JPH08502043A - ヘルペスウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 薬学的に許容され得る担体中に懸濁された突然変異化ヘルペスウイルスを含有するヘルペスウイルスワクチン。このヘルペスウイルスは、ワクチン接種される哺乳類の細胞を感染させることができるが、複製サイクルを完成することはできず、従ってその哺乳類において防御免疫応答を惹起することができる。この突然変異はこのウイルスの複製に不可欠なタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子において生じ、ウイルスの複製を欠損させる。

Description

【発明の詳細な説明】ヘルペスウイルスワクチン 発明の背景 本発明の分野はヘルペスウイルスワクチンである。 本発明は米国政府の助成を受けてなされたものであり、同政府は本発明におい て一定の権利を有する。 ヘルペスウイルスは二十面体ヌクレオキャプシドに包まれたエンベロープ２本 鎖ＤＮＡ含有ウイルスである。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純 ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン ・バールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペス ウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）をはじめと する少なくとも７種類のヘルペスウイルスがヒトの疾患に関与している。一般に 、ヘルペスウイルスには、増殖の場となる宿主に潜伏感染を引き起こす能力を有 するという共通の性質がある。 ＨＳＶ−１はもっともよく研究されているヘルペスウイルスの一つである。Ｈ ＳＶ−１は生産的感染の際に、厳密に調節された遺伝子発現パターンを示す［フ ィールズとクナイプ（Fields and Knipe），Virology，1990，Raven Press，NY に総説がある］。このウイルスによってコードされる７０〜８０個の遺伝子の一 部は発現のキネティックスに基づいて分類される。各クラスの遺伝子の発現は、 先行クラスの遺伝子の発現に依存する。まず、ウイルスのα遺伝子すなわち即時 早期遺伝子が発現され、次いで、ウイルスのβ遺伝子すなわち早期遺伝子が発現 され、さらにγ遺伝子すなわち後期遺伝 子が発現される。γ遺伝子は発現がウイルスＤＮＡ複製に依存する程度に応じて 更にγ−１とγ−２遺伝子に分類される。 数種類のウイルスタンパク質がＨＳＶ−１遺伝子の発現を調節することが示さ れている。ＩＣＰ４遺伝子産物はβ遺伝子とγ遺伝子の発現に不可欠である［デ ルカら（DeLuca et al．），1985，J．Virol．56:558］。ＩＣＰ２７遺伝子産物 はγ遺伝子の発現とウイルスＤＮＡの複製に必要である［マッカーシーら（McCa rthy et al．），1989，J．Virol．63:18］。主なＤＮＡ結合タンパク質である ＩＣＰ８はβ遺伝子産物であるが、このものもウイルスＤＮＡの複製とγ遺伝子 の発現に必要である［ガオとクナイプ（Gao and Knipe），1989，J．Virol．63: 5258；クインランら（Quinlan et al．），1984，Cell 36:657］。 ヘルペスウイルスによって引き起こされるヒトの疾患は軽度のものから重度の ものまで様々であるが、これらのウイルスへの感染が命にかかわることもある。 普通の疾患予防手段の一つにワクチン接種がある。単離免疫原や生の減弱化ウ イルスを原料とする様々なワクチンが下記のヘルペスウイルスを予防する手段と して提案されている：ＨＳＶ−−ロイズマン（Roizman）、米国特許第４８５９ ５８７号、メイグニエルら（Meignier et al．），（1988）J．Inf．Dis．3:603 -613；ＶＺＶ−−タカハシら（Takahasi et al．）（1975）Biken J．18:25-33 ；ＣＭＶ−−エレックとステルン（Elek and Stern）（1974）Lancet 1:1-5およ びプロトキンら（Plotkin et al．）（1975）Infect．Immun．12:521-527］。 発明の概要 本発明は、薬学的に許容される担体に懸濁した突然変異誘発ヘルペスウイルス からなるヘルペスウイルスワクチンであることに特徴がある。この突然変異誘発 ヘルペスウイルスは、ワクチン接種対象の哺乳類の細胞に感染する能力があり、 その哺乳類において防御免疫応答を惹起する能力がある。突然変異はウイルス複 製に不可欠のタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子で起きるので、こ の突然変異はウイルス複製を欠損させる。具体的には、防御すべき宿主において 標的細胞に感染する能力を一般に保持するという意味で、そのウイルスは生きて いる。感染しても子孫は作らないが、そのウイルスは、たとえば感染細胞が産生 するウイルス誘導免疫原やウイルスコード化免疫原を介して、防御免疫応答を惹 起する。防御とは、ワクチン接種後の野生型ウイルスによる感染が予防されるか 期間的および程度的に緩和されるように、宿主がワクチンに対する免疫応答を獲 得することをいう。とくに潜伏感染が予防される。標準的な動物実験を利用して 防御を確認することができる。たとえばＨＳＶの場合、マウスやウサギのモデル を使って防御能力を調べることができる［コーエンら（Coen et al．），Proc． Nat'l．Acad．Sci．（1989）86：4736-3740］。ＨＳＶ−２の場合は、標準マウ ス足蹠モデルやモルモット膣モデルを使うことができる。 好ましい態様においては、本発明のヘルペスウイルスは、 ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ− ７である。突然変異は、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７またはＨＳＶ−１のＩＣＰ８を コードする遺伝子、またはＨＳＶ−１以外のヘルペスウイルスにおけるこれらの 遺伝子の対応するホモログにおけるものが好ましい。ワクチンに使用するのに好 ましい変異体ヘルペスウイルスは、ｎ５０４Ｒまたはｄ３０１である。ヘルペス ウイルスは、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子とＩＣＰ８遺伝子の両方、または対 応するＨＳＶ−１以外のヘルペスウイルスの対応する２つのホモログ遺伝子の両 方において、突然変異を有するものであることがさらに好ましい。変異体ヘルペ スウイルスは、親のヘルペスウイルスと無関係の病原体に対する防御を誘導する ワクチン発現ベクターとなるように、１個以上のヘテロ遺伝子を含むように工学 的に操作してもよい。変異体ヘルペスウイルスは野生型のウイルスチミジンキナ ーゼ遺伝子を含んでいることが好ましい。 本発明の第二の側面は、上記突然変異化ヘルペスウイルスを構築し、それを薬 学的に許容される担体中に懸濁することによってヘルペスウイルスワクチンを作 成する方法に特徴がある。 本発明の他の側面は、上記突然変異化ヘルペスウイルスワクチンを投与するこ とによってヘルペスウイルスに対してヒトを免疫することも含むものである。 詳細な説明 まず図面について説明する。 図１は、野生型ＨＳＶ−１または本発明の複製欠損変異体であるｄ３０１とｎ ５０４の接種を受けたマウスの抗体応答を示すグラフである。本発明の範囲外で ある第３の変異体（ｄ１２０）を接種した場合の結果も開示している。Ｂａｌｂ ／ｃマウス（１群８匹）に、１０⁶プラーク形成単位（ｐｆｕ）の野生型ＨＳＶ −１または変異体であるｄ１２０、ｄ３０１、またはｎ５０４のいずれかを腹腔 内チャレンジ投与した。接種２週後、これらのマウスから得た血清に含まれるＨ ＳＶ−１特異的ＩｇＧ_2aをＥＬＩＳＡで定量した。データは、平均値とその標準 誤差で示した。この実験のデータは合計４つの実験を代表するものである。 図２は、野生型ウイルスまたは複製欠損変異体であるｄ１２０、ｄ３０１、ま たはｎ５０４のいずれかの接種を受けたマウスのＴ細胞応答を示すグラフである 。各ウイルスの接種を受けたマウスから得たＴ細胞を、１細胞あたり１ｐｆｕの 感染多重度で、ＵＶ照射ＨＳＶ−１または小水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）と 共に、インキュベートした。免疫しなかったマウスから得たＴ細胞を陰性対照と した。データは、平均値とその標準誤差で示した。この実験は合計３つの実験を 代表するものである。 図３は、複製欠損変異体の接種を受けた後で野生型ウイルスのチャレンジ投与 を受けたマウスの生存率を示すグラフである。各群のマウスに、１０⁶ｐｆｕの ｄ１２０（６匹）、ｄ３０１（６匹）、ｎ５０４（６匹）、または同等量のプソ ラレン不活化野生型ＨＳＶ−１（５匹）の腹腔内接種を行な った。対照マウス（９匹）には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内注射した 。接種６週後に、すべてのマウスに５ｘ１０⁷ｐｆｕのＨＳＶ−１（ｍｐ株）の 腹腔内チャレンジ投与を行なった。ほとんどのマウスはチャレンジ投与後７〜１ １日目に死亡した。生存率はチャレンジ投与後４週にわたり記録した。この実験 は合計４つの実験を代表するものである。 図４は、野生型のＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子と変異体のそれの位置と構造 を示すダイアグラムである。（Ａ）野生型遺伝子とｌａｃＺ挿入変異体の遺伝子 の構造。ＨＳＶ−１ゲノムの表現型配置を上部に示す。野生型およびｄ２７−ｌ ａｃＺｌゲノム由来のＰｓｔＩ制限酵素断片を下部に示す。細い線はウイルスゲ ノムのユニーク（Ｕ）領域を示し、白抜きバーはリピート領域（Ｒ）を示し、斜 線バーは大腸菌ｌａｃＺ配列を示す。上の矢印は６３ｋＤａのＩＣＰ２７タンパ ク質のコード配列を示し、下の矢印は約１３７ｋＤａのＩＣＰ２７−β−ガラク トシダーゼ融合タンパク質のコード配列を示す。（Ｂ）野生型、ナンセンス、お よび欠失変異体遺伝子の構造。ＩＣＰ２７変異体遺伝子は、制限酵素断片（括弧 ）を欠失させるか、３つの読み取り枠すべてに終止コドンを含むＸｂａＩまたは ＮｈｅＩオリゴヌクレオチドリンカー（それぞれＸとＮ）を挿入することによっ て構築した。矢印は、野生型ＩＣＰ２７タンパク質（上）またはナンセンス変異 体によってコードされた切断型ＩＣＰ２７を示す。制限部位は次のとおりである 。Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｓａ 、ＳａｌＩ；Ｈ、Ｈｐａｌ；Ｒ、ＲｓｒＩＩ；Ｓｔ、ＳｔｕＩ；Ｓｓ、ＳｓｐＩ ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｎ、ＮｈｅＩ。 図５は、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７変異体ゲノムのサザーンブロットハイブリダ イゼーション分析のオートラジオグラムである。精製ウイルスＤＮＡをＰｓｔＩ とＸｂａＩで消化し、アガロースゲル上の電気泳動に付し、ナイロンフィルター に移した。フィルターを、ＩＣＰ２７をコードするＨＳＶ−１ゲノム領域由来の ６．１ｋｂのＰｓｔＩ挿入断片を含むプラスミドの³²Ｐ標識ＤＮＡをプローブと して調べた。図の左側の数字は標準ＤＮＡサイズマーカーの相対位置である。 図６は、変異体ウイルス感染細胞で発現されたＩＣＰ２７関連ポリペプチドの ウエスタンブロット分析の結果である。感染後（ＰＩ）１０時間（ｈ）目に感染 ベロ細胞から全タンパク質を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロ ースフィルターに電気泳動的に移した。Ｈ１１１３をプローブとして、フィルタ ーを調べた。図の右側の数字は標準タンパク質サイズマーカーの相対位置である 。 図７は、変異体ＩＣＰ２７分子の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。ベロ細 胞にモック感染（ＡとＢ）させるか、野生型ウイルス（ＣとＤ）、ｎ２６３Ｒ（ ＥとＦ）、ｎ４０６Ｒ（ＧとＨ）、またはｎ５０４Ｒ（ＩとＪ）を感染させた。 ４ｈＰＩ（感染４時間後）の時点で、細胞を固定し、抗体Ｈ１１１３を用いて免 疫蛍光顕微鏡標本を作成した。パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉは免疫蛍光顕微鏡写真 であり、パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊは対応する位相差顕微鏡写真である。 図８は、ＩＣＰ２７変異体のウイルスＤＮＡ複製能力を示すオートラジオグラ ムである。ベロ細胞にモック感染させるか、または野生型ＨＳＶ−１もしくは様 々な変異体を感染させた。ウイルス吸着後ただちに（１ｈＰＩ）、または感染サ イクルの終点付近（１６ｈＰＩ）の時点で、全細胞ＤＮＡを調製した。等量の各 ＤＮＡ試料を５倍希釈列とし、得られた希釈液をスロットブロットマニホルドを 用いてニトロセルロースフィルターにかけた。フィルターを、ｐＳＨＺ［ナベル ら（Nabel et al．）（1988）Science、他所に引用］に由来する³²Ｐ標識ＤＮＡ をプローブとして調べた。 図９は、ＩＣＰ２７変異体感染細胞におけるタンパク質合成を示すオートラジ オグラムである。ベロ細胞にモック感染させるか、または野生型ＨＳＶ−１もし くは様々なＩＣＰ２７変異体を感染させた。３、６または９ｈＰＩの時点で［³⁵ Ｓ］−メチオニンで３０分間標識した後、細胞を集めた。タンパク質を溶解物か ら抽出し、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーに付 した。各パネルの右側に様々なＨＳＶ−１タンパク質の相対位置を示す。 図１０は、Ｖ２７細胞におけるＩＣＰ２７変異体の生育による異常タンパク質 合成の相補を示すオートラジオグラムである。ベロまたはＶ２７細胞にモック感 染させるか、野生型ＨＳＶ−１または様々なＩＣＰ２７変異体を感染させた。図 ９について説明したようにして、１５ｈＰＩの時点で細胞を［³⁵Ｓ］−メチオニ ンで３０分間標識し、タンパク質合成を分析した。図の右側に数種類のＨＳＶ− １タンパク質の位置 を示す。 図１１は、ＩＣＰ２７変異体感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡの蓄積を示す オートラジオグラムである。ベロ細胞にモック感染させるか、または野生型ＨＳ Ｖ−１もしくは様々なＩＣＰ２７変異体を感染させた。９ｈＰＩの時点で、細胞 質ＲＮＡを調製した。等量のＲＮＡを、ＩＣＰ２７（Ａ）、ＩＣＰ４（Ｂ）、ま たはｇＣ（Ｃ）のｍＲＮＡに対して特異的な³²Ｐ標識プローブを用いて、ノーザ ンブロットハイブリダイゼーション分析に付した。レーンは、モック感染細胞（ レーン２）、または４００μｇ／ｍｌのホスホノ酢酸（レーン１）、ｄ２７−１ （レーン３）、ｎ５９Ｒ（レーン４）、ｎ５０４Ｒ（レーン５）、または野生型 ＨＳＶ−１（レーン６）の存在下で野生型ＨＳＶ−１で感染させた細胞のＲＮＡ を含むものである。各パネルの右側にウイルスＲＮＡとリボソームＲＮＡの相対 位置を示す。 図１２は、ＩＣＰ８ナンセンス突然変異（ｎ）、欠失突然変異（ｄ）、および 点突然変異（ｐｍ）の位置を示すダイアグラムである。ＨＳＶ−１ゲノム上のＩ ＣＰ８コード領域の位置を図の上部に示す。示した制限酵素部位は、ＢａｍＨＩ （Ｂ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）、およびＳａｌＩ（Ｓ）である。 図１３は、野生型ＨＳＶ−１、ＨＤ−２、およびｎ２のＤＮＡのサザーンブロ ットハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムである。野生型ＨＳＶ− １、ＨＤ−２、およびｎ２を感染させた細胞から得たＤＮＡをＢａｍＨＩ−Ｘｂ ａＩ（レーン１、２、３）、およびＫｐｎＩ（レーン４、５ 、６）で消化し、ＫｐｎＩ消化ｐＳＧ１８−ＳａｃＩ（レーン７）とともに電気 泳動に付した。このＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し、³²Ｐ標識プラ スミドｐＩＣＰ８にハイブリダイズさせた。図の左側に標準サイズマーカーの相 対位置を示す。 図１４は、変異体感染細胞から得たＩＣＰ８特異的ポリペプチドのウエスタン ブロット分析のオートラジオグラムである。ホスホノ酢酸の存在下、ベロ細胞に 各ウイルスを感染させ、６ｈＰＩの時点で細胞を集めた。細胞抽出物に含まれる タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに電気泳動的に移し た。このフィルターを、ＩＣＰ８に対するウサギポリクローナル抗血清をプロー ブとして調べた。図の左側に標準サイズマーカーの相対位置を示す。 図１５は、ウイルスＤＮＡ複製の分析のフルオログラムである。ベロ細胞にモ ック感染させるか（レーン１）、またはホスホノ酢酸の非存在下（レーン２〜４ ）、もしくはホスホノ酢酸（レーン５）、ｐｍ１（レーン６）、ｎ１０（レーン ７）、ｎ２（レーン８）、ｄ１０２（レーン９）、ｄ１０１（レーン１０）、ま たはｄ３０１（レーン１１）の存在下、ベロ細胞に野生型ウイルスを感染させ、 ６〜１０ｈＰＩの間、［³Ｈ］−チミジンで標識した。全ＤＮＡを単離し、各試 料１０μｇ［レーン３（５μｇ）とレーン４（１μｇ）を除く］をＢａｍＨＩと ＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。電気泳動終了後、ゲル を１．０Ｍサリチル酸ナトリウムで処理してフルオログラフィーを行なった。 図１６は、１本鎖ＤＮＡセルロースへのＩＣＰ８の結合状態を示している。ホ スホノ酢酸の存在下に、ベロ細胞に野生型（Ａ）またはｐｍ１（Ｂ）を感染させ 、４〜６ｈＰＩの間、［³⁵Ｓ］−メチオニンで標識した。１本鎖ＤＮＡセルロー スカラム上で分離された様々なタンパク質画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。レ ーン１は全細胞溶解物を、レーン２は高塩分ＤＮアーゼ抽出で得たペレットを、 レーン３は透析後のペレットを、レーン４はカラムに負荷した抽出物を、レーン ５〜１０は素通り液と洗液を、レーン１１は０．３ＭのＮａＣｌ溶出物を、レー ン１２は０．５ＭのＮａＣｌ溶出物を、レーン１３は１．０ＭのＮａＣｌ溶出物 を、レーン１４は４．０ＭのＮａＣｌ溶出物を示す。各パネルの右側に野生型ま たは突然変異化ＩＣＰ８の相対位置を示す。 図１７は、変異体ＩＣＰ８ポリペプチドの細胞内分布を示す顕微鏡写真である 。ベロ細胞に野生型またはＩＣＰ８変異体ウイルスを感染させた。４ｈＰＩの時 点で細胞を固定し、透過性を高め、７９３抗ＩＣＰ８モノクローナル抗体とロー ダミン複合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（パネルＡ〜ＦおよびＨ）、または抗Ｉ ＣＳＰ１１／１２ポリクローナル血清とフルオレセイン複合ヤギ抗ウサギ免疫グ ロブリン（パネルＧ）のいずれかとともにインキュベートした。免疫蛍光顕微鏡 写真：Ａ、モック感染細胞；Ｂ、ホスホノ酢酸存在下での野生型感染細胞；Ｃ、 ｎ１０−感染細胞；Ｄ、ｄ１０２−感染細胞；Ｅ、ｐｍ１−感染細胞；Ｆ、ｄ３ ０１−感染細胞；Ｇ、ｎ２−感染細胞；Ｈ、ｄ１０１−感染細胞。 Ｉ．ワクチンとして有用なウイルス変異体の作成 本発明によれば、特定の変異体について以下に説明する方法と同様の方法を用 いて、ワクチンの候補となりえる有用なヘルペスウイルス変異体を構築し試験す ることができる。そのような変異体の構築は、４種類のヒトヘルペスウイルスす なわちＨＳＶ−１、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶの全ＤＮＡ配列が知られているとい う事実［マックゲオックら（McGeoch et al．），1988，J．Gen．Virol．69：15 31；マックゲオックら（McGeoch et al．），1985，J．Mol．Biol．181:1；マッ クゲオックら（McGeoch et al．），1986，Nucl．Acids Res．14:1727；ダビソ ンら（Davison et al．），1986，J．Gen．Virol．67:1759；バエルら（Baer et al．），1984，Nature 310:207；チーら（Chee et al．），1990，Current Top ics in Microbiol．and Immunol．154:125］、および上記以外のヒトヘルペスウ イルスにおける遺伝子のうちの多くのものの制限酵素マップ、部分配列、および 正確な位置も知られているという事実［フィールズとクナイプ（Fields and Kni pe），1990，同上］があるので容易である。さらに、ゲノムライブラリーが入手 可能であり、多くの異なるヘルペスウイルス特異的遺伝子をコードする大量のプ ラスミドも入手可能である［フィールズとクナイプ（Fields and Knipe），Viro logy，1990，Raven Press，N.Y.、および同文献中に引用されている文献を参照 ］。 一般に、ワクチン候補として有望な変異体ウイルスを得る方法は、ＨＳＶ−１ のＩＣＰ２７またはＩＣＰ８遺伝子にお けるウイルス変異体作成について以下に説明するものと同じステップを行なう。 まず、適当な突然変異をコードするウイルスＤＮＡを含むプラスミドであって、 相同組替えを受けるウイルスＤＮＡによってフランキングされているものを構築 する。次に、このＤＮＡを、突然変異を導入しようとするゲノムウイルスＤＮＡ とともに動物細胞に同時トランスフェクションをする。突然変異は、これらの細 胞中でウイルスＤＮＡが複製される際に相同組替えのプロセスによってこの親の ゲノムに導入される。以下に説明する技術を適宜組み合わせたものを使って、子 孫ウイルスに突然変異が起きているかどうかについてスクリーニングを行なう。 たとえば、当該遺伝子の発現がウイルス複製に不可欠である場合は、突然変異化 遺伝子の野生型相補コピーを発現する細胞系においてのみ複製する能力を有する 子孫ウイルスを選択することができる。次いで、これらのウイルスを、たとえば サザーンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、免疫蛍 光法、特異的ｍＲＮＡ種の発現などによって、スクリーニングすることができる 。このような技術は分子ウイルス学の分野では常法であり、以下に引用するサム ブルークら（Sambrook et al．）の分子クローニングマニュアルに詳細に述べら れている。 ウイルスワクチンの一般的目標は、疾患に対する防御を拡大することと（生涯 にわたることもある）、初期副作用と長期副作用をなくすことである。ワクチン は、防御のための体液性抗体と細胞性免疫の両方を誘導するものでなければなら ない。生のウイルスワクチンは、ワクチン接種を受けた者から接種を受けていな い者に広がることがなく、ワクチン接種を受けた者に潜伏感染を引き起こさない ものでなければならない。 本明細書で説明するような変異体ヘルペスウイルスは一般にこれらの基準を満 たす。具体的には、本発明のワクチン候補は少なくとも下記の性質を有するもの でなければならない。すなわち、導入先の宿主においてそれ自体が生存でき、か つ生存可能な子孫ウイルスを生じる能力を実質的に欠いているものでなければな らない。また、その宿主において防御免疫応答を誘導する能力を有するものでな ければならない。複製能力がないため（相補遺伝子を発現する支持宿主細胞系由 来のものなどの当該タンパク質の外来ソースの非存在下で）子孫ウイルスを生じ る能力を欠いているが、防御免疫応答が誘導される程度に抗原決定基を発現する 能力を有するものであれば、どのような生存ヘルペスウイルスでもワクチン候補 となりうる。したがって、上記したものなど突然変異化ＩＣＰ２７遺伝子やＩＣ Ｐ８遺伝子を保持するＨＳＶ−１株はワクチン候補となりうる。これらの株は、 ゲノム内にさらに突然変異を導入することによってさらに改良することができる 。たとえば、ＩＣＰ２７やＩＣＰ８と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子に さらに欠失を有するウイルスを作成することができる。これらのウイルスは以下 のようにして構築し、試験することができる。さらに突然変異を加えることで、 安定ウイルスもできる。 当該分野に習熟せる者であれば、ＩＣＰ２７タンパク質とＩＣＰ８タンパク質 の両方または一方におけるその他の適当な突然変異を本発明に適用することがで きることを理解するであろう。以下に示す実験を用いて、そのような突然変異を 有する候補ウイルスをスクリーニングすることができる。好ましい候補突然変異 は、上記ＩＣＰ８ドメインとＩＣＰ２７ドメインの両方または一方に突然変異を 導入されたものであって、しかも以下に説明する実験によって示されるように目 的の変異体表現型を保持するものである。 同様に、複数のウイルス遺伝子に突然変異を有するウイルスを作成することが できる。これらのウイルスは、１つのウイルス遺伝子だけに突然変異を導入され たウイルス株と比べて、安全性の点と、拡散能力を欠くという点で大いに有利で ある。これらのウイルスの例としては、ＩＣＰ２７遺伝子にすでに突然変異を有 するウイルスのゲノムにＩＣＰ８遺伝子の突然変異が導入された株などが挙げら れるが、これらに限定されない。逆に、ＩＣＰ８遺伝子にすでに突然変異を有す るウイルスのゲノムにＩＣＰ２７遺伝子の突然変異が導入されたウイルス株を構 築することもできる。そのようなウイルスを複製するために、野生型のＩＣＰ２ ７遺伝子とＩＣＰ８遺伝子の両方を発現する能力のある細胞系を作成する。複数 のヘルペスウイルス遺伝子を発現する細胞系を作成する手順は当該分野において 公知であって上記したものと類似のものであり、トランスフェクションを受けた 細胞がトランスフェクション混合物に含まれる遺伝子のそれぞれを取り込むこと がわかっている［クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe），（1983）Mol． Cell．Biol．5:957-963参照］。 防御免疫応答を惹起する原因となるウイルス特異的産物の大多数は、感染細胞 内で発現されるとともに一般にウイルス粒子の表面にも見られうるタンパク質と 糖タンパク質である。ヘルペスウイルスの場合、主な抗原決定基の一部はウイル スゲノムによってコードされる糖タンパク質である。いずれのヘルペスウイルス でも、異なるヘルペスウイルスによってコードされるのが普通である単数または 複数の糖タンパク質を発現する能力のあるワクチン候補株を構築することができ る。たとえば、通常はＨＳＶ−２またはその他のヒトヘルペスウイルスによって コードされる単数または複数の糖タンパク質をコードし発現する能力のあるＨＳ Ｖ−１の変異体株（ＩＣＰ２７とＩＣＰ８の両方または一方の遺伝子に突然変異 を有する）を作成することができる。そのようなウイルスは、通常の分子生物学 的手法と上記手順を用いて構築される。 そのような例の１つを以下に簡単に説明する。ＨＳＶ−２特異的糖タンパク質 をコードする単数または複数の遺伝子を、たとえばＨＳＶ−１特異的チミジンキ ナーゼ、より好ましくは糖タンパク質ｃＤＮＡ、またはウイルスの複製に不可欠 ではないＨＳＶ−１ゲノムのその他の領域など、約１００〜３００ｂｐのＨＳＶ −１特異的ＤＮＡで一端をフランキングすることができる。多くの抗ＨＳＶ化合 物の活性化にチミジンキナーゼ遺伝子の産物が必要であるため［フィールズとク ナイプ（Fields and Knipe）、他所に引用］、この遺伝子の無傷のコピーをワク チン株内に保持するのが有利であるかもしれない。この雑種ＤＮＡを、ＩＣＰ８ 遺伝子とＩＣＰ２７遺伝子の一方または両方に突然変異を有する感染性ＨＳＶ− １特異的ＤＮＡとともに細胞に同時トランスフェクションをさせる。次いで、子 孫ウイルスを得て、上記のようにフランキング配列によって決定した特異的ＨＳ Ｖ−１座位に単数または複数のＨＳＶ−２遺伝子の挿入があるものを探すスクリ ーニングを行なう。次いで、これらのウイルスが防御免疫応答を惹起する能力が あるかどうか以下に説明するようにして評価することができる。このようなウイ ルスはＨＳＶ−１ウイルスとＨＳＶ−２ウイルスの両者に対して特異的な抗原決 定基を発現する能力があるかもしれないので、両方のウイルスから個体を防御す るうえで有用となりうる。同様に、その他のヒトヘルペスウイルス、またはウイ ルス、細菌、真菌、寄生虫などその他の感染体によって発現されるのが普通であ る抗原をコードする遺伝子を複製欠損ＨＳＶ−１の遺伝的骨格に組込んで、単回 のワクチン接種で多重防御を得ることができる。 ＨＳＶ−２は、ＤＮＡ配列とタンパク質産物がＨＳＶ−１によってコードされ るものと相同である多くの遺伝子をコードすることが知られている［フィールド とクナイプ（Field and Knipe）、他所に引用］。実際、ＨＳＶ−２は、非常に よく似たＤＮＡ配列をもつ遺伝子をコードし、また、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺 伝子やＩＣＰ８遺伝子に非常によく似た 遺伝子をコードする。これらＨＳＶ−２のＩＣＰ２７やＩＣＰ８のホモログのタ ンパク質産物は、ＨＳＶ−１のものと非常によく似た性質を有する［モーセら（ Morse et al．）（1978）J．Virol．26:389-410；マースデンら（Marsden et al ．），（1978）J．Virol．28:624-642参照］。したがって、これらの遺伝子のい ずれか１つまたは両方に突然変異を有するＨＳＶ−１について説明したものと同 じやり方でＨＳＶ−２の変異体株を作成することができる。このような変異体も ＨＳＶ−２のワクチン候補である。さらに、その他のヘルペスウイルスや感染体 に対して特異的な糖タンパク質をコードする遺伝子を、各株がＨＳＶ−２糖タン パク質に加えてこれらのヘテロ遺伝子を発現する能力を有するようにこれらの変 異体株の遺伝的骨格に挿入することができる。 ＨＳＶ−２ゲノムは、組織培養で細胞を形質転換する能力があることが示され ている２つの異なるＤＮＡ領域をその長さ方向に有する。これらの領域をｍｔｒ ＩＩとｍｔｒＩＩＩと呼び、ＨＳＶ−２ゲノム上のそれらの正確な位置が知られ ている［ガロウエイら（Galloway et al．），1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 81:4736；アリら（Ali et al．），Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8257］ 。ＨＳＶ−２のワクチン株がイン・ビボで細胞を形質転換する能力がある可能性 を排除するために、相同組替えによってこれらのＤＮＡ領域を形質転換性のない ＨＳＶ−１配列と置換することができる。そのような配列の置換は、以下に説明 する特異的ＨＳＶ−１遺伝子の改変の作成に使用されるものと同様の手順を用い て 行なわれる。 ＨＳＶ−１やＨＳＶ−２以外のヘルペスウイルスも、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７ 遺伝子やＩＣＰ８遺伝子に対して相同性が高い遺伝子をコードする。ＨＳＶ−１ のＩＣＰ２７ホモログをコードするウイルスとしては、ＶＺＶ、ＥＢＶ、および ヒト以外のウマヘルペスウイルス１型などが挙げられ［ダビソンら（Davison et al．），1986，J．Gen．Virol．67:1759；バエルら（Baer et al．），1984，N ature 310:207；ホールデンら（Holden et al．），1992，J．Virol．66:664］ 、ＨＳＶ−１のＩＣＰ８ホモログをコードするウイルスとしては、ＶＺＶ、ＥＢ Ｖ、およびＣＭＶなどが挙げられる［ダビソンら（Davison et al．），1986，J ．Gen．Virol.，67:1759；バエルら（Baer et al．），1984，Nature 310:207； チーら（Chee et al．），1990，Current Topics in Microbiol．and Immunol． 154:125］。したがって、上記方法を用いれば、ＩＣＰ２７またはＩＣＰ８をコ ードする遺伝子に突然変異を有するＨＳＶ−１株について上記したものと同様の 性質を有するかもしれない候補ワクチン株をこれらのウイルスから作成すること ができる。 本発明のワクチンは、ＩＣＰ２７遺伝子やＩＣＰ８遺伝子、あるいはそれぞれ のホモログに突然変異を有するヘルペスウイルスに限定されない。生存可能であ りながら複製を欠損していて、しかも防御免疫応答を惹起するものであれば、い かなるウイルス変異体でもワクチン候補となる。カプシドタンパク質をコードす る遺伝子に突然変異を有するウイルスも ワクチン候補である。 たとえば、いくつかの糖タンパク質免疫原が開示されている［サルミエントら （Sarmiento et al．）（1979）J．Virol.，29:1159（「ｇＢ」）；コーカーら （Coker et al．），（1978）J．Virol．47:172-181（「ｇＤ」）；デサイら（D eSai et al．）（1988）J．Gen．Virol．69:1147-1156（「ｇＨ」）］。これら の糖タンパク質免疫原を、たとえばＩＣＰ２７やＩＣＰ８などの突然変異化骨格 に挿入してもよい。同様に、カプシドタンパク質変異体も有用であることがある 。 投与と用量： 当該分野に習熟せる者であれば、常法を用いて用量を最適化することができる ことを理解するであろう。一般に、ワクチンは適当な滅菌緩衝液中に処方され、 １０³〜１０⁹ＰＦＵ／ｋｇの用量で投与される（たとえば皮下、筋肉内、または 皮内注射による）。細胞免疫を誘導するとともに致死的感染に対する防御をもたらすＨＳＶ−１の複 製欠損変異体の具体例 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。 当該分野に習熟せる者であれば、以下に挙げる構築物の具体例は、ワクチンの基 本的性質を保持したまま上記発明の範囲内で様々に変更できることを理解するで あろう。 方法 以下の材料と方法を下記実施例で使用した。 マウス 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをTaconic Laboratory社（Germantown，NY）から購入 し、６〜１２週齢で使用した。０．５ｍｌのＰＢＳまたはウイルスをＰＢＳに懸 濁したもの０．５ｍｌをマウスに腹腔内注射した。 ウイルス 既報［クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe），1985，Mol．Cell．Biol ．5:957］に従い、ＨＳＶ−１野生型株ＫＯＳｌ．ｌとｍＰ株をベロ細胞上で増 殖させ、検定した。他所で引用したガオら（Gao et al．）に従い、ＩＣＰ８を コードする遺伝子に突然変異を有するウイルス（ｄ３０１という）を作成した。 ＩＣＰ２７遺伝子に突然変異を有するウイルス（ｎ５０４Ｒという）を下記のよ うにして作成した。突然変異化ＩＣＰ４遺伝子をコードするウイルス（ｄ１２０ ）をデルカら（DeLuca et al．）［1985，J．Virol．56:558］に従い作成した。 ホーンら（Horn et al．）［1989，J．Virol．63:4157］に従い、ＶＳＶを増殖 させた。すべてのウイルスストックは−７０℃で保存し、各ストックの一部を直 前に融解したものを各実験に使用した。５ｃｍ隔てた位置に置いた３０ＷのＵＶ 光源（Ｇ３０Ｔ８、General Electric社）を用いて、各ウイルスに０℃で４５分 間照射することで、ＵＶ照射ＨＳＶ−１とＶＳＶを調製した。プソラレン不活化 ウイルスはLee Biomolecular社（San Diego，CA）によって作成された。 Ｔ細胞活性のアッセイ ３〜４週前に１０⁶ｐｆｕの野生型ＨＳＶ−１、またはＩＣＰ４かＩＣＰ２７ かＩＣＰ８の遺伝子に突然変異を有するウイルス変異体を腹腔内接種したマウス から免疫脾臓細胞を採取した。ＰＢＳを接種したマウスを陰性対照とした。上記 マウスから採取した脾臓細胞をフィコール−ハイパック（Ficoll−hypaque）勾 配沈降法で処理して、赤血球と多形核白血球を除去した。脾臓細胞をＢリンパ球 特異的抗体とともに４℃で３０分間インキュベートすることで、混合物からＢリ ンパ球を除去した。次いで、細胞を洗い、磁石コア［Advanced Magnetics社（Ca mbridge，MA）］を含むヤギ−ラット抗体被覆ラテックス−ポリマービーズとと もにインキュベートした。次いで、磁石［バイオマグセパレーター（BioMag Sep arator）、Advanced Magnetics社］を用いて、磁石ビーズに結合したＪｌｌ−ｄ ２陽性細胞を除去した。９５％以上がＴ細胞からなる混合物に残留する細胞を洗 い、９６穴丸底培養プレート［ヌンク社（Nunc）、Roskilde，Denmark］中で合 計量０．２ｍｌとなるように１穴あたり１０⁵個の細胞濃度でインキュベートし た。細胞試料は４反復でプレート培養した。応答を示した細胞をＵＶ照射野生型 ＨＳＶ−１で剌激した。ウイルスを加えない対照細胞を並行に作成した。細胞を 、５％子ウシ血清（Hyclone Labs社、５６℃で１時間不活化した血清）、１００ Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gibco社）、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１ ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco社）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Gibco 社）、１０^-4ｍＭの２−メルカプトエタノール（Sigma社） 、および２ｍＭのグルタミン（Gibco社）を加えたダルベッコ変法イーグル培地 （Hazelton社）中でインキュベートした。細胞は、１０％のＣＯ₂の存在下で３ ７℃で３日間インキュベートした。１穴あたり１μＣｉの濃度の［³Ｈ］−チミ ジン（New England Nuclear社）を６時間加え、スクラトロンセルハーベスター （Skratron Cell Harvester）を用いて細胞を集めた。液体シンチレーションカ ウンター（Beta Trac 6895、TM Analytic社）を用いて、各試料中の放射活性量 を測定した。 抗体アッセイ 感染マウスから得た血清試料について、ＥＬＩＳＡによりＨＳＶ−１特異的抗 体が含まれているかどうかを調べた。用いたプロトコルは、齧歯類血清用に手を 加えた以外はカーロンとホイットレー（Kahlon and Whitley（1988，J．Inf．Di s．158:925）記載のものと同じであった。マイクロタイタープレート（Linbro／ Titertek社）を１０⁷ｐｆｕのＨＳＶ−１をＰＢＳに懸濁したものの１：５０希 釈液０．１ｍｌで１夜処理した。上記のようにして各ウイルスで免疫化されたマ ウスの血清は、そのマウスを眼窩後方で放血させることによって得た。ＨＳＶ− １被覆マイクロプレートを３回洗い、血清１：１００希釈液１００μ１、次いで １：３希釈液とともに室温で１夜インキュベートした。マイクロプレートを再び 洗い、１：２５０の希釈率のヤギ抗マウスＩｇＧ₂アルカリホスファターゼ（Sou thern Biotechnology社）とともに３７℃で３時間インキューベートした。１ｍ ｇ／ｍｌのアルカリ ホスファターゼ基質（Sigma 104）を添加してから３０分後に、７５μｌの３Ｎ ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。実験結果は、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリ ーダーを用いて得た。野生型ＨＳＶ−１免疫マウスの血清のプールを陽性対照と し、免疫化しなかったマウスの血清のプールを陰性対照とした。マウス血清は個 別に処理し、データは平均とその標準誤差として示した。 結果 複製欠損ウイルスの使用；死亡例なし 複製欠損ウイルス（すなわちＩＣＰ８またはＩＣＰ２７をコードする遺伝子に 突然変異を有するウイルス）をマウスに接種したときに致死的であるかどうかを 調べるために、マウスに生きた状態の野生型ＨＳＶ−１または変異体ウイルスｄ ３０１またはｎ５０４を注射した。１０⁸ｐｆｕという大量の各変異体を投与さ れたマウスは健康そうであり、ウイルスの影響を受けなかった。１０⁷ｐｆｕの 野生型ＨＳＶ−１の投与を受けた同腹仔はすべて死亡した。 変異体ウイルスの接種を受けたマウスにおけるＨＳＶ−１特異抗体の誘導 変異体ウイルスがマウス体内でＨＳＶ−１特異抗体を誘導する能力があったか どうかを調べるために、接種２週後の上記マウスから血清を採取し、ＨＳＶ−１ 特異抗体の存在を調べた。これらのマウスの血清中にＨＳＶ−１特異抗体が検出 できたが、抗体レベルは、野生型ウイルスの接種を受けたマウスの血清中の抗体 レベルより著しく低いという結果が繰り 返し得られた。ｄ３０１の接種を受けたマウスから得た血清よりも、ｎ５０４の 接種を受けたマウスから得た血清の方が抗体レベルが明らかに高かった。新たに 行なった２回目の実験で、接種後２週目と４週目のいずれの時点でも同様の結果 が得られた。 ＨＳＶ−１βタンパク質の発現がこれらの抗体の誘導に必要かどうかを調べる ために、１０⁶ｐｆｕのβタンパク質もγタンパク質も発現しないＩＣＰ４欠失 変異体ｄ１２０をマウスに接種した。対照レベルを超えるＨＳＶ−１特異抗体レ ベルがこれらのマウスで検出できたが、これらのレベルはＩＣＰ８変異体やＩＣ Ｐ２７変異体の接種を受けたマウスの血清で見られたものより有意に低かった（ 図１）。 ウイルス変異体の接種を受けたマウスにおけるＴ細胞応答の誘導 変異体（それぞれは後期ウイルス遺伝子産物の産生を欠損している）のＨＳＶ −１特異的Ｔ細胞応答誘導能力を調べるために、接種マウスから得た脾臓Ｔ細胞 のウイルス抗原に対する応答をイン・ビトロで調べた。マウスに、生きた野生型 （ＫＯＳｌ．ｌ）ウイルスまたは複製欠損変異体であるｄ１２０、ｄ３０１、お よびｎ５０４を１０⁶ｐｆｕ投与した。３週後に、各群のマウスから得たＴ細胞 をＵＶ照射ＨＳＶ株ｍＰの存在下でイン・ビトロでインキュベートした。非特異 的Ｔ細胞剌激の効果の対照として、無関係のウイルスであるＶＳＶに対するＴ細 胞の応答も評価した。ＶＳＶで免疫したマウスの脾臓Ｔ細胞は、ＶＳＶに応答し て増殖したが、ＨＳ Ｖ−１に応答して増殖することはなかった。バックグランドを超えるレベルのＴ 細胞活性の剌激が、各複製欠損ウイルスの接種を受けたマウスから得た脾臓Ｔ細 胞中で見られた（図２）。これらの結果は、変異体ウイルスをマウスに免疫する と、野生型ウイルスによる免疫の後で誘導されるものより低いレベルのＴ細胞剌 激が誘導されたことが示唆される。にもかかわらず、これらの変異体ウイルスは 相当なＴ細胞反応性を誘導した（図２）。 複製欠損ウイルスによる防御免疫の誘導 致死的ＨＳＶ−１に対する複製欠損ウイルスの防御免疫誘導能力を評価するた めに、マウスに上記複製欠損変異体のそれぞれを１０⁶ｐｆｕ接種した。３〜６ 週後に（実験ごとに異なる）、すべてのマウスに致死量（５ｘ１０⁷ｐｆｕ）の ＨＳＶ−１毒性株（ｍＰ）をチャレンジ投与した。３つの独立した実験で、変異 体ｄ３０１またはｎ５０４の接種を受けたマウスは生存率が１００％となり、野 生型ウイルスによるチャレンジから防御された。一方、野生型ウイルスだけを接 種した対照マウスは、生存率が２０％未満であった。その後３つの変異体ウイル ス（ｄ１２０、ｄ３０１、ｎ５０４）のすべてを用いて行なった実験で、対照マ ウス（ＰＢＳ注射）９匹のうち１匹だけが生存したのに対し、ＩＣＰ２７変異体 またはＩＣＰ８変異体をあらかじめ接種したマウスでは野生型ウイルスのチャレ ンジ投与後の生存率が１００％であった。即時早期遺伝子だけを発現するＩＣＰ ４変異体（ｄ１２０）ですら大多数のマウスを防御した。一方、ＵＶ照射ウイル スは最小の防御効果を示し、プソラレン不活化ウイルスで免疫化しても、マウス は致死的チャレンジから防御されなかった（図３）。 要するに、ＨＳＶ−１の複製欠損変異体は上記ウイルスの接種を受けたマウス において体液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導する能力がある。これらの変異体 をマウスに接種すると、これらのマウスを致死量の野生型ＨＳＶ−１によるチャ レンジから防御する。細胞性免疫は、単純ヘルペスウイルスの感染からの防御に とくに重要であるので［ホイットレー（Whitley），1990，In:Virology，ed．Fi elds and Knipe，Raven Press，p 1843-1887］、そのような免疫を誘導する能力 のあるも質であればいかなるものでもワクチン候補となりうる。上記したものな どの候補ワクチンも、複製を欠損するウイルスを含むので、とくに有用である。 これらのウイルスは子孫ウイルスを生じえないので、従来の減弱生ウイルスワク チンよりかなり安全である。上記したものなどの変異体ウイルスは、野生型相補 型の遺伝子を発現しない細胞中では複製できない。したがって、それらの変異体 ウイルスは最初の感染の場から広がることはできない。ヘルペスウイルスの病原 性に関するこの知見の重要な意味合いの一つは、上記変異体ウイルスはそれらの 導入先である宿主に潜伏感染を引き起こすことができにくいということである。 ｄ３０１またはｎ５０４のいずれかを角膜に接種されたマウスにおいて、これら のマウスから得た三叉神経節をイン・シチュ・ハイブリダイゼーションで潜伏期 関連の転写と発現について調べたとこ ろ、潜伏感染の検出を示す証拠がないという事実は、この説と一致する［コーエ ンら（Coen et al．）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:4736 et seq．（1989） 参照］。 上記研究で用いられたものなどのウイルス変異体および候補ウイルスワクチン として有用なそれ以外の変異体の構築とキャラクタライゼーションについて以下 に説明する。ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子の突然変異をコードするウイルスの構築とキャラ クタライゼーション 細胞、ウイルス、感染、トランスフェクション 細胞のウイルス感染と細胞のＤＮＡトランスフェクションをベロ細胞またはＶ ２７細胞中で実施した。ベロ細胞は、American Type Culture Collection， Roc kville，Md．から入手した。Ｖ２７細胞の誘導について以下に説明する。ＨＳＶ −１の野生型株であるＫＯＳ１．１をすべての実験で用いた。１細胞あたり１０ ｐｆｕの多重度で細胞に感染させた。以下に示すようにしてホスホノ酢酸（ＰＡ Ａ）ニナトリウム（Abbott Laboratories社，North Chicago，III．）を４００ μｇ／ｍｌの濃度となるよう培地に加えた。マーカー転移実験における細胞のウ イルスＤＮＡトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈澱法［ライスとクナ イプ（Rice and Knipe），1988，J．Virol．62:3814］を用いてＶ２７細胞中で 行なった。 ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子の安定組み込みコピーを有するＶ２７細胞系を 下記のようにして単離した。直径１００ ｍｍのプレートにほぼ全面に成育したベロ細胞を、薬物Ｇ４１８耐性を付与する プラスミドであるｐＳＶ２ｎｅｏ［サザーンとベルグ（Southern and Berg），1 982，J．Mol．Appl．Genet．1:327］の０．８μｇおよびＨＳＶ−１のＩＣＰ２ ７をコードするプラスミドであるｐＢＨ２７［ライスとクナイプ（Rice and Kni pe），1988，J．Virol．62:3814］の４または１０μｇでトランスフェクトさせ た。２日後、細胞を１：９の比率で１ｍｌあたり６００μｇのＧ４１８を含む培 地に継代した。２〜４週後にＧ４１８耐性コロニーを単離し、大量培養を行なっ た。得られた細胞系について、ＩＣＰ２７変異体ｔｓＹ４６［サックスら（Sack s et al．）1985，J． Virol．55:796］およびｔｓＬＧ４［サンドリーゴルディ ンら（Sandri-Goldin et al．），1981，J．Virol．38:41］のプラーク形成を支 持する能力に基づき、非許容温度でのＩＣＰ２７発現を調べた。このアッセイで は、１７個の単離株のうち６株が陽性であった。これらの細胞系のうちの１つを Ｖ２７と名付け、ＩＣＰ２７変異体の単離に用いた。サザーンブロット分析で、 Ｖ２７細胞は半数体ゲノムの１等量あたり約１個のＩＣＰ２７遺伝子コピーを有 することが示された。 ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７変異体の作成 ＩＣＰ２７はＨＳＶ−１の複製に不可欠の遺伝子であるため［サックスら（Sa cks et al．），1985，J．Virol．55:796］、ＩＣＰ２７に突然変異を有するウ イルスは致死的表現型を有する。そこで、Ｖ２７細胞を用いてそのような変異体 を 増殖させた。 大腸菌ｌａｃＺ遺伝子をＨＳＶ−１染色体に挿入すると、ウイルス変異体の単 離手段として有用である［カルミカエルとウエラー（Carmichael and Weller） ，1989，J．Virol．63:591；ゴールドシュタインとウエラー（Goldstein and We ller），1988，J．Virol．62:196］。ｌａｃＺ遺伝子の産物であるβ−ガラクト シダーゼを発現するウイルスプラークを、β−ガラクトシダーゼの発色基質であ るＸ−ｇａｌの存在下で、色（青）を指標として同定することができる。以下に 詳細に説明するように、まず、ＩＣＰ２７コード配列にフレーム内挿入されたｌ ａｃＺ遺伝子を有するβ−ガラクトシダーゼ発現性ＨＳＶ−１変異体を単離した 。次いで、このウイルスを、特異的に突然変異させたＩＣＰ２７対立遺伝子をウ イルスゲノムに導入するためのマーカー転移実験の受容体として使用した。新た に導入したＩＣＰ２７遺伝子を有する組替え体は、親の青色プラークのバックグ ランドに対して透明なプラークとして同定した。 ＨＳＶ−１のｌａｃＺ挿入変異体を作成するために、ｌａｃＺコード領域がＩ ＣＰ２７遺伝子の欠失バージョンに挿入された組替えプラスミドを構築した。次 いで、この融合遺伝子を、感染性ＨＳＶ−１のＤＮＡとともにＶ２７細胞に同時 トランスフェクションをさせた。トランスフェクション培養物由来の子孫ウイル スを、Ｘ−ｇａｌの存在下でＶ２７細胞上にプレート移植したところ、約３％の プラークが青色になった。１つの青色プラークを採取し、得られたウイルスクロ ーンをｄ２７−ｌａｃＺ１と名付けた。サザーンブロット分析で、ｄ２７−ｌａ ｃＺ１はＷＴのＩＣＰ２７遺伝子のＩＣＰ２７−ｌａｃＺ融合遺伝子での置換と 一致するゲノム構造を有することがわかった（図４Ａ）。また、ｄ２７−ｌａｃ Ｚ１−感染細胞はＷＴのＩＣＰ２７を発現せずその代わりにＩＣＰ２７−β−ガ ラクトシダーゼ融合タンパク質について予測されたサイズと一致する約１３７ｋ Ｄａのポリペプチドを発現した。ｄ２７−ｌａｃＺ１ウイルスのストックは、ベ ロ細胞上ではプラーク形成ができなかったが（＜２ｘ１０³ｐｆｕ／ｍｌ）、Ｖ ２７細胞上では効果的にプラークを形成した（２ｘｌ０⁸ｐｆｕ／ｍｌ）。ｄ２ ７−ｌａｃＺ１の単離に関する実験の詳細について以下に説明する。 プラスミドｐＰｓ２７ｐｄ１［ライスら（Rice et al．），1989，J．Virol． 63:3399］はＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡに由来する６．１キロベース（ｋｂ）のＰ ｓｔＩ挿入断片を含んでいる。この断片は、ＩＣＰ２７遺伝子全体ならびに隣接 配列を含んでいる（図４Ａ）。ＩＣＰ２７遺伝子に欠失を有するとともにｌａｃ Ｚ遺伝子の挿入を受けているｐＰｓ２７ｐｄ１誘導体を下記のようにして構築し た。ＳａｌＩで消化することによって、ＩＣＰ２７コード領域中でｐＰｓ２７ｐ ｄ１を線状化した。次いで、約０．５ｋｂのＤＮＡが各端から除去されるように 、ＤＮＡをＢａｌ３１で処理した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片［ アウスベルら（Ausubel et al．），1987，Current Protocols in Molecular Bi ology，John Wiley and Sons，NY］を用いる充填反応（fill ^- in reaction）で、両端を修復した。このＤＮＡをＢｇｌＩＩリンカー（New En gland BioLabs，Inc．社，Beverly，Mass．）につなぎ、得られた連結物をＢｇ ｌＩＩで消化し、再連結し、大腸菌の形質転換に使用した。それぞれＩＣＰ２７ 遺伝子と同じ方向にｌａｃＺ遺伝子が挿入された４つのプラスミド単離物が得ら れた。 上記４つのプラスミドＤＮＡのそれぞれをＰｓｔＩで消化し、ＷＴのＨＳＶ− １のＤＮＡとそれぞれ混合し、Ｖ２７細胞にトランスフェクトさせた。４日後に 、培養物を集め、得られたウイルスストックを、１％新生ウシ血清と０．１％ヒ ト免疫グロブリンを含む培地１９９（GIBCO Laboratories社，Grand Island，N. Y.）の液体重層条件下でＶ２７細胞上にプレート移植した。２日後、培地を１ｍ ｌあたり１％の新生ウシ血清、０．５％のアガロース、３００μｇの５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、Bo ehringer Mannheim Biochemicals社，Indianapolis，Ind．）を含む培地１９９ と交換した。生じた４つのウイルスストックのうちの１つが高率（約３％）で青 色プラークを生じた。１つの青色プラークを３回精製し、得られたウイルスクロ ーンをｄ２７−ｌａｃＺ１と名付けた。ｄ２７−ｌａｃＺ１のＤＮＡのサザーン ブロット分析で、ＷＴのＩＣＰ２７遺伝子はＩＣＰ２７−ｌａｃＺ融合遺伝子で 置換されていることがわかった（図４Ａ）。また、ウイルスＤＮＡのサザーンブ ロット分析ならびに親プラスミド（ｐＰｓｄ２７−ｌａｃＺ１と命名）の制限酵 素分析で、ｄ２７−ｌ ａｃＺ１において約０．８ｋｂがＩＣＰ２７遺伝子から欠失していることがわか った。 ＩＣＰ２７遺伝子に欠失またはナンセンス突然変異を含むＨＳＶ−１変異体の構 築 クナイプら（Knipe et al．），J．Virol．63:3400 et seq．記載の一般的説 明に従い、ＩＣＰ２７遺伝子に欠失またはナンセンスコドン挿入を有する５つの プラスミドを作成した。図４Ｂ参照。各プラスミド中のウイルスＤＮＡ挿入断片 をベクター配列から分離し、ｄ２７−ｌａｃＺ１ＤＮＡとともにＶ２７細胞に同 時トランスフェクションさせた。生じた子孫ウイルスをＸ−ｇａｌの存在下でＶ ２７細胞上にプレート移植したところ、一部（約１〜５％）が透明プラークを形 成した。透明プラークを形成したウイルスを単離し、免疫蛍光アッセイまたは以 下に述べるＤＮＡ制限分析によって、新規導入ＩＣＰ２７対立遺伝子を検出する スクリーニングを行なった。各変異体ごとに、陽性プラークを３回精製した。Ｉ ＣＰ２７欠失変異体の可能性のあるものをｄ２７−１と名付けた。ナンセンス変 異体の可能性のあるものをｎ５９Ｒ、ｎ２６３Ｒ、ｎ５０４Ｒと名付けた。変異 体の名称に付ついている数字は、各切断タンパク質に存在すると予想されるアミ ノ末端ＩＣＰ２７残基の数に相当する。一方、野生型タンパク質は５１２個のア ミノ酸残基からなる。 サザーンブロットハイブリダイゼーションにより組替えウイルスゲノムのキャ ラクタライゼーションを行ない、各ウイルスが適当な突然変異を含むことが確認 された。ウイルスＤ ＮＡを感染Ｖ２７細胞から単離し、サザーンブロットでＰｓｔＩとＸｂａＩの制 限酵素パターンを調べた。野生型ＩＣＰ２７遺伝子を含む６．１ｋｂのＰｓｔＩ ＨＳＶ−１ＤＮＡ断片をプローブとして用いた。この断片は、ＨＳＶ−１ゲノム のＬ成分の繰り返し配列の一部を含んでいるので（図４Ａ）、野生型ＨＳＶ−Ｉ ＤＮＡを調べたところ、２つのバンドが明白に見られた。これらのバンドは、６ ．１ｋｂのＩＣＰ２７断片とその他のＵ_L−Ｒ_Lジャンクションに由来する３．３ ｋｂの断片であった（図５）。一方、５つのＩＣＰ２７変異体ＤＮＡはいずれも ６．１ｋｂの断片を欠損していたが、３．３ｋｂの断片を含んでいた。変異体ｄ ２７−１は、予想された１．６ｋｂの欠失に一致する約４．６ｋｂの新規ＤＮＡ 断片を含んでいた。残りの４つの変異体はそれぞれ２つの新規バンドを含んでお り、それらの合計サイズは、各変異体ゲノム中の適当な位置にあるＸｂａＩ部位 の挿入と一致して約６．１ｋｂであった。さらに、上記変異体ゲノムのいずれも 、親のｄ２７−ｌａｃＺ１ＤＮＡだけに存在する８．４ｋｂのＰＳｔＩ断片を含 んでいなかった。 プラークアッセイを行なって、変異体がベロ細胞中で生育可能かどうかを調べ た。５つの変異体はいずれも、試験可能な最低希釈率でベロ細胞上にプラークを 形成することができなかったが（表１）（それ以下の希釈率では細胞単層が破壊 された）、各変異体はＶ２７細胞上で効果的にプラークを形成した。Ｖ２７ゲノ ム中に存在することが知られている唯一の無傷ＨＳＶ−１遺伝子はＩＣＰ２７遺 伝子の野生型コピー であるため、これらの結果は、各変異体における致死的欠損がこの野生型ＩＣＰ ２７によってトランス相補されることを示している。 これらの変異体の単離実験の詳細を以下に説明する。 ＩＣＰ２７遺伝子における欠失突然変異とナンセンス突然変異をプラスミドｐ Ｐｓ２７ｐｄ１に工学的に導入した（図４Ｂ）。４０６Ｒと５０４Ｒの突然変異 を有するプラスミド（それぞれｐＰｓ−４０６ＲとｐＰｓ−５０４Ｒという）を ライスら（Rice et al．）［1989，J．Virol．63:3399］の記載に従い構築した 。プラスミドｐＰｓｄ２７−１は、ｐＰｓ２７ｐｄ１をＢａｍＨＩとＳｔｕＩで 消化し、ＢａｍＨＩによるＤＮＡ３’陥凹末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのク レノウ断片で埋め、得られた大型ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで再び環状化する ことで構築した。プラスミドｐＰｓ−５９ＲとｐＰｓ−２６３Ｒは、上記プラス ミドｐＢＨ−５９Ｒ とｐＢＨ−２６３Ｒに由来する変異体の２．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片 を、ｐＰｓ２７ｐｄ１のＷＴの２．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片で置換す ることによって構築した。 以下のようにして組替え体ウイルスを構築した。上記プラスミドＤＮＡをＰｓ ｔＩで消化し、それぞれをｄ２７−ｌａｃＺ１ウイルスＤＮＡと混合し、Ｖ２７ 細胞にトランスフェクとさせた。３〜５日後に子孫ウイルスを集め、上記のよう にしてＸ−ｇａｌの存在下でＶ２７細胞上にプレート移植した。０．５〜５％の 頻度で見られた透明プラークを採取し、ＩＣＰ２７遺伝子突然変異を獲得したか どうかを決めるスクリーニングを行なった。 ２通りの方法でプラーク単離物をスクリーニングした。プラーク単離物である ｄ２７−１、ｎ５９Ｒ、およびｎ２６３ＲをＶ２７細胞中で３回精製した後、Ｖ ２７細胞の感染に使用した。感染細胞から粗ウイルスＤＮＡを調製した［ガオと クナイプ（Gao and Knipe），1989，J．Virol．63:5258］。各ＤＮＡ試料のＸｂ ａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素パターンを調べて、各突然変異の存在を確認した 。ｎ４０６Ｒとｎ５０４Ｒの場合、初期プラーク単離物を用いて小型のウイルス ストックを調製した。次いで、ガラスカバースリップ上で培養したベロ細胞に各 ウイルスを感染させた。感染細胞を固定し、抗ＩＣＰ２７モノクローナル抗体を 用いて免疫蛍光染色を行なった［アッカーマンら（Ackerman et al．），1984， J．Virol．52:108］。次いで、ｎ４０６Ｒとｎ５０４Ｒの 単離物をさらに２回プラーク精製し、各突然変異体の大型ストックをＶ２７細胞 中で調製した。 突然変異化ＩＣＰ２７ポリペプチドの発現と細胞内局在化 次に、突然変異体について、ＩＣＰ２７−関連ポリペプチドの発現があるかど うかを調べた。ベロ細胞にモック感染させるか、各ウイルスを感染させ、１０時 間ＰＩの時点で細胞抽出物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分 離し、ニトロセルロースに移し、モノクローナル抗体Ｈｌｌ１３と反応させた（ 図６）。モック感染細胞、ｄ２７−１−感染細胞、ｎ５９Ｒ−感染細胞の抽出物 ではＩＣＰ２７−関連ポリペプチドは検出されなかった。約３８ｋＤａのタンパ ク質がｎ２６３−感染細胞抽出物で検出され、約５２ｋＤａのタンパク質がｎ４ ０６−感染細胞の抽出物で検出された。ｎ５０４Ｒを感染させた細胞は、６３ｋ Ｄａの野生型タンパク質と同時泳動されるＩＣＰ２７−関連ポリペプチドを産生 した。切断タンパク質のサイズは、ＩＣＰ２７遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて予 想されたサイズとおおよそ一致していた［マックゲオクら（McGeoch et al．） ，1988，J．Gen．Virol．69:1531］。 ウイルスゲノム上で発現された変異体タンパク質の細胞内分布を調べるために 、各変異体を感染させたベロ細胞を４ｈＰＩの時点で集め、固定し、モノクロー ナル抗体Ｈ１１１３を用いて免疫蛍光顕微鏡標本を作成した。野生型ウイルスを 感染させた細胞は、核の１カ所以上の部分が相対的に強く染色されるという局在 化された核染色を示した（図７ＣとＤ） 。これらの部分は、核小体など特定の核領域とは対応していなかった。ｄ２７− １またはｎ５９Ｒを感染させた細胞では、バックグランドレベルを超える染色は 見られなかった。ｎ２６３Ｒを感染させた細胞は核染色を示し、ウイルス感染細 胞同様に核の一部が相対的に強く染色された（図７ＥとＦ）。これらの部分は核 小体に対応しているようであった。ｎ４０６Ｒを感染させた細胞も核染色を示し たが、染色パターンは野生型ウイルス感染細胞のものと２点で異なっていた（図 ７ＧとＨ）。まず、ほとんどの細胞では、ｎ４０６ＲによってコードされたＩＣ Ｐ２７タンパク質は核小体領域からほとんど排除されていた。次に、多くのｎ４ ０６Ｒ感染細胞はむしろ点状の染色パターンを示し、突然変異を受けたタンパク 質が球状クラスター状態で核内に濃縮されていた。ｎ５０４Ｒを感染させた細胞 も核染色を示したが、この場合、タンパク質は野生型ウイルス感染細胞で見られ たものよりも拡散したパターンを示す核全体に存在しているようであった。これ らの結果は、ｎ２６３Ｒ、ｎ４０６Ｒ、およびｎ５０４Ｒによってコードされた 突然変異型ＩＣＰ２７が細胞核に効果的に局在化されたものの、核内蓄積のパタ ーンの点で互いに異なり、野生型ウイルスとも異なっていたことを示している。 ＩＣＰ２７変異体を感染させた細胞におけるウイルスＤＮＡの合成 次に、ウイルスＤＮＡ複製に関してＩＣＰ２７変異体の表現型を決定した。各 変異体のウイルスＤＮＡ合成表現型を決 定するために、ベロ細胞にモック−感染させるか、各変異体を感染させた。１時 間の吸着期間の後で、単層を温かい培地でよく洗って未吸着ウイルスを除去した 。１ｈＰＩまたは１６ｈＰＩの時点でチャルベルグ（Challberg）の方法［チャ ルベルグ（Challberg）1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA83:9094］により全Ｄ ＮＡを調製した。精製したＤＮＡは、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づき定量 した。ＤＮＡを室温で３０分間、１００ｍＭの水酸化ナトリウム中で希釈、変性 させた。等量の１２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０． ０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを合わせたもの）を加え、スロットブロットマニ ホルド［シュライヒャーとシュエル（Schleicher and Schuell，Keene，N.H.） を用いてＤＮＡをニトロセルロースフィルターにかけた。フィルターを加熱し、 ＤＮＡをランダムプライマー標識法で調製した³²Ｐ標識ＨＳＶ−１特異的プロー ブにハイブリダイズさせた。プローブとしては、ＩＣＰ０遺伝子を含むｐＳＨＺ ［ナベルら（Nabel et al．），1988，Science 239:1299］またはＶｍｗ６５の 遺伝子を含むｐＲＢ３４４１［マックナイトら（McKnight et al．），1986，Ca ncer Cells 4:163］などを用いた。ＨＳＶ−１変異体であるｄ１０２はＩＣＰ８ 遺伝子に大きな欠失を有するのでＤＮＡを複製できないが［ガオとクナイプ（Ga o and Knipe），1989，J．Virol．63:5258］、これを陰性対照としてこれらの実 験で使用した。ウイルスＤＮＡは野生型ウイルス−感染細胞において高レベルで 複製した。一方、ｄ１０２−感染細胞では、ウイルスＤＮ Ａ複製の証拠は見られなかった。５つのＩＣＰ２７変異体はいずれも感染過程で ウイルスＤＮＡを複製する能力があった（図８）。 これらの結果を定量化するために、各スロットにハイブリダイズした放射活性 量をシンチレーションカウンターを用いて測定し、データを表２にまとめた。こ れらの結果によれば、変異体をＤＮＡ複製に関して２種類の表現型クラスに分け ることができた。変異体ｄ２７−１、ｎ５９Ｒ、ｎ２６３Ｒ、およびｎ４０６Ｒ を含む第１のクラスは、ＤＮＡ合成率と複製ＤＮＡの安定性によって測定される 量的指標である感染細胞中のウイルスＤＮＡ蓄積レベルを測定した実験で部分欠 損を示した。 ^a これらの数字は16h PIの時点での感染ベロ細胞中のHSV-1のＤＮＡの量の1h P Iの時点での存在量に対する比である。ＤＮＡは図５に示すように検出し、上述 のように定量した（実験１は図５に相当し、実験２は別の実験であった）。実験 １のプローブはpSHZであり、実験２のプローブはpRB3441であった。^b 各実験において、野生型ウイルスによるＤＮＡ増幅の量を100％に正規化し、 他の値はこの値に対する相対値として表している。ｄ１０２は感染中にＤＮＡの 量の減少を示すので、 ％値は決定しなかった。 ＩＣＰ２７変異体感染細胞におけるウイルスタンパク質合成のパターン ＩＣＰ２７遺伝子における突然変異がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を調べ るために、変異体感染細胞におけるウイルスタンパク質合成を調べた。３、６、 または９ｈＰＩの時点で、モック−感染またはＨＳＶ−１−感染ベロ細胞を培地 １ｍｌあたり１５μＣｉの［³⁵Ｓ］メチオニンで標識した。タンパク質を細胞か ら抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーで可視化した（ 図９）。３および６ｈＰＩの時点で、ｎ４０６Ｒ以外のＩＣＰ２７変異体は野生 型ウイルス感染細胞で見られたパターンに質的に似たタンパク質合成パターンを 示した。ｎ４０６Ｒを感染させた細胞はＩＣＰ６、ＩＣＰ８、ｇＢ前駆体（ｐｇ Ｂ）など数種類のタンパク質を欠損しているようであったが、９ｈＰＩの時点で は、５つのＩＣＰ２７変異体のいずれを感染させた細胞も野生型ウイルスと比べ て量的にも質的にも異なるウイルスタンパク質合成を示した。５つの変異体は９ ｈＰＩの時点でのウイルスタンパク質合成に関して４つの表現型クラスに分類で きた。変異体ｄ２７−１とｎ５９Ｒは、何度実験してもタンパク質合成パターン の点で常に互いに識別不能であった。これらの変異体はどちらもほとんどのβタ ンパク質を高レベルで発現したが、ＩＣＰ５とＩＣＰ２５を含む数種類のγ−１ タンパク質の発現レベルは（野生型のレベルと比べて）より低かった（図９、９ ｈＰＩ）。変異体ｎ２６３Ｒは、９ｈＰ Ｉの時点でのタンパク質合成パターンがｄ２７−１およびｎ５９Ｒのものと非常 に似ていたが、この変異体は数種類のγ−１タンパク質の発現量が少し多かった 。変異体ｎ４０６Ｒを感染させた細胞においてＩＣＰ６、ＩＣＰ８、およびｐｇ Ｂをはじめとする多くのウイルスタンパク質のレベルが明らかに大幅な低下を示 したという点で、この変異体はウイルスタンパク質合成に関し異常な表現型を有 していた。９時間ＰＩの時点でｄ２７−１−感染細胞と比べてγ−１タンパク質 であるＩＣＰ５とＩＣＰ２５のレベルが高くなったので、この効果はすべてのウ イルスタンパク質にあてはまるものではなかった。変異体ｎ５０４ＲはＩＣＰＩ ／２やＩＣＰ１５などのβタンパク質とγ−１タンパク質を高レベルで発現した 。 野生型ウイルス感染細胞においては、９時間ＰＩの時点で、αタンパク質であ るＩＣＰ４とＩＣＰ２７の発現が顕著に低下した（図９）。この現象は、細胞に ５つのＩＣＰ２７変異体のいずれを感染させた場合にもみられなかった。また、 ｎ５０４Ｒ−感染細胞ではＩＣＰ２７ポリペプチドの発現は止められなかった（ その他の変異体のいずれも、ＷＴのＩＣＰ２７と共泳動されるタンパク質をコー ドしないので、これはＩＣＰ２７タンパク質合成速度の直接比較が可能な唯一の ケースである）。ｎ４０６Ｒ以外のＩＣＰ２７変異体もＩＣＰ６やＩＣＰ８をは じめとする多くのβタンパク質の発現を負調節する能力を欠いていた。これらの 結果は、ＩＣＰ２７がα遺伝子とβ遺伝子の発現に負の調節作用を及ぼすことを 示唆するものである。 変異体ウイルス感染細胞で見られたウイルスＤＮＡ合成の欠損が野生型タンパ ク質の発現によって修復可能かどうかを調べるために、以下の実験を行なった。 ベロ細胞またはＶ２７細胞に野生型ウイルスまたは変異体の一つを感染させた。 １５ｈＰＩの時点で感染細胞タンパク質を［³⁵Ｓ］メチオニンで標識し、続いて ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーで分析した（図１０）。ベロ細胞中 １５時間ＰＩの時点で見られた各変異体のタンパク質発現パターンは、９時間Ｐ Ｉの時点での上記パターンと同様であったが、Ｖ２７細胞に各変異体を感染させ たところ、野生型ウイルスのものにさらに類似したタンパク質合成パターンが見 られた。 ＩＣＰ２７変異体ウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡの蓄積 変異体感染細胞において発現された定常レベルのウイルスｍＲＮＡをノーザン ブロットハイブリダイゼーションで分析した。各変異体を感染させた細胞をノニ デットＰ−４０処理することによってＲＮＡを単離した後、フェノール−クロロ ホルムで抽出した。このＲＮＡをエタノールで沈殿させ［クレシグら（Klessig et al．），1975，J．Virol．16:1850］、緩衝液に懸濁し、ＲＮアーゼを含まな いＤＮアーゼＩ（Bethesda Research Laboratories社，Gaithersburg,Md.）で消 化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで再沈殿させた。１０マ イクログラムの各ＲＮＡ試料を変性ホルムアルデヒド−アガロ−スゲル上の電気 泳動に付した［サ ムブルックら(Sambrook et al．），supra］。電気泳動終了後、ＲＮＡをジーン スクリーン（GeneScreen）フイルター（DuPont，NEN Research Products社，Bos ton，Mass．）に移した。次いで、ＲＮＡの³²Ｐ標識プローブへのハイブリダイ ゼーションを行なった［ライスとクレシグ（Rice and Klessig），1984，J．Vir ol．49:35］。プローブとしては、ｐＢＨ２７（ＩＣＰ２７遺伝子をコードする ）［ライスとクナイプ（Rice and Knipe）、本明細書の他所に引用］、ｐＫ１− ２（ＩＣＰ４遺伝子をコードする）［デルカとシャッファー（DeLuca and Schaf fer），1987，Nucl．Acids Res．15:4491］、およびｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ −Ｉ−Ｉ （ｇＣ遺伝子をコードする）［フリンクら（Frlnk et al．），1983 ，J．Virol．45:634］などを用いた。ウルトラスキャン（Ultrascan）レーザー デンシトメーターとオンラインインテグレーター（LKB Instruments，Inc．社， Rockville，Md．）を用いて濃度測定法でオートラジオグラムを分析した。 具体的には、モック−感染させたベロ細胞、野生型ウイルスを感染させたベロ 細胞、または変異体ｎ５９Ｒ、ｄ２７−１、またはｎ５０４Ｒを感染させたベロ 細胞からＲＮＡを抽出した。野生型ウイルス感染は、ＨＳＶ−１ウイルスＤＮＡ 合成の特異的阻害剤であるＰＡＡの存在下または非存在下で行なった。９時間Ｐ Ｉの時点で感染細胞から細胞質ＲＮＡを単離した。ノーザンブロット転写を行な った後、フィルターをＩＣＰ２７（図１１Ａ）、ＩＣＰ４（図１１Ｂ）、または ｇＣ（図１１Ｃ）のｍＲＮＡに対して特異的な放射標識ＤＮ Ａをプローブとして調べた。モック−感染細胞やｄ２７−１−感染細胞（図１１ Ａ）レーン２と３）では、ＩＣＰ２７特異的ｍＲＮＡは見られなかった。ｎ５９ Ｒやｎ５０４Ｒを感染させた細胞から単離したＲＮＡ（図１１Ａ、レーン４と５ ）は野生型ウイルス感染細胞から得たＲＮＡ（図１１Ａ、レーン６）より２〜３ 倍多い量の２．０ｋｂのＩＣＰ２７ｍＲＮＡを含んでいた。この結果は、９ｈＰ Ｉの時点でｎ５０４Ｒ−感染細胞で見られたＩＣＰ２７タンパク質合成レベルの 上昇と定性的に一致していた。 ＩＣＰ２７特異的ｍＲＮＡで得た結果とは対照的に、ほぼ等量のＩＣＰ４ｍＲ ＮＡがｄ２７−１−、ｎ５９Ｒ−、および野生型ウイルス−感染細胞で見られた が（図１１Ｂ、レーン３、４、６）、ｎ５０４Ｒ−感染細胞は野生型ウイルス− 感染細胞より１．６倍多い量のＩＣＰ４ｍＲＮＡを蓄積しただけであった（図１ １Ｂ、レーン５と６）。９時間ＰＩの時点で野生型ウイルス感染細胞にＩＣＰ４ タンパク質がほとんどあるいは全く見られなかったことから、これらの結果はや や予想外であった。ＩＣＰ４の合成はＩＣＰ２７変異体感染細胞で容易に検出さ れたので（図９、９ｈＰＩ）、９時間ＰＩの時点でのＩＣＰ４の発現レベルは細 胞質ＩＣＰ４転写物のレベルを反映していないことになる。このことは、ＩＣＰ ４のｍＲＮＡは野生型ウイルス感染細胞よりもＩＣＰ２７変異体感染細胞におけ る方がより効果的に翻訳されることを示唆している。 γ−２遺伝子をコードするｇＣに対して特異的なｍＲＮＡ の蓄積を変異体感染細胞で調べた。ＰＡＡによりウイルスＤＮＡ複製を阻害する と、野生型ウイルス感染細胞中に蓄積するｇＣのｍＲＮＡの量が大幅に減った（ 図１１Ｃ、レーン１と６；オートラジオグラム露出時間を延長すると、レーン１ にｇＣのｍＲＮＡが検出できた）。ｄ２７−１−、ｎ５９Ｒ−、またはｎ５０４ Ｒ−感染細胞はいずれも検出可能レベルのｇ ＣのｍＲＮＡを発現しなかった（ 図１１Ｃ）それぞれレーン３と４と５）。このことは、感染時にＷＴレベルのＤ ＮＡを複製した変異体ｎ５０４Ｒの場合にとくに興味深い。γ−２遺伝子の発現 には、ウイルスＤＮＡとウイルスをコードするトランス作用性因子すなわちＩＣ Ｐ２７の両方が複製される必要がある。ＨＳＶ−１のＩＣＰ８遺伝子における変異体の構築とキャラクタライゼーション ＩＣＰ８発現細胞系の単離 デルカら（DeLuca et al．）［1985，J．Virol．56:558］の記載と実質的に同 じやり方で、ベロ細胞をプラスミドｐＳＧ１８−ＳａｃＩ［リーとクナイプ（Le e and Knipe），1983，J．Virol．46:909；クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe），1985，Mol．Cell．Biol．5:957］またはｐ８Ｂ−Ｓ［ガオら（Gao et al．），1988，Ｖirology 163:319］およびｐＳＶｎｅｏ［サザーンとベルグ（ Southern and Berg），1986，J．Mol．Appl．Genet．1:327］で形質転換した。 抗生物質Ｇ４１８を含む培地で培養した後、２１個の薬物耐性コロニーを単離し 、増幅し、ＩＣＰ８変異体であるｔｓ１ ３、ｔｓ１８、およびｔｓＨＡ１［コンレーら（Conley etal．），1981，J．Vi rol．37:413；ホランドら（Holland etal．），1984，J．Virol．49:947］の生 育を相補する能力についてスクリーニングを行なった。非許容温度では、これら のｔｓ変異体は、ＩＣＰ８遺伝子を受け取った培養物に由来する２１の細胞系の うち７細胞系においてプラークを形成したが、ｐＳＶ２ｎｅｏのみでトランスフ ェクトされた細胞に由来するＮｅｏ^r細胞中ではプラークを形成しなかった。そ れぞれプラスミドｐ８Ｂ−ＳとｐＳＧ１８−ＳａｃＩでトランスフェクトされた 細胞に由来する細胞系であるＢ１０とＳ２は最高レベルの相補をもたらしたので 、これらを選んでさらに調べた（表３）。野生型ウイルスは両方の温度において Ｂ１０細胞とＳ２細胞のみならずＮｅｏ^r細胞においてもプラークを形成した。 変異体ウイルスｔｓ１３、ｔｓ１８、およびｔｓＨＡ１は３３．５℃の温度での みＮｅｏ^r細胞中で効果的にプラークを形成したが、Ｂ１０細胞とＳ２細胞中で は両方の温度で野生型と同等の効率でプラークを形成した。サザーンブロットハ イブリダイゼーションを行なってこれらの細胞系におけるＩＣＰ８遺伝子のコピ ー数を求めたところ、Ｂ１０細胞とＳ２細胞はそれぞれ半数体ゲノム１個あたり 約１コピーと１０コピーを含んでいた。 ^a Ｂ１０細胞、Ｓ２細胞およびNeo^r細胞の培養物を各ウイルスで感染させ、３ ３．５℃または３９℃でインキュベートした。^b プラーク数は２〜３日目に数えた。 いずれの実験でも、単層培養物に野生型または変異体ウイルスを１細胞あたり２ ０ｐｆｕの多重度で感染させた。 プラスミド プラスミドｐ８Ｂ−Ｓ、ｐＳＶ８、ｐｍ１およびそれらのヌクレオチド番号付 与体系が記載されている［ガオら（Gaoet al．），1988，Ｖlrology 163:319； スーとクナイプ（Su and Knipe），1987，J．Virol．61:615］。プラスミドｐ８ Ｂ−Ｓは、ＩＣＰ８プロモーターを含む５．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片 （マップ単位０．３７４〜０．４１１）をｐＵＣ１８にクローニングすることに よって構築した。プラスミドｐＳＶ８は、５．５ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片 （マップ単位０．３７４〜０．４０９）をサルウイルス４０早期プロモーターの 下流に挿入することによって構築した。プラスミドｐｍ１は、ＩＣＰ８遺伝子の コドン４９９と５０２をグリシンでなくシステインをコードするように変化させ る ことによって、プラスミドｐＳＶ８から誘導した。この研究で使用した変異体Ｉ ＣＰ８プラスミドは、５．５ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（マップ単位０．３ ７４〜０．４０９）がそれぞれｐＵＣ１９またはｐＳＰ６４に挿入されたｐＩＣ Ｐ８またはｐＳＰＩＣＰ８から誘導したものである。プラスミドｓｐＩＣＰ８を 線状化し（ＳｍａＩによる部分消化によって行なった）、その後にそれぞれヌク レオチド４０８４と３６９５の部位において３つの読み取り枠すべてに終止コド ンを有する１４ヌクレオチドＸｂａＩリンカー（５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣ ＴＡＧ−３’、New England BloLabs，Inc．社，Beverly，Mass．）を挿入する ことによって、プラスミドｐｎ１０とｐｎ２を作成した。したがって、ｐｎ１０ は最初の１１６０個のアミノ酸残基をコードし、ｐｎ２はＩＣＰ８の最初の１０ ２９個のアミノ酸残基、ならびにＸｂａＩリンカー配列によってコードされる４ つの付加アミノ酸Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐをコードする。２００１塩基 対（ｂｐ）のＮｏｔＩ断片（ヌクレオチド１３９５〜３３９６）の内部読み取り 枠内欠失によってプラスミドｐｄ３０１を作成した。プラスミドｐｄ１０１とｐ ｄ１０２は以下のようにして構築した。ＳｍａＩによる部分消化でプラスミドｐ ＳＰＩＣＰ８を線状化し、１２ヌクレオチドＢｇｌＩＩリンカー５’−ＧＧＡＡ ＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’をそれにつないだ。ＢｇｌＩＩ（ヌクレオチド６５２の 位置にあるＳｍａＩ部位から変換）およびＢａｍＨＩ（ヌクレオチド２２９４） による消化で１６４２ｂｐの欠失を作成して、プラスミドｐｄ １０１を得た。したがって、ｐｄ１０１は残基１７〜５６３に対応するコドンを 欠いているが、ＢｇｌＩＩリンカー配列によってコードされる１つのＡｒｇコド ンが挿入されている。ＢｇｌＩＩ（ヌクレオチド６５２と１８４０の位置にある ＳｍａＩ部位から変換）による消化で１，１８８ｂｐの欠失を作成して、プラス ミドｐｄ１０２を得た。したがって、ｐｄ１０２はＩＣＰ８をコードする配列の 残基１７〜４１１に対応するコドンを欠いているが、ＢｇｌＩＩリンカー配列中 の３つの付加アミノ酸Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコードする。プラスミドｐｄ１ ０１とｐｄ１０２はいずれもＩＣＰ８ポリ（Ａ）シグナルの下流のヌクレオチド ４４１９の位置に１４ヌクレオチドのＸｂａＩリンカーを有している。ヌクレオ チド４０８４と１８４０の付近にはその他のＳｍａＩ部位が存在するので、ｐｎ １０とｐｄ１０２の両方の配列を決めて、正確な突然変異部位を決定した。 変異体ウイルスの構築 ＩＣＰ８の機能ドメインを決定するために、数種類の突然変異をＩＣＰ８遺伝 子のコード領域に導入した（図１２）。すなわち、（ｉ）ナンセンス突然変異（ ｐｎ１０とｐｎ２）、（ｉｉ）内部欠失（ｐｄ３０１、ｐｄ１０１、ｐｄ１０２ ）、および（ｉｉｉ）部位特異的突然変異（ｐｍ１）［ガオら（Gao et al．） ，1988，Virology 163:319］である。マーカー転移後の組替え体ウイルスのスク リーニングを容易にするために、ＩＣＰ２７変異体の作成について上記したのと 同様の方法でＩＣＰ８コード領域にｌａｃＺ遺伝子が挿入され た変異体ウイルスを構築した。この組替え体ウイルス（ＨＤ−２と名付けた）は 、Ｘ−Ｇａｌの存在下でＩＣＰ８発現細胞系で青色プラークを形成したが、ベロ 細胞ではプラークを形成しなかった。様々な変異体ＩＣＰ８をコードするＤＮＡ をこの親株に組替え、生じた子孫を白色プラークから単離した。白色プラークは ２〜３９％の頻度で出現した。ＨＤ−２のＤＮＡとｐｄ１０１またはｐｄ１０２ でトランスフェクトさせた細胞における白色プラークの出現頻度はバックグラン ドを超えなかった。これはおそらく、ｐｄ１０１またはｐｄ１０２とＨＤ−２の ＤＮＡの間の組替えに利用可能なウイルス配列の量が制限されていたことによる ものであった。 以下のタイプの分析を行なって、上記組替え体ウイルスがＩＣＰ８遺伝子に適 当な突然変異を有することを証明した。ウイルスＤＮＡを単離し、適当な制限酵 素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分析した。サザーンブロット分析を行な ってウイルスＤＮＡ中に突然変異が存在することを証明するとともに、変異体ウ イルス集団の純度を測定した。たとえば、野生型ＤＮＡの８．２ｋｂのＢａｍＨ Ｉ Ｇ断片（図１３、レーン１）はＸｂａＩリンカー（レーン３）が存在するた め、ＢａｍＨＩとＸｂａＩによる消化でｎ２ＤＮＡ中の６．８ｋｂと１．４ｋｂ の断片に分割した。ＢａｍＨＩ ＧとＶ（２．３ｋｂｐ）のジャンクション領域 はＨＤ−２中のｌａｃＺ遺伝子で置換されたので、ＨＤ−２のＤＮＡをＢａｍＨ ＩとＸｂａＩで消化したところ、１２．６ｋｂの断片が得られた（図１３、レー ン２）。ＫｐｎＩで消化した野生型（図 １３、レーン４）、ＨＤ−２（レーン６）およびｎ２（レーン５）のＤＮＡを比 較したところ、野生型のＤＮＡとｎ２のＤＮＡは互いに類似していたが、ｌａｃ Ｚ挿入のためにＨＤ−２のＤＮＡ（レーン６）のそれとは異なっていることがわ かった。 ＩＣＰ８遺伝子に突然変異を有するウイルスの単離実験の詳細について以下に 説明する。 ＩＣＰ８遺伝子にｌａｃＺ挿入を有する変異体ウイルスＨＤ−２を以下のよう にして単離した。ｐＩＣＰ８から７８０−ｂｐＣ７）ＸｈｏＩ断片を欠失させた 後、このプラスミドをＢａ１ ３１で短時間消化し、このＤＮＡの両端にＢｇｌ ＩＩリンカーをつなぎ、ｌａｃＺ遺伝子（Pharmacia，Inc．社，Piscataway N.J ．）を挿入した。ｐＭＣ１８７１のｌａｃＺ遺伝子は転写プロモーターを含んで おらず、最初の８つの非必須アミノ末端コドンも欠いている。ＩＣＰ８：ｌａｃ Ｚプラスミド混合物を野生型ウイルスＤＮＡとともにＢ１０細胞にトランスフェ クトさせた。子孫ウイルスを単離し、０．１％ヒト免疫血清を含む１％子ウシ血 清を添加した培地１９９中のＢ１０細胞またはＳ２細胞上にプレート移植して、 ３７℃で１〜２日培養した。次いで、β−ガラクトシダーゼ活性を検出するため に、１ｍｌあたり４００μｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ− ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含む１．０％アガロースを添加した培地１ ９９と元の培地を交換し、インキュベーションを８〜１６時間続けた。組替え体 ウイルスは青色プラークとして同定し、約０ ．１〜０．５％の頻度で単離した。ＨＤ−２と名付けた１つの変異体単離物のプ ラーク精製を行なった。 この研究では、ｄ３０１以外のすべての変異体ウイルス作成の親ウイルスとし てＨＤ−２を用いた。感染性ＨＤ−２のＤＮＡを突然変異化ＩＣＰ８遺伝子をコ ードするプラスミドとともに同時トランスフェクションを行った後、Ｘ−Ｇａｌ の存在下で増殖させた白色プラークから組替え体ウイルスを単離した。 変異体ウイルスｄ３０１は、感染性野生型ウイルスのＤＮＡおよび２，００１ ｂｐのＮｏｔＩ断片がＩＣＰ８コード配列から欠失しているプラスミドｐｄ３０ １とともにＢ１０細胞を同時トランスフェクションさせることによって構築した （図１２）。このトランスフェクションでできた子孫ウイルスについて、ベロ細 胞ではなくＢ１０細胞における複製能力を試験した。 変異体ウイルスの生育特性 図１２に示した各変異体ウイルスはベロ細胞中では複製能力がなく、Ｂ１０細 胞またはＳ２細胞中に存在するＩＣＰ８遺伝子の野生型コピーによる相補が必要 であった。各変異体ウイルスは、これらのＩＣＰ８発現細胞系における野生型レ ベルと同等のレベルまで複製した。変異体ウイルスが形成したプラークのサイズ は、野生型ウイルスが形成したものよりやや小さかった。さらに、いずれの場合 も、Ｂ１０細胞またはＳ２細胞中で増殖させた変異体ウイルスはそれ自体の変異 体表現型を維持していた。 変異体ウイルスによるＩＣＰ８の発現 上記のようにしてウエスタンブロッティングにより、変異体感染細胞における ウイルスタンパク質合成を調べた。ウサギポリクローナル血清３−８３［クナイ ブら（Knipe et al．），1987，J．Virol．61:276］またはマウスモノクローナ ル抗体１０Ｅ−３［ローズら（Rose et al．），1986，J．Gen．Virol．67:1315 ］を用いてＩＣＰ８を検出した（図１４）。変異体ウイルスごとに特定されるＩ ＣＰ８ポリペプチドのサイズは予想されたサイズと一致していた。マウスモノク ローナル抗体１０Ｅ−３は、変異体ｐｍ１、ｄ１０１、ｄ１０２、およびｄ３０ １によって発現されたＩＣＰ８ポリペプチドと反応したが、ｎ１０とｎ２によっ て発現されたものとは反応しなかった（表４）。このことは、この抗体の少なく とも一部が、ＩＣＰ８のカルボキシル末端の３６個のアミノ酸の中に含まれてい るエピトープと反応することを示唆している。これらの結果は、ｄ１０１、ｄ１ ０２、およびｄ３０１がフレーム内欠失を有することも示している。 ^a 上清画分およびペレット画分は、ＤＮアーゼＩ処理後に遠心分離によって得 られる試料と定義された（クナイプら（Knipe et al．，1987，J．Virol．44:73 6）。^b ICP8を可視化するためウエスタンブロットに用いられた抗体はウサギポリク ローナル３−８３（Knipe et al．，1987，J．Virol．61:276）またはマウスモ ノクローナル10Ｅ−３（Rose et al．，1986，J．Gen．Virol．67:1315）であっ た。ウエスタンブロットの呈色反応が陰性のものは、デンシトメータで測定した 。 変異体ウイルス感染細胞におけるウイルスＤＮＡの複製 非許容条件下での各変異体ウイルス感染細胞におけるＤＮＡ複製を調べるため に、ベロ細胞に各ウイルスを感染させ、６〜１０時間ＰＩの間、［³Ｈ］−チミ ジンを培養物に加えた。細胞を集め、ＤＮＡを単離した。各ＤＮＡ試料をＢａｍ ＨＩとＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。ＨＳＶ−１のＤＮ Ａポリメラーゼを優先的に阻害する化合物であるホスホノ酢酸の存在下で培養し た野生型ウイルスの場合（図１５、レーン５）と同様、各変異体はウイルスＤＮ Ａを複製できなかった（図１５、レーン６〜１１）。野生型におけるＤＮＡ複製 レベルを図１５のレーン４に示した。 ウイルスＤＮＡ分析実験の詳細を以下に示す。 （ｉ）ＤＮＡの調製：クナイプら（Knipe et al．）［1979，J．Virol．29:698 ］に従い、プラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡを調製した。サザーンブロット分 析に使用したウイルスＤＮＡは、以下のようにして精製した。後期ＰＩ時間の時 点で感染細胞を凍結融解させた後、０〜４℃で３０秒間にわたり４８０ｘｇで超 音波処理した。生じた上清を２３，５００ｘｇの遠心分離にかけた。ペレットを フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：２４：１）で３回抽 出した。エタノール沈殿させた後、ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶かした 。 （ｉｉ）ウイルスＤＮＡ合成の測定：細胞に適当なウイルスを感染させ、１ｍｌ あたり２０μＣｉの［³Ｈ］チミジンで６〜１０時間標識し、全ＤＮＡをチャル ベルグ（Challberg）の方法［1986，Proc．Natl．Acad．Sci．US 83:9094］によ って単離した。ＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分 離した。電気泳動終了後、ゲルを１．０Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理してフ ルオログラフィーを行なった［チャンバーライン（Chamberlain），1979，Anal ．Biochem．98:132］。 突然変異化ＩＣＰ８のＤＮＡ結合特性 変異体ＩＣＰ８分子のＤＮＡ結合特性を調べる前に、個々のポリペプチドの溶 解性を測定したところ（表５）、非常に変動が大きいことがわかった。次いで、 可溶性の突然変異化ＩＣＰ８分子のＤＮＡ結合特性を１本鎖ＤＮＡセルロース上 のクロマトグラフィーで調べた。４〜６時間ＰＩの間［³⁵Ｓ］メチオニンで細胞 を標識すること以外は既報［クナイプら（Knipe et al．），1981，J．Virol．4 4:736］と同じ方法に従い、感染細胞抽出物の１本鎖ＤＮＡセルロースクロマト グラフィーを行なった。タンパク質を１本鎖ＤＮＡセルロースを含むカラムにか け、濃度上昇勾配のＮａＣｌで溶出させた。野生型ウイルスと変異体ｐｍ１を比 較した実験の結果を図１６に示す。野生型ウイルス感染細胞中で発現されたＩＣ Ｐ８のほとんどはカラムに結合し（図１６Ａのレーン４と５を比較）、次いで０ ．５Ｍ濃度のＮａＣｌで溶出された（レーン１２）。一方、ｐｍ１感染細胞中で 発現されたＩＣＰ８はほとんどカラムに結合しなかった（図１６Ｂのレーン４と ５を比較）。ｎ１０感染細胞中で発現されたＩＣＰ８は、野生型ＩＣＰ８と同じ 効率と強度で１本鎖ＤＮＡセルロースに結合した。ｄ３１０感染細胞中で発現さ れたＩＣＰ８で最低レベルの結合（２１％）が見られた。アミノ末端欠失変異体 であるｄ１０１とｄ１０２によってコードされたＩＣＰ８はそれぞれ７２％と７ ５％のレベルでＤＮＡセルロースに結合した。これらの結果によれば、ＩＣＰ８ のアミノ酸残基５６４〜１１６０部分がＤＮＡ結合に必要な領域を含むと結論づ けられる。 ^a ウエスタンブロットで調製された陰性のもののデンシトメトリで得られたデ ータ。 ウイルス変異体によってコードされたＩＣＰ８分子の核局在化 野生型ＩＣＰ８は感染細胞中で効率的に核に局在化する［フェンウイックら（ Fenwick et al．），1978，J．Gen．Virol．39:519；クナイプとスパング（Knip e and Spang），1982，J．Virol．43:314；クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe），1983，Mol．Cell．Biol．3:315；クインランとクナイプ（Quinlan an d Knipe），1985，Mol．Cell．Biol．5:957］。ｎ２以外のすべての変異体ウイ ルスの場合は、７９３抗ＩＣＰ８モノクローナル抗体の１：１０希釈液とローダ ミン複合ヤギ抗マウス抗体の１：１００希釈液を用いるクインランとクナイプ（ Quinlan and Knipe）［1983，Mol．Cell．Biol．3:315］の方法に従って実施し た間接免疫蛍光法で、野生型と変異体のＩＣＰ８分子の細胞内分布を調べた。 ｎ２のＩＣＰ８の検出は、抗ＩＣＳＰ１１／１２ポリクローナル血清［パウエル ら（Powell et al．），1981，J．Virol．39:894］の１：３０希釈液とフルオレ セイン複合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンの１：２００希釈液を用いて行った。結 果を図１７に示す。ｎ１０は、カルボキシル末端から最後の３６個のアミノ酸を 欠損していて野生型ＩＣＰ８と同程度に効果的にＤＮＡに結合するＩＣＰ８ポリ ペプチドをコードしたが、核には局在せず、感染細胞の細胞質内に留まっていた （図１７Ｃ）。一方、ＤＮＡとの結合が弱いｐｍ１のＩＣＰ８ポリペプチドは主 に核に存在することがわかった（図１７Ｅ）。これらの結果は、ＩＣＰ８の核局 在化シグナル（単数または複数）がＤＮＡ結合機能と分離していることを明白に 証明している。 ｄ１０１によってコードされたＩＣＰ８は核に局在し（図１７Ｈ）、ＤＮＡと 結合する能力もあったが（表５）、このウイルスはウイルスＤＮＡ複製能力がな かった。この変異体の表現型は、ＩＣＰ８はＤＮＡとの結合以外の核機能を有し ていることを示す遺伝的証拠を提供するものである。 ＩＣＰ８変異体の表現型特性を下記の表６にまとめる。 他の態様は以下のクレームに含まれる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬学的に許容され得る担体中に懸濁された突然変異化ヘルペスウイルスを 含むワクチンであって、該ヘルペスウイルスが哺乳動物細胞に感染することがで き、そして該ヘルペスウイルスでワクチン接種された哺乳動物中で防御免疫応答 を引き出すことができ、該ヘルペスウイルスの複製に不可欠な蛋白質をコードす る遺伝子の少なくとも一つにおいて突然変異していることに特徴を有し、該突然 変異が該ウイルスを複製欠損とするものであるワクチン。 ２．該ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ 、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７である請求項１記載のワクチン。 ３．該蛋白質がＨＳＶ−１ ＩＣＰ２７またはそのホモログである請求項１記 載のワクチン。 ４．該ヘルペスウイルスがｎ５０４Ｒである請求項３記載のワクチン。 ５．該蛋白質がＨＳＶ−１ ＩＣＰ８またはそのホモログである請求項１記載 のワクチン。 ６．該ヘルペスウイルスがｄ３０１である請求項５記載の ワクチン。 ７．該ヘルペスウイルスが以下の蛋白質：ＨＳＶ−１ ＩＣＰ２７、ＨＳＶ− １ ＩＣＰ８、ＨＳＶ−１、またはそれらのホモログ、の少なくとも一つをコー ドする遺伝子中に突然変異を含むものである請求項１記載のワクチン。 ８．該ヘルペスウイルスがさらに１種以上の異種遺伝子をコードするものであ る請求項１記載のワクチン。 ９．該ヘルペスウイルスがウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の野生型をコード するものである請求項１記載のワクチン。 １０．請求項１ないし請求項９いずれか１項に記載の突然変異化ヘルペスウイ ルスを構築し、そして該ヘルペスウイルスを薬学的に許容され得る担体中に懸濁 させることを含むヘルペスウイルスワクチンの製造方法。 １１．請求項１ないし請求項９いずれか１項に記載のワクチンをヒトに投与す ることよりなる、ヘルペスウイルスに対して該ヒトを免疫する方法。