JPH08502164A

JPH08502164A - オピオイドレセプター遺伝子

Info

Publication number: JPH08502164A
Application number: JP6506445A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．エヴァンス、クリストファー; イー．ジュニアケイス、デュエーン; エイチ．エドワーズ、ロバート; カウフマン、ダニエル
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1992-08-13
Filing date: 1993-08-13
Publication date: 1996-03-12
Anticipated expiration: 2024-01-14
Also published as: JP4208960B2; EP1306437A3; AU5012393A; DK0656007T3; ATE242321T1; EP0656007A4; EP0656007B1; ES2201061T3; US6265563B1; US5985600A; EP1306437A2; DE69333019D1; EP0656007A1; WO1994004552A1; PT656007E; JP2004154144A; DE69333019T2; CA2142305A1

Abstract

(57)【要約】オピオイドレセプターをコードする遺伝子を、低緊縮条件下で本願明細書に開示したネズミ（murine）プローブを使用して脊椎動物ライブラリーから回収することができる。図５に示されるＤＮＡ配列またはその相補体を使用してヒトデルタ、カッパおよびミユー遺伝子、並びにネズミミュー遺伝子を得ることができる。提供したプローブはネズミデルタオピオイドレセプターをコードしている。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称オピオイドレセプター遺伝子本願発明は、アルコール、薬品濫用および精神衛生管理によって授与された助成金第ＤＡ05010号による政府援助で実施した。政府は本発明に一定の権利を有している。技術分野本発明は脊椎動物の神経系に関与する物質、そして特にオピオイドレセプターおよび該レセプターが介在する活性に関するものである。従って、本発明はオピオイドレセプターの産生に有用な遺伝子組換え物質、診断用手段としてのオヒオイドレセプター、該レセプターに係わる治療用および診断用組成物、並びに該レセプターの活性を調節する薬品をスクリーニングするために該レセプターを使用する方法に関係するものである。背景技術用語「オピオイド」は、モルヒネ様作用を有する全ての天然および合成薬品を総称するものである。以前には、用語「オピエート」はアヘンから誘導される医薬品、例えばモルヒネ、コデインおよび多数の半合成モルヒネ類似体を呼称するために使用された。モルヒネ様作用を有するペプチド化合物が単離された後、モルヒネ様作用を有する全ての薬品を総称するためにオピオイドの用語が導入された。オピオイドには、モルヒネ様活性を示す種々のペプチド、例えばエンドルフィン、エンケファリンおよびダイノルフィンが含まれる。しかし乍ら、出典によっては一般的な意味で用語「オピエート」を使用し続けているものがあり、そしてこのような状況では、オピエートとオピオイドは互いに交換可能である。更に、オピオイドの用語は、モルヒネ様薬品のアンタゴニストを呼称するため並びにこのような薬品と結合するレセプターまたは結合部位を特徴付けるために使用されている。オピオイドは一般的には鎮痛剤として使用されるが、他の多数の薬理学的効果も同様に有している。モルヒネおよび関連オピオイドは中枢神経および消化器系に主要な影響をもたらす。これらの影響は多様であり、それらには痛覚消失、眠気、気分変化、呼吸抑制、めまい、精神混濁、不快感、痒み、胆管内圧増加、胃腸運動性低下、悪心、嘔吐、並びに内分泌および自律神経系の変化がある。オピオイドによってもたらされる痛覚消失の顕著な特徴は、これが意識の消失なしに生じることである。痛みのある患者にモルヒネの治療的投与量を投与したとき、痛みは程度がより小さくなるか、不快感がより少なくなくなるか、または完全に消失することが報告されている。苦痛の緩和を経験することに加えて、患者によっては多幸感を味わう者もいる。しかし乍ら、選択した痛み緩和投与量のモルヒネを痛みのない人に投与したとき、この経験は常に快いものとはかぎらず；悪心が一般的であり、そして嘔吐を起こすこともある。眠気、集中不可、精神活動性の困難、感情鈍麻、身体活動低下、視力低下、および嗜眠が生じることがある。反復使用による耐性および身体的依存性の発現が全てのオピオイド薬品に特有の特徴であり、そしてこれら薬品の影響により精神的依存性が発現する可能性のあることがこれら薬品の臨床的使用を主として制限している。選択した細胞集団での耐性にはホスホリル化が関係しているという証拠がある（Louie，A.等、Bio chem．Biophys．Res．Comm （1988年）152：1369〜1375）。急性オピオイド中毒は臨床上の過剰投与、偶発的過剰投与、または自殺未遂から生じることがある。臨床的環境では、昏睡、縮瞳（針穴瞳孔）および呼吸低下の三徴候はオピオイド中毒を示唆する。バルビツール酸塩またはアルコールのような物質を含む混合中毒も急性オピオイド中毒の臨床的様相の一因となることがある。オピオイド中毒のどんなシナリオであろうとも、迅速に治療を施さなければならない。オピオイドは幾つかの密接に関連したレセプターと思われるものと相互作用する。薬理学的効果をオピオイドと特別の一団のオピオイドレセプターとの相互作用に関連付けるように試みたデータから種々の推論が得られている（GoodmanおよびGilmanのTHE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS、第7版、493〜4 95頁（MacMillan 1985年））。例えば、痛覚消失はミューおよびカッパレセプターと関係があった。デルタレセプターは、これらレセプターが主として脳の辺縁領域に局在していることに基づいて、感情行動の変化に関係があると考えられる。更に、デルタオピオイドレセプターの活性化、例えば更なるレセプター介在性応答の刺激とリガンドが結合すると他の神経伝達物質の放出が阻止されると考えられる。比較的多いデルタオピオイドレセプター集団を有する経路はハンチントン病に関係があると示唆された経路に類似している。従って、ハンチントン病はデルタオピオイドレセプターに与える何らかの影響と関係かあると推定される。２つの異なるクラスのオピオイド分子がオピオイドレセプターと結合することができる：オピオイドペプチド（例えば、エンケファリン、ダイノルフィンおよびエンドルフィン）並びにアルカロイドオピエート（例えば、モルヒネ、エトルフィン、ジプレノルフィンおよびナロキソン）。初期のオヒエート結合部位の証明（Pert，C．B．およびSnyder，S．H.、Science（1973年）179：1011〜1014 ）に引き続くオピオイドペプチド類似体とアルカロイドオピエートの両者の薬理学的および生理学的効果の差異が多数のオピオイドレセプターを概説するのに役立った。従って、３つの解剖学的および薬理学的に異なるオピオイドレセプタータイプが記載されている：デルタ、カッパおよびミュー。更に、各タイプはサブタイプを有していると考えられている（Wollemann，M.、J．Neurochem．（1990 年）54：1095〜1101；Lord，J．A．等、Nature（1977年）267：495〜499）。これら３つのオピオイドレセプタータイプは全て細胞レベルで同一の機能メカニズムを共有していると考えられる。例えば、オピオイドレセプターはアデニル酸シクラーゼの阻止、およびカリウムチャンネルの活性化とCa2+チャンネルの阻止の両方による神経伝達物質放出阻止を生じさせる（Evans，C．J.、Biological Basis of Substance Abuse 、S．G．Korenman & J．D．Barchas編、Oxfor d University Press（印刷中）；North，A．R．等、Proc．Natl．Acad．Sci． USA （1990年）87：7025〜7029；Gross，R．A．等、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA（1990年）87：7025〜7029；Sharma，S．K．等、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA（1975年）72：3092〜3096）。機能メカニズムは同一であるが、レセプター選択薬品の作用徴候は大いに異なっている（Gilbert，P．E．及びM artin，W.R．、J．Pharmacol．Exp．Ther．（1976年）198：66〜82）。このような差異は種々のレセプターの解剖学的位置に一部起因すると思われる。デルタレセプターはミューまたはカッパレセプターのどちらよりも哺乳動物CN S内分布との関係が少なく、類扁桃コンプレックス、線条体、黒質、嗅球、嗅結節、海馬形成および大脳皮質での濃度が高い（Mansour，A．等、Trends in Ne urosci （1988年）11：308〜314）。ラットの小脳はデルタオピオイドレセプターを含むオピオイドレセプターを著しく欠いている。幾つかのオピオイド分子はデルタレセプターと選択的にまたは優先的に結合することが知られている。脊椎動物の内在性オピオイドのうちで、エンケファリン、特にｍｅｔ−エンケファリンおよびｌｅｕ−エンケファリンは、ミューレセプターに対しても高い親和性を有しているが、デルタレセプターに対して最も高い親和性を有しているように思われる。更に、カエル皮膚から単離されたペプチド、デルトルファンはデルタレセプターに対して高い親和性と選択性を有するオピオイドペプチドの群を含んでいる（Erspamer，V．等、Proc．Natl．Acad．Sci．US A （1989年）86：5188〜5192）。（Ｄ−Ｓer²）ロイシンエンケファリンＴhr（ＤＳＬＥＴ）（Garcel，G．等（ 1980年）、FEBS．Lett．118：245〜247）および（Ｄ−Ｐen²，Ｄ−Ｐen⁵）エンケファリン（ＤＰＤＰＥ）（Akiyama，K．等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（19 85年）82：2543〜2547）を含む多数の合成エンケファリン類似体もデルタレセプター選択性である。最近他の多数のデルタレセプター選択リガンドが合成されており、そしてそれらの生物活性および結合特性は１つより多いデルタレセプターサブタイプの存在を示唆している（Takemori，A．E．等、Ann．Rev．Pharm．Toxicol．（1992年）32 ：239〜269；Negri，L．等、Eur．J．Pharmacol．（1991年）196：355〜335： Sofuoglu，M．等、Pharmacoloist（1990年）32：151。合成ペンタペプチド 2dA la，5dL eu エンケファリン（ＤＡＤＬＥ）はデルタ選択性であると考えられたが、これはまたミューレセプターにも同等に良く結合する。合成ペプチドＤ−Ａla²−Ｎ−Ｍe−Ｐhe⁴−Ｇｌy−ol⁵−エンケファリン（ＤＡＧＯ）はミューレセプター用選択性リガンドであることが見い出された。多数のデルタオピオイドレセプターの存在は上記した薬理学研究からだけでなく、不可逆的アフィニティーリガンドを使用して得た分子量概算からも暗示されている。デルタオピオイドレセプターの分子量は30kDaから60kDaの範囲である（ Evans，C．J.、上述；Evans，C．J．等、Science 258：1952〜1955（1992年）、これらの文書は本願の優先権書類の開示と一致する；Bochet，P．等、Mol．Ph armacol ．（1988年）34：436〜443）。レセプターの種々の大きさは択一的な（a lternative）スプライス生成物を示していると思われるが、このことは確立されていない。デルタオピオイドレセプターに関する多数の研究は、ラットグリア（神経膠）細胞株（C6BU−1）とマウス神経芽腫細胞株（N18−TG2）の融合によって産生された神経芽腫／グリオーマ（神経膠腫）細胞株 NG108−15を用いて実施された（Klee，W．A．およびNirenberg，M．A.、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1974年）71：3474〜3477）。ラットグリア細胞株は本質的に全くデルタオピオイドレセプターを発現せず、一方マウス神経芽腫細胞株は少量の該レセプターを発現する。かくして、NG108−15細胞中のデルタレセプターはマウス染色体起源のものであることが示唆された（Law、Mol．Pharm．（1982年）21：438〜491）。各NG108 −15細胞は約300，000個のデルタレセプターを発現すると概算される。デルタタイプのオピオイドレセプターだけが発現されるが、これらが１つより多いサブタイプを示しているかどうかは知られていない。かくして、NG108−15細胞株はオピオイドレセプター、特にデルタオピオイドレセプターの結合特性を少なからず洞察するのに役立っている。しかし乍ら、NG 108−15細胞株は癌ハイブリッドであり、そしてハイブリッド細胞特有の細胞環境のため内在性ニューロン中にデルタレセプターを完全には発現していないと思われる。広範囲に亘る文献で、オピオイドレセプターはG−タンパク質と結合するので（例えば、Schofield，P．R．等、EMBO J.、8：489〜495（1989年））、G−タンパク質結合レセプターの群のメンバーであると主張されている。G−タンパク質は、細胞表面レセプターが受け取る細胞外シグナルを種々の細胞内の第二のメッセンジャー系と結合させるグアニンヌクレオチド結合タンパク質である。G− タンパク質結合群の同定されたメンバーは多数の構造的特徴を共有しており、そして最も高度に保存されているのは７つの明白な膜スパンニング領域であり、該領域はこの群のメンバー間で非常に相同性である（Strosberg，A．D.、Eur．J． Biochem．196 ：1〜10（1991年）。オピオイドレセプターがこの群のメンバーであるという証拠には、オピオイドによるGTPアーゼ活性の刺激、GTP類似体がオピオイドおよびオピエートアゴニスト結合を劇的に生じさせるという観察、並びに百日咳毒素（これはADPリボシル化によってG−タンパク質のGiとGoサブファミリーの両方を選択的に不活性化する）がアデニレートシタラーゼやK⁺およびCa²⁺チャンネルに結合するオピオイドレセプターを阻止するとの観察（Evans，D．J.、上述）が含まれる。 G−タンパク質結合レセプター群のメンバーは１つの範囲の特徴を示している。多くのG−タンパク質結合レセプター、例えばソマトスタチンレセプターやアンギオテンシンレセプターは、全タンパク質コード領域をコードする１個のエキソンを有している（Strosberg、上述；Langord，K．等、Biochem．Biophys．Res ．Comm．138：1025〜1032（1992年））。しかし乍ら、他のレセプター、例えばサブスタンスPレセプターやドーパミンＤ２レセプターはタンパク質コード領域を有している。Ｄ２レセプターは、遺伝子の交互スプライシングによって異なる転写産生物（即ち、レセプター）を生じさせる（Evans，C．J.、上述；Strosber g、上述）という点で特に興味がある。面白いことに、ソマトスタチンリガンドはオピオイドレセブターに結合し（Terenius，L.、Eur．J．Pharmacol．38：211 （1976年）：Mulder，A．H．等、Eur．J．Pharmacol．205： 1〜6（1991年））、そして更には、類似した分子メカニズムを有している（Tsun oo，A．等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：9832〜9836（1986年））と報告されている。オピオイドレセプターを記載しそして精製するこれまでの努力において、オピオイドレセプターの１部分かまたは全体のいずれかをコードすると仮定された2 つのクローンが記載されている。オピエート結合タンパク質 OBCAMをコードする第1のクローン（Schofield等、上述）はモルヒネアフィニティーカラムで精製したタンパク質のアミノ酸配列から設計したプローブを使用して得られた。OBCA Mは膜スパンニング領域を欠いているが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）結合によるタンパク質と膜の結合に特徴的なC−末端領域を有している。免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーが共有しているこの特徴はG−タンパク質に結合したレセプターの群では一般的でない。かくして、OBCAMはG−タンパク質に結合する他の成分と一緒にレセプターコンプレックスの一部をなすと提案されている（Schofield等、上述）。しかし乍ら、現在、このようなコンプレックスの直接的な証拠はない。２番目に提案されたオピオイドレセプタークローンは、カッパオピオイドレセプターリガンドに結合するレセプターをクローン化する努力中に得られた（Xie，G．X.、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 89：4124〜4128（1992年））。胎盤ｃＤＮＡライブラリーから得られるG−結合レセプターをコードするＤＮＡ分子を単離した。このレセプターはニューロキニンＢレセプターと非常に高い相同性を有している（提案されたタンパク質配列全体で84％の同一性）。このクローンをＣＯＳ細胞で発現させたとき、それは³Ｈ−ブレマゾシン（カッパレセプターに対して高い親和性を有するオピエートリガンド）のオピオイドペプチド置換性結合を示した。しかし乍ら、このレセプターは³Ｈ−ブレマゾシンに対して親和性が低くそしてこのレセプターには適当な選択性が無い（ミューおよびデルタリガンドの両方に結合する）ため、クローン化したこの分子が実際にオピオイドレセプターであるのかは疑問であった。更に、オピオイドレセプタータンパク質は膜から一度可溶化されると不安定であるので、これらタンパク質の特徴決定は困難であることが証明されている；精製デルタオピオイドレセプターは単離されていない。オピオイドレセプターの分子量が30kDaから60kDaまでの範囲であるとのこれまでの概算は、これらのタンパク質の単離および特徴決定が困難であることを更に反映している。最近、マウス大脳から得られるネズミカッパおよびデルタオピオイドレセプターをコードするＤＮＡがヤスダ（Yasuda）K．等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA （1993年）90：6736〜6740によって報告された。このクローンの配列は予想される7つのトランスメンブラン領域の存在を示していた。更に、チェン（Chen）Y．等は、分子薬理学（Molecular Pharmacology）（1993年）に間もなく発表される原稿中で「ラット脳から得られるミューオピオイドレセプターの分子のクローニングおよび機能発現」を報告している。事実、ラットミューレセプターは本願発明者のDOR−1クローンを使用してクローン化され、これは以下で開示する本願発明が実施可能であることを支持している。最後に、マウスデルタオピオイドレセプターは、本出願の優先権書類の出願日より後にクローン化されたとして開示された（Kieffer，B．J．等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：12048〜12058 （1992年12月））。しかし乍ら、そこに報告された配列はマウスデルタレセプターに関して本願発明者が報告した配列とは異なっている（Evans等、1992年、上述；本件開示）。発明の開示本願発明は、ネズミ（murine）デルタオピオイドレセプター（受容体）をコードする組換え体核酸分子、並びに本願明細書で開示したＤＮＡとの低緊縮ハイブリッド形成を使用して回収することができる組換え体核酸分子を提供する。それ故本発明は、本願明細書に記載した低緊縮条件下でハイブリッド形成するのに十分相同性のデルタ、カッパおよびミューレセプターをコードする遺伝子を含有するあらゆる種の上記レセプターをコードする遺伝子を提供する。かくして、1つの視点においては、本発明はオピオイドレセプターの組換え体核酸分子およびその産生方法に向けられたものであり、その際オピオイドレセプターは低緊縮下で図5のヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリッド形成する遺伝子によってコードされる。用語「低緊縮」（low−stringency）によって、50％ホルムアミド／６×ＳＳＣ、37℃で一夜ハイブリッド形成させ、続いて２×ＳＳＣ 0.1％ＳＤＳで室温で洗浄することを意味する。上記した核酸分子を含有する発現系も提供する。レセプターはこれらの発現系および該発現系を含有するように変性した宿主細胞を使用した組換え体として産生させることができる。オピオイドレセプタータンパク質が細胞表面に現れるようにオピオイドレセプター遺伝子を発現する脊椎動物が特に有用である。これらの細胞はオピオイドレセプターの天然および合成の候補アゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする手段を提供する。更に他の視点では、本発明は、本発明の組換え形質転換細胞を使用してオピオイドレセプターに作用する候補アゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングする方法に向けられている。このようなアッセイには（１）オピオイドレセプターに結合することが知られているリガンドとの競合を使用する結合アッセイ、（２）遺伝子導入（ないし形質転換）細胞におけるオピオイドレセプター活性化に関連した第２の経路の活性化を分析するアゴニストアッセイ、および（３）ナトリウムイオンとＧＴＰの存在または不存在が候補のレセプターへの結合に与える影響を評価するアッセイが含まれる。アンタゴニストアッセイには、候補がそれ以上の活性化を達成しないようにレセプターに結合する能力と、更に重要な、既知アゴニストとの競合を組み合わせたものが含まれる。本発明の更にもう１つの視点は、オピオイドレセプタータンパク質と免疫反応性である抗体組成物を提供することである。このような抗体は、例えば、レセプターの可溶化後または組換え体産生後にレセプターを精製する際に有用である。更に他の視点では、本発明は、オピオイドレセプターの種々の種または異なるタイプおよびサブタイプの関連オピオイドレセプターをコードするＤＮＡを同定するのに有用なプローブに向けられている。従って、本願発明の１つの目的・対象はオピオイドレセプターをコードするＤＮＡ配列の単離および精製された形態を提供することであり、この形態は上記レセプターの産生に有用であるだけでなくプローブとしても有用なものである。もう１つの目的・対象は、オピオイドレセプターをコードし組換え体として産生されるＤＮＡ配列を提供することである。もう１つの目的・対象は、オピオイドレセプターをコードする既知のセンス配列に対応するアンチセンス配列を産生することである。本発明のもう１つの目的・対象は、オピオイドレセプターをコードするＤＮＡ配列に機能的ないし操作的に（operatively）結合された制御配列を含むＤＮＡ構築物を提供しそして該ＤＮＡ構築物を含有するように変性された組換え体宿主細胞を提供することである。もう１つの目的・対象は、種々の脊椎動物種から誘導されるＤＮＡと本発明のオピオイドレセプターをコードする天然ＤＮＡ配列をハイブリッド形成させることによって、種々の関連レセプターをコードするＤＮＡ配列を種々の脊椎動物種から単離し、クローン化しそして特徴を決定することである。本願発明の利点は、薬品がオピオイドレセプターと相互作用する能力および／または該レセプターに結合する能力について薬品をスクリーニングするために好都合に使用できる上記レセプターをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞の表面に発現できることである。本願発明のこれらの目的および他の目的、利点並びに特徴は当該技術分野の熟練者に明白となるであろう。図面の簡単な説明図１は、ＤＯＲ−１を用いてＣＤＭ８ベクター中でＮＧ１０８−１５細胞およびＣＯＳ細胞の各々をトランスフェクション（エレクトロポーレーションによって）してから３日後の上記細胞間の³Ｈ−ジプレノルフィンの結合（飽和曲線）の比較を示すものである。特異的なオピオイド結合はトランスフェクション（遺伝子導入）されていないＣＯＳ細胞またはプラスミドだけで検出され、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞中では検出できなかった。図２は、ＤＯＲ−１でトランスフェクションした細胞のＣＯＳ細胞膜から得られる５nM ³Ｈ−ジプレノルフィンの置換曲線を示す。³Ｈ−ジプレノルフィンはジプレノルフィン、エトルフィン、モルヒネおよびレボルファノールで置換されたか、デキストロファン（レボルファノールの非オピエイト剤活性光学異性体）では置換されなかった。図３は、ＤＯＲ−１でトランスフェクションした細胞のＣＯＳ細胞膜から得られる５nM ³Ｈ−ジプレノルフィンの置換曲線を示す。³Ｈ−ジプレノルフィンは、デルタ選択アゴニストであるＤＰＤＰＥおよびＤＳＬＥＴ、ミューおよびデルタレセプターの高アフィニティー（親和性）リガンドであるＤＡＤＬＥ）およびカッパ優先リガンドであるダイノルフィンで置換された。³Ｈ−ジプレノルフィンはミュー選択リガンドであるＤＡＧＯでは置換されなかった。図4は、ＮＧ108−15細胞および種々のラット脳領域から得られる細胞のｍＲＮＡをノーザン分析した結果を示すものである。図5は、ＤＯＲ−１クローンのヌクレオチド配列および推定（deduced）アミノ酸配列を示すものである。図６は、ＤＯＲ−１の推定アミノ酸配列をラットソマトスタチンレセプターと比較して示すものである。細胞外ドメインになると推定されるコンセンサスグリコシル化部位は星印で示す。潜在的タンパク質キナーゼC部位は実施例５に示す。7つの推定膜スパンニング領域（下線）は疎水性プロフィールおよび発表された予測（MacVectorソフトウェアプログラム（ＩＢＩ）；T．HoppおよびK．Woods、Proc．Natl．Acad．Sci． U SA 78 ：3842〜3828（1981年））に基づいて推定される。配列分析については、ｃＤＮＡ挿入物をp Bluescript に入れてサブクローン化し、そして両ストランドはシークエナーゼおよびTaqサイクル配列分析を使用して１本鎖ＤＮＡから配列を分析した。圧縮による不明確さについては、配列分析反応で７−デアザ−ｄＧＴＰで置換したｄＧＴＰおよび生成物をホルムアミドゲルで分析した。図7は、Bam HIで切断したNG108−15、マウス、ラットおよびヒトDNAと高緊縮でハイブリッド形成した放射標識ＤＯＲ−１ｃＤＮＡプローブのサザン法ブロットを表わすものである。図８ａは、ヒトデルタオビオイドレセプターゲノムクローンH3（ヒトＤＯＲａまたはｈＤＯＲａとも称される）の部分的ヌクレオチド配列を示す。図８ｂは、ヒトカッパオピオイドレセプターゲノムクローンＨ14（ヒトＫＯＲ aまたはｈＫＯＲａとも称される）の部分的ヌクレオチド配列を示す。図８ｃは、ヒトムミューオピオイドレセプターケノムクローンＨ20（ヒトＭＯＲａまたはｈＭＯＲａとも称される）の部分的ヌクレオチド配列を示す。図８ｄは、Ｈ20 ＤＮＡの近くのＣＡＣＡＣＡ反復のヌクレオチド配列を示す。図９は、ｍＭＯＲ−１またはｍＭＯＲ−１αとも呼称されるネズミ（murine）ミューレセプタークローンＤＯＲ−２のヌクレオチド配列を示すものである。図１０は、種々のレセプターアミノ酸配列の相同性を示すものである。発明の実施態様本発明は哺乳動物オピオイドレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ並びにこれらタンパク質を産生するのに有用な追加的な組換え体核酸、発現ベクターおよび方法を提供する。更に、細胞表面にオピオイドレセプタータンパク質を発現するように本発明の組換え体分子を導入・形質転換した真核細胞、例えばＣＯＳ細胞は候補オピオイドアゴニストおよびアンタゴニストを同定するスクーニングアッセイで有用である。更に、組換え体として産生されたオピオイドレセプタータンパク質に対して抗体を生じさせることができる。これらの抗体は上記タンパク質のイムノアッセイやアフィニティー精製で有用である。組換え体オピオイドレセプターネズミ（murine）デルタオビオイドレセプターをコードするｃＤＮＡの取得を以下に説明する。ｃＤＮＡの完全なDNA配列、およびそれによってコードされるアミノ酸配列は本願明細書の図５に記載する。このｃＤＮＡを入手できると、対応するオピオイドレセプターをコードするＤＮＡを他の脊椎動物種から回収することが可能になる。従って、本願発明は種々のタイプおよび種々の脊椎動物種のオピオイドレセプターを発現する細胞を作る組換え体分子および方法を当該技術分野に提供する。かくして、図５のｃＤＮＡまたはその１部分をプローブとして使用して、オピオイドレセプタータンパク質をコードする脊椎動物ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの１部分を同定することができる。ゲノムライブラリーを作成しそしてオピオイドレセプターをコードする遺伝子を同定するために使用した方法を便宜上以下に記載する。図５に記載したＤＯＲ−１クローンはネズミデルタオピオイドレセプターに対応するｃＤＮＡクローンである。本願発明者は、低緊縮条件下でヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするとヒトオピオイドレセプターの3つの全てのタイプをコードするＤＮＡが回収されることを発見したので、本願明細書にこのことを記載する。同様にして、ネズミゲノムクローンが得られた。更に、ｃＤＮＡクローンはネズミミューオピオイドレセプターをコードするマウス大脳ライブラリーから得られた。かくして、適当な供給源、例えば大脳から得られるｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムライブラリーは本願発明のＤＮＡおよび対応する組換え体材料を得るのに効果的な供給源または基質である。それ故、本発明は脊椎動物のオピオイドレセプターをコードするＤＮＡに向けられており、その際オピオイドレセプターは、低緊縮条件下で図５に示されるヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされる。変法として、ｍＲＮＡを分析して、例えばノザンプロット技術を使用してオピオイドレセプタータンパク質を発現する特定の組織または細胞を同定するために図５のＤＮＡまたはその１部分を使用することができる。それ故、本発明のプローブを使用してオピオイドレセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡを含有していることが確認されている組織は、以下に記載するｃＤＮＡを使用して更に探査できるｃＤＮＡライブラリーの作成に適切な供給源である。以下に記載する標準的な技術に従って、一般に上記したようにして得られる、種々の脊椎動物オピオイドレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを使用して、表面にオピオイドレセプターを発現する細胞を作ることができる；このような細胞は典型的には真核細胞、特にＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞である。このような作成に適する真核細胞中の発現系を以下に記載する。オピオイドレセプタータンパク質は原核生物、または変法としてタンパク質自体を産生する真核生物発現系中で産生させることもできる。タンパク質をコードするＤＮＡは、タンパク質の分泌を生じさせるシグナル配列が先行している発現ベクター中に連結（ligate）することができるか、または発現系および宿主の選択に依存して細胞表面のみならず細胞内でも産生させることができる。所望の場合、このようにして組換え体として産生されたオピオイドレセプタータンパク質は、タンパク質精製の適当な手段を使用して、そして特に、オピオイドレセプタータンパク質に対して免疫特異的なそれらタンパク質の抗体またはフラグメントを使用するアフィニティー精製によって精製することができる。組換え体細胞を使用するオピオイドアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング候補化合物がオピオイドアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力は、種々の方法で本発明の組換え体細胞を使用して評価することができる。アゴニストまたはアンタゴニストのどちらかの活性を示すためには、候補化合物はオピオイドレセプターと結合しなければならない。それ故、候補化合物の結合能を評価するために、直接的かまたは間接的な結合アッセイのいずれかを使用することができる。直接的結合アッセイでは、候補結合化合物それ自体を例えば放射性同位元素または蛍光標識を用いて検出可能なように標識し、そして組換え体細胞による標識の獲得を対応する非遺伝子導入（対照）細胞による標識の獲得と比較することによって本発明の組換え体細胞との結合を評価する。しかし乍ら、一層好都合なことは、本発明の組換え体細胞との結合に関して、レセプターに結合することが知られているオピオイドリガンドの検出可能な標識体と候補化合物が競合する競合アッセイを使用することである。このようなリガンドそのものは、例えば放射性同位元素または蛍光部分を使用して標識される。このレセプターに結合することが知られている特に適当なオピオイドはジプレノルフィンである。このようなアッセイに典型的なプロトコールは次のとおりである：一般的に、約10⁶個の組換え体細胞をｐＨ7.4のクレブスリンガーヘペス緩衝液（ＫＲＨＢ）1.0ml中で懸濁物として³Ｈ−ジプレノルフィンと共に37℃で20分間インキュベートする。非特異的結合は上記結合混合物中に400nMのジプレノルフィンを添加して測定する。種々の濃度の候補化合物を反応混合物に加える。インキュベーションはホワットマンＧＦ−Ｂフィルター上で細胞を採集して終了させ、過剰の放射能は０℃でＫＲＨＢ５mlを用いてフィルターを３回洗浄して除去する。シンチレーション流体、例えばリキシント（Liquiscint（商品名））（National Diagnostics）ニュージャージー州ソマービル）５ml中20℃で一夜インキュベートした後、フィルター上の放射能を液体シンチレーション計数法によって測定する。候補アヘン剤リガンドのK_d（解離定数）値はＩＣ₅₀値（「阻止濃度50」は標識ジプレノルフィンの結合が50％減少する候補リガンドの濃度を意味する）から決定することができる。組換え体として発現されたレセプターに対するリガンドの結合に与えるナトリウムとＧＴＰの影響はアゴニスト活性をアンタゴニスト活性と区別するために使用することができる。候補化合物の結合がＮａ⁺とＧＴＰに感受性である場合、オピオイドレセプターとアデニル酸シクラーゼのような別のメッセンジャー分子の機能的結合にはナトリウムとＧＴＰの両方の存在が必要である（Blume等、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA73 ：26〜35（1979年））ので、候補化合物はアンタゴニストであるよりはアゴニストであると考えられる。更に、ナトリウム、ＧＴＰおよびＧＴＰ類似体はオピオイドおよびオピオイドアゴニストをオピオイドレセプターに結合させることが知られている（Blume、Life Sci．22：1843〜1852（ 1978年））。オピオイドアンタゴニストは、グアニンヌクレオチドやナトリウムに感受性の結合を示さないので、この影響は結合アッセイを使用してアゴニストをアンタゴニストと区別する方法として使用される。更に、アゴニスト活性は細胞内の機能的結果によって直接評価することができる。例えば、オピオイドアゴニストの結合はｃＡＭＰ形成を阻止し、カリウムチャンネル活性化を阻止し、カルシウムチャンネル活性化を阻止し、そしてＧＴＰアーゼを刺激することが知られている。候補化合物に応答したこれらの活性の評価はアゴニスト活性の診断に役立つ。更に、エトルフィンのような既知アゴニストの活性の活性化を妨げる化合物の能力によって該化合物は事実上アンタゴニストとして分類される。 1つの典型的なアッセイでは、オピオイドレセプターを発現する細胞中のcAMP 値（レベル）の測定は³Ｈ−アデニンで予め標識した細胞内ＡＴＰプールから形成される³Ｈ−ｃＡＭＰの量を測定することによって行われる（Law等、上述）。かくして、ｃＡＭＰ形成アッセイは、0.5×10⁶個の細胞／0.5mlのＫＲＨＢ、ｐＨ7.4を用い、37℃で20分間インキュベートして実施する。内部標準 ³²Ｐ−ｃＡＭＰを添加した後、既知の二重カラムクロマトグラフィー法を使用して放射姓 cAMPを他の³Ｈ−標識ヌクレオチドから分離する。次に、オピエイトアゴニストがｃＡＭＰ蓄積を阻止する能力をロー（Law）等（上述）が記載したようにして測定する。候補オピエイトアンタゴニストの有効性は、既知量の候補アンタゴニストの存在下および不存在下でエトルフィンがサイクリックＡＭＰ蓄積を阻止する能力を測定することによって決定することができる。次に、アンタゴニストの阻止定数（Ｋｉ）を競合的インヒビターの式から計算することができる。先行技術のＮＧ108−15細胞を使用するスクリーニングアッセイの興味ある特徴は、明らかにアゴニストアデニル酸シクラーゼ阻止機能がこれら細胞上の全てのレセプターと結合する必要がないということである。それ故、これら細胞を使用したときには、オピオイドリガンドのＫｄとＫｉ値は異なっていた。本願発明の組換え体として形質転換された細胞で実施した上記のような前述のアッセイは、アゴニストおよびアンタゴニストオピオイドレセプター活性を有する候補化合物に関して、当該技術分野でこれまでに入手可能であったより直接的で且つ好都合なスクリーニンブを提供する。更に、このようなアッセイは、本願発明に従って、高いレベルのオピオイドレセプターを発現するように細胞を操作することができるので、一層感度が高い。更に、本願発明に従って操作した細胞は、ＮＧ108−15細胞が、それらの腫瘍細胞背景のため、オピオイドレセプターの発現に人工的に影響を与える細胞環境を有しているとの懸念を回避するであろう。本願明細書に記載したミューオピオイドをコードするＤＮＡは遺伝形質パターンを追跡する手段も提供する。ＤＮＡ配列の多形性は遺伝子を囲む非コード領域で頻繁に生じる。多形性は、異なる個人に存在する多数の繰返しでしばしば明確な多形性を示すＣＡＣＡＣＡのような繰返し配列で特に頻繁である。これらの多形性は、群のメンバー間の遺伝子の遺伝形質を追跡するマーカーを提供する。遺伝子の遺伝形質（例えば、ＭＯＲａ）またはそのヒト対応物は、ＣＡＣＡＣＡの多形性を囲む領域のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅および得られた産生物の分析によって追跡することができる。これは、ミューオヒオイドレセプター遺伝子の有用な診断用マーカーであろう。オピオイドレセプタータンパク質またはその１部分の調製方法本願発明はネズミオピオイドレセプターのアミノ酸配列を提供し；同様に、本発明のｃＤＮＡを入手できることで、アミノ酸配列を標準方法で測定することもできる対応する脊椎動物オピオイドレセプターが当該技術分野に提供される。このようなオピオイドレセプターのアミノ酸配列は既知であるかまたは測定可能であるので、天然供給源から上記レセプタータンパク質を精製することに加えて、レセプタータンパク質またはペプチドを調製するために組換え体産生または合成ペプチド方法論も使用することができる。かくして、オピオイドレセプターまたはその１部分は、当該技術分野で知られている標準的な固体相（または溶液相）ペプチド合成法を使用して調製することもできる。更に、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、上記方法でタンパク質を産生する市販で入手可能なオリゴヌクレオチド合成手段を使用して合成することができる。勿論、遺伝子でコードされていないアミノ酸を含めるべきである場合、固体相ペプチド合成を使用し産生させることが必要である。本発明のペプチドおよびタンパク質を記載するために使用した命名法は、Ｎ− 末端アミノ基がペプチドの各アミノ酸残基の左側にありそしてカルボキシ基が右側にある慣用のプラクティスに従っている。本願発明の特定の選択された実施態様を表わす式においては、しばしば特別には示していないが、他に特定していない限り、アミノ−およびカルボキシ−末端は生理学的ｐＨ値で推定されるであろう形態であると考えられる。それ故、必ずしも特定の実施例かまたは一般式のどちらかで特定して示していないが、生理学的ｐＨでＮ− 末端ＮＨ³⁺とＣ−末端ＣＯＯ−が存在していると理解される。アミノ酸残基の側鎖上の遊離官能基はグリコシル化、ホスホリル化、システイン結合、アミド化、アシル化または他の置換によって修飾することができ、これらは、例えば、下記請求の範囲の意味内で化合物の活性に影響を与えることなく化合物の生理学的、生化学的または生物学的特性を変化させることができる。示したペプチドにおいては、適当な場合には各遺伝子をコードする残基は、以下の慣用のリストに従ってアミノ酸の通称に対応する１字名称で示す：アミノ酸１字記号３字記号アラニンＡＡｌａアルギニンＲＡｒｇアスパラギンＮＡｓｎアスパラギン酸ＤＡｓｐシステインＣＣｙｓグルタミンＱＧｌｎグルタミン酸ＥＧｌｕグリシンＧＧｌｙヒスチジンＨＨｉｓイソロイシンＩＩｌｅロイシンＬＬｅｕリジンＫＬｙｓメチオニンＭＭｅｔフェニルアラニンＦＰｈｅプロリンＰＰｒｏセリンＳＳｅｒスレオニンＴＴｈｒトリプトファンＷＴｒｐチロシンＹＴｙｒバリンＶＶａｌエンケファリンの命名法エンケファリンは、１と番号を付けたＮ−末端残基を有し５つの残基を有する次の２つのペプチドのどちらかである：「ｍｅｔエンケファリン」では５番目の残基はメチオニンである：ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｍｅｔ「ｌｅｕエンケファリン」では５番目の残基はロイシンである：ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｌｅｕエンケファリン類似体は（１）アミノ酸置換、（２）Ｄ−アミノ酸置換および／または（３）追加アミノ酸を有するように作成することができる。置換される部位は化合物の名称の最初に記載する。例えば、「（Ｄ−ａｌａ²、Ｄ−ｌｅｕ⁵）エンケファリン」はＤ−ａｌａが２番目の位置に存在しそしてＤ−ｌｅｕが５番目の位置に存在することを意味する：ｔｙｒ−［Ｄ−ａｌａ］−ｇｌｙ−ｐｈｅ−［Ｄ−ｌｅｕ］１字略号も使用することができる。それ故、「（Ｄ−ｓｅｒ²）ｌｅｕエンケファリン」は「ＤＳＬＥ」と省略することができよう。追加的な残基も同様に記載される。かくして、（Ｄ−ｓｅｒ²）ｌｅｕエンケファリンの（６番目の位置への）スレオニン残基付加は「（Ｄ−ｓｅｒ²）ｌｅｕエンケファリンｔｈｒ」であり、これは「ＤＳＬＥＴ」と省略できよう：ｔｙｒ−［Ｄ−ｓｅｒ］−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｌｅｕ−ｔｈｒ抗体本願発明のオビオイドレセプタータンパク質またはペプチドと免疫反応する抗体は、抗体が標的とするように意図した本願レセプターの部分を抗原領域として含有するペプチドで適当な哺乳動物対象を免疫化して得ることができる。或るタンパク質配列は高い抗原能力を有していることが測定されている。このような配列は抗原索引、例えばマックベクター（MacVector）ソフトウエア（I．B．I．）に示されている。それ故、オヒオイドレセプタータンパク質の配列を決定しそして抗原索引で配列を評価することによって、考えられる抗原性配列が突き止められる。抗体は、ペプチドハプテンが十分な長さである場合には該ハプテンだけを使用して、または所望の場合若しくは免疫原性を高める必要がある場合には、適当な担体と抱合したハプテンを使用して既知の免疫化プロトコールに従って適当な哺乳動物宿主を免疫化して調製する。ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他の担体タンパク質のような担体を用いて免疫原性抱合体を調製する方法は当該技術分野で良く知られている。或る状況下では、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的抱合が有効であり；他の場合には、イリノイ州ロックフォードのピアースケミカルカンパニィー（Pierce Chemical Co.）によって供給されるような結合試薬がハプテンの利用可能性を提供するのに望ましいことがある。ハプテンペプチドは、例えば、担体への結合を促進するために、システイン残基を用いて延長するかまたは挿入変化（intersperse）させることができる。免疫原の投与は、一般的に当該技術分野で理解されるような適当なアジュバントを使用して一般的には適当な時間をかけて注入することによって行われる。免疫化スケジュール中、抗体の力価を測って抗体形成が適切であることを決定する。適用によっては上記のようにして産生したポリクローナル抗血清で十分であると思われるが、製薬組成物ではモノクローナル抗体（ｍＡｂ）調製物を使用することが好ましい。所望のmAbを分泌する固定細胞株は、一般的に知られているようにしてリンパ球または脾細胞の固定化を行うコーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）の標準的な方法または修正法を使用して調製することができる。所望のｍＡｂを分泌する固定化した細胞株はイムノアッセイでスクリーニングされ、その際抗原はペプチドハプテンであるかまたは組換え体宿主細胞に現れたオヒオイドレセプターそのものである。所望のｍＡｂを分泌する適当な固定細胞培養物が同定されると、細胞をインビトロかまたは動物の腹腔内に注入して培養することができ、そしてｍＡｂが腹水中に産生される。次に、所望のｍＡｂを培養上清液または腹水から回収する。無傷抗体に加えて、抗原結合部分を有するｍＡｂまたはポリクローナル抗体のフラグメントをアンタゴニストとして使用することができる。免疫学的に反応性の抗原結合フラグメント、例えばF（ab’）₂フラグメントのFab、Fab’を使用することは、特に治療に関しては、これらのフラグメントが一般的に免疫グロブリン全分子より免疫原性が低いのでしばしば好ましい。標準方法オピオイドレセプターに対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の配列を分析し、クローニングしそして発現する技術、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドの合成、ｃＤＮＡライブラリーの精査、細胞の遺伝子導入ないし形質転換、ベクターの構築、既知のセンスヌクレオチド配列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の調製、メッセンジャーＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの調製等は当該技術分野で良好に確立されている。通常の技倆を有する技術者は標準的な供給源材料、特定の条件および方法に精通している。以下の節は便宜上提供するものであり、そして本発明は下記請求の範囲によってだけ制限されると理解すべきである。ＲＮＡの調製とノザンブロット法ＲＮＡの調製は次のとおりである：ＲＮＡを調製するために使用した試料は液体窒素中で直ちに冷凍し、そしてその後使用するまで−80℃で貯蔵する。ＲＮＡは、修正したホモジネーション緩衝液（Chirgwin等、Biochemistry 18：5294〜5 299（1979年））を使用してＣｓＣｌ遠心（Ausubel等、上述）によって調製する。ポリ（A＋）ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフイー（AvivおよびLeder、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 69：1408〜1412（1972年））によって選択する。ＲＮＡ試料は−80℃で貯蔵する。遺伝子発現および組織分布の分析は、例えば放射標識プローブを使用してノザンブロット法を使用して達成することができる。ｍＲＮＡはゲル電気泳動を使用してサイズ分離し、そしてその後典型的にはナイロン膜またはニトロセルロースに移し、そして放射標識プローブとハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成したプローブの存在はオートラジオクロマトグラフィーを使用して検出する。クローニングオピオイドレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、無作為にプライミングし、サイズ選択したｃＤＮＡライブラリーから得られる。或いは、オヒオイドレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、サムブルック（Sambrook）J．等の分子クローニング（MOLECULAR CLONING）：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989年、に記載された方法に従って、大脳のような種々の器官中のレセプタータンパク質を発現する細胞から単離したｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから得る。次に、上首尾のクローンから得られE coR Iのような制限酵素で切断したｃＤＮＡ挿入物を最初のｃＤＮＡライブラリーまたは他のライブラリー（低緊縮）のプローブとして使用して、タンパク質をコードするヌクレオチドの全配列の間隙を、一緒になってまたは単独で、埋めるタンパク質の他の領域をコードする挿入物を含有する追加的なクローンを得る。オピオイドレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を得る別の方法はＰＣＲである。ＰＣＲは、既に知られている輸送体配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、逆転写したＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーのプールから得られる配列を増幅するために使用する。ベクターの構築所望のコード化および制御配列を含有する適当なベクターの構築には、当該技術分野で良く理解されている連結および制限技術を使用する（Young等、Nature3 16：450〜452（1988年））。プラスミドベクターＣＤＭ８に挿入するために、オヒオイドレセプタータンパク質をコードする二本鎖ｃＤＮＡを合成しそして調製する。或いは、Bluescript²またはラムダＺＡＰ²（st ratagene、カリフオルニア州サンジエゴ）のようなベクターまたはクロンテック（Clontech）（カリフオルニア州パロアルト）から得られるベクターを標準方法（Sambrook，J．等、上述）に従って使用することができる。部位特異性のＤＮＡ開裂は、適当な制限酵素、例えばE coR I、または１つより多い酵素を用いて当該技術分野で一般的に理解されておりそしてこれらの市販で入手可能な制限酵素の製造者によって特定されている条件下で処理して実施する。例えば、ニューイングランドバイオラブズ（New England Biolabs）の製品カタログ参照。一般的に、約1μｇのＤＮＡは約20μｌの緩衝溶液中１単位の酵素で開裂される；本願明細書の実施例では、典型的には、過剰の制限酵素を使用してＤＮＡ基質を確実に完全消化する。約37℃で約１から２時間のインキュベーション時間が実行可能であるが、変法が許容される。各インキュベーション後・タンパタ質はフェノール／クロロホルムで抽出して除去し、そして続いて他の抽出を行いそしてエタノールで沈殿させて水性フラクションから核酸を回収することができる。「ベタターフラグメント」を使用するベクター構築では、５’ホスフェートを除去しそしてベクターの再連結を防ぐために、ベクターフラグメントを細菌性アルカリホスフアターゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスフアターゼ（ＣＩＰ）で通常どおりに処理する。消化は、Ｎａ⁺およびＭｇ⁺⁺の存在下でベクタ−１ μｇ当たり約１単位のＢＡＰまたはＣＩＰを使用してそれぞれ60℃または37℃で約１時間、約150mMのトリス中ｐＨ８で実施する。核酸フラグメントを回収するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出しそしてエタノールで沈殿させる。或いは、望ましくないフラグメントを追加的に制限酵素で消化することによって二重消化したベクターで再連結を防止することができる。次の標準的な条件および温度下15〜50μｌ容量で連結を行う：20mM トリス− ＨＣｌ、ｐＨ７．５、10mMＭｇＣｌ₂、10mM ＤＴＴ、33μg／mlＢＳＡ、10mM 〜50mM ＮａＣｌ、および０℃で40μＭＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０１〜０．０２（Weiss）単位（「付着端」連結用）かまたは14℃で1mM ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．３〜０．６（Weiss）単位（「ブラント末端」連結用）のいずれか。分子内「付着端」連結は通常、33〜100μg／mlの総ＤＮＡ濃度（５〜100nMの総末端濃度）で行う。分子内ブラント末端連結（通常は10〜30 倍モル過剰のリンカーを使用する）は1μMの総末端濃度で行う。ベクター構築の正しい連結はヤング（Young）等、ネイチャー（Nature）、316：450〜452（1988 年）の方法に従って確認される。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｃＤＮＡライブラリーは、オースベル（Ausubel）等、分子生物学における現行プロトコール（CURRENTPROTOCOLS IN HOLECULAR BIOLOGY）、グリーンパブリッシングおよびウイリー−インターサイエンス（Green Publishing and Wi ley−interscience）、ニューヨーク州（1990年）によって記載された低緊縮条件（reduced stringency）を使用するかまたはサムブルック等（上述）に記載された方法を使用するかまたはオヒオイドレセプタータンパク質をコードするＤＯＲ−１ｃＤＮＡのフラグメントとのコロニー若しくはプラークハイブリッド形成法を使用してスクリーニングすることができる。プラークハイブリッド形成は典型的には次のようにして実施される：ＬＥ392 （Stratagene）のような宿主細菌をＬＢブイヨン（Sambrook等、上述）中37゜で一夜増殖させ、静かにペレット化し、そして10mM ＭｇＳＯ₄、10mM ＣａＣｌ₂ の最初の容量の半分の容量中に再懸濁する。滴定後、約50，000のプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含有するファージライブラリーの所定量を宿主細菌300μｌに加え、37゜で15分間インキュベートし、そして10mlのＮＺＹＣＭトップアガロースを有するＮＺＹＣＭ寒天上にまく。20個の15cmプレート上に分布した総計百万個のプラークをスクリーニングする。コロニーのスクリーニングには、トランスフェクションした細菌を適当な抗生物質と共にＬＢブイヨンプレート上にまく。プラークまたはコロニーが1mmに増殖した後、プレートを少なくとも２時間４℃に冷却し、そしてその後重複してニトロセルロースフィルターで上を覆い、続いて0. 5M NaOH／1.5M NaCl中で５分間フィルターを変性し、そして0.5M トリス、ｐＨ 7.4／1.5M NaCl中で５分間中性化する。次に、フィルターを空気乾燥し、8 0℃で２時間焼き、５×ＳＳＣ／0.5％ＳＤＳ中68℃で数時間洗浄し、そして0. 5M NaPO₄、ｐＨ 7.2／１％ＢＳＡ／1mM ＥＤＴＡ／７％ＳＤＳ／100μｇ／mlの４時間以上変性させたサケ精子ＤＮＡ中で予めハイブリッド形成させる。プローブとして無作為にプライミングして標識したＤＯＲ−１ｃＤＮＡ（本願明細書に記載した）を使用して、高緊縮ハイブリッド形成を同一溶液中68℃で実施し、そして低（lower）緊縮ハイブリッド形成ではこの温度を50〜60℃に下げる。16〜24時間ハイブリッド形成させた後、フィルターを先ず40mM NaPO₄、ｐＨ 7.2／0.5％ＢＳＡ／５％ＳＤＳ／1mM ＥＤＴＡで各１時間で２回、次に40mM NaPO₄、ｐＨ 7.2／１％ＢＳＡ／1mＭＥＤＴＡで各１時間、両方ともハイブリッド形成と同じ温度で洗浄する（Boulton等、Cell 65：663〜675 （1991年））。次に、フィルターを強化スクリーンを有するフィルムに−70℃で１日から１週間暴露する。次に、陽性シグナルをプレートに並べ、そして一次スクリーニングと同じ条件を使用して対応する陽性ファージを次の回のスクリーニングで精製する。次に、精製したファージクローンを使用して、配列分析用のプラスミドベクター中にサブクローン化するためにファージＤＮＡを調製する。種々の独立クローンに対応するＤＮＡの組織分布は、ノザンブロット法、および標準方法を使用するインシトウハイブリッド形成を使用して分析する。ＤＮＡの機能は、ＣＯＳ細胞のような異種真核生物発現系中での発現を使用して試験する。オピオイドレセプタータンパク質の発現オビオイドレセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は種々の系で発現させることができる。ｃＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、そして上記発現用の原核生物または真核生物発現ベクター中に連結することができる。例えば、以下に述べるように、タンパク質をコードするｃＤＮＡはＣＯＳ細胞中で発現させる。機能的な発現を行わせるために、プラスミド発現ベクターＣＤＭ８（AruffoおよびSeed、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：8573〜8577（1987 年）、Dr．AruffoおよびDr．Seed（マサチューセッツ州ボストンのハーバード大学）が提供した）を使用した。或いは、レトロウイルスベクターのような他の適当な発現ベクターを使用することができる。オビオイドレセプターを発現させるために原核生物および好ましくは真核生物系を使用することができる。酵母のような真核微生物はオビオイドレセプタータンパク質の大量生産用宿主として使用することができる。多数の他の株が一般的に利用可能であるが、サッカロミセスセレビシエの実験室株、製パン用（Baker' s）酵母が最も使用される。例えば、２μの複製起源（Broach、Meth．Enz．101 ：307（1983年））または他の酵母と適合する複製起源（例えば、Stinchcomb等、Nature282：39（1979年）；Tschempe等、Gene 10：157（1980年）；およびCl arke等、Meth．Enz．101：300（1983年））を採用するベクターを使用することができる。酵母ベクターの対照配列には解糖酵素の合成用プロモーターが含まれる（Hess等、J．Adv．Enzme Reg．7:1 49（1968年）；Holland等、Biochemistry 17：4900（1978年））。当該技術分野で既知の更なるプロモーターには３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター（Hitzeman等、J．Biol．Chem．255：2073（1980年））および他の解糖酵素のプロモーターが含まれる。増殖条件で制御される転写の追加的利点を有する他のプロモーターはアルコールデヒドロケナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、並びにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。ターミネーター配列がコード化配列の３’末端にあることが望ましいことも考えられる。このようなターミネーターは、酵母由来遺伝子のコード化配列の後の３’非翻訳領域に見られる。或いは、オピオイドレセプタータンパク質をコードする遺伝子は多細胞生物から誘導される真核宿主細胞培養物中で発現される。（例えば、Tissues Culture s 、Academic Press、CruzおよびPatterson編、（1973年）参照）。これらの系はイントロンをスプライシングできる別の利点を有しており、そしてそれ故、直接使用してケノムフラグメントを発現させることができる。有用な宿主細胞株には、ツメガエル卵母細胞のような両生類卵母細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯおよびＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＳＦ９細胞のような昆虫細胞が含まれる。このような細胞の発現ベクターには通常、例えば、バクロウイルス、ワクシニアウイルス、シミアンウイルス40 （ＳＶ40）（Fiers等、Nature 273：113（1973年））のような哺乳動物細胞と適合するプロモーターや制御配列、またはポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパヒローマウイルス、若しくはニワトリ肉腫ウイルスから誘導されるような他のウイルスプロモーターが含まれる。制御可能なプロモーター、ｈＭＴＩＩ（Kari n等、Nature 299：797〜802（1982年））も使用することができる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な持徴はアタセル（Axel）の米国特許第4，399，216 号によって記載されている。「エンハンサー」領域は発現を最適化する際に重要であることが明らかであり；これらは一般的に、非コード化ＤＮＡ領域中のプロモーター領域の上流または下流に見られる配列である。必要な場合には、ウイルス供給源から複製起源を得ることができる。しかし乍ら、染色体への組込みは真核生物でのＤＮＡ複製に共通したメカニズムである。原核生物系を使用する場合、イントロンのないコード化配列を適当な制御配列と一緒に使用すべきである。オピオイドレセプタータンパク質のｃＤＮＡは適当な制限酵素を使用して切断しそしてこのような発現用の適当な制御配列と一緒に原核生物ベクター中に連結することができる。原核生物は最もしばしば大腸菌の種々の株によって代表される；しかし乍ら、他の微生物種や株を使用することもできる。リボソーム結合部位配列と一緒に、任意にオペレーターと共に転写開始用プロモーターを含めるように本願明細書に定義されている原核生物制御配列が一般的に使用され、上記プロモーターにはβ −ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Chang等、Nature 198：1056（1977年））並びにトリプトフアン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel等、Nucl．Acids Res．8：4057（1980年））並びにλ誘導Ｐ_LプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake等、Nature 292：128（1981年））のような一般的に使用されるプロモーターが含まれる。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適する標準的な技術を使用して遺伝子導入を行う。コーエン（Cohen）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 69：2 110（1972年）またはサムブルック等（上述）によって記載された塩化カルシウムを使用する処理は、実質的な細胞壁バリヤーを有する原核生物または他の細胞に使用することができる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞には、任意にウイグラー（Wigler）等、細胞（Cell）16：777〜785（1978年）またはチェンおよびオカヤマ（Okayama）（上述）で修正したグラハム（Graham）およびファンデルエブ（van der Eb）、ウイルス学（Virology）54：546（1978年）のカルシウムホスフェート沈殿方法を使用することができる。酵母への遺伝子導入はファンゾリンケン（Van Solingen）等、J．Bact．130：946（1977年）またはヒシアオ（Hsiao）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76：3829（1979年）の方法に従って実施することができる。他の代表的なトランスフェクション方法にはウイルストランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション技術、リソチーム融合若しくは赤血球融合、掻き取り、直接的取込み、浸透性若しくはサッカロースショック、直接的微量注入、赤血球媒介技術のような間接的微量注入、および／または宿主細胞への電流印加法が含まれる。細胞に遺伝情報を導入する他の方法が開発されることは疑いないので、トランスフェクション技術に関する上記リストはこれらに尽きるものとは考えられない。アンチセンス配列による発現の調節或いは、アンチセンス配列を、センスオリゴヌクレオチドでコードされるレセプターの機能的発現を調節する手段としてオヒオイドレセプターを発現する細胞中に挿入することができる。アンチセンス配列は、当該技術分野に既知の標準的な方法によって、既知のセンス配列（ＤＮＡかまたはＲＮＡのどちらか）から調製する。オピオイドレセプター遺伝子またはＲＮＡ転写に特異的なアンチセンス配列を使用して、オビオイドレセプターをコードするオリゴヌクレオチドに結合するかまたは該オリゴヌクレオチドを不活性化することができる。用語本願明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「an」および「the」には、文脈が明らかに他を記載していない限り、複数の言及が含まれる。それ故、例えば、「１つのレセプター（a receptor）」の言及にはこのような複数のレセプターの混台物か含まれ、「１つのオヒオイド（an opioid）」の言及には複数の上記オピオイドおよび／またはオピオイド混合物が含まれ、そして「該宿主細胞（th e host cell）」の言及には、このような細胞の同一または類似のタイプ等の複数の細胞が含まれる。他に定義しない限り、本願明細書に使用した全ての技術的および科学的用語は、本願発明が属する技術分野の通常の技倆を有する者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。以下の実施例は説明するためであって本発明の限定を意図するものではない。他に特定しない限り、温度は℃でありそして圧力はほぼ大気圧である。モノ₁₂₅Ｉ−ＤＡＤＬＥの調製ＤＡＤＬＥ（Peninsula Laboratories Inc．）は、ヨウ素産生法（Maidment 等、MICRODIALYSIS IN THE NEUROSCIENCES、T．RobinsonおよびJ．Justice編、275〜303頁（Elsevier、1991年））を使用してヨウ化した。モノおよびジヨウ化形態の両方を生じさせた。ジヨウ化ＤＡＤＬＥは、チロシン残基のジヨウ化により、オピエイトレセプターと結合しないことが報告されている（Miller，R．J ．等、Life Sci．22：379〜388（1978年））。従って、モノヨウ化ＤＡＤＬＥが好ましい。モノ¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥは他の同位元素で標識されたＤＡＤＬＥと比べて極端に高い比活性を有しているので、これも好ましい。かくして、週または月よりむしろ日のオーダーの暴露時間を使用することができる。ヨウ化を行うとき、概ね1：100のヨウ化ナトリウム対ペプチドのモル比を使用することによって、好ましいモノヨウ化ＤＡＤＬＥの収量が増加した。更に、モノヨウド化形態の収量を一層高めるために、ヨウ化ＤＡＤＬＥ（モノおよびジヨウド化形態の両方を含む）を逆相ＨＰＬＣ（Maidment等、上述）で精製した。この方法を使用して、モノヨウ化ＤＡＤＬＥの単一の主要な放射標識ピークをジヨウ化および非ヨウ化形態から分離した。スクリーニングの成功には¹²⁵Ｉでモノ標識したＤＡＤＬＥが重要である。放射標識した¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥは幾つかの重要なパラメーターがＤＡＤＬＥと異なっている：大きさ、疎水性、および結合親和性（僅かに低い）。ＨＰＬＣステップによってモノヨウ化ＤＡＤＬＥをジヨウ化および非ヨウ化ＤＡＤＬＥから精製すると非常に高い比活性（約2000Ｃｉ／ミリモル）を有するリガンドが得られる。モノヨード化形態の比活性は、モノ−、ジ−、および非ヨウ化ＤＡＤＬＥの非分離混合物より約100倍高い。モノ標識¹²⁵Ｈ−ＤＡＤＬＥはこれを調製してから２，３日以内に使用しなければならない。実施例１ＤＯＲ−１の調製ＮＧ１０８−１５細胞系（UCLAのクリストファー・エバンズ博士より入手）はデルタオピオイド（以下、δ−オピオイド）受容体の均質で豊富な供給源を含む。ＮＧ１０８−１５から単離したｍＲＮＡを用いて、プラスミドベクターＣＤＭ８中にランダムプライム（random-primed）、サイズ選別ｃＤＮＡライブラリーを組みこんだ（construct）。ｃＤＮＡライブラリーを細菌中で増幅させた。このｃＤＮＡライブラリーをエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に導入（トランスフェクション）した。一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７菌叢をスクリーニングし、高純度のモノ−¹²⁵Ｉ−２ｄＡｌａ、５ｄＬｅｕエンケファリン（¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥ）で選択した。陽性クローンをフィルムオートラジオグラフィーにより同定し、これらの細胞由来プラスミドを回収し、細菌中で増幅させた。その後、このプラスミドをＣＯＳ−７細胞に再び導入（トランスフェクション）した。このようなプラスミド富化を３サイクル行った後、個々のクローンをトランスフェクトし、¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥを結合した純粋なクローンを同定した。Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築６Ｍグアニジウムイソチオシアネート中でホモジナイズし、次いで塩化セシウムを加えて遠心処理することにより、ＮＧ１０８−１５細胞よりＲＮＡを調製した（J．M．Chirgwinら、Biochemistrｙ 18：5294（1979））。オリゴ−ｄＴ− セルロースでのクロマトグラフィーによりポリ−Ａ⁺ＲＮＡを分離した（H．Aviv およびP．Leder、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 69：1408（1972））。このＲＮＡを鋳型にしてランダムヘキサマーをプライマーとして用いて、鳥類の骨髄芽球ウィルスの逆転写酵素（ライフサイエンス社）によるｃＤＮＡ合成を行った。第２鎖合成をＲＮａｓｅ−Ｈおよび大腸菌（E．Coli）ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った（U．GublerおよびB．J．Hoffman、Gene 24：263（1983））。ｃＤＮＡの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、BstXIリンカーを添加した。５％アクリルアミドでの電気泳動および電気溶出により、1.5kbより長いｃＤＮＡを選択した。1.5kbのｃＤＮＡをＣＤＭ８ベクターに連結し（A．Aruffo およびB．Seed、前記）、エレクトロポレーションによりMC−1061菌に導入した（W．J．Dowerら、Nucl．Acids Res．：16：6127（1988））。こうして約２×1 06組み換え体の最初のｃＤＮＡライブラリーからプラスミドＤＮＡのプールを６つ調製した。Ｂ．エレクトロポレーションによるプラスミドトランスフェクションおよびＣＯＳ細胞での発現ＣＯＳ細胞を高密度で増殖させ、トリプシン中で集菌し、次いで２０％胎児子牛血清を含む1.2×ＲＰＭＩ中に２×１０⁷／ｍｌで再懸濁した。次に、これらの細胞を上記ｃＤＮＡライブラリーからの組み換えプラスミドＤＮＡ２０μｇと共に４℃で１０分間インキュベートし、さらに０．４ｃｍ間隔のキュベット（gapc uvette）（バイオラド（Biorad））中 960μＦ、230ｖでエレクトロポレーションを行った。次に、細胞を４℃でさらに10分間インキュベートし、10％胎児子牛血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に塗布した。Ｃ．トランスフェクトされたＣＯＳ細胞のスクリーニング上記で得たトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を３日間増殖させ、放射標識したモノ ¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥを用いてスクリーニングを行った。トランスフェクトＣＯＳ菌叢をＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡを含むＫＨＲＢ中で１０〜２０ｎＭ ¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥと共に室温でインキュベートした。１時間後、プレートを氷冷ＰＢＳで手早く数回洗浄し、次いで強い強制冷気流で氷上で乾燥した。プレートを室温でカセット中のデュポン・クロネックス・フィルム（DuPont Cronex film）上に暴露した。低倍率顕微鏡を通してペトリ皿を用いてフィルムを注意深く並べることにより陽性クローンを同定した。マイクロマニュプレーターの毛細管に接続した注射器から供給したｔＲＮＡ１ μｇ／μｌを含む０．１％ＳＤＳのＴＥ溶液中で可溶化することにより陽性細胞からＤＮＡを除去した。ハート（Hirt）の溶菌操作を用いて抽出細胞からプラスミドを精製し（Hirt，B.，J．Mol．Bio．26；365-369(1967)）、エレクトロポレーションによりＭＣ−１０６１菌に入れた。プラスミドを精製後、ＣＯＳ細胞に再び導入（トランスフェクション）した。このような富化サイクルを３回行った後、各プラスミドクローンをＣＯＳ細胞に導入し、ＤＯＲ−１と命名した１個のクローンを得た。実施例２ＤＯＲ−１の特性決定まず、ＤＯＲ−１クローンの特性を、標識したＤＡＤＬＥにより、ＤＯＲ−１発現細胞の細胞膜画分をスクリーニングすることにより決定した。 ¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥの結合が、ナノモル濃度のオビエート（opiate）アルカロイド類であるジプレノルフィン、モルヒネ（モルフィン）、エトルフィンにより、またＤＡＤＬＥ）ＤＳＬＥＴおよびＤＰＤＰＥにより置換されることが判った。デキストロルファン（１０μＭ）は ¹²⁵Ｉ−ＤＡＤＬＥと置換せず、一方そのオピオイド−活性鏡像体であるレボルファノールは放射標識ＤＡＤＬＥと置換した。さらにｍｕ（ μ）受容体−選択性リガンドであるＤＡＧＯ（５μＭ）はカウントを置換しなかった。さらに、ＤＯＲ−１クローンを発現する完全な細胞への ³Ｈ−ジプレノルフィンの結合を測定し（図１）、そしてこのような細胞の膜画分からの ³Ｈ−ジプレノルフィンの置換を測定することにより（図２、３）、ＤＯＲ−１クローンについて薬理学的特性を決定した。結合試験は、完全な細胞については１％ＢＳＡを含むＫＲＨＢ中で、あるいは膜については２５mM ＨＥＰＥＳ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ7.7の溶液中で行った。細胞は１mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で集菌し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いでＫＨＲＢに再懸濁した。細胞から調製した膜（Law，P．Y．E．等、Mol．Pharm ． 23：26-35(1983)）を結合試験において直接使用した。結合試験は、適宜量の放射標識リガンドを含む全量100μｌ中、４℃で96ウェルのポリプロピレンクラスタープレート（コスター（Coster））で行った。１時間のインキュベーション後、プレートをトムテック（Tomtec ）ハーベスターで集め、Ｂ型フィルターマットをメルティレックス（Meltilex）Ｂ／ＨＳ（ファルマシア製）メルト−オンシンチレーターシートを用いて、ベータプレート（Beterplate）（ファルマシア製）シンチレーション計数管で計測した。ＤＯＲ−１を発現する完全な細胞を、高い親和性のオピエートアンタゴニストである³Ｈ−ジプレノルフィンで分析した。４００ｎＭジプレノルフィンで置換されたカウントにより特異的結合を表した。図１はＮＧ１０８−１５細胞、およびδ−オピオイド受容体クローンでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞に対する³Ｈ−ジプレノルフィンの飽和曲線を示す。トランスフェクトされていないＣＯＳ細胞、または挿入断片をもたないプラスミドを導入したＣＯＳ細胞は特異的結合を示さなかった。このように、ＣＯＳ− ＤＯＲ−１細胞のオピオイド結合性はＮＧ１０８−１５細胞のものと類似している。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から標準法で調製した膜を、ＤＯＲ− １クローンによりコードされる受容体のより広範な薬理学的特性を決定するために用いた。³Ｈ−ジプレノルフィンと競合させた以下のアルカロイドオピエート類に対する親和性を図２に説明する：非標識ジプレノルフィン、δ受容体に対する高親和性アンタゴニスト：エトルフィン、δ、μおよびκ受容体に対する高親和性アゴニスト、；レボルファノール、δ受容体に対する低親和性アゴニスト；モルヒネ、δ受容体に対する低親和性アゴニストでありμ受容体に対する高親和性アゴニスト；およびデキストロファン、δ受容体に結合しないレボルファノールの非オピエート活性鏡像体。図２に示すように、 ³Ｈ−ジプレノルフィンの置換は、親和性の低くなる順（decreasing order）にジプレノルフィン、エトルフィン、レボルファノールおよびモルヒネでみられる。予想されるように、 ³Ｈ−ジプレノルフィンはデキストロファンでは置換されなかった。 ³Ｈ−ジプレノルフィンと競合させた以下のオピオイドペプチドの親和性を図３に示す：ＤＡＤＬＥ）μおよびδ受容体に対する高親和性のアゴニスト；ＤＳＬＥＴおよびＤＰＤＰＥ、両者ともδ（μではない）受容体に対する高親和性のアゴニスト；ＤＡＧＯ、μ受容体に対する選択的アゴニスト；ダイノルフィン１ −１７、κ受容体に対する高親和性アゴニストであり、δ受容体に対する中〜低親和性アゴニスト。図３に示すように、³Ｈ−ジプレノルフィンの置換は、親和性の低くなる順にＤＳＬＥＴ、ＤＰＤＰＥ、ＤＡＤＬＥおよびダイノルフィン１ −１７で見られた。ＤＡＧＯでは弱い置換しかみられなかった。実施例３ＲＮＡのノーザンブロット分析ノーザン分析のために、ＮＧ１０８−１５細胞由来のｍＲＮＡおよびラット脳領域から切り出した細胞由来のｍＲＮＡを、２．２Ｍホルムアルデヒド／１．５％アガロースの電気泳動により分離し、ナイロンに転写し、高い緊縮下で水溶液中でハイブリダイズさせた。フィルターを0.5M NaPO4、pH7.2；１％ＢＳＡ；１ mM ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳ；および100μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液で少なくとも４時間６８℃においてプレハイブリダイズさせた（Boulton等、前出）。次いでフィルターをランダムプライミングにより標識した精製ｃＤＮＡ挿入断片５×10⁶ｃｐｍ／ｍｌ以上を用い、上記と同じ条件で一晩ハイブリダイゼーションを行った（A．P．FeinbergおよびB．Vogelstein，Anal．Biochem．13 2:6(1983)）。フィルターを40mM NaPO₄、pH7.2；0.5％ＢＳＡ；５％ＳＤＳ：および１mM ＥＤＴＡで１時間、２回洗浄し、次いで40mM NaPO₄、pH7.2；１％ＳＤＳ：および１mM ＥＤＴＡ中で２回、それぞれ１時間、すべて６８℃において洗浄した。その後、デュポン・クロメックス・ライトニング・プラス（DuPont Cromex Lightening Plus）で−７０℃においてオートラジオグラフィーを行った。ｍＲＮＡのノーザン分析の結果は、約8.7、6.8、 4.4、2.75および2.2キロベース（ｋｂ）においてプローブにハイブリダイズする複数バンドの存在を示した（図４）。また、ノーザン分析は、脳領域の間でｍＲＮＡのパターンが変化することを示した。現時点では、これらのｍＲＮＡが異なる蛋白質配列をコードするかどうか、またもしそうであれば、これらの情報が異なるタイプあるいはサプタイプのオピオイド受容体を表しているかどうかについては明らかでない。実施例４ＤＮＡのサザンブロット分析放射標識したＤＯＲ−１ｃＤＮＡプローブを標準法よりケノムサザンブロットにハイブリダイズさせた（Sambrooｋ等、前出）。即ち、放射標識ＤＯＲ−１ｃＤＮＡプローブを、高い緊縮下で、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したＮＧ１０８ −１５、マウス、ラットおよびヒトＤＮＡのブロットにハイブリダイズさせた（図７）。ＮＧ１０８−１５、マウスおよびラットＤＮＡを含むクローン中に単一バンドがみられた。ｃＤＮＡプローブへハイブリダイズするバンドの大きさは５．２ｋｂ（ＮＧ１０８−１５）、５．２ｋｂ（マウス）および５．７ｋｂ（ラット）と判定された。これらの結果はマウスとラット遺伝子の高い相同性を示し、またＤＯＲ−１クローンは、ＮＧ１０８−１５細胞系のマウスの親（murine）に由来することを示す。ＥｃｏＲＩで切断した、異なる種由来のゲノムＤＮＡを含むブロットにおいて、中程度の緊縮でのＤＯＲ−１ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションではマウス、ラット、ヒト、ウサギおよびいくつかのその他の哺乳動物種の各レーンに２つのバンドがみられた。これは、これらの種のすべてでオピオイド受容体遺伝子間に高い関連性があることを意味する。さらに、これらの結果は、これらの種のそれそれからの遺伝子またはｃＤＮＡは、中程度の素縮でのハイブリダイゼーションを用いて容易にクローン化できることを示す。実施例５ｃＤＮＡ配列決定ＤＯＲクローンとして発現する単離ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡクローン由来挿入断片をpBluescript ^TM（ストラータジーン（Stratagene）、サンジエゴ、ＣＡ）などのプラスミドへサブクローニングし、ジデオキシ法（Sanger等、Proｃ Nat l Acad Sci USA 74：5463-5467（1977））を用いて分析した。ｃＤＮＡの塩基配列を、一本鎖ＤＮＡおよび特に設計した内部プライマーから、シークエナーゼおよびΔＴａｑサイクル・シークエンシングキット（ＵＳＢ）を用いて決定した。これらのキットは当分野で広く使用されており、ジデオキシ鎖終止法を用いるものである。次いでＤＮＡ配列および予想される蛋白質配列をジーンバンク（GeneBank）のような確立されたデータバンクにおける配列と比較した。ＤＯＲ−１クローン中のｃＤＮＡ挿入断片の配列決定により、３７０個のアミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかになった（図５）。ジーンバンクにおける既知配列と比較すると、ＤＯＲ−１とＧ−蛋白質結合ソマトスタチン受容体との間に高い相同性を示し（アミノ酸の５７％の一致）、アンギオテンシンに結合する受容体、２つの走化性因子であるＩＬ−８およびＮ−ホルミルペプチドとの相同性はやや低かった。図６はヒトソマトスタチン１受容体に対する相同性を示す。本発明の受容体クローンとソマトスタチン受容体との高い相同性は特に注目すべきである。というのはソマトスタチンリガンドはオピオイド受容体に結合すること、δ受容体中のものと似た分子機構を有することが報告されているからである。ｃＤＮＡ配列から推定されるＤＯＲ−１クローンのアミノ酸配列のその他の特徴には、残基番号１８及び３３（細胞外のＮ末端領域にあると予想される）および残基番号３１０（Ｃ末端に近く、細胞内にあると予想される）の３つのコンセンサス・グリコシル化部位がある。ホスホキナーゼＣコンセンサス部位は予想される細胞内領域内の残基番号２４２、２５５、３４４および３５２に存在する。膜にある（membrane-spanning）推定の７つの領域を、疎水性の性質および、マックベクター（MacVector）（I．B．I．）分析を用いて膜にある領域について分析されたロドプシンおよびその他のＧ−蛋白質結合受容体との相同性に基づいて同定した。本発明の原理により単離されたＤＯＲ−１クローンはＮ−グリコシル化などの翻訳後修飾の前の、推定分子量40,558ダルトンを有するδ受容体を産生する。実施例６オピオイド受容体ゲノムクローンの単離ゲノムクローンの単離を当分野で既知の手法によって行った。オビエート受容体ゲノムクローンを単離するために、γｇｅｍｌｌ（プロメガ（Promega））中の300,000個のヒトケノムクローンおよび同程度の数のラムダＦｉｘ（ストラータジーン）中のマウスゲノムクローンを宿主株Ｌｅ３９２上に置き、主にコード領域を含む１．１ｋｂのＤＯＲ−１Ｐｓｔ／Ｘｂａ断片をプローブとして釣り上げた。ハイブリダイゼーションの条件はかなり低い緊縮であった：５０％ホルムアミド／６×ＳＳＣ、３７℃で一晩。洗浄も低い緊縮：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温、で行った。ハイブリダイゼーションおよびプラーク精製の繰り返しにより、１個のマウスクローンおよび３個のヒトゲノムクローンを単離し精製した。ＤＮＡ調製および制限酵素による分析で、３個のヒトクローンは非常に異なるＥｃｏＲＩ切断パターンを示した。１．１ｋｂオビエート受容体プローブは、それそれのクローンに対してサザン分析における異なる単一ＥｃｏＲＩバンドにハイブリダイズした。これらの結果から、３個の異なる遺伝子が、Ｈ３、Ｈ１４およびＨ２０と命名されるヒトケノムクローンにより発現されることが予備的に示唆された（図８ａ、８ｂ、８ｃおよび８ｄ参照）。これらのクローンはそれそれ、ブダペスト条約に基づいてロックビル、メリーランドのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクションに１９９３年８月１３日に寄託された。これらの寄託物の入手の制限は、この出願に基づく米国での特許発行の時に除かれるであろう。ＡＴＣＣ寄託番号はＨ３については、Ｈ１４については、Ｈ２０についてはである。ＥｃｏＲＩおよびＴａｑＩにより、Ｈ３、Ｈ１４およびＨ２０クローンをより小さい断片に切断後、配列決定のためにBluescriptの適宜部位にショントガンクローン化した。Ｈ３の部分ヌクレオチド配列を図８ａに、Ｈ１４の部分ヌクレオチド配列を図８ｂに、Ｈ２０の部分ヌクレオチド配列を図８ｃに示す。３つのケノムクローンはサルク研究所（Salk Institute）のグレン・エバンズ（Glenn Evans）博士によりin situハイブリダイゼーションによりヒト中期染色体上に位置決定された。Ｈ３は染色体１Ｐに、Ｈ１４は染色体８の動原体近くに、Ｈ２０は染色体６上に位置する。上記したように得られた配列データを、前出のマウスの対応物について公開された配列、および以下に記載するＤＯＲ− ２クローンと比較すると、次のことが確認できた：（ａ）Ｈ３はヒトδ−オピオイド受容体をコードする：（ｂ）Ｈ１４はヒトκ−オピオイド受容体をコードする、そして（ｃ）Ｈ２０はヒトμ−受容体をコードする。さらにＨ２０は、この遺伝子の遺伝（inheritance）を探るための手段を提供するＣＡＣＡＣＡマーカー（図８ｄ）を含むようである。ゲノムクローンをＥｃｏＲＩおよびＴａｑＩでより小さい断片に切断し、配列決定のためにBluescriptの適宜位置にショットガンクローン化した。実施例７他の生物由来のオピオイド受容体クローンの単離哺乳動物の脳細胞、例えばヒト脳細胞からのオピオイド受容体を単離するために、λＺａｐ（ストラータジーン）中のランダムープライムヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーを、この明細書記載のＤＯＲ−１をコードするマウスｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。陽性プラークを精製し、再度スクリーニングを行った。各プラーククローンを配列決定し、上記のようにして特性を決定した。実施例８可能な抗原配列の決定ＤＯＲ−１にコードされるオピオイド受容体のアミノ酸配列をマックベクター（Ｉ．Ｂ．Ｉ．）抗原インデックスおよびJameson，B．ａｎｄ H．Wolf，Comut ．Applic．in Biosci ．4：181-186（1988）による抗原インデックスで判定して、δ−オピオイド受容体の以下の下線部分の配列が高い抗原性を有すると決定された。Ｎ末端配列は細胞外であり、他の４つの配列は細胞内であると推定される。実施例９マウスのクローンＤＯＲ−２（ｍＭ０Ｒ−１）の回収マウス脳から調製されたλｇｔｌｏ中のｃＤＮＡライブラリーを、実施例６の低い緊縮の条件下でプローブとしてＤＯＲ−１を用いて釣り上げた。１個のクローンを回収し、Bluescriptに挿入し、配列を決定した。ノーザンおよびサザンブロットにより、ＤＯＲ−１との違いが示された。ＤＯＲ−２と命名したこのクローンは、新しい遺伝子を発現した。ＤＯＲ−２はＤＯＲ−１とは異なるパターンのニューロンにハイブリダイズし、線条体（striatum）のより大きい標識を示した。ベクターpCDNAへの挿入および哺乳動物細胞へのトランスフェクションによるＤＯＲ−１の発現により、モルヒネに結合する細胞−μ受容体を表わす−を産生した。この細胞は非選択的オピエートアンタゴニストであるジプレノルフィンにも結合する。ＤＯＲ−２（ｍＭＯＲ−１）がμ受容体であることは、ナノモル濃度のμ−選択的リガンドのモルフィセプチン、ＤＡＭＧＯおよびモルヒネによる ³Ｈ−ＤＰＮの置換により確認された。δ選択的リガンドＤＰＤＰＥおよびデルトルファンは結合を置換せず、ナロキソンは予想された高親和性を有していた。実施例６に記載のＨ２０と命名された部分配列は、実質的にＤＯＲ−２と類似していた。ＤＯＲ−２の部分配列を図９に示す。図１０はマウスのδ受容体のアミノ酸配列とラットのμおよびＫ受容体との比較を示す。広い領域で相同性がみられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ (72)発明者ケイス、デュエーンイー．ジュニアアメリカ合衆国、カリフォルニア 91367 ウッドランドヒルズ、ティアラストリート 23805 (72)発明者エドワーズ、ロバートエイチ. アメリカ合衆国、カリフォルニア 90049 ロサンゼルス、グランヴィレ 120, ＃19アールイー (72)発明者カウフマン、ダニエルアメリカ合衆国、カリフォルニア 90404 サンタモニカ、センティネラアヴェニュー 1453，アパートメントシー

Claims

【特許請求の範囲】１．低緊縮条件下で図５に示されるヌクレオチド配列からなるプローブまたはその相補体とハイブリッド形成するオピオイドレセプターをコードするヌクレオチド配列を含有する単離および精製または組換え体ＤＮＡ分子。２．上記ヌクレオチド配列がヒトデルタオピオイド、ヒトカッパオピオイドレセプター、ヒトミューオピオイドレセプター、ネズミ（murine）デルタオピオイドレセプターまたはネズミミューオピオイドレセプターをコードする請求項１に記載のＤＮＡ分子。３．宿主に導入したとき、宿主内でオピオイドレセプターを産生し得る発現系を含むＤＮＡ分子であって、該発現系は、上記宿主内でオペラブルな（operable ）異種制御配列にオペラブルに（operably）結合された上記オピオイドレセプターをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、その際上記オピオイドレセプターは低緊縮条件下で図５のヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされるものとして定義される。４．上記オピオイドレセプターがヒトデルタオピオイドレセプター、ヒトカッパオピオイドレセプター、ヒトミューオピオイドレセプター、ネズミ（murine）デルタオピオイドレセプターまたはネズミミューオピオイドレセプターである請求項３に記載のＤＮＡ分子。５．請求項３または請求項４に記載の発現系を含有するように修正された組換え体宿主細胞。６．コード化ＤＮＡを発現させてオピオイドレセプタータンパク質を産生させる条件下で請求項５に記載の細胞を培養し、そして培養物から上記レセプタータンパク質を回収することを含む上記オピオイドレセプタータンパク質の生産方法。７．組換え体細胞表面にオピオイドレセプターが現れる組換え体細胞の産生方法であって、該方法はコード化ＤＮＡを発現させて上記レセプタータンパク質を上記細胞表面に産生させる条件下で請求項５に記載の細胞を培養することを含む。８．請求項７に記載の方法で調製した組換え体細胞。９．オピオイドアゴニストまたはアンタゴニスト活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、該方法は：上記活性を検出するのに適当な条件下で候補物質の存在下および不存在下で請求項８に記載の細胞をインキュベートし、そして上記活性の存在、不存在または量を検出する、ことを含む。１０．請求項６に記載の方法で産生されたオピオイドレセプター。１１．請求項６に記載の方法で産生されたオピオイドレセプターに対し免疫活性の抗体を含む、赤血球不含抗体組成物。１２．脊椎動物におけるオピオイドレセプターの解剖的位置の決定方法であって、該方法は：請求項１１に記載の抗体組成物を脊椎動物対象に投与し；上記抗体組成物が上記レセプターとコンプレックスを形成するのに十分な時間待機し；そして上記対象内で上記コンプレックスの位置を検出する、ことを含む。１３．オピオイドとオピオイドレセプターとの相互作用の阻止方法であって、該方法は：上記レセプターを請求項１１に記載の抗体組成物と接触させ；そして上記組成物を上記レセプターに結合させる、ことを含む。１４．オピオイドレセプターをコードするＤＮＡの発現調節方法であって、該方法は請求項１に記載のＤＮＡが該ＤＮＡに相補的な標的ＤＮＡとハイブリッド形成する条件下で請求項１に記載のＤＮＡに相補的なＤＮＡを用いて上記発現を行い得る細胞を処理することを含む。