに撒いて家禽類の通常の行動を通じて排泄部に接触させる。プロバイオテックは家禽類の排泄部に接触すると、逆蠕（ぜん）動によって排泄腔に入る。プロバイオテックの投与は家禽類の生存期間どの時期に行ってもよいが、生後１〜１４日のふ化したばかりのヒナに行うのが好ましい。プロバイオテックは、投与されない家禽類に比べてサルモネラ菌のコロニー形成が十分に抑制される分量が投与される。適切な量は熟練の養鶏者なら容易に決定することができ、動物の大きさによって異なる。以下の例は本発明をさらに詳しく説明するためのものであり、請求の範囲に定義される本発明の主題の範囲を限定するものではない。例１バクテリアの分離成長したブロイラーから盲腸の内容物を採集し、Hinton et al.(Avian Dis.， 34:626-633，(1990)、関連文献として記載）に開示されるように、−７０℃で保存する。解凍した盲腸内容物２ｍｌに、２００ｍｌの調整ＶｉａｎｄｅＬｅｖｕｒｅ（ＶＬ）肉汁を加える。肉汁の組成は、１０ｇ／ｌのトリプトース（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ミシガン州デトロイト）と、５ｇ／ｌのイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）と、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリップスバーグ）と、２．４ｇ／ｌのビーフエキス（Ｄｉｆｃｏ）と、０．４ｇ／ｌのＬシステイン塩酸塩（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ミズーリ州セントルイス）と、２．５ｇ／ｌのブドウ糖（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，オハイオ州クリーブランド）と、０．６ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ）である。調整ＶＬ寒天は、寒天濃度を１．２％まで高めることによって作られる。こうして植え付けを行った肉汁を１８〜２４時間、嫌気性チャンバー（ＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ，ミネソタ州アンアルバー）内で、３７℃で定温培養した。この肉汁の連続希釈液をＶＬ寒天上で培養し、再度嫌気的に３７℃で１８〜２４時間定温培養することによってバクテリアを分離した。分離したバクテリアを、強化クロストリジウム菌媒体（ＲＣＭ）（ＵｎｉｐａｔｈＣｏ．，Ｏｘｏｉｄ部、ニューヨーク州オグデンズバーグ）のチューブに植え付け、嫌気的に３７℃で１８〜２４時間定温培養した。培養物を１〜２週間の間隔で新鮮なＲＣＭに移し、定温培養し、嫌気性チャンバー内で室温で保存することによって保持した。乳酸生成バクテリア調整ＶＬ肉汁を入れた別のチューブに分離バクテリアを植え付けた。植え付けしたチューブを、嫌気的に３７℃で１８〜２４時間定温培養した。定温培養のあと、培養した媒体をＳｉｍａｄｚｕＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈＧＣ−９Ａ（ＳｈｉｍａｄｚｕＣｏｒｐ．，メリーランド州コロンビア）を用いて気体色層分析によって分析し、Hinton et al．（1990，ibid）の方法で生成した乳酸のレベルを検出した。最大濃度の乳酸を生成する２種類の分離菌を保持した。同様の方法で、乳酸を生成するその他の分離菌を再度取り出した。ただし、分離媒体はラクトースの代わりにグルコースを含む調整ＶＬ肉汁であり、媒体のｐＨを４．０に調節した。揮発性有機酸生成バクテリア乳酸を揮発性有機酸に転化できるバクテリアを選出するために、調整ＶＬ肉汁中のデクストロースを０．２５％Ｌ−乳酸とリチウム塩（Ｓｉｇｍａ）に変えて、乳酸ベースの媒体を用意した。この媒体のチューブに、上述の処理過程で得られた各分離菌を植え付け、チューブを嫌気的に３７℃で１８〜２４時間定温培養した。定温培養の後、これらの分離細菌の培養媒体をガスクロマトグラフィーで分析した。揮発性有機酸（酢酸およびプロビオン酸）を最も多量に生成した分離菌を確保した。乳酸生成および澱粉加水分解バクテリア乳酸の生成および澱粉の加水分解に有効な４番目のバクテリアを分離する。調整ＶＬ肉汁中で定温培養した盲腸内容物の連続希釈物を、調整ＶＬ寒天のデクストロースの代わりに０．３％の水溶性スターチ（Ｓｉｇｍａ）を用いて０．５％のＫ₂ ＨＰＯ₄ を添加した澱粉ベースの寒天に植え付けた。ＲＣＭチューブと新たな澱粉媒体のプレートに、定温培養プレートから取り出した組織的に異なる分離菌をそれぞれ植え付けた。このチューブとプレートを定温培養した後、プレートにグラムヨード溶液（Ｄｉｆｃｏ）を注いだ。ヨード液を満たしたプレートの寒天上のコロニー周辺のクリアリングゾーンを調べて、澱粉を加水分解した分離菌を選出し、１種類の澱粉加水分解バクテリアを分離した。このバクテリアを嫌気性チャンバー内で、１０ｇ／ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）と、１０ｇ／ｌのイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）と、５ｇ／ｌのＫ₂ ＨＰＯ₄ （Ｓｉｇｍａ）と、３ｇ／ｌの水溶性スターチ（Ｄｉｆｃｏ）とを含む澱粉媒体で培養し、保存した。さらに、この澱粉加水分解バクテリアを上記同様、乳酸生成能力を検出するために分析した。分離菌の識別すべての分離菌のグラム反応と酸素必要条件を検出し、さらに、ＢＢＬ Mini tek Numerical Identification System，Anaerobe II（Becton Dickinson Micro biology System，メリーランド州Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ）と、Microrings A N antibiotic discs（Medical Wire & Equiment Co.，ニュージャージー州ビクトリアガーデン）を用いて、すべての分離菌の識別を行った。バクテリアのその他の発酵生成物も、分離菌を０．１％グルコースを含むポリペプトンイーストエキス媒体で嫌気的に３７℃で４８時間定温培養した後、ガスクロマトグラフィーで分析することによって識別した（Association of Official Analytical Chemi st，1976，Bacteriological Analytical Manual,ワシントンＤＣ）。結果として、乳酸生成分離菌は、Entercococcus durans（細胞株ＣＡ２４０）と、Lactobacillus acidophilus（細胞株ＣＡ２５５）と、Streptococcus morbi llum （細胞株ＣＡ３３１）、澱粉加水分解乳酸生成分離菌は、Streptococcusin termedius （細胞株ＣＡ５０２）、揮発性有機酸生成分離菌は、Veillonellapar vula （細胞株ＣＡ１２６）であると識別された。例２Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（サルモネラタイフィムリウム）の盲腸でのコロニー形成の低減上述のようにして識別した乳酸生成分離菌Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｅ．ｄｕｒａｎｓ，Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ，Ｓ．ｍｏｒｂｉｌｌｕｍを、強化ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ寒天（Ｕｎｉｐａｔｈ）を含むペトリ皿で、嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ）内で３７℃で１８〜２４時間、培養した。揮発性有機酸生成分離菌Ｖ．ｐａｒｖｕｌａを、調整ＶＬ寒天を含み、１３ｇ／ｌのナトリウム乳酸（Ｓｉｇｍａ）を添加したペトリ皿で培養した。媒体のｐＨを、１．０Ｎの水酸化ナトリウムで７．２に調整し、この媒体をオートクレーブ（加圧減菌）処理した。この媒体でＶ．ｐａｒｖｕｌａを、嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ）内で３７度℃で４８時間培養した。０．８５％の塩化ナトリウム水溶液（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）と０．６％のＢａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、プレートからバクテリアを採取した。すなわち、４ｍｌの塩化ナトリウム水溶液をバクテリアの培養面に注ぎ、ガラス棒で寒天からバクテリアを掻きとった。Ｖ．ｐａｒｖｕｌａの懸濁液を、塩化ナトリウム寒天液で１００倍に薄めた。この希釈Ｖ．ｐａｒｖｕｌａ懸濁液と、希釈していないＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｅ．ｄｕｒａｎｓ，Ｓ．ｍｏｒｂｉｌｌｕｍ，Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓの懸濁液を同量ずつ含む混合液とを、嫌気性チャンバー内で表１に示される体積比で混合した。こうして混合したバクテリア懸濁液の一部に、２０％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ）の無菌溶液を混合した。バクテリア−スキンミルク混合液を凍結乾燥ボトルに移し、−７０℃で約１時間凍らせ、フリーズドライにした。フリーズドライの培養物１ｇを９９９ｇの養鶏飼料に加え、完全に混ぜ合わせた。７２羽のヒナを１２羽ずつ、表１に示されるように６つのグループに分け、第１日目に混合飼料を与えた。２日目に１０４Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを投与し、８日目にヒナを検査処分した。ヒナの盲腸内容物に含まれるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの濃度を、Ziprin et al．（Avian Diseases，34:749-753，(1 990)）（関連文献として記載）の方法で検出した。検出結果を表１に示す。例３Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの盲腸でのコロニー形成の低減例２の処理プロセスを、新たにふ化した別のヒナ集団に対しても行った。その結果を表２に示す。表１および２の結果から、どのプロバイオテック投与実験においてもヒナのサルモネラ菌コロニー形成の抑制が効果的であることがわかる。特に、第１の培養物に対する第２の培養物の比率が体積比で１：１０^-2であるプロバイオテックを用いた実験番号３では効力を発揮し、感染したヒナの数とＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの平均濃度を４ｌｏｇｓ（対数）以下に、著しく低減した。上記の詳細な説明は例として示されただけであり、本発明の原理と範囲から外れることなく多様な変形が可能であることに留意されたい。 ★各処理グループのＬＡＢとヴェイロネラ（Veillonella）との比率は、下記のとおりである。（１）コントロール（２）ＬＡＢとヴェイロネラとの比率（１：１）（３）ＬＡＢとヴェイロネラとの比率（１：１０^-2）（４）ＬＡＢとヴェイロネラとの比率（１：１０^-4）（５）ＬＡＢとヴェイロネラとの比率（１：１０^-6）（６）ＬＡＢとヴェイロネラとの比率（１：１０^-8）なお、上記ＬＡＢは、L．acidophilus，E．durans，S．morbillumとS.interme dius である。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年１２月１５日【補正内容】請求の範囲１．下記（ａ）、（ｂ）を含む、家禽類のサルモネラ菌コロニー形成を抑制するための組成物。（ａ）乳酸を発酵させて、酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なヴェイロネラの培養物（ｂ）炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効な少なくとも２種類の嫌気性バクテリア細菌株の培養物であって、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアの細菌株は、ストレプトコッカスインターメディウム、ストレプトコッカスモービリウム、エンターコッカスディランス、ラクトバシルスアシドフィウスの中から選択される、乳酸生成バクテリアの培養物２．請求項１に記載の組成物において、前記ヴェイロネラは、ヴェイロネラパーヴェラである、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。３．請求項１に記載の組成物において、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアのうち少なくとも３種類を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。４．請求項１に記載の組成物において、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアの全種類含む、サルモネラ閑コロニー形成抑制のための組成物。５．請求項４に記載の組成物において、前記乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアは、メガスファーラとヴェイロネラとの混合菌である、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。６．請求項１に記載の組成物において、さらにラクトースを含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。７．請求項１に記載の組成物において、さらにグラム陽性のバクテリアに対して不活性なコクジウム抑制薬を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。８．請求項１に記載の組成物において、さらにキャリアを含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。９．請求項１に記載の組成物において、前記ヴェイロネラはカプセルで包まれる、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１０．請求項１に記載の組成物において、乳酸を生成する嫌気性バクテリアの培養物と前記ヴェイロネラの培養物との比率は、１：１〜１：１０^-8の間である、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１１．請求項９に記載の組成物において、前記比率はおよそ１：１０^-2である、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１２．動物の飼料に請求項１に記載の組成物を組み合わせた飼料製品。１３．下記（ａ）、（ｂ）の物質を家禽類に投与して、家禽類のサルモネラ菌コロニー形成を抑制するための方法。（ａ）乳酸を発酵させて、酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なヴェイロネラの培養物（ｂ）炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効な少なくとも２種類の嫌気性バクテリア細菌株の培養物であって、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアの細菌株は、ストレプトコッカス、エンターコッカス、ラクトバシルスの中から選択される、家禽類の腸のサルモネラ菌コロニー形成を抑制するのに効果的な量の培養物１４．請求項１２に記載の方法において、前記家禽類は飼鳥類である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１５．請求項１３に記載の方法において、前記飼鳥類は、鶏、七面鳥、あひる、うずら、がちょうの中から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１６．請求項１４に記載の方法において、前記飼鳥類は、生後１４日以内のヒナである、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１７．請求項１２に記載の方法において、前記ヴェイロネラは、ヴェイロネラパーヴェラである、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１８．請求項１２に記載の方法において、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアは、ストレプトコッカスインターメディウム、ストレプトコッカスモービリウム、エンターコッカスディランス、ラクトバシルスアシドフィウスの中から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１９．請求項１７に記載の方法において、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアのうち少なくとも３種類を家禽類に投与する、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２０．請求項１７に記載の方法において、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアの全種類を家禽類に投与する、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２１．請求項２０に記載の方法において、前記乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成する嫌気性バクテリアは、メガスファーラとヴェイロネラとの混合菌である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２２．請求項１２に記載の方法において、さらに前記家禽類へのラクトースの投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２３．請求項１２に記載の方法において、さらに、グラム陽性のバクテリアに対して十分に活性ではないコクジウム抑制薬の投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２４．請求項１２に記載の方法において、前記培養物はキャリアと共に投与される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２５．請求項１２に記載の方法において、前記ヴェイロネラは、カプセルに包まれる、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２６．請求項１２に記載の方法において、乳酸を生成する嫌気性バクテリアの培養物と前記ヴェイロネラの培養物との比率は、１：１〜１：１０^-8の間である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２７．請求項２４に記載の方法において、前記比率は１：１０^-2である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２８．請求項１２に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、家禽類への経口的な投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２９．請求項２６に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、前記培養物を家禽類の飼料に混合した投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３０．請求項２６に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、前記培養物を家禽類の飲料水に混合した投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３１．請求項１２に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、前記家禽類の排泄部に前記培養物を接触させるステップを含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３２．請求項１に記載の組成物においてさらに、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なメガスファーラの培養物を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。３３．請求項３２に記載の組成物において、前記メガスファーラは、メガスファーラエルスデニイである、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。３４．請求項４に記載の組成物においてさらに、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なメガスファーラの培養物を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。３５．請求項３４に記載の組成物において、前記メガスファーラは、メガスファーラエルスデニイである、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。３６．請求項１３に記載の方法においてさらに、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なメガスファーラの培養物の投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３７．請求項３６に記載の方法において、前記メガスファーラは、メガスファーラエルスデニイである、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３８．請求項１３に記載の方法において、前記ヴェイロネラと、前記乳酸を生成するのに有効なバクテリアは、成長した家禽類の糞便または盲腸内容物から分離される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３９．請求項２０に記載の方法においてさらに、乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なメガスファーラの培養物の投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。４０．請求項３９に記載の方法において、前記メガスファーラは、メガスファーラエルスデニイである、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。４１．（ａ）乳酸を発酵させて酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋なヴェイロネラの培養物、と（ｂ）炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効な少なくとも２種類の嫌気性バクテリア細菌株の培養物であって、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアの細菌株は、ストレプトコッカス、エンターコッカス、ラクトバシルスの中から選択される、乳酸生成バクテリアの培養物と、を含む、家禽類のサルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物であって、前記ヴェイロネラおよび乳酸を生成するのに有効なバクテリアは、成長した家禽類の糞便または盲腸内容物から分離される、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。

Claims

【特許請求の範囲】１．下記（ａ）、（ｂ）を含む、サルモネラ菌のコロニー形成を抑制するための組成物。（ａ）乳酸を発酵させて、酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋な嫌気性のバクテリアの培養物であって、前記乳酸を発酵させて有機酸を生成するのに有効な嫌気性のバクテリアは、ヴェイロネラ、メガスファーラ、およびこれらの混合菌のなかから選択される、バクテリアの培養物（ｂ）炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効な少なくとも一種類の嫌気性バクテリアの培養物２．請求項１に記載の組成物において、前記乳酸を発酵させて揮発性の有機酸を生成するのに有効な嫌気性のバクテリアは、ヴェイロネラパーヴェラ、メガスファーラエルスデニイ、およびこれらの混合菌の中から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。３．請求項１に記載の組成物において、前記乳酸を生成するのに有効な嫌気性のバクテリアは、ストレプトコッカスインターメディウム、ストレプトコッカスモービリウム、エンターコッカスディランス、ラクトバシルスアシドフィウスの中から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。４．請求項３に記載の組成物であって、前記乳酸を発酵させるのに有効な嫌気性バクテリアのうち少なくとも２種類含む、サルモネラ菌コロニー形成を抑制する組成物。５．請求項３に記載の組成物であって、前記乳酸を発酵させるのに有効な嫌気性バクテリアのうち少なくとも３種類含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。６．請求項３に記載の組成物であって、前記乳酸を発酵させるのに有効な嫌気性バクテリアを全種類含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。７．請求項６に記載の組成物において、前記乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成するのに有効な嫌気性バクテリアは、メガスファーラとヴェイロネラとの混合菌である、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。８．請求項１に記載の組成物において、さらにラクトースを含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。９．請求項１に記載の組成物において、さらにグラム陽性のバクテリアに対して活性ではないコクジウム抑制薬を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１０．請求項１に記載の組成物において、さらにキャリアを含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１１．請求項１に記載の組成物において、前記乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成する嫌気性バクテリアはカプセルで包まれる、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１２．請求項１に記載の組成物において、乳酸を生成する嫌気性バクテリアの培養物と乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成する嫌気性バクテリアの培養物との比率は、１：１〜１：１０~ ８の間である、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１３．請求項１１に記載の組成物において、前記比率はおよそ１：１０~ ２である、サルモネラ菌コロニー形成抑制のための組成物。１４．動物の飼料に請求項１に記載の組成物を組み合わせた飼料製品。１５．下記（ａ）、（ｂ）の物質を、家禽類の腸のサルモネラ菌コロニー形成を抑制するのに効果的な分量だけ家禽類に投与して、家禽類のサルモネラ菌コロニー形成を抑制するための方法。（ａ）乳酸を発酵させて、酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む揮発性の有機酸を生成するのに有効な、十分に純粋な嫌気性のバクテリアの培養物であって、前記乳酸を発酵させて有機酸を生成するのに有効な嫌気性のバクテリアは、ヴェイロネラ、メガスファーラ、およびこれらの混合菌のなかから選択される、バクテリアの培養物（ｂ）炭水化物を発酵させて乳酸を生成するのに有効な少なくとも一種類の嫌気性バクテリアの培養物１６．請求項１４に記載の方法において、前記家禽類は飼鳥類である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１７．請求項１５に記載の方法において、前記飼鳥類は、鶏、七面鳥、あひる、うずら、がちょうからなる群から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１８．請求項１６に記載の方法において、前記飼鳥類は、生後１４日以内のヒナである、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。１９．請求項１４に記載の方法において、前記乳酸を発酵させて揮発性の有機酸を生成する嫌気性バクテリアは、ヴェイロネラパーヴェラ、メガスファーラエルスデニイ、およびこれらの混合菌の中から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２０．請求項１４に記載の方法において、前記乳酸を生成する嫌気性バクテリアは、ストレプトコッカスインターメディウム、ストレプトコッカスモービリウム、エンターコッカスディランス、ラクトバシルスアシドフィウスの中から選択される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２１．請求項１９に記載の方法において、前記乳酸を生成する嫌気性バクテリアのうち少なくとも２種類を家禽類に投与する、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２２．請求項１９に記載の方法において、前記乳酸を生成する嫌気性バクテリアのうち少なくとも３種類を家禽類に投与する、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２３．請求項１９に記載の方法において、前記乳酸を生成する嫌気性バクテリアのうち全種類を家禽類に投与する、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２４．請求項２３に記載の方法において、前記乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成する嫌気性バクテリアは、メガスファーラとヴェイロネラとの混合菌である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２５．請求項１４に記載の方法において、さらに前記家禽類へのラクトースの投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２６．請求項１４に記載の方法において、さらに、グラム陽性のバクテリアに対して十分に活性ではないコクジウム抑制薬の投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２７．請求項１４に記載の方法において、前記嫌気性バクテリアの培養物はキャリアと共に投与される、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２８．請求項１４に記載の方法において、前記乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成する嫌気性バクテリアは、カプセルに包まれる、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。２９．請求項１４に記載の方法において、乳酸を生成する嫌気性バクテリアの培養物と乳酸を発酵させて揮発性有機酸を生成する嫌気性バクテリアの培養物との比率は、１：１〜１：１０~８の間である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３０．請求項２７に記載の方法において、前記比率は１：１０~ ２である、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３１．請求項１４に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、家禽類への経口的な投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３２．請求項２９に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、前記培養物を家禽類の飼料に混合した投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３３．請求項２９に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、前記培養物を家禽類の飲料水に混合した投与を含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。３４．請求項１４に記載の方法において、前記培養物投与のステップは、前記家禽類の排泄部に前記培養物を接触させるステップを含む、サルモネラ菌コロニー形成抑制方法。