JPH08502170A - ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物 - Google Patents

ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物

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JPH08502170A JP6509326A JP50932694A JPH08502170A JP H08502170 A JPH08502170 A JP H08502170A JP 6509326 A JP6509326 A JP 6509326A JP 50932694 A JP50932694 A JP 50932694A JP H08502170 A JPH08502170 A JP H08502170A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物に関する。図１７はヒトノッチＤＮＡおよびコード化されるヒトノッチタンパク質の配列を示す。本発明は、本発明の治療用化合物を投与することにより細胞の運命つまり分化の障害を治療することを提供する。このような治療用化合物（ここでは“治療剤”という）としては、ノッチタンパク質とその類似体および誘導体（断片を含む）、これらに対する抗体、ノッチタンパク質、その類似体または誘導体をコードする核酸、ノッチアンチセンス核酸、ならびにノッチタンパク質と結合するかまたはこれと相互作用するトポリズミックタンパク質および誘導体、これらをコードする核酸またはこれらに対する抗体が含まれる。好適な態様において、本発明の治療剤は、癌のような状態を治療するために、あるいは新生物発生前つまり非悪性状態から新生物形成つまり悪性状態へ進行するのを防ぐために投与される。

Description

【発明の詳細な説明】 ノッチタンパク質および核酸に基づいた 治療および診断方法ならびに組成物 1.序論 本発明は、ノッチ（Notch）タンパク質、その類似体および誘導体、これらに 対する抗体、ノッチタンパク質、その誘導体および類似体をコードする核酸、ノ ッチ アンチセンス核酸、ならびにノッチと結合するトポリズミック（toporythmi c）タンパク質およびその核酸および抗体を含有する治療用組成物に関する。治 療および診断方法も提供する。 2.発明の背景 2.1. ノッチ遺伝子およびタンパク質 接合体の神経形成遺伝子座、すなわちNotch（N）、Delta（Dl）、mastermind （mam）、Enhancer of Split （E(spl)）、neuralized（neu）およびbig brain （bib）、のいずれか１つのヌル（null）突然変異は腹側および外側の表皮構造 を犠牲にして神経系の肥大をもたらす。この作用は表皮前駆細胞の神経経路への ミスルートによるものであり、神経形成遺伝子機能が神経形成領域内の細胞を神 経細胞の運命から上皮細胞の運命へと向きを変える必要があることを示唆してい る。バッタ（grasshopper）の特定の胚性神経芽細胞のレーザー切除の成果を調 べる研究（Doe andGoodman，1985，Dev．Biol．111，206-219）から、神経芽細 胞と 周囲の補助細胞との細胞相互作用は、補助細胞が神経芽細胞の運命を選ぶのを妨 げるのに役立つことが見いだされた。同時に、これらの遺伝的および発生的観察 は、神経形成遺伝子座のタンパク質産物が適切な表皮発生に必要な細胞相互作用 機構の成分として機能するという仮説を提起させた（Artavanis-Tsakonas，1988 ，Trends Genet．4，95-100）。 配列解析（Whartonら，1985，Cell 43，567-581； Kiddら，1986，Mol．Cell ．Biol．6，3094-3108；Vassinら，1987，EMBOJ．6，3431-3440；Kopczynskiら ，1988，Genes Dev．2，1723-1735）から、２つの神経形成遺伝子座、つまりノ ッチ （N0tCh）およびデルタ（Delta）、は膜を１回貫通する膜貫通タンパク質を コードしているらしいことが分かった。ショウジョウバエ（Drosophila）のノッ チ 遺伝子は、ノッチ／lin-12リピートと称する、３６の上皮増殖因子（ＥＧＦ） 様のタンデムリピートと、これに続く３つの他のシステインに富むリピートを含 む大きなＮ末端細胞外ドメインを有する約３００ｋｄのタンパク質（我々はこの タンパク質を表すのに“ノッチ”を使用する）をコードしている（Whartonら，1 985，Cell 43，567-581；Kiddら，1986，Mol．Cell．Biol．6，3094-3108；Ｙo chemら，1988，Nature 335，547-550）。ツメガエル（Xenopus）の配列（Coffma nら，1990，Science 249：1438-1441）およびＴＡＮ−１と名づけられたヒトノ ッチ相同体の配列（Ellisenら，1991，Cell66：649-661）も報告されている。デ ルタ は細胞外ドメインに９のＥＧＦ様リピートを有する約１００ｋｄのタンパク 質（我々は主要な接合体および母系転写物のタンパク質産物であるＤＬＺＭを表 すのに“デル タ”を使用する；Kopczynskiら，1988，Genes Dev．2，1723-1735）をコードし ている（Vassinら，1987，EMBO J．6，3431-3440；Kopczynskiら，1988，Genes Dev．2，1723-1735）。これらのリピートの機能的な意義についてはほとんど知 られていないが、ＥＧＦ様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含 めて、種々のタンパク質に存在している（Furie and Furie，1988，Cel153，505 -518）。特に、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸ（Reesら，1988，EM BO J．7，2053-2061；Furie andFurie，1988，Cell 53，505-518）、他のショウ ジョウバエ遺伝子（Knustら，EMBO J．761-766；Rothbergら，1988，Cell 55， 1047-1059）、いくつかの細胞表面受容体タンパク質、例えばトロンボモジュリ ン（Suzukiら，1987，EMBO J．6，1891-1897）およびＬＤＬ受容体（Sudhofら， 1985，Science 228，815-822）といった細胞外タンパク質において見いだされて いる。トロンボモジュリンおよびウロキナーゼではＥＧＦリピートドメインにタ ンパク質結合部位がマップされている（Kurosawaら，1988，J．Biol．Chem．263 ，5993-5996；Appellaら，1987，J．Biol．Chem．262，4437-4440）。 ノッチおよびデルタ突然変異間の数々の興味をそそる相互作用が記載されてい る（Vassinら，1985，J．Neurogenet，2，291-308；Shepardら，1989，Genetics 122，429-438；Xuら，1990，Genes Dev．4，464-475）。多くの遺伝子研究（Al tonら，1989，Dev．Genet．10，261-272に要約されている）は、ノッチおよびデ ルタ の互いに対する遺伝子量が正常な発生にとって極めて重要であることを示し た。野生型ノッチバックグラウンドにおいてデ ルタ の量を５０％減少させると、翼の静脈の拡張が起こって基盤部で“デルタ” が作り出される （Lindsley and Grell，1968，Publication Number 627，Wash ington，D．C．，CarnegieInstitute of Washington）。同様の表現型が、野生 型デルタバックグラウンドにおけるノッチの量の５０％増加によっても生じる（ “Confluens”表現型；Welshons，1965，Science 150，1122-1129）。このデル タ 表現型はノッチ量の減少によって部分的に抑制される。ノッチのＥＧＦ様リピ ートにおける変異と関連がある対立遺伝子間の致死相互作用は、デルタの量を減 少させることによって救済され得ることが分かっている（Xuら，1990，Genes De v．4，464-475）。Xuら（1990，Genes Dev．4，464-475）は、デルタまたはｍａ ｍ でのヌル突然変異が、Abruptex（Ax）突然変異として知られる、ノッチ対立遺 伝子のヘテロ接合体組合せ間の致死相互作用を抑制することを見いだした。Ax対 立遺伝子はノッチ細胞外ドメインのＥＧＦ様リピート内のミスセンス突然変異と 関連している（Kelleyら，1987，Cell 51，539-548；Hartleyら，1987，EMBO J ．6，3407-3417）。 最近の研究からは、ノッチとデルタ、およびノッチとセレート（Serrate）が 分子レベルで直接的に相互作用していることが明らかになっている（Fehonら，1 990，Cell 61：523-534；Rebayら，1991，Cell 67：687-699）。 ノッチは胚性ニューロンの成長の間に軸索で発現される（Johansenら，1989， J．Cell Biol．109：2427-2440；Kiddら，1989，Genes Dev．3：1113-1129；Feh onら，1991，J．Cell Biol．113：657-669）。 ノッチのある種のAx対立遺伝子は、成虫原基での感覚ニューロンの成長におい て軸索の経路発見（pathfinding）を厳格に変更し得ることが分かっているが、 軸索それ自体または上皮（これに沿って軸索が成長する）での異常なノッチ発現 がこの障害の原因になるのかどうかはまだ知られていない（Palkaら，1990，Dev elopment 109，167-175）。 2.2.癌 新生物、すなわち腫瘍は制御できない異常な細胞増殖により生ずる新生物形成 の塊で、体表面に隆起を形成することがあり、良性または悪性であり得る。良性 の腫瘍は一般に局所にとどまっている。悪性の腫瘍は集合的に癌と呼ばれている 。“悪性”という用語は、一般に、腫瘍が近隣の身体構造に侵入して破壊し、離 れた部位に広がって死を引き起こすことを意味する（再調査の際には、Robbins and Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed．，W．B．Saunders Co．Philadelp hia，pp．68-122を参照されたい）。 癌の有効な治療および予防は、必要性が久しく感じられたままであり、生物医 学研究の主な目標となっている。 3.発明の概要 本発明は、ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならび に組成物に関する。本発明は、本発明の治療用化合物を投与することにより細胞 の運命すなわち分化の障害を治療する方法を提供する。このような治療用化合物 （ここでは“治療剤”という）として、ノッチタンパク質とその類似体および誘 導 体（断片を含む）、これらに対する抗体、ノッチタンパク質またはその類似体も しくは誘導体をコードする核酸、ノッチアンチセンス核酸、およびノッチタンパ ク質に結合するかまたはそれと相互作用するトポリズミックタンパク質とその誘 導体、ならびにそれらをコードする核酸およびそれらに対する抗体を挙げること ができる。好ましい実施態様において、本発明の治療剤は癌のような状態を治療 するために、あるいは新生物発生前つまり非悪性の状態から新生物形成つまり悪 性の状態へと進行するのを防ぐために投与される。他の特定の実施態様において 、本発明の治療剤は神経系の障害を治療するために、あるいは組織の再生および 修復を促進するために投与される。 一つの実施態様では、ノッチ機能に拮抗する、またはノッチ機能を抑制する治 療剤（以後“アンタゴニスト治療剤”という）が治療効果を求めて投与される。 こうした治療を施すことができる疾患は下記の第5．1．節に記載するようなin v itroアッセイによって確認しうる。このようなアンタゴニスト治療剤として、ノ ッチアンチセンス核酸、抗ノッチ中和抗体、ノッチタンパク質−タンパク質相互 作用の競合的阻害剤（例えば、ノッチELR-11およびELR-12からなるタンパク質と これらの誘導体）を挙げることができるが、これらに限らない。これら全てを以 下で詳述する。 別の実施態様では、ノッチ機能を促進する治療剤（以後“アゴニスト治療剤” という）が治療効果を求めて投与される。こうした治療を施すことができる疾患 は下記の第5．1．節に記載するようなin vitroアッセイによって確認しうる。こ のようなアゴニスト治療剤として、ノッチタンパク質および細胞内ドメインを含 むそ の誘導体、およびノッチと相互作用するタンパク質（例えば、ショウジョウバエ のデルタアミノ酸１−２３０（図１および配列番号２を参照）に相同なデルタ配 列からなるタンパク質、またはショウジョウバエのセレートアミノ酸７９−２８ ２（図５および配列番号４を参照）に相同なセレート配列からなるタンパク質） を挙げることができるが、これらに限らない。 ノッチタンパク質の異常なまたは望ましくないレベルの発現または活性を伴う 、細胞運命（cell fate）の疾患、特に高増殖性疾患（例えば、癌）または低増 殖性疾患は、以下で詳しく説明するように、このようなレベルを検出することに よって診断することが可能である。 好ましい面において、本発明の治療剤は、トポリズミック遺伝子によりコード されるタンパク質の少なくとも断片（ここでは“接着性断片”という）からなる タンパク質であり、ノッチタンパク質またはその接着性断片への結合を仲介する ものである。ここで用いるトポリズミック遺伝子とは、遺伝子ノッチ、デルタ、 およびセレート、ならびに配列相同または遺伝子相互作用によって同定しうるデ ルタ ／セレートファミリーの他のメンバーを意味し、一般には、分子相互作用（ 例えば、in vitroでの結合）または遺伝子相互作用（例えばショウジョウバエで は表現型により検出）によって同定される“ノッチカスケード（Notch cascade ）”または“ノッチグループ（Notch group）”の遺伝子のメンバーを指すもの とする。 その他の面において、本発明は、ヒトノッチタンパク質（特にｈＮ相同体によ ってコードされるもの）と、該タンパク質の細胞 外ドメインを含むタンパク質およびそのサブ配列に向けられる。 前述のものをコードする核酸、ならびに組換え細胞も提供する。 3.1.定義 本明細書中で用いる次の略号は以下に示した意味を有するものである： ＡＡ ＝ アミノ酸 ＥＧＦ ＝ 上皮増殖因子 ＥＬＲ ＝ ＥＧＦ様（相同）リピート ＩＣ ＝ 細胞内 ＰＣＲ ＝ ポリメラーゼ連鎖反応 本明細書においては、遺伝子の名前に下線を施したものは遺伝子を表し、これ に対して、遺伝子の名前で示されるそのコード化タンパク質産物には下線が引い てない。例えば、“ノッチ”はノッチ遺伝子を指し、一方“ノッチ”はノッチ遺 伝子のタンパク質産物を指すものである。 4.図面の説明 図１．デルタcDNA D11の一次ヌクレオチド配列（配列番号１）およびデルタア ミノ酸配列（配列番号２）。D11 cDNAの5’-3’鎖のＤＮＡ配列を示してあり、 これはKopczynkskiら（1988，GenesDev．2：1723-1735）により提示されたもの と比べて多くの修正を含んでいる。 図２．ノッチ発現構築物およびデルタ／セレート結合ドメインの欠失マッピン グ。対数増殖期のＳ２細胞を図示した一連の発現 構築物で一時的にトランスフェクトした。この図面は作製された種々のノッチ欠 失変異体の推定タンパク質産物を示す。すべての発現構築物は構築物 #1 pMtN Mgに由来するものであった。一時的にトランスフェクトした細胞を、安定した形 質転換系L49-6-7からのデルタ発現細胞と、または一時的にトランスフェクトし たセレート発現細胞と混合し、CuSO4で誘発させ、凝集条件下でインキュベート し、その後特異的抗血清および免疫蛍光顕微鏡検査を使ってそれらの凝集能につ いて評価した。凝集物はノッチ発現細胞とデルタ／セレート発現細胞の両方を含 む４個以上の細胞のクラスターとして定義された。凝集％として示した数値は、 デルタ（Ｄ１）（左欄）またはセレート（Ｓｅｒ）（右欄）を含むクラスター中 に存在する全ノッチ発現細胞のパーセンテージを指す。種々のノッチ欠失構築物 は連結部を示すスプライスラインによって模式的に表してある。各ＥＧＦリピー トを点描した長方形のボックスとして表し、連結部の両側のＥＧＦリピートの数 字を示してある。種々の欠失によって作られた部分ＥＧＦリピートはオープンボ ックスと閉じたブラケットで表してある（例えば、#23 ΔCla+EGF(10-12)を参 照）。構築物#3-13はClal欠失系列を表す。図示したように、リピート７、９、1 7および26中の４つのClal部位は第３システインの直後でリピートをその真ん中 で破壊し（オープンボックスリピートで表される；詳細については図３を参照） 、一方、第５および最も３’側の部位はＥＧＦリピート30および31間を正確に破 壊する（クローズドボックスリピート31で表される；この場合も図３を参照）。 構築物 #15 splitでは、スプリット点突然変異を有するＥＧＦリピート１４が しま模様のボック スとして描かれている。構築物 #33ΔCla+XEGF（10-13）では、ツメガエルノッ チ由来のＥＧＦリピートが異なる陰影パターンによってショウジョウバエのリピ ートから区別されている。ＳＰ：シグナルペプチド、ＥＧＦ：上皮増殖因子リピ ート、Ｎ：ノッチ／lin-12リピート、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ｃｄｃ１０：ｃｄ ｃ １０／アンキリンリピート、ＰＡ：推定ヌクレオチド結合コンセンサス配列、 ｏｐａ：ｏｐａと呼ばれるポリグルタミンの広がり、Ｄ１：デルタ、Ｓｅｒ：セ レート。 図３．ノッチ欠失構築物 #19-24の詳細な構造。ＥＧＦリピート11および12は 両方ともノッチ−デルタ凝集にとって必要である。ＥＧＦリピート10-13を最上 部に示し、６個のシステイン残基（Ｃ）の規則的間隔を示してある。これらの構 築物（図２に示した名称および数字）において生成されたＰＣＲ産物は黒線で表 してあり、正確な終点が種々のＥＧＦリピートに対して記してある。デルタとの 凝集能は各構築物について（＋）または（−）で示してある。ＰＣＲ断片は、５ つのClal部位のうち４つと同じ位置で第３システインの直後でＥＧＦリピートを 真ん中で破壊するか、または最もＣ末端のClal部位と同じ位置で２つのリピート 間を正確に破壊する。 図４．ショウジョウバエおよびツメガエルのノッチからのＥＧＦリピート11お よび12のアミノ酸配列の比較。ショウジョウバエのノッチのＥＧＦリピート11お よび12のアミノ酸配列（Whartonら，1985，Cell43：567-581；Kiddら，1986，Mo l．Cell Biol．6：3094-3108）を、ツメガエルのノッチからの同じ２つのＥＧＦ リピートのアミノ酸配列（配列番号１５）（Coffmanら，1990， Science 249：1438-1441）と並列化させる。同一のアミノ酸はボックスで囲って ある。各ＥＧＦリピートの６個の保存システイン残基およびＣａ++結合コンセン サス残基（Reesら，1988，EMBO J．7：2053-2061）には＊印が付けてある。凝集 に失敗したツメガエルのＰＣＲクローンに見られたロイシンからプロリンへの変 化を下に示してある。 図５．セレートおよびデルタ間の核酸配列相同性。ショウジョウバエのセレー ト ヌクレオチド配列（配列番号３）の一部を、その下に記載したコード化セレー トタンパク質配列（配列番号４）（Flemingら，1990，Genes & Dev．4：2188-22 01，2193-94）とともに示してある。ショウジョウバエのデルタ配列との高配列 相同を示す４つの領域には配列ラインの上に番号が付けてあり、かっこで示して ある。相同の全領域はセレートヌクレオチド配列のヌクレオチド番号627から129 0までに及んでいる（Flemingら，1990，Genes & Dev．4：2188-2201の図４と同 じ番号付け）。 図６．ヒトノッチクローンの模式図。ヒトノッチの模式図を示してある。模式 図の下の太い黒線は４つのｃＤＮＡクローンのそれぞれに含まれるノッチ配列の 部分を示す。ＰＣＲで用いたプライマーの位置およびそれらの方向を矢印で示す 。 図７．ショウジョウバエノッチ配列と並列化させたヒトノッチ配列。番号の付 いた垂直線はショウジョウバエノッチの座標に一致する。各マップの下の水平線 は、配列の広がり（太い水平線）に対してクローンがどこにあるのかを示してい る。 図８．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ２ｋ中に含まれるヒトノッチのヌクレ オチド配列。図８Ａ：ヒトノッチ挿入物の一部の ＤＮＡ配列（配列番号５）を示し、３’末端のEcoRI部位で出発して、３’から ５’の方向へ進む。図８Ｂ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号６ ）を示し、５’末端のEcoRI部位で出発して、５’から３’の方向へ進む。図８ Ｃ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号７）を示し、図８Ｂに示し た配列の３’で出発して、５’から３’の方向へ進む。示した配列は確定的なも のではなく、重複配列の決定による確認を受ける必要がある。 図９．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ４ｋ中に含まれるヒトノッチのヌクレ オチド配列。図９Ａ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号８）を示 し、５’末端のEcoRI部位で出発して、５’から３’の方向へ進む。図９Ｂ：ヒ トノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号９）を示し、３’末端付近で出発 して、３’から５’の方向へ進む。示した配列は確定的なものではなく、重複配 列の決定による確認を受ける必要がある。 図10．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３ｋ中に含まれるヒトノッチのＤＮＡ （配列番号10）およびアミノ酸（配列番号11）配列。 図11．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５ｋ中に含まれるヒトノッチのＤＮＡ （配列番号12）およびアミノ酸（配列番号13）配列。 図12．ｈＮ５ｋと他のノッチ相同体との比較。図12Ａ．ショウジョウバエノッ チの模式図。シグナル配列、３６のＥＧＦ様リピート、３つのノッチ／lin-12リ ピート、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、６つのｃｄｃ１０リピート、ｏｐａリピート 、およびＰＥＳＴ（プロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニン）に富む領域 を 示してある。図12Ｂ．ｈＮ５ｋの推定アミノ酸配列と他のノッチ相同体の配列と の並列化。アミノ酸は左側に番号を付けてある。ｃｄｃ１０とＰＥＳＴに富む領 域は両方ともボックスで囲ってあり、個々のｃｄｃ１０リピートにも印が付けて ある。３つ以上の配列において同一であるアミノ酸が注目される。ｈＮ５ｋのク ローニングに使用したプライマーは配列の下に示してあり、これらの配列からプ ライマーが設計された。脊椎動物ノッチ相同体の推定ＣｃＮモチーフの核局在化 配列（ＮＬＳ）、カゼインキナーゼII（ＣＫII）、およびｃｄｃ２キナーゼ（ｃ ｄｃ２）部位をボックスで囲ってある。ショウジョウバエノッチの可能な２分節 核標的化配列（bipartite nuclear targeting sequence：ＢＮＴＳ）および近隣 のリン酸化部位もボックスで囲ってある。 図13．いろいろな生物種のノッチタンパク質のアミノ酸配列の並列化。ｈｕｍ Ｎ：ｈＮ相同体（プラスミドｈＮ５ｋに一部が含まれる）によってコードされる ヒトのノッチタンパク質（配列番号19）。ＴＡＮ−１：ＴＡＮ−１相同体によっ てコードされるヒトのノッチタンパク質（配列番号20）（示した配列は一部が我 々自身の研究から、そして一部がEllisenら，1991，Cell 66：649-661に発表さ れたＴＡＮ−１配列から誘導されたものである）。ＸｅｎＮ：ツメガエルのノッ チタンパク質（Coffmanら，1990，Science 249：1438-1441）。ＤｒｏｓＮ：シ ョウジョウバエのノッチタンパク質（Whartonら，1985，Cell43：567-581）。構 造ドメインを示してある。 図14．ヒト患者からの乳癌組織の免疫細胞化学的染色。ヒト患者から得られた 試料中の悪性乳房組織をパラフィン切片に埋め込 み、ＴＡＮ−１タンパク質に対する抗ヒトノッチモノクローナル抗体Ｐ４を用い て免疫細胞化学的染色を行った。悪性でない乳房組織はほとんど染色されなかっ た（図示せず）。 図15．結腸癌を有するヒト患者からの結腸組織の免疫細胞化学的染色。結腸癌 患者から得られた結腸組織試料をパラフィン切片に埋め込み、ｈＮコード化タン パク質に対する抗ヒトノッチモノクローナル抗体Ｐ１を用いて免疫細胞化学的染 色を行った。強い染色領域は、細胞形態学的に検査して、悪性細胞が存在する領 域である。 図16．子宮頸部組織の免疫細胞化学的染色。同一患者から子宮頸癌（図16Ａ） または正常な頚部の上皮（図16Ｂ）を含むヒト組織試料を採取し、パラフィン切 片に埋め込み、ＴＡＮ−１タンパク質に対する抗ヒトノッチモノクローナル抗体 を用いて免疫細胞化学的染色を行った。悪性細胞（形態学的に検査）を含む領域 は非悪性細胞と比べて強い染色を示した。非悪性細胞のうち、結合組織と上皮の 基底層（幹細胞を含む）は抗ノッチ抗体により染色された。 図17．ヒトノッチ相同体ｈＮのＤＮＡ（配列番号21）およびコード化アミノ酸 配列（配列番号19に含まれる）。全ＤＮＡコード配列（ならびに非コード配列） を示してあるが、開始Ｍｅｔをコードするものは除いてある。最後の８個のヌク レオチド（番号9716-9723）はベクターであって、ｈＮ配列ではない。 5.発明の詳細な説明 本発明は、ノッチ（N0tCh）タンパク質及び核酸に基づいた治療及び診断方法 ならびに組成物に関する。本発明は、本発明の治療用化合物の投与により細胞の 運命又は分化の障害の治療法を提供する。かかる治療用化合物（ここでは“治療 剤”という）には、ノッチタンパク質及びその類似体及び誘導体（その断片を含 む）；それらに対する抗体；ノッチタンパク質、その類似体又は誘導体をコード する核酸；ノッチアンチセンス核酸；並びにノッチタンパク質と結合するか又は 他の方法で相互作用するトポリズミック（toporythmic）タンパク質及びその誘 導体及び類似体、及びそれらをコードする核酸及び抗体が含まれる。ノッチタン パク質の他のトポリスミックタンパク質（例えば、デルタ（Delta）、セレート （Serrate））との相互作用を阻害できるタンパク質及びその誘導体及び類似体 も含まれる。好ましい態様においては、本発明の治療剤は、癌のような状態を治 療するために、あるいは新生物発生前若しくは非悪性状態（例えば、変質形成状 態）から新生物形成若しくは悪性状態への進行を予防するために投与される。他 の特有の態様においては、本発明の治療剤は、神経損傷又は変性性疾患の如き神 経系障害を治療するために投与される。なお他の特有の態様においては、本発明 の治療剤は、種々の状態の治療のための組織再生及び修復を促進するために投与 される。 １つの態様においては、ノッチ機能を相殺又は阻害する治療剤（以下“アンタ ゴニスト治療剤”）を治療的作用のために投与する。かくして、治療され得る障 害を以下の5.1節に記載するようなin vitroアッセイによって同定することがで きる。かかるア ンタゴニスト治療剤には、ノッチアンチセンス核酸、抗ノッチ中和性抗体、ノッ チタンパク質−タンパク質相互作用の競合的阻害物質（例えば、ノッチＥＬＲ− １１及びＥＬＲ−１２を含むタンパク質）、及び以下に詳記するｃｄｃ１０繰り 返し体により媒介されるものの如きノッチ細胞内機能を妨害する分子が含まれる が、これらに限定されない。 他の態様においては、ノッチ機能を促進する治療剤（以下“アゴニスト治療剤 ”）を治療的作用のために投与する。かくして、治療され得る障害を以下の5.1 節で説明するようなin vitroアッセイによって同定できる。かかるアゴニスト治 療剤には、ノッチタンパク質及びその細胞内ドメインを含む誘導体、前記のもの をコードするノッチ核酸、及びノッチと相互作用するトポリズミックタンパク質 ドメインを含むタンパク質（例えば、ショウジョウバエ・デルタアミノ酸１〜１ ２３０（図１及び配列番号：２を参照のこと）と相同性のデルタタンパク質又は デルタ配列の細胞内ドメインを含むタンパク質、又はショウジョウバエ・セレー トアミノ酸７９〜２８２（図５及び配列番号：４を参照のこと）と相同性のセレ ート配列を含むタンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。 ノッチタンパク質の異常な又は望ましくないレベルの発現又は活性を包含する 、細胞運命の障害、特に変質形成及び異形成の如き前癌状態、及び高増殖性（例 えば、癌）又は低増殖性障害は、以下でより十分に説明するようなレベルを検出 することによって診断することができる。 好ましい側面においては、本発明の治療剤は、トポリズミック 遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも１断片（ここでは“接着性 断片”と呼ぶ）からなるタンパク質であって、ノッチタンパク質又はその接着性 断片への結合を媒介するタンパク質である。ここで用いられるトポリズミック遺 伝子とは、ノッチ、デルタ及びセレート遺伝子、並びに配列相同性又は遺伝的相 互作用に基づいて同定することができるデルタ／セレートファミリーの他のメン バーを意味し、より一般的には、遺伝子の“ノッチカスケード”又は“ノッチグ ループ”のメンバーであって、分子相互作用（例えば、in vitroでの結合）又は 遺伝的相互作用（表現型で検出されるようなもの、例えば、ショウジョウバエに おけるもの）により同定されるものを意味する。 本発明は、更に、ｈＨ同族体によりコードされるヒトノッチタンパク質、及び ノッチタンパク質及びそのサブ配列の細胞外ドメインを含むタンパク質を提供す る。前記のものをコードする核酸、及び組換え細胞も提供する。 開示を明瞭なものにするために、限定としてではなく、本発明のこの詳細な説 明を次の小節に分ける： （i） 治療的用途； （ii） 予防的用途； （iii） 治療的又は予防的利用の実地； （iv） 治療的／予防的投与及び組成物； （v） ノッチ発現のアンチセンス調節； （vi） 診断的利用； （vii） ノッチ核酸； （viii）タンパク質治療剤の組換え産生； （ix） ノッチ及び他のトポリズミックタンパク質の誘導体及び類似体； （x） ノッチタンパク質、誘導体及び類似体のアッセイ；及び （xi） ノッチタンパク質、誘導体及び類似体に対する抗体。 5.1.治療的用途 前に述べたように、本発明のアンタゴニスト治療剤は、ノッチ機能を相殺又は 阻害する治療剤である。かかるアンタゴニスト治療剤は、最も好ましくは、既知 の便利なin vitroアッセイの使用によって、例えば、他のタンパク質（ここの６ 〜８節を参照のこと）へのノッチの結合を阻害する、又はin vitroでアッセイさ れるあらゆる既知のノッチ機能を阻害するそれらの能力に基づいて同定すること ができるが、遺伝的アッセイ（例えば、ショウジョウバエにおいて）も用いるこ とができる。好ましい態様においては、アンタゴニスト治療剤は、ノッチの接着 性断片の如き機能的に活性な断片を含むタンパク質又はその誘導体である。特有 の態様においては、そのようなアンタゴニスト治療剤は、以下の６節及び７節に 記載する適当な構築体によってコードされる接着性タンパク質、又はノッチ細胞 外領域、特にＥＬＲ−１１及びＥＬＲ−１２を含むタンパク質、又はそれらに対 する抗体、又はノッチ細胞内シグナル変換（signal-transducing）領域、ノッチ 接着性断片を発現できる核酸、又はノッチアンチセンス核酸（ここの5.5節を参 照のこと）であってもよい。一方、一定の場合には、ノッチ接着性断片（又は他 の推定し得るアンタゴニスト治療剤）が、この治療剤に曝される組織の発達経歴 に依存して、アゴニス ト治療剤として働くことができることに留意すべきである。好ましくは、以下に 説明する適当なin vitro又はin vivoアッセイが、具体的な治療剤の作用及びそ の投与が害された組織の治療に必要とされているかどうかを確認するために用い られるべきである。 本発明の他の態様においては、ノッチ遺伝子の一部分を含有する核酸をアンタ ゴニスト治療剤として用いて、相同的組換えによってノッチ不活性化を促進する （KollerとSmithies，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：8932-8935：Zijl straら，1989，Nature 342：435-438）。 前に記載したように、本発明のアゴニスト治療剤は、ノッチ機能を促進する。 かかるアゴニスト治療剤には、ノッチへの結合を媒介するデルタ又はセレートの 如きトポリズミックタンパク質の部分を含むタンパク質及び誘導体、及び前記の ものをコードする核酸（投与するとそれらがコードする産物をin vivoで発現で きるもの）が含まれるが、これらに限定されない。特有の態様においては、デル タのそのような部分は、Ｄ．メラノガステル（D．melanogaster）デルタアミノ 酸１〜２３０（配列番号：１）又はそれに最も相同なヒトデルタの部分である。 他の特有の態様においては、セレートのそのような部分は、Ｄ．メラノガステル ・セレートアミノ酸７９〜２８２（配列番号：５）又はそれに最も相同なヒトセ レートの部分である。他の特有の態様においては、デルタ又はセレートのそのよ うな部分は、かかるタンパク質の細胞外部分である。 本発明の治療剤の更なる説明及び供給源は、ここの5.4節から 5.8節にかけて見出される。 本発明のアゴニスト及びアンタゴニスト治療剤は、細胞の運命の障害のための 治療的効用を有している。アゴニスト治療剤は、（1）ノッチ機能の不存在又は （正常な又は望ましいものに比較して）低下を包含する疾患又は障害において、 例えば、ノッチタンパク質が欠如しているか、遺伝的に欠陥があるか、生物学的 に不活性若しくは活性不足であるか、又は発現不足である患者において；及び（ 2）in vitro（又はin vivo）アッセイ（以下を参照のこと）によりノッチアゴニ スト投与の利用が必要とされる疾患又は障害において、治療用に投与される（予 防用も含む）。ノッチ機能の不存在又はレベルの低下は、例えば、患者組織サン プルを（例えば、生検組織から）採取して、タンパク質レベル、発現されたノッ チタンパク質の構造及び／又は活性についてそれをin vitroでアッセイすること によって容易に検出できる。かくして、ノッチタンパク質を検出及び／又は可視 化するイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降後のドデシル硫 酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等；以下の5.6節 に掲げたアッセイも参照のこと）、及び／又はノッチｍＲＮＡを検出及び／又は 可視化することによりノッチ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（ 例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション 等）を含むがこれらに限定されない当該技術分野で標準的な多くの方法を用いる ことができる。 特定のアゴニスト治療剤又はアンタゴニスト治療剤の投与が必要とされるかど うかを確認するのに用いることができる in vitroアッセイには、患者組織サンプルを培養液中で増殖させ、治療剤に曝すか 又は治療剤を投与し、そしてかかる治療剤の組織サンプルへの作用を観察するin vitro細胞培養アッセイが含まれる。１つの態様においては、患者が悪性腫瘍を 有する場合、かかる悪性腫瘍からの細胞のサンプルをプレートに塗布するか又は 培養液中で増殖させてから、それら細胞を治療剤に曝す。悪性細胞の生存又は増 殖を（例えば、終末分化を促進することによって）阻害する治療剤をin vivoで の治療用途用に選択する。当該技術分野で標準的な多くのアッセイを用いて、か かる生存及び／又は増殖を評価することができる。例えば、細胞増殖は、3H−チ ミジン取り込みを測定することにより、細胞を直接計数することにより、プロト オンコジーン（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）又は細胞サイクルマーカーの如き既知 遺伝子の転写活性の変化を検出することによりアッセイすることができ、細胞生 活能力は、トリパンブルー染色により評価することができ、分化は、形態等の変 化に基づいて目視で評価することができる。特有の側面においては、悪性細胞培 養物を（1）アゴニスト治療剤、及び（2）アンタゴニスト治療剤に別々に曝すと 、このアッセイの結果により、どちらのタイプの治療剤が治療効力を有するかが 示される。 他の態様においては、高増殖性又は低増殖性障害を有するか又は有すると考え られる組織からの患者細胞サンプルに、所期の作用、つまりそれぞれ細胞増殖の 阻害又は促進を示す治療剤の使用が必要とされる。かかる高増殖性又は低増殖性 障害には、以下の5.1.1節から5.1.3節にかけて記載されているものが含まれるが それらに限定されない。 他の特有の態様においては、神経損傷又は神経系変性性障害（5.1.2節を参照 のこと）の治療において、害された患者タイプの神経細胞からの神経再生／神経 突起伸長のin vitro促進を示す治療剤の使用が必要とされる。 加えて、本発明のアンタゴニスト治療剤の投与は、ノッチ優性活性化表現型（ “機能獲得”突然変異）を包含することが確認され又は知られている疾患又は障 害においても必要とされる。アゴニスト治療剤の投与は、ノッチ優性負表現型（ “機能損失”突然変異）を包含することが確認され又は知られている疾患又は障 害において必要とされる。本発明者らは、ｈｓｐ７０熱ショックプロモーター並 びに眼特異的（eye-specific）プロモーターの下で一連のショウジョウバエ・ノ ッチ欠失突然変異体を異所的に発現させることにより、in vivoでのノッチタン パク質の種々の構造ドメインの機能を調べた。２クラスの優性表現型が認められ 、１つはノッチ機能欠損突然変異（Notch loss-of functionmutations）を示唆 するものであり、もう１つはノッチ機能獲得突然変異（Notch gain-of function mutations）を示唆するものであった。優性“活性化”表現型は、殆どの細胞外 配列を欠くタンパク質の過剰発現から生じたものであり、一方、優性“負”表現 型は、殆どの細胞内配列を欠くタンパク質の過剰発現から生じたものであった。 本発明者らの結果は、ノッチがレセプターとして機能し、そのレセプターの細胞 外ドメインがリガンド結合を媒介する結果、その細胞質ドメインにより発達シグ ナルが伝達されることを示している。認められた表現型は、この細胞内ドメイン 内のｃｄｃ１０／アンキリンリピート領域がノッチ媒介シグナル 変換事象（細胞内機能）においてある重要な役割を果たしていることも示唆した 。 種々の特有の態様においては、患者の障害に関連する細胞型の代表的細胞でin vitroアッセイを行って、治療剤がかかる細胞型への所期の作用を有しているか どうかを確認することができる。 他の態様においては、新生物発生前であると考えられる患者組織サンプルの細 胞を同じくプレートに塗布するか又はin vitroで増殖させて、治療剤に曝す。よ り正常である細胞表現型（即ち、新生物発生前状態、新生物形成状態、悪性状態 、又は形質転換表現型にあまり該当しないもの）をもたらす治療剤を治療用途に 選択する。当該技術分野で標準的な多くのアッセイを用いて、新生物発生前状態 、新生物形成状態、又は形質転換若しくは悪性表現型が存在するかどうかを評価 することができる（5.2.1節を参照のこと）。例えば、形質転換表現型に関連付 けられる特徴（invivoで催腫瘍能力に関連付けられる一組のin vitro特徴）には 、より丸くなった細胞形態、よりゆるい下層付着、接触阻害の低下、足場依存性 の低下、プラスミノーゲンアクチベーターの如きプロテアーゼの放出、糖輸送の 増加、血清要求量の減少、胎児性抗原の発現、250,000ダルトン表面タンパク質 の消失等が含まれる（Luriaら，1978，General Virology，3d Ed．，JohnWiley & Sons．New York pp．436-446を参照のこと）。 他の特有の態様においては、前記のin vitroアッセイは、治療されるべき特定 の患者由来の細胞サンプルというよりむしろ細胞系を用いて行うことができ、そ の際、この細胞系は、治療又は予防することが望まれる悪性、新生物形成又は新 生物発生前障害 から誘導されるか又はその障害に関連付けられる特徴を示すものであるか、又は 本発明に従いある作用が望まれる神経細胞型又は他の細胞型から誘導される。 これらアンタゴニスト治療剤は、（1）ノッチ機能の（正常な又は望ましいも のに比較して）レベルの上昇を包含する疾患又は障害において、例えば、ノッチ タンパク質が過剰発現されるか又は過剰活性であるである場合において；及び（ 2）in vitro（又はin vivo）アッセイによりノッチアンタゴニスト投与の利用が 必要とされる疾患又は障害において、治療用に投与される（予防用も含む）。ノ ッチ機能のレベルの上昇は、上記の如き方法により、つまりタンパク質及び／又 はＲＮＡを定量することにより容易に検出できる。治療的効用を確認するための 患者組織サンプルの細胞又は適当な細胞系又は細胞型でのin vitroアッセイは、 上記の通りに行うことができる。 5.1.1.悪性腫瘍 アンタゴニスト又はアゴニスト治療剤の介在の効力について前記のように試験 され得、かくして治療的利用の必要性が認められたことに基づいて治療され得る 悪性及び新生物発生前状態には、5.1.1節及び5.2.1節で以下に記載するものが含 まれるが、それらに限定されない。 悪性腫瘍及び関連する障害であって、そのタイプの細胞がinvitro（及び／又 はin vivo）で試験され得、そして適当なアッセイの結果に基づいて本発明に従 って治療され得るものには、表１に掲げたものが含まれるが、それらに限定され ない（かかる障害の委細については、Fishmanら，1985，Medicine，2d Ed．， J.B.Lippincott Co．，Philadelphiaを参照のこと）。 表１ 悪性腫瘍及び関連する障害 白血病 急性白血病 急性リンパ性白血病 急性骨髄性白血病 骨髄芽球性 前骨髄球性 骨髄単球性 単球性 赤白血病 慢性白血病 慢性骨髄性（顆粒球性）白血病 慢性リンパ性白血病 一次性赤血球増加症 リンパ腫 ホジキン病 非ホジキン病 多発性骨髄腫 ワルデンストレームマクログロブリン血症 Ｈ鎖病 中実腫瘍 肉腫及び癌腫 線維肉腫 粘液肉腫 脂肪肉腫 軟骨肉腫 骨原性肉腫 脊索腫 血管肉腫 内皮肉腫 リンパ管肉腫 リンパ管内皮肉腫 滑膜腫 中皮腫 ユーイング腫瘍 平滑筋肉腫 横紋筋肉腫 結腸癌 膵臓癌 乳癌 卵巣癌 前立腺癌 扁平上皮癌 基底細胞癌 腺癌 汗腺癌 皮脂腺癌 乳頭状癌 乳頭状腺癌 嚢胞腺癌 髄様癌 気管支原生癌 腎細胞癌 肝細胞癌 胆管癌 絨毛癌 精上皮腫 胎生期癌 ビルムス腫瘍 子宮頸癌 精巣癌 肺癌 小細胞肺癌 膀胱癌 上皮癌 膠腫 神経膠星状細胞腫 髄芽細胞腫 頭蓋咽頭腫 上衣細胞腫 松果体腫 血管芽細胞腫 聴神経腫 乏突起膠腫 メナンギオーマ（menangioma） 黒色腫 神経芽細胞腫 網膜芽細胞腫 特有の態様においては、悪性又は異常増殖性変化（変質形成及び異形成の如き もの）は、頸部、食道、及び肺の如き上皮組織において治療又は予防される。 以下の10.1節の実施例で詳記するように、乳房、結腸、及び頸部の悪性腫瘍で は、同じ非悪性組織に比べてヒトノッチの発現が増加する。かくして、特有の態 様においては、乳房、結腸、又は頸部の悪性腫瘍は、有効量の本発明のアンタゴ ニスト治療剤を投与することによって治療又は予防される。乳癌、結腸癌、及び 頸癌における増加したノッチ発現の存在は、多く癌性状態で、ノッチが上方調節 されることを示唆している。かくして、本発明者らは、多くの癌、例えば、精上 皮腫、黒色腫及び肺癌を、アンタゴニスト治療剤を投与することによって治療又 は予防することができると考える。 5.1.2.神経系障害 アンタゴニスト又はアゴニスト治療剤の介在の効力について前記のように試験 され得、かくして治療的利用の必要性が認められたことに基づいて治療され得る 細胞型を含む神経系障害には、神経系損傷；及び軸策の断絶、ニューロンの減少 若しくは再生、又 は髄鞘脱落のいずれかをもたらす疾患又は障害が含まれるが、これらに限定され ない。本発明に従い、患者（ヒト及び非ヒト哺乳動物患者を含む）において治療 され得る神経系傷害には、次の中枢（脊髄、脳を含む）又は抹消神経系のいずれ かの傷害が含まれるが、それらに限定されない。 （ｉ） 物理的損傷によって起こる傷害又は手術に伴う傷害を含む外傷的損 傷、例えば、神経系の一部分を切断する傷害又は圧迫損傷； （ii） 神経系の一部分における酸素の欠乏がニューロンの損傷又は死をも たらす虚血性傷害であって、大脳梗塞若しくは虚血、又は脊髄梗塞若しくは虚血 を含むもの； （iii） 神経系の一部分が、悪性腫瘍を伴う神経系又は非神経系組織から 派生した悪性腫瘍のいずれかである悪性組織によって、破壊又は損傷を受ける悪 性傷害； （iv） 神経系の一部分が、例えば、菌塊による感染の結果として破壊又は 損傷を受けるか、又はヒト免疫不全ウィルス、帯状疱疹ウィルス、又は単純疱疹 ウィルスによる感染に関連付けられるか又はライム病、結核、梅毒に関連付けら れる感染性傷害； （ｖ） パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、又は筋 萎縮性側索硬化症に関連付けられる変性を含むがこれらに限定されない変性過程 の結果として神経系の一部分が破壊又は損傷を受ける変性性傷害； （vi） ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ疾患、タバコー アルコール性弱視、マルキアファーヴァービニャーミ病（脳梁の一次変性）、及 びアルコール性小脳変性を含むがこれらに限定されない栄養性傷害又は代謝の傷 害により神経系の一部分が破壊又は損傷を受ける栄養性疾患又は傷害に関連付け られる傷害； （vii） 糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル不全麻痺）、全身性エリ テマトーデス、癌腫、又はサルコイドーシスを含むがこれらに限定されない全身 性疾患に関連付けられる神経系傷害； （viii）アルコール、鉛、又は特定の神経毒を含む毒性物質により起こる傷 害； （ix） 多発性硬化症、ヒト免疫不全ウィルス関連脊髄傷害、横断脊髄傷害 又は種々の病因、進行性多病巣性白質脳症、及び橋中央ミエリン溶解を含むがこ れらに限定されない脱髄疾患により神経系の一部分が破壊又は損傷を受ける脱髄 傷害 本発明に従い神経系傷害の治療に有用な治療剤は、ニューロンの生存又は分化 を促進する生物活性について試験することによって選択することができる（5.1 節も参照のこと）。例えば、限定としてではなく、次のいずれかの作用を引き出 す治療剤は、本発明に従って有用であるといえる。 （ｉ） 培養液中でのニューロンの生存時間の増加； （ii） 培養液中又はin vivoでのニューロンの新芽形成 の増加； （iii） 培養液中又はin vivoでのニューロン関連分子、例えば、運動ニュ ーロンに関するコリンアセチルトランスフェラーゼ又はアセチルコリンエステラ ーゼの産生の増加； （iv） in vivoでのニューロン機能傷害の症状の減少。 かかる作用は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって測定することができ る。好ましい非限定的態様においては、ニューロンの生存の増加は、Arakawaら （1990,J.Neurosci．10:3507-3515）に記載された方法によって測定でき；ニュ ーロンの新芽形成の増加は、Pestronkら（1980,Exp.Neurol.70:65-82）又はBrow nら（1981,Ann.Rev.Neurosci.4:17-42）に記載された方法によって測定でき；ニ ューロン関連分子の産生の増加は、測定される分子に依存して、バイオアッセイ 、酵素的アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイ等によって測定でき； そして運動ニューロン機能傷害は、運動ニューロン障害の物理的症状発現、例え ば、衰弱、運動ニューロン伝導速度、又は機能的能力障害を評価することによっ て測定できる。 特有の態様においては、本発明に従って治療され得る運動ニューロン障害には 、運動ニューロン並びに神経系の他の成分を害し得る、亀裂骨折、感染症、毒素 への暴露、外傷、手術による損傷、変性性疾患又は悪性腫瘍の如き障害、並びに 筋萎縮性側索硬化症の如きニューロンを選択的に害する障害が含まれるがこれら に限定されず、また、進行性輔筋萎縮、進行性延髄麻痺、一次側索硬化症、小児 及び若年筋萎縮症、幼年期の進行性延髄完全麻痺（ Fazio-Londe症候群）、ポリオ及びポリオ後症候群、及び遺伝性運動知覚神経疾 患（Carcot-Marie-Tooth疾患）が含まれるがこれらに限定されない。 5.1.3.組織修復及び再生 本発明の他の態様においては、本発明の治療剤を、良性異常増殖性障害の治療 を含むがこれに限定されない、組織再生及び修復の促進に用いる。特有の態様は 、肝硬変（瘢痕化が正常肝臓再生過程よりも過剰に進んだ状態）の治療、ケロイ ド（過形成性瘢痕）形成（瘢痕化過程が正常な更新を妨害する皮膚の醜悪化）、 乾癬（皮膚の過剰増殖及び適正な細胞の運命決定の遅れによって特徴付けられる よく起こる皮膚の状態）、及び禿頭症（終末分化した毛嚢（ノッチが豊富な組織 ）が適正に機能することができない状態）の治療に向けられている。 5.2. 予防的用途 5.2.1.悪性腫瘍 本発明の治療剤は、表１に掲げた障害を含むがそれらに限定されない新生物形 成又は悪性状態への進行を予防するために投与することができる。かかる投与は 、前記のように、かかる障害の治療又は予防の効用を有することがアッセイで示 される場合に必要とされる。かかる予防的用途は、新生物又は癌への進行に先行 することが知られているか又は先行すると考えられる状態において、特に過形成 、変質形成、最も特定的には異形成からなる非新生物形成細胞増殖が起こる場合 に必要とされる（かかる異常増殖状態の委細については、RobbinsとAngell，197 6，Basic Pathology，2d Ed.,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,pp.68-79を参照 のこと）。過形成は、構造又は機能において有意な変化なしに組織又は器官内で の細胞数の増加を包含する制御された細胞増殖の一形態である。一例として、子 宮内膜過形成は、子宮内膜癌に先行することが多い。変質形成は、あるタイプの 成熟した又は十分に分化した細胞が別のタイプの成熟細胞と置き換わる制御され た細胞増殖の一形態である。変質形成は、上皮又は結合組織細胞内で起こり得る 。非定型の変質形成は、幾分無秩序な変質形成上皮を包含する。異形成は頻繁に 癌の前駆症状となり、主として上皮において見出され；それは非新生物形成細胞 増殖の最も無秩序な形態であって、個々の細胞統一性と細胞の構築方向性の損失 に関連している。異形成細胞は、異常に大きくて濃く染色した核を有する場合が 多く、多形性を示す。異形成は、慢性過敏又は炎症が存在する場合に起こり、頸 部、気道、口腔、及び胆嚢で見出されることが多い。 過形成、変質形成、又は異形成として特徴付けされる異常細胞増殖の存在とは 別に又はそれに加えて、患者からの細胞サンプルにより in vivoで発揮される か又はin vitroで発揮される形質転換表現型又は悪性表現型の１又は２以上の特 徴の存在は、本発明の治療剤の予防的／治療的投与が望ましいことを示すことが できる。前に挙げたように、形質転換表現型のかかる特徴には、形態的変化、ゆ るい下層付着、接触阻害の低下、足場依存性の低下、プロテアーゼの放出、糖輸 送の増加、血清要求量の減少、胎児性抗原の発現、250,000ダルトン細胞表面タ ンパク質の消失等が含まれる（形質転換又は悪性表現型に関連付けられる特徴に ついては、同文献のpp．84-90を参照のこと）。 特有の態様においては、白斑症、上皮の良性と思われる増殖性又は形成不全型 傷害、又はブラウン疾患、つまりin situでの癌腫は、予防的介在が望ましいこ とを示す前新生物性傷害である。 他の態様においては、線維嚢胞病（嚢胞性過形成、乳房異形成、特に腺疾患（ 良性上皮過形成））は、予防的介在が望ましいことを示している。 他の態様においては、悪性腫瘍の次の素因を１又は２以上示す患者を、有効量 の治療剤を投与することによって治療する：悪性腫瘍に関連付けられる染色体移 動（例えば、慢性骨髄性白血病についてのフィラデルフィア染色体、濾胞性リン パ腫についてのｔ（１４，１８）等）、家族性ポリープ症又はガードナー症候群 （結腸癌のあり得る前駆症状）、良性モノクローナル高ガンマグロブリン症（多 発性骨髄腫のあり得る前駆症状）、及びメンデル遺伝パターンを示す癌又は前癌 性疾患を有する人と一親等であること（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガー ドナー症候群、遺伝性外骨腫症、多発性内分泌腺腫症、アミロイド産生及び褐色 細胞腫を有する延髄甲状腺癌、ポイツージェガーズ症候群、VonRecklinghausen の神経繊維腫症、網膜芽細胞腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内黒色癌、色 素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調、チェディアック・東症候群、白化症、ファ ンコーニ再生不良性貧血、及びブルーム症候群（RobbinsとAngell,1976,Basic P athology,2d Ed.,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,pp．112-113を参照のこと） 等）。 他の特有の態様においては、本発明のアンタゴニスト治療剤をヒトの患者に投 与して、乳癌、結腸癌、又は子宮頸癌への進行を 予防する。 5.2.2.他の障害 他の態様においては、本発明の治療剤を投与して、5.1.2.に記載した神経系障 害又は5.1.3.に記載した他の障害（例えば、肝硬変、乾癬、ケロイド、禿頭症） を予防することができる。 5.3. 治療的又は予防的利用の実地 本発明の治療剤は、所期の治療的又は予防的活性についてin vivoで試験する ことができる。例えば、かかる化合物をヒトで試験する前に、マウス、ニワトリ 、ウシ、サル、ウサギ等を含むがこれらに限定されない適当な動物モデル系で試 験することができる。in vivo試験には、ヒトへの投与の前に、当該技術分野で 知られているあらゆる動物モデル系を用いることができる。 5.4. 治療的／予防的投与及び組成物 本発明は、被験体に有効量の本発明の治療剤を投与することによる治療（及び 予防）の方法を提供する。好ましい側面においては、この治療剤は実質的に精製 されている。被験体は、好ましくは、ウシ、ブタ、ニワトリ等の如き動物を含む がこれらに限定されない動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましく はヒトである。 種々の送達系が知られており本発明の治療剤を投与するのに用いることができ る。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への被包、組換え細胞に よる発現、レセプター媒介飲食作用（例えば、WuとWu,1987,J.Biol.Chem.262:44 29-4432を参照のこと）、レトロウィルス又は他のベクターの部分としての治療 剤核酸の構築等である。導入方注には、皮膚内、筋肉内、 腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、及び経口ルートが含まれるがこれらに限定され ない。これら化合物は、あらゆる便利なルートにより、例えば、輸注又は濃縮塊 注射（bolus injection）により、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、 直腸又は腸粘膜等）を通過する吸収により投与することができ、他の生物活性な 物質と一緒に投与してもよい。投与は全身投与であっても局所投与であってもよ い。加えて、本発明の医薬組成物を、脳室内及び髄腔内注射を含むあらゆる適当 なルートによって中枢神経系に導入するのが望ましいといえる。脳室内注射は、 脳室内カテーテル、例えば、オマヤレザバーの如きレザバーに取り付けられた脳 室内カテーテルにより容易化できる。 特有の態様においては、治療を要する部分に局所的に本発明の医薬組成物を投 与するのが望ましいといえる。これは、例えば、限定としてではなく、手術中の 局所輸注、手術後の例えば創傷包帯を用いた局所適用により、注射により、カテ ーテルにより、坐剤により、又はシアラスティック（sialastic）膜の如き膜又 は繊維を含む多孔性、非多孔性、又は膠状材料製の移植片により行うことができ る。１つの態様においては、投与は、悪性腫瘍又は新生物形成又は新生物発生前 組織の部位（又は元の部位）での直接注射によってもよい。 特有の態様においては、ノッチ発現細胞内への治療剤の投与は、デルタ（又は 他のトポリズミック）タンパク質又はノッチとの結合を媒介できるデルタタンパ ク質の部分に治療剤を連結させることにより行われる。ノッチ発現細胞とその連 結治療剤との接触により、そのデルタ部分を介して、細胞表面上のノッチへの連 結治 療剤の結合が行われ、その後にノッチ発現細胞内への連結治療剤の取り込みが行 われる。 ノッチ細胞内シグナル変換ドメインの類似体が、ノッチシグナル変換を阻害で きるように治療剤として用いられる特有の態様においては、その類似体を好まし くは細胞内に（例えば、核酸ベクターからの発現により、又はノッチに結合でき るデルタの部分への連結、それに続く結合及び内在化により、又はレセプター媒 介メカニズムにより）送達する。 治療剤がタンパク質治療剤をコードする核酸である特有の態様においては、そ の核酸をin vivoで投与してそのコードされたタンパク質の発現を促進すること ができる。これは、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築し、それが 細胞内のものとなるように、例えば、レトロウィルスベクターの使用により又は 直接注射により（米国特許第4,980,286号を参照のこと）、又は微粒子砲撃（例 えば、遺伝子銃；Biolistic,Dupont）の使用又は脂質若しくは細胞表面レセプタ ー若しくは形質移入剤のコーティングによりなされ、又は核に入り込むことが知 られているホメオボックス様ペプチドとの連結体でそれを投与すること（例えば 、Joliotら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：1864-1868を参照のこと） 等によりなされる。また、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして相同的組換えに より発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませてもよい。 特定の障害の治療又は予防に向けられる特有の態様においては、好ましくは次 の投与形態が用いられる。 障害 好ましい投与形態 頸癌 局所 胃腸癌 経口、静脈内 肺癌 吸入、静脈内 白血病 静脈内、体外 転移性癌腫 静脈内、経口 脳癌 標的投与、静脈内、髄腔内 肝硬変 経口、静脈内 乾癬 局所 ケロイド 局所 禿頭症 局所 脊髄傷害 標的投与、静脈内、髄腔内 パーキンソン病 標的投与、静脈内、髄腔内 運動ニューロン疾患 標的投与、静脈内、髄腔内 アルツハイマー病 標的投与、静脈内、髄腔内 本発明は医薬組成物も提供する。かかる組成物は、治療的有効量の治療剤、及 び薬学的に許容できる製剤上の担体又は賦形剤を含む。そのような製剤上の担体 には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタ ノール、及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。この製剤 上の担体及び組成物は無菌であってもよい。その配合は、投与様式に適するもの であるべきである。 所望により、この組成物は、僅かな量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も 含有することができる。この組成物は、液体溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸 剤、カプセル剤、徐放性製剤、又 は散剤であってもよい。この組成物をトリグリセリドの如き伝統的な結合剤及び 製剤上の担体と共に坐剤として製剤してもよい。経口用製剤は、医薬用のマンニ トール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリ ウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の如き標準的な製剤上の担体を含んでも よい。 好ましい態様においては、この組成物は、人への静脈内投与に適合した医薬組 成物として日常的操作に従って製剤される。典型的には、静脈内投与用組成物は 、無菌等張性水性緩衝液中の溶液剤である。必要な場合には、この組成物は、可 溶化剤及び注射部位における痛みを和らげるためにリグノカインの如き局所麻酔 剤も含んでもよい。一般に、これら成分は別々に又は一緒に混合するかして、単 位投与形態で、例えば、活性物質の量を示すアンプル又は袋の如き密封容器内の 凍結乾燥粉末又は水不含濃厚物として供給される。この組成物を輸注によって投 与する場合は、それを無菌医薬用水又は生理食塩水を含有する輸注ビンで調剤し てもよい。この組成物を注射によって投与する場合は、注射用無菌水又は生理食 塩水のアンプルを、それら成分を投与前に混合できるように提供してもよい。 本発明の治療剤は、中和形態又は塩形態として製剤されてもよい。薬学的に許 容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるもの の如きフリーのアミノ基と形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモ ニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、 ２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるものの 如きフリーのカルボキシル基と形成されるものが含まれ る。 特定の障害又は状態の治療に有効であろう本発明の治療剤の量は、その障害又 は状態の性質に依存するであろうが、標準的臨床技術によって決めることができ る。加えて、in vitroアッセイを任意に用いて最適投与量範囲を特定する助けと してもよい。この製剤中に用いられる正確な用量も、投与ルート及び疾患又は障 害の重さに依存するであろうが、医師の判断及び各患者の状況に従って決定され るべきである。しかしながら、静脈内投与に適する投与量範囲は、一般的には、 体重１ｋｇ当たり活性化合物約20〜500マイクログラムである。鼻腔内投与に適 する投与量範囲は、一般的には、約0.01ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重であ る。有効量は、in vitro又は動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から 推定することができる。 坐剤は、一般には、０．５〜１０重量％の活性成分を含有し、経口用製剤は、 好ましくは１０〜９５重量％の活性成分を含有する。 本発明は、本発明の医薬組成物の１又は２以上の成分を充填した１又は２以上 の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。かかる容器に、医薬品又は生物 学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定された形での警告 であって、製造、使用又は販売のこの機関によるヒト投与のための認可を反映し たものを付するのは任意である。 5.5 アンチセンスによるノッチの発現の調節 本発明では、ノッチあるいはその一部をコードしている遺伝子あるいはｃＤＮ Ａのアンチセンスである、６個以上のヌクレオチドからなる核酸の、治療上ある いは予防上の使用が提供される。ここで、「アンチセンス」とは、配列のある程 度の相補性ゆえに、ノッチＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部とハイブリダイ ズしうる核酸のことを称するものである。この種のアンチセンス核酸は、本発明 のアンタゴニスト治療剤として利用することができ、さきに第５．１節やその下 位の節で説明したような障害を治療したり予防したりする際に使用することがで きる。 本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖、一本鎖、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡであ るオリゴヌクレオチド、あるいはそれらを修飾したり、それらから誘導したもの とすることができ、このアンチセンス核酸は、直接細胞に投与することも、外来 の導入配列の転写によって細胞内で生成させることもできる。 ある具体的実施態様では、腫瘍あるいは障害に罹患した細胞が、（in vitroあ るいはin vivoで）ノッチ遺伝子を発現していることを立証されうるような腫瘍 あるいは他の障害を治療するにあたって、本発明によって提供されるノッチのア ンチセンス核酸を使用することができる。ノッチ遺伝子が発現されていることは 、ノッチＲＮＡあるいはノッチタンパク質を検出することによって立証すること ができる。 本発明は、さらに、さきに第５．４節で説明したような、本発明のノッチのア ンチセンス核酸の有効量と、製剤学的に許容しうる担体とを含有する医薬組成物 も提供するものである。（第５． １ならびに５．２節で説明したような）障害を治療ならびに予防するにあたって 、本発明の医薬組成物を投与する方法も提供される。 別の実施態様では、本発明は、ノッチ核酸配列の原核あるいは真核細胞中での 発現を抑制するにあたって、細胞に、本発明のアンチセンスノッチ核酸を含有す る組成物を有効量与える方法に関するものとなっている。 また別の実施態様では、機能的ノッチ受容体を発現している細胞の同定を、ノ ッチのアンチセンス核酸が細胞に及ぼした毒性作用から、ノッチがその細胞を「 救済」しえたか否かを観察することによって行うことができる。 本発明のさらに別の実施態様では、ノッチに結合する（「接着性」の）トポリ ズミックなタンパク質あるいは断片をコードする核酸に対してアンチセンスとな る核酸を、治療剤として想定している。 ノッチのアンチセンス核酸ならびにその使用について、以下で詳しく説明する 。 5.5.1 ノッチのアンチセンス核酸 ノッチのアンチセンス核酸は、６個以上のヌクレオチドを有しており、好まし くは、オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド６−約５０個の範囲のオリゴヌクレオ チド）である。本発明の具体的観点のいくつかでは、オリゴヌクレオチドは１０ 個以上、１５個以上、１００個以上、あるいは２００個以上のヌクレオチドを有 している。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれ らのキメラ混合物とすることも、それらの誘導体、あるいはそれらを修飾したも のとすることもでき、また、一本鎖とすることも二本鎖とすることもできる。オ リゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、リン酸骨格のいずれを修飾することも できる。オリゴヌクレオチドは、他の付加部分、たとえばペプチド、あるいは細 胞膜をとおしての輸送を促進する物質（たとえば、Letsinger et a1.，1989，Pr oc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86：6553-6556、Lemaitre et al.，1987，Proc． Natl．Acad．Sci．U.S.A．84：648-652、１９８８年１２月１５日に公開された ＰＣＴ公開番号第ＷＯ８８／０９８１０号を参照のこと）、血液−脳障壁をとお しての輸送を促進する物質（たとえば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣ Ｔ公開番号第ＷＯ８９／１０１３４号を参照のこと）、ハイブリダイゼーション が引金となる切断物質（たとえば、Krolet al.，1988，BioTechniques 6：958-9 76を参照のこと）、あるいは挿入物質（たとえば、Zon，1988，Pharm．Res．5： 539-549を参照のこと）を有することもできる。 本発明の好適な観点では、ノッチのアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供さ れ、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。特に好適な観 点では、このオリゴヌクレオチドは、ノッチ、特に好ましくはヒトのノッチのＥ ＬＲ１１およびＥＬＲ１２をコードする配列に対するアンチセンスであるような 配列を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、構造中の任意の位置を、当業界で一 般に公知の置換基で修飾することもできる。 ノッチのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブ ロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨード ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボ キシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チ オウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、 β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン 、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２− メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシ ン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、 ５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシ ン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メ チルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、 ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５− メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチル ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢 酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ２−カル ボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ，および２，６−ジアミノプリンよ りなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾塩基部分を含むこともできる。なお 、修飾塩基部分はこれらに限定されるものではない。 別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラ ビノース、キシルロース、ならびにヘキソースよりなる群から選ばれる少なくと も１種の修飾糖部分を含有している。なお、修飾糖部分はこれらに限定されるも のではない。 さらに別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホス ホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロ ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル ムアセタールあるいはその同族体よりなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾 リン酸骨格を含有している。 さらに別の実施態様では、オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオ チドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡとともに特異 的な二本鎖のハイブリッドを形成し、このハイブリッドでは、通常のβ単位とは 異なり、双方の鎖が互いに平行に延在している（Gautier et al.，1987，Nucl． AcidsRes．15：6625-6641）。 オリゴヌクレオチドは、別の分子、たとえばペプチド、ハイブリダイゼーショ ンが引金となる架橋物質、輸送物質、ハイブリダイゼーションが引金となる切断 物質などと結合させることもできる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の標準的な方法、たとえば、自 動ＤＮＡ合成装置（たとえば、バイオサーチ（Biosearch）、アプライドバイオ システムズ（Applied Biosystems）などから入手可能な装置）を使用することに よって合成することができる。たとえば、ホスホロチオエートオリゴは、スタイ ンら（Stein et al.，1988，Nucl．Acids Res．16：3209）の方法によって合成 することができ、メチルホスホネートオリゴは、controlled pore glassポリマ ー支持体（Sarin et al.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85：7448-745 1）を使用することによ って調製することができる。 ある具体的実施態様では、ノッチのアンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒Ｒ ＮＡあるいはリボザイム（たとえば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ 国際公開ＷＯ９０／１１３６４、Sarver et al.，1990，Science 247：1222-122 5を参照のこと）である。別の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、２’ −Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al.，1987，Nucl．Acids Res．15：6 131-6148）、あるいはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al.，1987，FEBS Lett．215：327-330）である。 別の実施態様では、本発明のノッチのアンチセンス核酸を、外来の配列からの 転写によって細胞内で生成させる。たとえば、in vivoで細胞にベクターが摂取 されるようにベクターを導入すると、ベクターあるいはその一部が細胞内で転写 されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成されることになる。このベ クターは、ノッチのアンチセンス核酸をコードする配列を含んでいるものであり 、転写されることによって所望のアンチセンスＲＮＡが生成されるのであれば、 ベクターはエピソームのままとどまっても、染色体に組み込まれてもよい。こう したベクターは、当業界で標準となっている組換えＤＮＡ技術によって構築する ことができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス性ベクターをはじめとする、 哺乳動物の細胞中での複製ならびに発現に使用される当業界で公知のベクターと することができる。ノッチのアンチセンスＲＮＡをコードする配列を発現させる にあたっては、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で作用することが当業界で知ら れている任意のプロモーターを用いることができ、このプロモーターは、 誘導性のものとすることも、構成的なものとすることもできる。こうしたプロモ ーターとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon，19 81，Nature 290：304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロング・ターミナル・ リピートに含まれるプロモーター（Yamamoto et al.，1980，Cell 22：787-797 ）、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター（Wagner etal.，1981， Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78：1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の 調節配列（Brinster et al.，1982，Nature 296：39-42）などを挙げることがで きるが、プロモーターはこれらに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は、ノッチ遺伝子、好ましくはヒトのノッチ遺伝子 のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的な配列を有している。アンチセンス核 酸は、ＲＮＡ転写物と完全に相補的であるのが好ましいものの、必ずしも完全に 相補的でなくてもよい。ここで、「ＲＮＡの少なくとも一部との相補的な」配列 とは、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重螺旋を形成するのに十分な相補性 を有する配列のことを意味するものであり、二本鎖ノッチアンチセンス核酸の場 合には、二重螺旋のＤＮＡのうちの一本の鎖を調べるか、三重螺旋の形成につい て調べることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度と、アンチセ ンス核酸の長さの双方に左右される。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほ ど、ノッチＲＮＡと一致しない塩基の数が増えるものの、安定な二重螺旋（場合 によっては三重螺旋）が形成されるようになる。当業者であれば、標準的な方法 を使用してハイブリダイズした複合体の解離点を測定することによって、許容可 能なミ スマッチの程度を確認することができる。 5.5.2 ノッチのアンチセンス核酸の治療上の有用性 ノッチのアンチセンス核酸は、細胞がノッチＲＮＡを発現することがわかって いるような種類の悪性疾患を治療（あるいは予防）する際に使用することができ る。ノッチＲＮＡの発現について調べることのできる悪性細胞、新生物細胞、な らびに前新生物細胞としては、先に第5.1.1ならびに5.1.2節で説明したものが挙 げられるが、これらに限定されるものではない。ある好適な実施態様では、一本 鎖ＤＮＡのアンチセンスノッチオリゴヌクレオチドを使用する。 ノッチＲＮＡを発現する悪性（特に腫瘍）細胞の種類は、当業界で公知の各種 の方法によって特定することができる。こうした方法としては、ノッチ特異的な 核酸とのハイブリダイゼーション（たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション 、ドットブロットハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション） が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な観点では、治療を行 う前に、患者から採取した一次腫瘍組織をノッチの発現について調べておくこと ができる。 有効量のノッチのアンチセンス核酸と、製剤学的に許容しうる担体とを含有す る本発明の医薬組成物（第5.1.4節を参照のこと）は、ノッチＲＮＡが発現され るような種類の悪性疾患に罹患した患者に投与することができる。 特定の障害あるいは状態を治療するにあたってのノッチのアンチセンス核酸の 有効量は、障害あるいは状態の性状に応じて決ま り、この量は、臨床上の標準的技法によって決定することができる。可能であれ ば、ヒトでの試験や使用を行う前に、治療を行う種類の腫瘍細胞に対するアンチ センスの毒性をin vitroで決定し、次に、有用な動物モデル系で測定しておくの が望ましい。 ある具体的実施態様では、ノッチのアンチセンス核酸を含有する医薬組成物を 、リポソーム、微粒子、あるいはマイクロカプセルとして投与している。本発明 の種々の実施態様では、この種の組成物を使用して、ノッチのアンチセンス核酸 を持続的に放出させることが有用なこともある。ある具体的実施態様では、抗体 を用いることによって特定の同定可能な腫瘍抗原まで送達されるようにしたリポ ソームを使用するのが望ましいことがある（Leonetti et al.，1990，Proc．Nat l．Acad．Sci．U.S.A．87：2448-2451；Renneisen et al.，1990，J．Biol．Che m．265：16337-16342）。 5.6. 診断上の有用性 ノッチタンパク質、類似体、誘導体、あるいはその配列の一部、ノッチ核酸（ ならびにそれに対して相補的な配列）、ならびにノッチタンパク質と相互作用を 生じる抗ノッチ抗体および他のトポリズミックタンパク質ならびにその誘導体お よび類似体、ならびにノッチタンパク質とトポリズミックタンパク質との相互反 応を阻害する物質は、診断上の用途を有している。こうした分子は、種々の検定 法、たとえば免疫検定法によって、ノッチの発現に影響が及ぶような各種の状態 、疾病、ならびに障害を検出したり、予後を予測したり、診断したり、監視した りする際、そしてまた、 その治療経過を監視したりする際に使用することができる。こうした免疫検定法 は、特に、患者から採取した試料と抗ノッチ抗体とを免疫特異的な結合が生じう るような条件下で接触させ、抗体による免疫特異的な結合の量を検出あるいは測 定する方法によって実施されるものである。ある具体的実施態様では、ノッチの 異常なレベルが疾病状態の指標となるような場合に、ノッチに対する抗体を使用 して、患者の組織あるいは血清の試料中のノッチの存在の有無を調べることがで きる。 使用しうる免疫検定法としては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ 、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫検定 法、免疫沈降検定法、沈降素反応法、ゲル核酸沈降素反応法、免疫拡散検定法、 凝集検定法、補体結合検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテイン Ａ免疫検定法をはじめとする種々の技法を使用した競合的ならびに非競合的な検 定システムを挙げらことができるが、使用しうる検定法はこれらに限定されるも のではない。 ノッチ遺伝子およびその関連核酸配列、ならびにその部分配列、たとえば、相 補的配列ならびに他のトポリズミックな配列も、ハイブリダイゼーション検定法 に使用することができる。ノッチ核酸配列、あるいは約８個以上のヌクレオチド を有するその部分配列は、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用するこ とができる。ハイブリダイゼーション検定法は、上述したようなノッチの発現お よび／または活性の異常な変化を伴う状態、障害、あるいは疾病状態を検出した り、予後を予測したり、診断したり、監視したりする際に使用することができる 。こうしたハイブリダ イゼーション検定法は、特に、核酸を含有する試料と、ノッチＤＮＡあるいはＲ ＮＡとハイブリダイズしうる核酸プローブとを、ハイブリダイゼーションが生じ うるような条件下で接触させ、その結果生じたハイブリダイゼーションを検出あ るいは測定する方法によって実施されるものである。 後述の第１０．１節の実施例でも詳しく説明するように、ヒトの乳癌、結腸癌 、ならびに子宮頸癌では、ノッチの発現が増大する。したがって、具体的実施態 様のいくつかでは、ヒトの乳癌、結腸癌、ならびに子宮頸癌、あるいはそうした 組織の前悪性変化の診断を、（患者あるい別の提供者から採取した）類似した非 悪性（あるいは、場合によっては非前悪性）の試料でのノッチの発現（すなわち 量）（実験的に測定した発現量、あるいはこうした試料の標準的レベルとして既 知の発現量）に対する、患者から採取した試料でのノッチの発現（すなわち量） の増加を検出することによって行う。 一実施態様では、検出あるいは測定を行うノッチタンパク質（あるいは、ノッ チ抗原性を有しているその誘導体）が、細胞表面に存在している。別の実施態様 では、ノッチタンパク質（あるいは誘導体）は、（たとえば、血液あるいは血清 試料で測定されるような）無細胞の可溶性分子であったり、細胞内に存在してい たりする。出願人は、無細胞ノッチは、細胞表面から分泌あるいは遊離されるこ とによって生じたものであると考えているが、無細胞ノッチの生成機序は、こう した機序に限定されるものではない。さらに別の実施態様では、可溶性、細胞表 面、ならびに細胞内のノッチタンパク質あるいは誘導体の量を検出あるいは測定 する。 5.7. ノッチ核酸 ノッチ核酸またはノッチアンチセンス核酸、およびタンパク質治療剤をコード する核酸である本発明の治療剤は、下記のものを含み、それらは当分野の技術で 公知の方法、特に下記の方法によって得ることができる。 本発明のある側面において、本発明は抗原決定基を含む（すなわち、抗体によ って認識され得る）、または機能的に活性であるノッチ、好ましくはヒトノッチ ならびにそれらの断片および誘導体のアミノ酸配列、またそれらをコードする核 酸配列を提供する。ここで使用される「機能的に活性な」物質とは、全長（天然 型）ノッチタンパク質産物にともなう１つ以上の公知の機能的活性、例えば、デ ルタに結合する、セレートに結合する、他の任意のノッチリガンドに結合する、 抗原性（抗ノッチ抗体に結合する）、等を示す物質をいう。 特定の態様において、本発明は少なくとも４０アミノ酸からなる、または少な くとも７５アミノ酸からなる、ノッチタンパク質の断片を提供する。他の態様に おいて、タンパク質はノッチタンパク質の細胞内ドメイン、膜貫通領域、細胞外 ドメイン、ｃｄｃ１０領域、ノッチ／ｌｉｎ−１２リピート、またはＥＧＦ−相 同リピート、あるいは以上のものの任意の組み合わせを含む、または本質的にそ れらからなる。ノッチのＥＧＦ−相同リピートのいくつかまたは全部を欠く断片 または断片を含むタンパク質もまた提供される。以上のものをコードする核酸が 提供される。 他の特定の態様において、本発明は少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも ５０ヌクレオチド、または少なくとも１５０ヌク レオチドからなる、ノッチ、好ましくはヒトノッチの、ヌクレオチド配列および サブ配列を提供する。 上記のタンパク質およびタンパク質断片をコードする核酸が、そのような核酸 と相補的な核酸およびそれらとハイブリダイゼーション可能な核酸と共に、提供 される。１つの態様において、そのような相補的配列は、少なくとも２５ヌクレ オチドまたは少なくとも１００ヌクレオチドのノッチｃＤＮＡ配列と相補的であ り得る。好ましい側面において、本発明はヒトノッチまたはその一部分をコード するｃＤＮＡ配列を利用する。ある特定の態様においては、ヒトノッチ遺伝子ま たはｃＤＮＡのこのような配列は、プラスミドｈＮ３ｋ、ｈＮ４ｋまたはｈＮ５ ｋ（下記の第９節参照）あるいはそれに対応する遺伝子に含有される。このよう なヒトノッチタンパク質配列は図１０（配列番号１１）または図１１（配列番号 １３）に示されるものであり得る。他の態様において、ノッチ核酸および／また はそれにコードされるタンパク質は、次の刊行物のうち１つにに示される配列の 少なくとも一部を有する：Whartonら、1985，Cell 43:567-581（ショウジョウバ エノッチ）；Kiddら、1986，Mol.cell.Biol．6:3094-3108（ショウジョウバエ ノッチ）；Coffmanら、1990，Science 249:1438-1441（ツメガエル ノッチ）； Ellisenら、1991、Cell 66:649-661（ヒトノッチ）。もう１つの側面において、 ヒトノッチ配列は、図１３に示されるようなヒトノッチアミノ酸配列またはその 一部をコードするものである。ある特定の側面において、ヒトノッチ配列はｈＮ 相同体（プラスミドｈＮ５ｋによって部分的に表される）またはＴＡＮ−１相同 体のそれである。 本発明の１つの態様において、本発明は図１３に示されるｈＮ相同体によって コードされる、信号配列（すなわち、前駆体タンパク質：アミノ酸１−２１６９ ）を含有するもの、および信号配列（すなわち、成熟タンパク質：アミノ酸〜２ ６−２１６９）を欠くもの両方の全長ヒトノッチタンパク質、その部分（つまり 、細胞外ドメイン、ＥＧＦ相同リピート領域、ＥＧＦ様リピート１１および１２ 、ｃｄｃ−１０／アンキリンリピート、等）および前記のものを含むタンパク質 ならびに前記のものをコードする核酸に向けられている。 容易に明らかなように、ここで使用される「ノッチタンパク質の断片または部 分をコードする核酸」という表現は、ノッチタンパク質の他の部分ではなく記述 されている断片または部分のみをコードする核酸をいうと理解されるべきもので ある。 本発明の好ましいが限定的ではない側面において、ヒトノッチＤＮＡ配列のク ローン化および配列決定が、第９節に後述する方法によって可能である。 別の好ましい側面においては、選択に先立ち、ライブラリー中の所望の配列を 増幅するのにＰＣＲが用いられる。例えば、所望の遺伝子の相同体によってコー ドされる付着性ドメインを部分的に表すオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲ におけるプライマーとして使用できる。 上記の方法は、ノッチのクローンを得る方法の下記の一般的記述を制限するも のではない。 真核細胞は、ノッチ遺伝子の分子クローニングのための核酸供給源として役立 つ可能性がある。ＤＮＡは当技術分野で公知の標 準的手順によって、クローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」 ）から、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または所望のヒト細胞から精製した ゲノムＤＮＡあるいはその断片のクローニングによって得ることができる［例え ば、Sambrookら、1989,Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，2d.Ed.，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M． （編），1985，DNA Cloning：A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford ，U.K．Vol．I，II参照］。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、コード領 域のほかに、調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含有する可能性がある。ｃ ＤＮＡから誘導されたクローンはエキソン配列のみを含有する。供給源が何であ れ、遺伝子はその増殖のために適切なベクター中に分子としてクローン化されな ければならない。 ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子の分子クローン化においては、ＤＮＡ断片が作成さ れ、そのうちいくつかが所望の遺伝子をコードする。種々の制限酵素を用いて特 定部位でＤＮＡを開裂することができる。または、マンガンの存在下でＤＮアー ゼ（ＤＮＡｓｅ）を用いてＤＮＡをばらばらにすることも可能であるし、あるい は、例えば超音波処理により、ＤＮＡを物理的に切断することも可能である。次 に、線形ＤＮＡ断片を、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動なら びにカラムクロマトグラフィーを含むがこれらのみに限定されない標準的技法に より、サイズによって分離することができる。 いったんＤＮＡ断片を作成したならば、いろいろな方法で所望の遺伝子を含有 する特定ＤＮＡ断片の同定を成し遂げることが可 能である。例えば、（任意の種の）ノッチ遺伝子またはその特異的ＲＮＡの一部 分、もしくはその断片（例えば接着性ドメイン）の量が分かっていて、精製し標 識することが可能ならば、作成されたＤＮＡ断片は標識されたプローブへの核酸 ハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる（Benton，W ．およびDavis，R.，1977，Science 196，180；Grunstein，M．およびHogness， D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．72．3961参照）。プローブに対し実質的 相同性を有するそれらのＤＮＡ断片はハイブリダイゼーションを行なう。また、 制限酵素切断、および断片サイズと公知の制限酵素地図（もし入手可能であれば ）にしたがって予想される断片サイズとの比較、によっても適切な断片を同定す ることができる。遺伝子の特性に基づいて、さらに選択を実施することが可能で ある。または、遺伝子の存在を、発現された産物の物理的、化学的または免疫学 的特性に基づくアッセイによって検出することもできる。例えば、ノッチについ て知られているのと同様の、または同一の電気泳動移動、等電点電気泳動挙動、 タンパク質分解消化地図、in vitro凝集活性［「接着性」］または抗原特性を有 するタンパク質を産生する適切なｍＲＮＡをハイブリッド選択（hybrid-select ）するｃＤＮＡクローンまたはＤＮＡクローンを選択することができる。ノッチ に対する抗体が入手可能ならば、ノッチタンパク質は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イ ムノソルベントアッセイ）タイプの手順によって、標識抗体の推定上のノッチ合 成クローンとの結合により同定することができる。 ノッチ遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ 選択とそれに続くin vitro翻訳によっても同定することができる。この手順にお いては、断片はハイブリダイゼーションによって相補的ｍＲＮＡを単離するのに 使われる。このようなＤＮＡ断片は、別の種（例えば、ショウジョウバエ）の入 手可能な、精製ノッチＤＮＡを表すものであってよい。単離されたｍＲＮＡの単 離された産物のin vitro翻訳産物の免疫沈殿分析または機能アッセイ（例えば、 in vitroにおける凝集能力；後述の実施例を参照）は、ｍＲＮＡを同定し、した がって所望の配列を含有する相補的ＤＮＡ断片を同定する。さらに、特異的ｍＲ ＮＡは、細胞から単離したポリソームをノッチまたはデルタタンパク質に特異的 に向けられている固定化抗体に吸着することにより、選択することができる。放 射性標識ノッチｃＤＮＡは、（吸着されたポリソームから）選択したｍＲＮＡを 鋳型として用いて合成することができる。次に、放射性標識ｍＲＮＡまたはｃＤ ＮＡを、他のゲノムＤＮＡ断片からノッチＤＮＡ断片を同定するためのプローブ として使用できる。 ノッチゲノムＤＮＡを単離することに代わる方法は、以下のものを含むがそれ らだけに限定されない。すなわち、公知の配列から遺伝子配列それ自体を化学的 に合成する、またはノッチ遺伝子をコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作成 する。例えば、ノッチ遺伝子のｃＤＮＡクローン化のためのＲＮＡは、ノッチを 発現する細胞から単離することができる。他の方法も可能であり、それらは本発 明の範囲内にある。 次に、同定され、単離された遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入する ことができる。当技術分野で公知の、多数のベク ター−宿主系が使用できる。可能性のあるベクターはプラスミドまたは修飾され たウイルスを含むがこれらだけに限定されない。しかし、ベクター系は使用され る宿主細胞と適合するものでなければならない。このようなベクターには、ラム ダ誘導体などのバクテリオファージ、あるいはＰＢＲ３２２またはｐＵＣプラス ミド誘導体などのプラスミドが含まれるが、これらだけに限定されない。クロー ニングベクターへの挿入は、例えばＤＮＡ断片を相補的接着末端を有するクロー ニングベクターに連結することにより達成することができる。しかし、ＤＮＡを 断片にするのに使用される相補的制限部位がクローニングベクターにない場合は 、ＤＮＡ分子の末端を酵素により修飾することができる。または、ヌクレオチド 配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより、任意の所望部位を作成す ることができる：これらの連結されるリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識 配列をコードする特異的な、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むこと ができる。別の方法では、開裂されたベクターおよびノッチまたはデルタ遺伝子 を、ホモポリマーによるテーリング（tailing）によって修飾することができる 。遺伝子配列のコピーが多数生じるように、組換え分子を形質転換、トランスフ ェクション、感染、電気穿孔法、などにより宿主細胞に導入することができる。 別の方法では、所望の遺伝子を適切なクローニングベクターに「ショット・ガ ン」法により挿入した後に、同定し単離することができる。例えば、サイズ分別 による所望遺伝子の富化を、クローニングベクターへの挿入の前に実施できる。 特定の態様において、単離されたノッチ遺伝子、ｃＤＮＡ、ま たは合成されたＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転 換は、遺伝子の多数コピーの産生を可能とする。したがって、形質転換細胞を培 養し、そこから組換えＤＮＡ分子を単離し、そして必要であれば単離された組換 えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、その遺伝子を大量に得る ことができる。 本発明によって提供されるノッチ配列は、天然のノッチタンパク質に見出ださ れるものと実質的に同一なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および 機能的に等しいアミノ酸を持つコードされたアミノ酸配列を含む。これらの配列 すべては、後述の第５．６節にノッチ誘導体として記載されている。 デルタ、セレート、またはその接着性部分、あるいは他の興味のあるトポリズ ミック（toporythmic）遺伝子をコードする核酸を得るために、上に記述した方 法と同様の方法が用い得る。特定の態様において、デルタ核酸は図１（配列番号 １）に示される配列の少なくとも一部分を有する。別の特定の態様では、セレー ト核酸は図５（配列番号３）に示される配列の少なくとも一部分を有する。トポ リズミックタンパク質をコードする核酸配列は、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ またはイヌ、ならびに霊長目の動物から、ならびに公知のトポリズミック遺伝子 ［以下の遺伝子（公表された配列を持つ、括弧内に示すもの）を含むがそれらだ けに限定されない：デルタ（Vassinら、1987、EMBO J．6，3431-3440；Kopczyns kiら、1988，Genes Dev．2，1723-1735；本明細書の図１（配列番号１および配 列番号２）に見出だされるKopczynskiらの配列への訂正に注意されたい）およびセレート （Flemingら，1990， Genes & Dev．4，2188-2201）］の相同体を同定することができる他の任意の種 から、単離することができる。そのような配列は、上に述べた機能的に等しい分 子をもたらす置換、付加、または除去によって変更することができる。 5.8. タンパク質治療剤の組換え産生 本発明のタンパク質治療剤をコードする核酸は、適切な発現ベクター、すなわ ち挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要なエレメント を含有するベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは 、天然のトポリズミック遺伝子および／またはそのフランキング領域によっても 供給され得る。タンパク質をコードする配列を発現するため、種々の宿主−ベク ター系が使用できる。これらには以下のものが含まれるが、それだけに限定され ない。すなわち、ウイルス［例えば、ワクシニアウイルス（vaccinia virus）、 アデノウイルス（adenovirus）、等］に感染させた哺乳動物細胞系、ウイルス［ 例えば、バクロウイルス（baculovirus）］に感染させた昆虫細胞系、酵母ベク ターを含有する酵母、等の微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ）プラス ミドＤＮＡ、あるいはコスミドＤＮＡによって形質転換されたバクテリアである 。 ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が様々である。使用する 宿主−ベクター系によって、多数ある適切な転写および翻訳エレメントのうち任 意の１つを使用できる。特定の態様において、ノッチ遺伝子の接着性部分、例え ばＥＧＦ様リピート（ＥＬＲ）１１および１２が発現される。他の特定の態様に おいて、ヒトノッチ遺伝子、またはヒトノッチの機能的に活性な部 分をコードする配列が発現される。 ＤＮＡ断片をベクターに挿入するために上に記述した方法の任意のものを、適 切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質をコードする配列からなるキメラ 遺伝子を含有する発現ベクターの構築に使用できる。これらの方法は、in vitro 組換えＤＮＡおよび合成技法およびin vivo組換え体（遺伝子組換え）を含むこ とができる。ノッチタンパク質またはペプチド断片をコードする核酸配列の発現 は、そのノッチタンパク質またはペプチドが組換えＤＮＡ分子によって形質転換 された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって制御され得る。例え ば、ノッチタンパク質の発現を、当分野の技術で公知の、任意のプロモーター／ エンハンサーエレメントによって制御することができる。トポリズミック遺伝子 発現を制御するのに使用できるプロモーターは、以下のものを含むがそれらだけ に限定されない。すなわち、ＳＶ４０初期プロモーター領域（BernoistおよびCh ambon,1981,Nature 290,304-310）；ラウス肉種ウイルス（Rous sarcoma virus ）の３′末端ＬＴＲ（long terminal repeat）に含有されるプロモーター（Yama motoら、1980,Cell 22,787-797）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wa gnerら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．78,1441-1445）；メタロチオネイン 遺伝子の制御配列（Brinsterら、1982,Nature,296,39-42）；β−ラクタマーゼ プロモーター等の原核細胞発現ベクター（Villa-Kamaroffら、1978，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A．75、3727-3731）またはｔａｃプロモーター（DeBoerら、1983, Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．80、21-25）；Scientific American,1980,242,74-9 4記載の「組換えバクテリア由来の 有用タンパク質」をも参照のこと；ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含 む植物発現ベクター（Herrera-Estrellaら、Nature 303,209-213）、またはカリ フラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Gardnerら、1981,Nucl .Acids Res.9,2781）、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラー ゼ（Herrera-Estrellaら、1984、Nature 310、115-120）；酵母または他の菌類由 来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコ ール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（フォスフォグリセロールキナーゼ）プ ロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し トランスジェニック動物に使用されてきた、下記の動物転写制御領域：膵臓腺房 細胞において活性のエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら、1984,Cell 38,63 9-646;Ornitz ら,1986,Cold Spring Harbor Symp．Quant.Biol.50,399-409;MacD onald,1987,Hepatology 7,425-515）；膵臓ベータ細胞において活性のインスリ ン遺伝子制御領域（Hanahan,1985,Nature 315,115-122）、リンパ球において活 性なイムノグロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、1984,Cell 38,647-658;A damesら、1985,Nature 318,533-538;Alexanderら、1987,Mol.Cell.Biol．7,1436 -1444）、精巣、胸部、リンパ球および肥満細胞（mast cell）において活性なマ ウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Lederら、1986,Cell 45,485-495）、肝臓にお いて活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、1987,Genesand Devel.1,268 -276）、肝臓において活性なα−フェトプロテイン（fetoprotein）遺伝子制御 領域（Krumlaufら、1985,Mol.Cell.Biol．5,1639-1648;Hammerら、1987,Science 235,53-58）；肝臓に おいて活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、1987,Genes a nd Devel.1,161-171）；骨髄様細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域 （Magramら、1985,Nature 315,338-340;Kolliasら、1986,Cell 46,89-94;脳の希 突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead ら、1987,Cell 48,703-712）；骨格筋において活性なミオシンＬ鎖−２遺伝子制 御領域（Sani,1985,Nature 314,283-286）、および視床下部において活性なゴナ ドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら、1986,Science 234,1372-137 8）である。 ノッチ遺伝子挿入配列を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチに よって同定することができる。すなわち、（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、 （ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および（ｃ）挿入された配列 の発現、である。第１のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入された外来 遺伝子の存在を、挿入されたトポリズミック遺伝子と相同的な配列を含むプロー ブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより、検出することができる。第２の アプローチにおいては、外来遺伝子のベクターへの挿入によって生じた、ある「 マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形 質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体の形成、等）の存在または不在 に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば 、ノッチ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、ノッチ挿入 配列を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定され得る。 第３のアプローチにおいては、組換え発現ベクターは、組換え体によっ て発現された外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定され得る。このよ うなアッセイは、例えばin vitroアッセイ系におけるノッチ遺伝子産物の物理的 または機能的特性、例えば凝集（接着）能力、に基づいて行ない得る（後述の第 ６〜７節参照）。 ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されたならば、それを増殖 させるため、当分野の技術で公知のいくつかの方法を用いることができる。適切 な宿主系および増殖条件が確立されたならば、組換え発現ベクターを増殖させ、 大量に調製することが可能である。前に説明したように、発現ベクターは下記の ベクターおよびその誘導体を含むが、それらだけに限定されない。すなわち、例 を少し挙げれば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス等のヒトまたは動物 ウイルス；バキュロウイルス等の昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファ ージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドならびにコスミドＤＮＡベ クターである。 さらに、宿主細胞株は、所望の特定の方法で挿入された配列の発現を調節し、 または遺伝子産物を修飾し処理するものを選択することができる。あるプロモー ターからの発現は、特定のインデューサー（inducer）の存在下で高めることが できる。したがって、遺伝子操作されたノッチタンパク質の発現は制御可能であ る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳後のタンパク質のプロセシング および修飾（例えば、グリコシル化、開裂、等）についてそれぞれ特徴的で特異 的なメカニスムを有する。発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセ シングを確実にする、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。例え ば、グリ コシル化されていない、コアタンパク質産物を産生するためには、バクテリア系 による発現が使用できる。酵母における発現は、グリコシル化された産物を産生 する。哺乳動物細胞における発現は、異種哺乳動物トポリズミックタンパク質の 「天然の」グリコシル化を確実にするために使用できる。さらに、異なるベクタ ー／宿主発現系はタンパク質分解開裂などのプロセシング反応をそれぞれ異なる 度合で行なうことができる。 他の特定の態様において、ノッチタンパク質、断片、類似体、または誘導体は 、［ペプチド結合によって異種タンパク質配列（または異なる蛋白質）に結合し た上記のタンパク質、断片、類似体、または誘導体を含む］融合またはキメラタ ンパク質産物として発現することができる。このようなキメラ産物は、所望のア ミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を当技術分野の公知の方法によって適切 なコーディングフレーム（coding frame）の中で相互に連結し、そして当分野の 技術で周知の方法によりキメラ産物を発現することにより、作成できる。または 、このようなキメラ産物は、例えばペプチドシンセザイザーを用いるタンパク質 合成技法によって作製することも可能である。 ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方ともクローン化し、発現することができる。 他の態様においては、ノッチｃＤＮＡ配列を染色体上で統合し、発現すること が可能である。当分野の技術で公知の相同組換え手順が使用できる。 5.8.1. 発現された遺伝子産物の同定および精製 ノッチ遺伝子配列を発現する組換え体が同定されたならば、遺 伝子産物を分析することができる。これは、産物の物理的または機能的特性に基 づくアッセイによって達成することができる。ここには、産物の放射性標識とそ れに続くゲル電気泳動による分析が含まれる。 ひとたびノッチタンパク質が同定されたならば、クロマトグラフィー［例、イ オン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー］、遠 心、示差溶解性を含む標準的な方法、またはタンパク質精製のための他の任意の 標準的技法により、このタンパク質を単離し、精製することができる。その機能 的特性は、凝集アッセイを含むがこれだけに限定されない、任意の適切なアッセ イを用いて評価することができる（第６〜７節参照）。 5.9. ノッチおよび他のトポリズミックタンパク質の誘導体および類似体 本発明はさらに治療剤としてノッチタンパク質の誘導体（断片を含むがそれだ けに限定されない）および類似体を提供する。また、治療剤として、他のトポリ ズミックタンパク質ならびにその誘導体および類似体、または、特にこのような 他のトポリズミックタンパク質とノッチとの相互作用を促進、または阻害するノ ッチリガンドをも提供する。 ノッチに関連する誘導体および類似体の作成および使用は、本発明の範囲内に ある。ある特定の態様において、その誘導体または類似体は機能的に活性である 。つまり、全長、天然型のノッチタンパク質に伴なう１つ以上の機能的活性を示 すことができる。１例として、所望の抗原性を有するこのような誘導体または類 似体は、例えば第５．３節に記述されたように診断的イムノアッセ イに使用できる。所望のノッチ特性（例えば、デルタまたは他のトポリズミック タンパク質に結合する、細胞内リガンドに結合する、等）を保有する、またはこ れを阻害する分子は、このような特性のそれぞれインデューサーまたはインヒビ ターとして、およびその生理学的相関物として治療に使用できる。ノッチの誘導 体または類似体は、後述するアッセイを含むがそれらだけに限定されない当分野 の技術で公知の手順により、所望の活性について、試験することができる。ある 特定の態様においては、ペプチドライブラリーをスクリーニングして、所望の活 性を有するペプチドを選択することができる：このようなスクリーニングは、例 えばノッチ、またはデルタなどのノッチ結合パートナーとの結合についてアッセ イすることにより実施できる。 特に、ノッチ誘導体は、機能的に等しい分子をもたらす置換、付加または除去 によってノッチ配列を変更することにより作成できる。ヌクレオチドをコードす る配列の縮重により、ノッチ遺伝子と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする 他のＤＮＡ配列が、本発明の実施において使用し得る。これらの配列は、次のも のを含むがそれだけに限定されない。すなわち、ノッチ遺伝子の全部または一部 を含む、機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの配列内での置 換によって変更されており、したがってサイレント変化（silent change）を生 じているヌクレオチド配列である。同様に、本発明のノッチ誘導体は、一次アミ ノ酸配列として、配列内で機能的に等しいアミノ酸残基が置換され、その結果サ イレント変化を生じている変更された配列を含めて、ノッチタンパク質のアミノ 酸配列の全部または一部を含有する誘導体 を包含するが、それだけに限定されない。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸 残基を、機能的等価物として働く、同様の極性をもつ別のアミノ酸によって置換 することが可能であり、その結果サイレント変化が生じる。配列内のあるアミノ 酸の置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することが できる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイ シン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン が含まれる。極性中性のアミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システ イン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性に帯電した（ 塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。陰性 に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパルギン酸およびグルタミン酸が含まれ る。 ノッチの誘導体または類似体は、ノッチまたはその断片に実質的に相同的なペ プチド、またはそれをコードする核酸がノッチ核酸配列とハイブリダイゼーショ ンを行なうことができるペプチドを含むが、それらだけに限定されない。 本発明のノッチ誘導体および類似体は、当分野の技術で公知の種々の方法によ って作成することができる。それらの作成をもたらす操作は、遺伝子またはタン パク質のレベルで起こり得る。例えば、クローン化されたノッチ遺伝子配列は、 当分野の技術で公知の多くの方策のうち任意のものによって修飾することができ る（Maniatis，T.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor、New York）。上記の配列 は、制限エンドヌクレアーゼを用い て適切な部位で開裂し、続いて所望であればさらに酵素的修飾を行ない、単離し 、そしてin vitroで連結することができる。ノッチの誘導体または類似体をコー ドする遺伝子を作成する際は、修飾された遺伝子が、所望のノッチ活性がコード されている遺伝子領域で、翻訳停止シグナルに中断されずに、ノッチと同一の翻 訳リーディングフレーム内に確実にとどまるように注意しなければならない。 さらに、ノッチをコードする核酸配列をin vitroまたはin vivoで突然変異さ せて、翻訳、開始、および／または終始配列を創製および／または破壊し、また はコード領域内で変化を創製し、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ 部位を形成し、または既存の制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊し、それによっ てさらなるin vitro修飾を容易にすることが可能である。in vitro部位特異的突 然変異誘発法（Hutchinson，C.，ら、1978,J.Biol.Chem．253:6551）、ＴＡＢ（ 登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用、等を含むがこれらだけに限定されな い、当分野の技術で公知の任意の突然変異誘発技法が使用できる。 ノッチ配列の操作は、タンパク質レベルでも行ない得る。翻訳中または翻訳後 に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロ ッキング基による誘導体化、タンパク質分解開裂、抗体分子またはの他の細胞リ ガンドとの結合、等により示差的に修飾されたノッチタンパク質の断片または他 の誘導体もしくは類似体は、本発明の範囲に含まれる。多数の化学修飾の任意の ものが、公知の技法により実施できる。これらの技法は以下のものを含むが、そ れだけに限定されない。すなわち、臭 素化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｎａ ＢＨ4による特異的化学開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマ イシンの存在下での代謝合成；等である。 さらに、ノッチの誘導体および類似体は、化学的に合成することができる。例 えば、所望のドメインを含む、または所望のin vitroでの凝集活性または受容体 との結合を仲介する、ノッチタンパク質の一部に対応するペプチドは、ペプチド シンセサイザーの使用によって合成することができる。さらに、所望であれば、 ノッチ配列に、置換物または付加物として、ノンクラシカル（nonclassical）ア ミノ酸または化学的アミノ酸類似体を導入することもできる。ノンクラシカルア ミノ酸には、以下のものが含まれるがそれらだけに限定されない。すなわち、普 通のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシ プロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ− ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、 たとえばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ 酸、等のデザイナー（designer）アミノ酸である。 ある特定の態様において、ノッチ誘導体は、ペプチド結合によってアミノ−お よび／またはカルボキシ−末端で非ノッチアミノ酸配列と融合したノッチタンパ ク質またはその断片を含むキメラまたは融合タンパク質である。ある態様では、 このようなキメラ蛋白質は、そのタンパク質をコードする核酸（フレーム内で非 ノッチコード配列に結合している、ノッチをコードする配列を含 む）の組換え発現によって産生される。このようなキメラ産物は、所望のアミノ 酸配列をコードする適切な核酸配列を公知の方法により適切なコーディング・フ レーム（coding frame）内で相互に連結し、そして当分野の技術で周知の方法に よりキメラ産物を発現させることにより作成される。または、このようなキメラ 産物は、例えばペプチドシンセサイザーの使用によるタンパク質合成技法によっ て作成することができる。ある特定の態様において、異種シグナル配列をもつ成 熟ノッチタンパク質をコードするキメラ核酸は、キメラタンパク質が細胞によっ て発現されて、成熟ノッチタンパク質へと処理されるように、発現される。本発 明を制限するものではない別の例として、ノッチおよび他のトポリズミック遺伝 子（例えばデルタ）の両方のコード部分を含む組換え分子を、本発明にしたがっ て構築することができる。このような組換え分子のコードされたタンパク質は、 ノッチおよびデルタの両方に伴なう特性を示すことができるだろう。そして、ア ゴニストおよびアンタゴニストを含む生物学的活性の新しい特徴を表すことがで きるであろう。ノッチおよびデルタの第１次配列は、コンピュータ・シミュレー ションを用いて分子の３次構造を予測するのにも使用できる（HoppおよびWoods, 1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．78:3824-3828）；ノッチ／デルタキメラ組換 え遺伝子は、３次構造と生物学的機能の相関性を考慮して設計することができる だろう。同様に、異種（非ノッチ）タンパク質をコードする任意の配列と融合し たノッチ部分を含むキメラ遺伝子を構築することができる。ある特定の態様は、 少なくとも６個のアミノ酸からなるノッチの断片を含むキメラタンパク質に関す る。 別の特定の態様では、ノッチ誘導体は別のトポリズミックタンパク質との相同 領域を含むノッチの断片である。本明細書中では、第１のタンパク質のある領域 のアミノ酸配列を、その領域に含まれるアミノ酸の数と同数のアミノ酸からなる 第２のタンパク質の任意の配列と比較した時、少なくとも３０％同じ場合、また は少なくとも７５％同じかコンサーバティブ（conservative）な変化を含む場合 、第１のタンパク質のその領域は第２のタンパク質と「相同的である」と考慮さ れるものとする。 セレート、デルタ、および他のトポリズミックタンパク質の誘導体、ならびに それらの接着性部分は、上に記述した方法と同様の方法で作成することができる 。 5.9.1. ノッチタンパク質の１つ以上のドメインを含有するノッチの誘導体 特定の態様において、本発明はノッチタンパク質の１つ以上のドメインを含む ノッチ誘導体および類似体、特にノッチ断片およびその断片の誘導体である治療 剤を提供する。これらのドメインは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内 ドメイン、ノッチタンパク質の膜結合領域、１つ以上のＥＧＦ様リピート（ＥＬ Ｒ）、ｃｄｃ１０リピート、およびノッチ／ｌｉｎ−１２リピートを含むが、こ れらだけに限定されない。特定の態様において、ノッチ誘導体はＥＬＲの全部ま たは一部、あるいはノッチタンパク質の他の領域の１つ以上を欠くことがある。 キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）以外の種、好ましくはヒトのノッ チタンパク質に関連したある特定の態様において、ノッチの特定部分を含む断片 は、各ノッチタンパク質におけるシ ョウジョウバエノッチタンパク質の特定断片（例えば、ＥＬＲ１１およびＥＬＲ １２）と最も相同的な部分を含む断片である。 5.9.2. トポリズミックタンパク質ドメインへの結合を仲介するノッチまたは他 のトポリズミックタンパク質の誘導体、ならびにそのインヒビター 本発明はまた、トポリズミックタンパク質ドメインへの結合を仲介する、（し たがって本明細書では「接着性」と表現される）ノッチ断片およびその断片の類 似体または誘導体、ならびにそれらをコードする核酸配列を提供する。 本発明の治療剤として包含されるものには、また、トポリズミック（例えば、 デルタ、セレート）タンパク質断片およびその類似体又は誘導体があり、それら はノッチへのヘテロタイプの結合（したがって本明細書では「接着性」と表現さ れる）及び上記のものに関連する核酸配列を仲介する。 本発明の治療剤として包含されるものには、また、上記のトポリズミックタン パク質とノッチとの相互作用のインヒビター（例えば、ペプチドインヒビター） がある。 トポリズミックタンパク質に結合する能力は、そのようなトポリズミックタン パク質を発現する細胞と、ノッチまたはノッチ誘導体を発現する細胞を用いたin vitro凝集アッセイによって実証することができる（第６節参照）。すなわち、 あるタンパク質断片のノッチタンパク質に結合する能力は、第１の細胞の表面で 発現された時に、第２の細胞の表面で発現されたノッチタンパク質に結合するそ の断片の能力を検出することにより実証できる。上記の相互作用のインヒビター は、このようなin vitroでの凝集を 阻止する能力によって検出が可能である。 このようなアッセイに使用される、トポリズミックタンパク質またはその接着 性ドメインをコードする核酸配列は、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イ ヌ、または昆虫、および霊長目の動物から、ならびに公知のトポリズミック遺伝 子の相同体を同定することができるその他の任意の種から、単離することができ る。 ある特定の態様では、ノッチの接着性断片は、ＥＬＲ１１および１２、すなわ ちショウジョウバエノッチ配列のアミノ酸番号４４７から５２７（配列番号１４ ）と最も相同的なノッチの部分を含む断片である（図４参照）。また別の特定の 態様においては、ノッチへの結合を仲介するデルタの接着性断片は、ショウジョ ウバエデルタ配列（配列番号２）のアミノ酸番号１〜２３０あたりと最も相同的 なデルタの部分を含む断片である。セレートの接着性断片に関連する特定の態様 においては、そのような断片は、ショウジョウバエセレート配列［図５（配列番 号４）参照］のアミノ酸番号８５〜２８３または７９〜２８２あたりと最も相同 的なセレートの部分を含む断片である。 ヌクレオチドコード配列の縮重により、接着性配列と実質的に同一のアミノ酸 配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施に使用することができる。こ れらのＤＮＡ配列には以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。す なわち、ノッチ、デルタまたはセレート遺伝子の全部または一部を含む、機能的 に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの配列内での置換によって変更 され、したがってサイレント変化を生じているヌクレオチド配列である。同様に 、本発明の接着性タンパク質断片ま たはその誘導体は、一次アミノ酸配列として、配列内で機能的に等しいアミノ酸 残基が置換され、その結果サイレント変化を生じている変更された配列を含めて 、接着性ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含有する誘導体を包含する が、それらだけに限定されない。 トポリズミックタンパク質の接着性断片、および接着性トポリズミックタンパ ク質配列に関連した考えうる誘導体、類似体、またはペプチドは、所望の結合活 性について、例えば本明細書の実施例に記述されているin vitro凝集アッセイに よって試験することができる。トポリズミックタンパク質の接着性断片の接着性 誘導体または接着性類似体は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。 すなわち、上記の接着性断片と実質的に相同なペプチド、またはそのコードする 核酸が上記の接着断片をコードする核酸配列とハイブリダイゼーションを行うこ とができるペプチドで、これらのペプチドおよびペプチド類似体は、実施例の節 に記述されているような凝集アッセイによりin vitroで試験すると、積極的な結 合活性を有する。このような誘導体および類似体は、治療剤として考えられてお り、本発明の範囲内にある。 本発明の接着性タンパク質に関連した誘導体、類似体およびペプチドは、当分 野の技術で公知の種々の方法により作成できる。それらの作成をもたらす操作は 、遺伝子またはタンパク質レベルで起こりうる（第５．６節参照）。 さらに、上記の接着性のものをコードする核酸配列は、in vitroまたはin vit roで突然変異させることができる；そして、接着性配列の操作もまた、タンパク 質レベルで行ないうる（第５．６ 節参照）。 さらに、接着性断片に関連する類似体およびペプチドは化学的に合成すること ができる。 5.10. ノッチタンパク質、誘導体および類似体のアッセイ ノッチタンパク質、誘導体および類似体、ならびにノッチに結合する他のトポ リズミックタンパク質のin vitro活性を、様々な方法でアッセイすることができ る。 例えば、抗ノッチ抗体への結合能力、または抗ノッチ抗体への結合について天 然型ノッチと競合する能力をアッセイする１つの態様においては、当分野の技術 で公知の種々のイムノアッセイを使用することができる。そこには、ラジオイム ノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッ チ」イムノアッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッ セイ、in situイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体 標識を使用）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝 集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロ テインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等の技法を用いる競合的および 非競合的アッセイ系が含まれるが、これらだけに限定されない。１つの態様にお いては、第１の抗体上の標識を検出することによって、抗体結合が検出される。 別の態様においては、第２の抗体または試薬の、第１の抗体への結合を検出する ことによって第１の抗体が検出される。さらに別の態様においては、第２の抗体 が標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が公知 であり、これらは本発明の範囲内にある。 ノッチへの結合を仲介する能力をアッセイするもう１つの態様においては、第 ６節または７節に記述されているような、in vitro凝集アッセイを実施すること ができる（Fehonら、1990,Cell61:523-534;Rebayら、1991，Cell 67:687-699も 参照されたい）。 ノッチに対する別のリガンドが同定されるもう１つの態様においては、リガン ド結合を、例えば当分野の技術で周知の結合アッセイによってアッセイすること ができる。別の態様においては、ノッチ受容体（シグナル変換）を発現する細胞 へのリガンド結合の生理学的相関物をアッセイすることができる。 別の態様においては、昆虫または他のモデル系で、天然型ノッチの誘導体また は類似体であるノッチ変異体の表現型効果を研究する遺伝子研究を実施すること ができる。 当業者には他の方法が分かるであろう。そして、それらは本発明の範囲内にあ る。 5.11. ノッチタンパク質、誘導体および類似体に対する抗体 本発明の１つの態様によれば、ノッチに対して向けられた抗体およびその結合 ドメインを含有する断片は、治療剤である。したがって、ノッチタンパク質、そ の断片、類似体または誘導体、特にヒトノッチタンパク質またはその断片は、抗 ノッチタンパク質抗体を産生するための免疫原として使用できる。このような抗 体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆａｂ断片、または Ｆａｂ発現ライブラリー由来でありうる。特定の態様においては、ノッチのＥＧ Ｆ様リピート１１および１２に対して特異的な抗体を調製することができる。他 の態様においては、ノッチの細胞外ドメインと反応する抗体を産生することがで きる。 このような抗体の１例は、in vitroアッセイにおける凝集を妨げることができる 。別の態様においては、ヒトノッチに特異的な抗体が産生される。 ノッチタンパク質またはペプチドに対するポリクローナル抗体の産生のために 、当分野の技術で公知の種々の手順が使用できる。特定の態様においては、図１ ０または１１に示される配列またはそのサブ配列によってコードされるヒトノッ チタンパク質のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体を得ることができ る。抗体産生のために、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらだけに限定さ れない種々の宿主動物を、天然のノッチタンパク質、または合成したノッチタン パク質、またはそれらの断片の注射により免疫感作することができる。宿主の種 により、免疫応答を増大させるため様々なアジュバントを使用することができる 。これらのアジュバントには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されな い。すなわち、（完全および不完全）フロイントアジュバント、水酸化アルミニ ウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニック（pluronic ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールド（ keyhold）リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カル メットーゲラン杆菌）、コリネバクテリウム・パルバム（corynebacterium parv um）等の可能性として有用なヒトのアジュバントである。 ノッチタンパク質配列に向られたモノクローナル抗体の調製のためには、培養 の連続細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技法が使用できる。例とし ては、KohlerおよびMilstein（19 75,Nature 256,495-497）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、なら びにトリオーマ（trioma）技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozborら、19 83,Immunology Today 4,72）、ヒトモノクローナル抗体産生のためのＥＢＶ−ハ イブリドーマ技法（Coleら、1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ，Alan R．Liss,Inc.,pp.77-96）が挙げられる。 抗体分子のイディオタイプ（結合ドメイン）を含有する抗体断片は、公知の技 法により作成することができる。例えば、そのような断片は以下のものを含むが 、それらだけに限定されない。すなわち、抗体分子のペプシン消化により産生す ることができるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することに より産生することができるFab'断片、および抗体分子をパパインならびに還元剤 で処理することによって産生できるＦａｂ断片である。 抗体の産生にあたっては、所望の抗体を得るためのスクリーニングを、当分野 の技術で公知の技法、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ） によって達成することができる。例えば、ノッチタンパク質の接着性ドメインを 認識する抗体を選択するため、そのようなドメインを含有するタンパク質断片に 結合する産物について、産生されたハイブリドーマをアッセイすることができる 。ヒトノッチに特異的な抗体を選択するためには、ヒトノッチへの陽性結合およ びショウジョウバエノッチへの結合の欠如に基づいて、選択することができる。 治療上の有用性に加えて、上記の抗体は第５．６節に記述した診断的イムノア ッセイにおいても有用である。 先に記述した手順と同様の手順が、ノッチと結合もしくは別な相互作用をする 、他のタンパク質（特にトポリズミックタンパク質）のドメイン（例：デルタま たはセレートの接着性断片）に対する抗体である治療剤を作成するのに使用でき る。 6. ノッチのドメインはデルタとの結合を仲介する ノッチおよびデルタ遺伝子の産物間の分子間会合を、Drosophila Schneider's （S2）細胞（Fehonら，1990，Cell 61,523-534）における凝集に対するそれらの 発現の効果を検討することにより、検出した。この相互作用の成分を分析する際 に使用することができるアッセイ系のみならず、ノッチおよびデルタ間の分子間 相互作用の直接的な証拠もここに記載する。ノッチを発現する通常非接着性のDr osophila S2培養細胞は、カルシウムに依存する様式で、デルタを発現する細胞 に特異的に結合する。さらに、ノッチを発現する細胞は互いに結合しないが、デ ルタを発現する細胞は互いに結合し、このことから、ノッチとデルタは細胞表面 でデルタへの結合に関して競合しうることが示唆される。ノッチとデルタは、培 養細胞および胚細胞の両方において、界面活性剤可溶性の複合体を形成し、この ことからノッチとデルタは分子レベルでin vitroおよびin vivoで直接相互作用 することが示唆される。上記の分析は、ノッチおよびデルタタンパク質が細胞表 面でそれらの細胞外ドメインを介して相互作用することを示唆している。 6.1. 実験方法 6.1.1. 発現構築物 発現構築物はFehonら，1990，Cell 61：523-534に記載されている。簡単に説 明すると、pRmHa-3（Bunchら， 1988，Nucl．Acid Res．16，1043-1061）への挿 入に続いて、MgIIaミニ遺伝子cDNA/ゲノムキメラ構築物（Ramosら，1989，Genet ics 123， 337-348）によりコードされたノッチを発現させた。pMtNMgと命名された得られ た構築物において、pRmHa-3のメタロチオネインプロモーターは、翻訳開始部位 の20ヌクレオチド上流で始まるノッチに融合している。 細胞外ノッチ構築物（ECN1）はノッチコスミド（Ramosら，1989，Genetics 12 3，337-348）から誘導され、アミノ酸1790から2625までのノッチコード配列の内 部欠失（Whartonら，1985，Cell 43，567-581）、および新規な59アミノ酸カル ボキシル末端を産生する予測されたフレームシフトを有する。 このデルタ発現構築物について、D11 cDNA（Kopczynskiら，1988，Genes Dev ．2，1723-1735;図１；SEQ ID NO:1）（これはデルタに対して完全なコード能力 を含む）をpRmHa-3のEcoRI部位へ挿入した。この構築物をpMTD11と称した。 6.1.2. 抗体の作製 ノッチの分子内ドメイン（アミノ酸1791-2504；Whartonら，1985，Cell 43，5 67-581）の大半をコードする配列を含む2.1kbのSaII-HindIII断片をベースとす る融合タンパク質で免疫感作したマウスから、ハイブリドーマ細胞系C17.9C6を 得た。上記の断片をpUR289（RutherおよびMuller-HiII，1983，EMBO J．2，1791 -1794）にサブクローニングした後、pATH1発現ベクター（DieckmannおよびTzago loff，1985，J．Biol．Chem．260，1513-1520）へBgIII-HindIII断片として移入 した。可溶性融合タンパク質が発現され、6M尿素中に再懸濁させた25%（NH4）2S O4で沈殿させ、Rotofor（Bio-Rad）を用いる分取等電点電気泳動 により精製した（詳細については、Fehonら，1989，RotoforReview No．7，Bull etin 1518，Richmond，California：Bio-RadLaboratoriesを参照のこと）。 個々にin-frameで適当なpGEX発現ベクター（SmithおよびJohnson，1988，Gene 67,31-40）に挿入された、0.8kb（アミノ酸237-501：Whartonら，1985，Cell 4 3，567-581）、1.1kb（アミノ酸501-868）、0.99kb（アミノ酸868-1200）および 1.4kb（アミノ酸1465-1935）の長さの４つのBstY1断片を用いて、ノッチの細胞 外ドメインに対して、マウスポリクローナル抗血清を生産させた。上記の断片は 、膜貫通ドメインを横切って第５のEGF様リピートから伸びていた。融合タンパ ク質をグルタチオン−アガロースビーズ（SIGMA）上で精製した。マウスおよび ラットの抗血清を50%（NH4）2SO4で沈殿させ、0.02% NaN3とともにPBS（150 mM NaCl，14 mM Na2HPO4，6 mM NaH2PO4）に再懸濁させた。 デルタの４番目から９番目のEGF様リピートまで伸びている配列（アミノ酸350 -529）を含む、デルタの細胞外ドメイン（Kopczynskiら，1988，Genes Dev．2， 1723-1735）由来のコード配列を含む融合タンパク質で免疫感作したマウスから 、ハイブリドーマ細胞系201を得た。 同じ融合タンパク質構築物から誘導された抗原での免疫感作に続いて、ラット ポリクローナル抗血清を得た。この場合、IPTG誘導細胞をSDS-Laemmli緩衝液（C arrollおよびLaughon，1987，in DNA Cloning，III巻，D.M．Glover編（Oxford ：IRL Press），pp．89-111）に溶解し、SDS-PAGEでタンパク質を分離し、その ゲ ルから適当なバンドを切り出し、そして、そのゲル切片から免疫感作に使用する ための抗原を電気溶出する（HarlowおよびLane，1988，Antibodies：A Laborato ry Manual(Cold Spring Harb，New York：Cold Spring Harbor Laboratory)）こ とにより、融合タンパク質を調製した。 6.1.3. 細胞培養およびトランスフェクション S2細胞系（Schneider，1972，J．Embryol．Exp．Morph．27，353-365）を、2. 5mg/mlバクトペプトン（Difco）、1mg/ml TCYeastolate（Difco）、11%熱不活性 化ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone）および100U/mlペニシリン−100μg/mlストレ プトマイシン−0.25μg/ml fungizone（Hazleton）を補充したM3培地（Hazleton 社により調製）中で増殖させた。HEPES緩衝液（ChenおよびOkayama，1987，Mol ．Cell．Biol．7，2745-2752）の代わりにBES緩衝液（SIGMA）を使用した他は前 記したように（Wiglerら，1979，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78，1373-1376 ）、対数期の約２ｘ106個/mlで増殖している細胞を培養物5ml当たり1mlの量で20 μgのDNA-リン酸カルシウム共沈殿物によりトランスフェクトした。16〜18時間 後、細胞をコニカル遠心管に移し、臨床用遠心機にてフルスピードで30秒間ペレ ット化し、1/4体積の新鮮な完全培地で１回すすぎ、もとの体積の完全培地に再 懸濁し、そして、もとのフラスコに戻した。その後、トランスフェクトした細胞 を誘導の前に24時間回復させた。 6.1.4. 凝集アッセイ CuSO4を0.7mMまで添加することにより、ノッチおよびデル タメタロチオネイ ン構築物の発現を誘導した。ECN1構築物でトランスフェクトした細胞も同様に処 理した。その後、細胞を混合し、凝集条件下でインキュベートし、特異的抗血清 および発現細胞を視覚化する免疫蛍光鏡検法を用いてそれらの凝集能を採点した 。 ２種類の凝集アッセイを用いた。第１のアッセイにおいては、全量3mlの細胞 （5-10 x 106個/ml）を25ml三角フラスコに入れ、40〜50rpmで回転振盪機上で24 〜48時間室温にて回転させた。これらの実験のために、誘導が始まった後、細胞 を１〜４時間混合して、凝集期間中ずっと誘導を続けた。第２のアッセイにおい ては、室温で一晩誘導させた（12〜16時間）後、約0.6mlの細胞を0.6mlエッペン ドルフ管（小さな泡が残っている）に入れ、１〜２時間４℃で穏やかに振動させ た。抗体阻止およびCa2+依存性の実験は後者のアッセイを用いて行った。Ca2+依 存性の実験のために、まず細胞を回収して、11%FCSを添加した平衡塩類溶液（BS S）（BSS-FCS；FCSは0.9%NaCl、5mM Tris［pH 7.5］で透析した。）中で、ある いは、10mM EGTAを含有するCa2+不含BSS-FCS（Snowら，1989，Cell 59，313-323 ）中ですすいだ後、同じ培地にもとの体積で再懸濁させた。抗体阻止の実験のた めに、ノッチでトランスフェクトした細胞を回収し、M3培地中ですすいだ後、凝 集の前に、M3培地中で１時間４℃で、ノッチの細胞外ドメイン由来のセグメント を含む融合タンパク質で免疫感作した４匹のマウスの各々由来の1：250希釈の免 疫血清または免疫前血清で処理した（上記の抗体の作製を参照のこと）。 6.1.5. 免疫蛍光法 細胞を遠心分離で（3000rpmで20分間エッペンドルフ微量遠心機にて）回収し 、0.6mlエッペンドルフ管にて0.5mlの新たに調製した2%パラホルムアルデヒドの PBS溶液で10分間室温で固定した。固定後、細胞を遠心分離で回収し、PBS中で２ 回すすぎ、そして、１時間PBS中の一次抗体にて0.1%サポニン（SIGMA）および１ ％正常ヤギ血清（Pocono Rabbit Farm．Canadensis，PA）で染色した。モノクロ ーナル抗体上清を1:10に希釈し、この工程のためにマウスまたはラット血清を1: 1000に希釈した。その後、細胞をPBS中で１回すすぎ、１時間PBS-サポニン-正常 ヤギ血清中の特異的二次抗体（二重標識グレードのヤギ抗マウスおよびヤギ抗ラ ット，Jackson Immunoresearch）にて染色した。このインキュベーションの後、 細胞をPBS中で２回すすぎ、90%グリセロール、10% 1 M Tris（pH8.0）および0.5 %没食子酸ｎ-プロピル中でスライド上に載せた。エピ蛍光（epifluorescence） 下、LeitzOrthoplan ２顕微鏡上で、細胞を検視した。 Zeiss Axiovert複合顕微鏡に接続したBio-Rad MRC 500システムを用いて、共 焦点顕微鏡写真を撮った。ALIGNプログラムを用いて配列させ、MERGEを用いて合 わせた、BHSおよびGHSフィルターセットを用いて、画像を修正した。グリーンか らレッドチャンネルへの蛍光ブリードスルーは、BLEEDプログラム（Bio-Radによ り提供された全ソフトウェア）を用いて減少させた。写真は、Kodak Ektar 125 フィルムを用いてコンピューターモニターから直接得た。 6.1.6. 細胞溶解産物、免疫沈降、およびウェスタンブロット 組織培養物および野生型Canton-S胚の非変性界面活性剤溶解産物を、氷上で、 約10細胞体積の溶解緩衝液（300 mM NaCl，50 mMTris（pH 8.0），0.5%NP-40，0 .5%デオキシコール酸，1mMCaCl2，1mM MgCl2）にて、プロテアーゼ阻害物質とし ての1:2500に希釈した、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）およ びジイソプロピルフルオロホスフェートを用いて調製した。1ccツベルクリンシ リンジにとりつけた18G、21Gおよび25G針を用いて、溶解産物を順次トリチュレ ートした後、フルスピードで微量遠心機（microfuge）にて10分間４℃で遠心分 離し、不溶性物質を除去した。約１μｇの抗体（１〜２μｌのポリクローナル抗 血清）を250〜500μｌの細胞溶解産物に添加し、１時間４℃で攪拌しながらイン キュベートすることにより、免疫沈降を行った。この混合物に、15μｇのヤギ抗 マウス抗体（Jackson Immunoresearch：これらの抗体は、マウスおよびラットIg Gの両方を認識する。）を添加し、１時間４℃で攪拌しながらインキュベートし た。これに続いて、100μｌの固定したStaphylococcus aureus（Staph A）バク テリア（Zysorbin，Zymed：製造業者の使用説明書に従って再懸濁した）を添加 した。これらは、前もって回収され、溶解緩衝液中で５回洗浄され、もう１時間 インキュベートされていた。その後、Staph A−抗体複合体を遠心分離によりペ レット化し、溶解緩衝液中で３回洗浄し、続いて２回15分間溶解緩衝液中で洗浄 した。新たな管に移した後、沈殿した物質を50μｌのSDS-PAGE試料緩衝液に懸濁 させ、直ちに10分間煮沸し、3%-15%勾配ゲルにかけ、ニトロセルロースに ブロットし、前記したように（Johansenら，1989，J．Cell Biol．109，2427-24 40）、モノクローナル抗体およびHRP-複合（conjugated）ヤギ抗マウスニ次抗体 を用いて検出した。ウェスタンブロットに使用した全細胞タンパク質試料につい ては、細胞を遠心分離で回収し、1mM PMSFを含む10細胞体積の試料緩衝液に溶解 させ、直ちに煮沸した。 6.2. 結果 6.2.1. 培養細胞におけるノッチおよびデルタの発現 ノッチおよびデルタ間の相互作用を検出するために、凝集アッセイを用いて、 これらのタンパク質をその表面上に発現している細胞の挙動を調べた。これらの 検討のために、S2細胞系（Schneider，1972，J．Embryol．Exp．Morph．27，353 -365）を選択した。S2細胞は、ノッチコード配列の５’末端の再配列のために、 異常なノッチメッセージを発現し、検出可能なノッチを発現しない。これらの細 胞は検出可能なデルタも発現しない。 ウェスタンブロットおよび免疫蛍光分析の結果は、ノッチおよびデルタ構築物 が予想される大きさのタンパク質の発現および細胞下の局在化を支持することを 明らかに示した。 6.2.2. ノッチおよびデルタ凝集物を発現する細胞 単純な凝集アッセイを用いて、S2細胞の表面に発現したノッチおよびデルタ間 の相互作用を検出した。 対数期増殖のS2細胞を、ノッチまたはデルタメタロチオネインプロモーター構 築物のいずれかで、別々にトランスフェクトした。 CuSO4での誘導の後、トランスフェクトした細胞を同じ数で混合し、一晩室温で 凝集させた（詳細については、実験方法、第6.1節を参照のこと）。あるいはま た、代謝活性を減少させることを意図したいくつかの実験において、細胞を４℃ で１〜２時間穏やかに混合した。凝集物が生成したかどうかを決定するために、 各遺伝子産物に特異的な抗体および標識の異なる蛍光二次抗体を用いる免疫蛍光 鏡検法用に細胞を処理した。安定というより一過性の形質転換体を使用したので 、発現細胞は、通常、全細胞集団の5%未満を構成した。残りの細胞は、ある種の タンパク質を発現しないか、免疫蛍光鏡検法により検出できない程低いレベルで 発現していた。対照として、シングルタイプのトランスフェクトした細胞だけを 用いて、凝集を行った。 その結果（Fehonら，1990，Cell 61:523-534）は、ノッチ発現（ノッチ+）細 胞は単独ではこのアッセイにおいて凝集物を形成しなかったが、デルタ発現（デ ルタ+）細胞は形成したことを示した。有糸分裂姉妹細胞間の接着からおそらく 生じるであろう４〜８細胞の細胞塊が普通に生じる場合、デルタ+細胞が凝集す る傾向は、非凝集対照試料においても見られた。しかしながら、塊は凝集条件下 でのインキュベーション後にはよりよく生じ（例えば、インキュベーション前に は19%のデルタ+細胞が凝集物にあるのに対し、インキュベーション後には３７％ のデルタ+細胞が凝集物にある）、このことは、デルタ+細胞がこのアッセイにお いて互いに安定な接触を形成できることを示している。 ノッチ+細胞単独での対照実験とは著しく対照的に、ノッチ+およびデルタ+細 胞の混合物の凝集は、20個の細胞またはそれ以 上までの塊を形成する結果となった。24時間の凝集の後に、４個以上の染色細胞 の塊に見出される発現細胞の画分は、ノッチ+およびデルタ+細胞の混合物の32% 〜54%の範囲に及んだ。この範囲は、デルタ+細胞単独（37%〜40%）に見られるも のと類似であったが、ノッチ+細胞単独のもの（たった0%〜5%）とは非常に異な っていた。デルタ+細胞のみからなる数個の塊が見出されたが、デルタ+細胞も存 在しない限り、ノッチ+細胞は４〜５個より多くの細胞の塊に見出されることは なかった。さらにまた、トランスフェクトした細胞は全細胞集団の小さな画分の みを構成していたが、これらの塊内の全ての細胞はノッチまたはデルタのいずれ かを発現した。48時間で、凝集の程度はより高くなった（63%〜71%）ようであり 、このことは、凝集が24時間後にこれらの条件下でまだ最大に達していなかった ことを示唆している。また、ノッチおよびデルタ構築物で同時トランスフェクト した細胞（その結果、すべてのトランスフェクトした細胞は両方のタンパク質を 発現する）は、同じ実験条件下で同様の様式で凝集した。 凝集に対する、ノッチのほぼ全細胞外ドメインに伸びる融合タンパク質に対す るポリクローナル抗血清の混合物の効果を調べることにより、凝集プロセスにノ ッチが関与することを直接試験した（実験方法、第6.1節を参照のこと）。表面 抗原のパッチングに対する代謝応答のために生じるかもしれない人工産物を最小 にするために、これらの実験において、抗体処理および凝集アッセイを４℃で行 った。ノッチ+細胞を免疫前または免疫マウス血清のいずれかとともに１時間イ ンキュベートし、デルタ+細胞を添加し、凝集を１〜２時間行った。免疫前血清 で前処理したノッチ+ 細胞はデルタ+細胞により凝集した（３回の実験のうち１回において、23%のノ ッチ+細胞がノッチ+−デルタ+細胞凝集物に存在した）が、免疫血清で処理した ものは凝集しなかった（たった2%のノッチ+細胞が凝集物に存在した）。この結 果は、ノッチの細胞外ドメインがノッチ+−デルタ+細胞凝集に必要であることを 示唆した。 6.2.3. ノッチ−デルタ仲介凝集はカルシウム依存性である 発現細胞がCa2+イオンの存在または不存在下で凝集する能力を試験して、ノッ チ−デルタ凝集にCa2+イオンが要求されるかどうかを決定した。Ca2+の除去に対 する代謝応答のためにありうる非特異的効果を最小にするために、これらの実験 を４℃で行った。その結果は、ノッチ−デルタ仲介凝集が外因性Ｃａ2+に依存す ることを明らかに実証した。 6.2.4. ノッチおよびデルタは単一の細胞内で相互作用する 同時トランスフェクトした細胞におけるノッチおよびデルタの分布を調べるこ とにより、ノッチおよびデルタが、両方のタンパク質を発現する１個の細胞の膜 内で会合するかどうかの問題が提起された。観察された同時局在化がノッチおよ びデルタ間の安定な相互作用と一致するのか、あるいは、かかる相互作用を提示 するのかどうかを試験するために、生細胞を過剰のポリクローナル抗ノッチ抗血 清で処理した。この処理により、免疫蛍光法により検出されるような、分離した パッチへの発現細胞の表面上でのノッチの“パッチング（patching）”が生じた 。この処理の後、こ れらの細胞の表面上でノッチおよびデルタの分布には明瞭な相関関係があり、こ のことは、これらのタンパク質が膜内で会合することを示している。 6.2.5. デルタとの相互作用はノッチの細胞内ドメインを必要としない EGF様リピートを含む大きな細胞外ドメインに加えて、ノッチは約940アミノ酸 のかなり大きな細胞内（IC）ドメインを有する。このICドメインは、リン酸化部 位（Kiddら，1989，Genes Dev．3，1113-1129）、推定上のヌクレオチド結合ド メイン、ポリグルタミンの広がり（Whartonら，1985，Cell 43，567-581；Kidd ら，1986，Mol．Cell．Biol．6，3094-3108）、および酵母cdc 10遺伝子に相同 の配列（これは、酵母の細胞周期制御に関与している）（BreedenおよびNasmyth ，1987，Nature 329，651-654）を含んでいる。上で特筆した構造上の特徴をす べて含んでいるが、ICドメインの約835アミノ酸をコードする配列を欠失させた （25の膜に近位のアミノ酸および新規な59のアミノ酸カルボキシル末端を残して いる；実験方法を参照のこと）変異型ノッチ構築物を使用した。 凝集アッセイにおいて、ECN1構築物を発現している細胞は、完全なノッチを発 現している細胞について観察されたように、デルタ+細胞と凝集物を常時形成し たが、自分自身とは凝集物を形成しなかった。ECN1の鋭いバンドがデルタ+細胞 との接触部位内に観察され、さらに、このことは、ECN1が細胞間の接触部位内に 局在化すること示している。膜内の相互作用について試験するため に、ECN1およびデルタ構築物で同時トランスフェクトした細胞を用いて、表面抗 原コパッチング実験を行った。完全なノッチで観察されたように、ノッチの細胞 外ドメインに対するポリクローナル抗血清を用いてECN1をパッチした時、ECN1お よびデルタは細胞表面に同時局在化した（colocalize）。これらの結果は、膜内 のノッチおよびデルタ間の観察された相互作用はノッチのICドメインの欠失部分 を必要とせず、従って、おそらく細胞外ドメインにより仲介されることを実証し ている。 6.2.6. ノッチおよびデルタは界面活性剤可溶性の分子間複合体を形成する 先の結果は、同じ膜内に存在するノッチおよびデルタ間、ならびに異なる細胞 上に発現したこれらのタンパク質間の分子相互作用を示した。そのような相互作 用についてのさらなる試験は、これらのタンパク質が、ノッチおよびデルタを発 現する細胞の非変性界面活性剤抽出物から共沈するかどうかである。もしノッチ およびデルタが、細胞間で、あるいは細胞内のいずれかで、安定な分子間複合体 を形成するならば、これらのタンパク質のひとつに対する特異的な抗血清を用い て、細胞抽出物から両方のタンパク質を沈殿させることができるはずである。一 晩凝集させた、ノッチおよびデルタ構築物で同時トランスフェクトした細胞、ま たは０〜24時間の野生型胚のNP-40/デオキシコール酸溶解産物由来のポリクロー ナル抗血清（実験方法を参照のこと）でデルタを免疫沈降させることにより、こ の分析を行った。 ノッチの共沈は、同時トランスフェクトした細胞および胚由来 のデルタ免疫沈降物において、検出された。しかし、共沈しているノッチは、デ ルタよりはるかに少ない量で存在するようであり、従って、検出するのが困難で あった。デルタの免疫沈降によりノッチの共沈が生じた事実は、これらの２つの タンパク質が、トランスフェクトしたS2細胞において、また、胚細胞において、 安定な分子間複合体を形成することの直接的な証拠となる。 6.3. 考察 通常非接着性のS2細胞を用いるin vitro凝集アッセイを用いたところ、ノッチ およびデルタを発現する細胞は互いに特異的に接着することが示された。 7. ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ−仲介凝集のために 必要であり、かつ十分である。 デルタとの相互作用のために必要なノッチの細胞外ドメイン中の領域を同定す るため、ノッチの欠失変異体とともに、第６節に記載したのと同一の凝集試験を 行った。その結果は、ノッチのＥＧＦリピートが直接この相互作用に関与し、36 のＥＧＦリピートの２個（ELRIIおよび12）のみが必要らしいことを示す。これ ら２つのＥＧＦリピートはデルタに結合するのに十分であり、ノッチ−デルタ仲 介凝集のカルシウム依存性もまた、これら２つのリピートと関係する。最後に、ノッチ のツメガエル相同物からの２つの対応するＥＧＦはまた、デルタとの凝集 も仲介し、ノッチの構造が進化において保存されているのみならず、その機能を も有していることを意味する。これらの結果は、ノッチの細胞外ドメインは驚く ほどにモジュール（modular）であり、かつ、デルタに加えて潜在的に種々のタ ンパク質を結合することができることを示す（Rebay et al.，1991，Cell 67:68 7-699参照）。 7.1 実験方法 7.1.1. 発現構築物 記載された構築物は全てが全長のノッチ発現構築物＃１pMtNMgの誘導体であり （第６節参照，上掲）、上記のようにして作製した（Rebay et al.，1991，Cell 67:687-699）。 7.1.2. 細胞培養およびトランスフェクション ショウジョウバエＳ２細胞系を増殖させ、第６節（上掲）に記載されたように トランスフェクトした。デルタを発現している、安定に形質転換されたＳ２細胞 系L-49-6-7（L．Cherbasが樹立したもの）を、11%熱不活化ウシ胎児血清（FCS） （Hyclone）、100U/mlペニシリン-l00μg/mlストレプトマイシン-0.25μg/mlフ ァンギゾン（Hazleton）、２×10-7Ｍメトトレキセート、0.1mMヒポキサンチン 、および0.016mMチミジンを補ったM3培地（Hazleton社によって調製された）中 で増殖させた。 7.1.3. 凝集試験および免疫蛍光 凝集試験およびCa++依存性実験は第６節（上掲）に記載の通りである。細胞を 、抗ノッチモノクローナル抗体9C6．Cl7および抗デルタラットポリクローナル抗 血清（詳細は第６節に記載，上掲）で染色した。ノッチの細胞外ドメインからの 0.8kb（アミノ酸237-501；Wharton et al.，1985，Cell 43，567-581）BstYI断 片に対するラットポリクローナル抗血清を用いて、非透過細胞中のノッチ構築物 の表面発現を試験した。細胞は、蛍光発色下、Leitz Orthoplan ２顕微鏡で観察 した。 7.2 結果 7.2.1． ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ仲介凝集のた めに必要である。 ノッチ−デルタ相互作用に関与することが示された（第６節，上掲；Fehon et al.，1990，Cell 61: 523-534）ノッチタンパク質の細胞外ドメインの広範囲な 欠失分析を実施し、これらの相互 作用を仲介するノッチの正確なドメインを同定した。様々な欠失構築物でトラン スフェクトされた細胞のデルタとの相互作用能を、第６節に記載された凝集試験 を用いて試験した。簡単に述べると、ノッチ欠失構築物を一時的にショウジョウ バエＳ２細胞にトランスフェクトし、CuSO4で誘導し、次いで、安定に形質転換 されたデルタ発現細胞系L-49-6-7（Cherbas）から得られた少量の細胞を用いて 室温で一晩凝集させた。典型的に約１％のノッチ発現細胞および約５％のデルタ 発現細胞を含むものの、残りの細胞はどちらのタンパク質も発現していない集団 が得られた。 試験した構築物の模式図および凝集試験の結果を図２に示す。凝集の程度を調 べるため、細胞を各遺伝子産物に特異的な抗血清で染色し、免疫蛍光顕微鏡検査 法で検査した。ノッチおよびデルタの両方を発現している細胞を含む４個以上の 細胞クラスターを凝集物と定義し、そして、図２に示した値は、かかるクラスタ ー中に見られる全てのノッチ発現細胞の百分率を表す。全ての数字は、少なくと も100個のノッチ発現細胞単位（単一の細胞又はクラスター）に評点をつけると いう、少なくとも２つの別々のトランスフェクション実験からの平均の結果を表 す。 初期の構築物（＃2 DSphおよび＃3ΔCla）は、ＥＧＦリピートの広範な部分を 欠失したものである。ノッチ−デルタ凝集を促進することができないこれらの能 力は、ノッチのＥＧＦリピートがデルタとの相互作用に関係があることを示唆し た。フレーム内における一連の６か所のClal制限部位を用いて、ＥＧＦリピート の７〜30間の領域をさらに切断した。リピート間の配列の相同性のために、５か 所のClal部位がＥＧＦリピート中の同一の相対的 な場所、ちょうど第３番目のシステインの後に存在するのに対し、６番目の部位 は、ＥＧＦリピート31の最初のシステインの直前に存在する（図３）。従って、 部分的Claｌ消化、次いで再連結を行うことによって、ノッチタンパク質のオー プンリーディングフレームを保存するのみならず、さらに、少なくとも理論的に は再連結によって作製されたキメラＥＧＦリピート中の３つのジスルフィド結合 の構造的完全性を頻繁に維持し、空間を保存する欠失体が得られた（図２，構築 物＃４〜14）。残念ながら、最も３’側のClal部位は消化に抵抗性であったが、 その隣の３’側のClal部位はＥＧＦリピート30と31との間で壊れた。したがって 、種々のClal消化断片が完全なClal消化物（構築物＃３ΔCla）の骨格内に再挿 入されると、ＥＧＦリピートの全体にわたる構造は、明らかに３’連結部で中断 された。 この一連の構築物についていくつかの点は特に言及する価値がある。第一に、 ＥＧＦリピート９および17内で壊れるClal制限断片を除去する（構築物＃８ΔEG F9-17）と、デルタとの凝集が失われ、一方、この断片を構築物＃３ΔCla（ＥＧ Ｆリピート７−30を欠く）に再挿入する（構築物＃13ΔCIa＋EGF9-17）と、おお むね野生型レベルにまで凝集が回復し、ＥＧＦリピート９から17までがデルタに 結合するために重要な配列を含むことを示唆する。第二に、このシリーズ（＃４ −14）の全ての構築物は、ＥＧＦリピート９から17への結合部位マッピングと一 致した。これらのリピートを含む発現構築物（＃６，７，９，10，13）はノッチ −デルタ相互作用を促進するが、これらのリピートを欠く構築物（＃４，５，８ ，11，12，14）は促進しない。デルタと凝集できない能力が、 単に細胞表面に達することができない突然変異ノッチタンパク質によるのではな く、実際には必要な結合部位の欠失によるものであることを確認するため、ノッ チの細胞外ドメインに対して特異的な抗体を用いて、トランスフェクトされた生 細胞を免疫蛍光染色することにより、全ての構築物の細胞表面発現を試験した。 ノッチ−デルタ相互作用を仲介することができない全ての構築物は、細胞表面で 通常発現すると思われるタンパク質を生産した。第三に、凝集試験は定量的では ないが、ＥＧＦリピート９−17を含む２個の構築物、＃９ΔEGF17-26又は最も顕 著には＃10ΔＥＧF26−30が外観上低レベルで凝集した。構築物＃９ΔＥＧＦ17 −26及び10ΔＥＧＦ26−30でトランスフェクトした細胞は、標準よりも表面染色 が極めて少ないことを示した。しかし、固定して透過性をもたせた細胞は同一の 抗体と反応し、普通に染色された。これは、抗血清によって認識されるエピトー プが単に欠失されていなかったことを示す。透過性をもたせた細胞、または生細 胞の集団中のトランスフェクトされた細胞の百分率を比較することにより、構築 物＃９ΔＥＧＦl7−26についてはトランスフェクトされた細胞の約50%および構 築物＃10ΔＥＧＦ26−30については10％が、細胞表面で検出可能なタンパク質を 生産することがわかった。したがって、これら２つの構築物はタンパク質を生産 するが、そのタンパク質は、恐らく折り畳みの間違いのためにあまり細胞表面に 達することができず、このため、トランスフェクトされた細胞がデルタ発現細胞 と凝集する能力を、消去されないまでも、減少させたと思われる。 ＥＧＦリピート９から17までに結合部位をマッピングしたので、 別の実験では（Rebay et al.，1991，Cell 67：687-699）、ノッチのＥＧＦリ ピート14が、組織培養試験によりモデル化したデルタとの相互作用に関与しない ことを明らかにした。 ＥＧＦリピート９−17内のデルタ結合ドメインをさらにマッピング（位置決定 ）するため、特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ技術を用いて、 この領域のいくつかのサブ断片を作製した。３つの重なった構築物である＃16、 17および18が作製され、このうちただ一つの＃16ΔCla＋ＥＧＦ９−13が、Ｓ２ 細胞にトランスフェクトされたときにデルタ細胞との凝集を起こした。ＥＧＦリ ピート９を欠く構築物の＃19ΔCla＋ＥＧＦ（10−13）は、ノッチ−デルタ相互 作用に必要な領域であるとしてＥＧＦリピート10−13をさらに規定した。 構築物＃20−24は、同じＰＣＲ戦略をさらに用いて、このドメインを破壊しよ うとする試みを提示するものであった（図３参照）。ＥＧＦリピート12が添加さ れた唯一の完全なリピートである構築物＃20ΔCla＋ＥＧＦ（11−13）、および 、ＥＧＦリピート11が添加された唯一の完全なリピートである＃21ΔC1a＋ＥＧ Ｆ（10−12）は、凝集を仲介することができなかった。これは、ＥＧＦリピート 11又は12のいずれかが単独で存在しても、ノッチ−デルタ相互作用に十分でない ことを示唆する。しかしながら、これら構築物の３’連結部がＥＧＦリピートの 全体の構造を中断するため、極めて重要なリピートを正常に機能させるのに短い “バッファー”ゾーンが必要でありうる。従って、例えば構築物＃19ΔCla＋Ｅ ＧＦ（10−13）において、ＥＧＦリピート12は直接デルタとの結合に関係しない のかもしれないが、その代わりに、 ＥＧＦリピート11の構造を保護するために必要とされる最小量のバッファー配列 に寄与し、それにより、デルタとの相互作用を可能にするのかもしれない。構築 物＃22−24はこの問題を解決した。凝集を仲介しなかった構築物＃22ΔCla＋Ｅ ＧＦ（10−11）、および仲介した＃23ΔCla＋ＥＧＦ（10−12）は、リピート11 および12の両方が必要とされるが、リピート13からのフランキング配列は明らか に必要とされないことを再度示唆した。最後に、構築物＃24ΔCla＋ＥＧＦ（11 −12）は、５’連結部で潜在的に構造的に破壊されるが、ＥＧＦリピート10から の配列が最重要でないことを納得いくように実証した。従って、24個の構築物か らの完全に矛盾のないデータに基づくと、ノッチのＥＧＦリピート11および12は 、一緒になって、トランスフェクトされたＳ２細胞においてデルタと結合するた めの必要な部位を包含する、この分析から得ることができる最も小さい機能単位 を規定するものである。 7.2.2. ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ仲介凝集のため に十分である。 ＰＣＲ断片が挿入された大きなClal欠失体（＃３ΔCla）は、もとの36のＥＧ Ｆリピートの約１／３および３つのノッチ／lin-12リピートを保持する。これら は、明らかに凝集を促進するには十分でないが、特定のＥＧＦリピートがデルタ と相互作用できる必要なフレームワークを形成するかもしれない。わずかのＥＧ Ｆリピートのみが実際に凝集を促進するのに十分であるかどうかを試験するため 、２つの構築物を設計した。リピート１の最初の２ ／３を除く全ての３６のＥＧＦを欠失した＃25ΔＥＧＦ、並びにＥＧＦリピート １の最初の１／３を除くノッチの全細胞外部分及び膜貫通ドメインの直前の約35 アミノ酸を欠失した＃30ΔＥＣＮである。構築物＃３ΔClaのバックグラウンド でノッチ−デルタ凝集を仲介した断片は、構築物＃25ΔＥＧＦ内に挿入されたと きは、再びデルタとの相互作用を促進することができた（構築物＃26−30）。ノ ッチ ／lin-12リピートも存在しない類似の構築物（＃31，32）は、ノッチ−デル タ凝集をうまく仲介した。従って、ＥＧＦリピート11及び12は、ノッチの細胞外 ドメインの大半がなくても、Ｓ２細胞におけるノッチ−デルタ相互作用を仲介す るのに十分である独立のモジュール単位として機能するようである。 7.2.3. ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ仲介凝集のカル シウム依存性を維持する いくつかの欠失構築物を発現する細胞がデルタ発現細胞と凝集する能力を、Ca++ イオンの存在下又は非存在下で調べた。相互作用のカルシウム依存性は、最も 小さい構築物においてさえも保存され、ＥＧＦリピート11および12を含む最小の 構築物が全長ノッチの様式と同様の様式でデルタに結合するという考えと一致し た。 7.2.4. ノッチのＥＧＦリピート11および12のデルタ結合機能は、ノッチのツメ ガエル相同物において保存されている ツメガエルノッチ配列（Coffman et al.，1990，Science 249，1438-1441）に 基づくＰＣＲプライマーを用いて、リピート10および13の半分によってそれぞれ の側が隣接されたＥＧＦリピート11 および12を含むツメガエルステージ17のｃＤＮＡライブラリーから、約350bpフ ラグメントを得た。この断片を構築物＃３ΔClaにクローニングし、３つの独立 のクローンを、細胞培養凝集試験においてデルタとの相互作用能について試験し た。クローンの２つ、＃33ａおよびｂΔCla＋ＸＥＧＦ（10−13）は、Ｓ２細胞 にトランスフェクトされたときは、類似のショウジョウバエノッチ構築物である ＃19ΔCla＋ＥＧＦ（10−13）とほぼ等しいレベルで、そしてさらにカルシウム 依存性の様式でノッチ−デルタ相互作用を仲介することができた（表III）。し かしながら、３番目のクローン＃33ｃΔCla＋ＸＥＧＦ（10−13）は、非透過性 の生細胞を染色することにより判定して、細胞表面で普通にタンパク質を発現し たが、ノッチ−デルタ相互作用を仲介することができなかった。構築物＃33ａお よび33ｃにおけるツメガエルＰＣＲ産物の配列比較により、構築物＃33ｃのＥＧ Ｆリピート11中のロイシンからプロリンへの変化をもたらすミスセンス突然変異 （アミノ酸＃453，Coffman，et al.，1990，Science 249，1438-1441）が明らか になった。この残基はショウジョウバエおよびツメガエルノッチ間で保存されて いないが（図８）、プロリン残基の導入は容易にＥＧＦリピートの構造を破壊し 、このためデルタとの相互作用を妨げるのかもしれない。 ショウジョウバエおよびツメガエルノッチのＥＧＦリピート11および12のアミ ノ酸配列の比較により、カルシウム結合コンセンサス配列（図４，配列番号１お よび２）を含むアミノ酸の高度の同一性が明らかになった。しかしながら、相同 性のレベルは、他のほとんどのＥＧＦリピート間で共有されるものと著しく異な っ ていない（アミノ酸レベルで、全体が約50％の同一性を示す）。ショウジョウバ エおよびツメガエルノッチの個々のＥＧＦリピートの１対１の対応は、ＥＬＲ11 および12の機能的保存とともに、ノッチの36のＥＧＦリピートが保存された機能 的単位のタンデム（tandem）領域から成ることを示唆する。 7.3. 考察 ノッチの細胞外ドメインの広範囲な欠失分析を用いて、ＥＧＦ相同リピート11 および12を含むノッチの領域がノッチ−デルタ仲介凝集のために必要かつ十分で あり、そして、このデルタ結合能は、ツメガエルノッチの同じ２つのＥＧＦリピ ートにおいて保存されていることが分かった。凝集がノッチのＥＧＦリピート11 および12にマッピングされるという発見は、ノッチのＥＧＦリピートも特定のタ ンパク質結合ドメインとして機能することを示す。ＥＧＦリピート11および12の み（＃32ΔＥＣＮ＋ＥＧＦ(11−12)）で、ノッチ−デルタ相互作用のCa++依存性 を維持するために十分であった。 様々な欠失構築物は、ＥＬＲ11およびＥＬＲ12がモジュール単位として機能し て、それらが置かれた直接的状況とは無関係であることを示唆する。従って、残 りの34のリピートも、３つのノッチ／lin-12も、ＥＧＦリピート11および12が、 機能するために必要とされる構造的骨格を確立するのに必要ではなさそうである 。おもしろいことに、ほとんど逆の効果が観察された。すなわち、凝集試験は相 互作用の強さを測定するものではないが、結合部位が次第に小さい断片に制限さ れるにつれて、トランスフェクトさ れた細胞がデルタ発現細胞と凝集する能力の増加が観察された。これは、通常の フランキングＥＧＦ配列が、実際にタンパク質との間の会合を妨げることを示唆 する。残りの34のＥＧＦリピートはまた、発生のいろいろな時期にノッチと相互 作用する他のタンパク質のためのモジュール結合ドメインを形成するのかもしれ ない。 ノッチのＥＧＦリピート11および12が別々のデルタ結合単位を形成するという 知見は、各ＥＧＦリピート又はリピートの小さいサブセットが、発生の間、恐ら く他のタンパク質との直接の相互作用を通して、特有の役割を果たすのかもしれ ないという考えを支持する最初の具体的な証拠を提示するものである。デルタお よびセレート（Serrate）の接着性ドメイン間で見られる相同性（図５）は、セ レー卜の相同な部分が他のトポリズミック（toporythmic）タンパク質への結合 を仲介するという点で“接着性”であることを示唆する（下記の第８節参照）。 さらに、フィブリノーゲンに対する類似性を有する分泌タンパク質をコードする 遺伝子スカブラス（scabrous）は、ノッチと相互作用するかも知れない。 ＥＧＦリピートに加えて、他の構造的モチーフの多重コピーが共通して種々の タンパク質に存在する。一つの適当な例は、ｃｄｃ10／アンキリン（ankyrin） モチーフであり、その６コピーがノッチの細胞内ドメインに存在している。アン キリンは、22のこれらリピートを含む。恐らく、構造的モチーフの反復配列は、 一般に、一連のモジュールタンパク質結合単位の線状アセンブリーを表すのかも 知れない。これらの結果をノッチの既知の構造、遺伝的および発生的複雑性と合 わせると、ノッチは、発生を通して正 確に調節された時間的および空間的なパターンにおいて、多くの異なるリガンド と相互作用するのかも知れない。かかる状況であれば、細胞外タンパク質との特 異的相互作用は、ＥＧＦおよびノッチ／lin-12リピートによって仲介され、一方 、細胞骨格および細胞質タンパク質との相互作用は、細胞内ｃｄｃ10／アンキリ ンモチーフによって仲介されるであろう。 8. ノッチーセレート相互作用を仲介する配列 ここに記載するように、デルタとの相互作用を仲介するノッチの２つのＥＧＦ リピート、すなわち、ＥＧＦリピート11および12は、セレート結合ドメインをも 構成する（Rebay et al.，1991，Cell 67：687-699参照）。 ノッチおよびセレートが直接相互作用するかどうか試験するため、Ｓ２細胞を セレート発現構築物でトランスフェクトし、凝集試験においてノッチ発現細胞と 混合した。セレート発現構築物のために、442位（全ての配列番号は、Fleming e t al.，1990，Genes & Dev．4：2188-2201に従う）のイニシエーターＡＵＧのす ぐ５’側に人工的BamHI部位を含み、かつ464位まで相同である合成プライマーを 、681-698の位置からの第２のプライマーとともに用いて、約260塩基対のＤＮＡ 断片を作製した。この断片をBamHIおよびKpnIで切断し（571位）、Bluescript K S+（Stratagene）に連結した。この構築物であるBTSer5’PCRを配列決定により 確認し、次いでKpnIで切断した。セレートKpnI断片（571-2981）を挿入し、適正 な方向を選択してBTSer5’PCR-Kpnを作製した。BTSer5’PCR-Kpnの５’SacII断 片（Bluescriptポリリンカーおよびセ レート（1199）中のSacII部位）を単離し、ｃＤＮＡ Ｃｌの５’SacII断片を置 き換えるために用いた（Fleming et al.，1990，Genes & Dev．4：2188-2201） 。次いで、５’非翻訳領域を除いた全長セレートｃＤＮＡを再形成させた。この 挿入物は、Sall及び部分的BamHI消化により単離され、pRmHa-3のBamHIおよびSal l部位に挿入して、最終発現構築物であるSer-mtnを作製した。 セレート発現細胞は、カルシウム依存性様式でノッチ発現細胞に接着した（図 ２及びRebay et al.，1991，上掲）。しかしながら、試験した実験条件のもとで はデルタとは違って、セレートはホモタイプ的に相互作用するようには思われな かった。さらに、セレートとデルタとの間に相互作用は検出されなかった。 ノッチ欠失構築物のサブセットを試験したところ、デルタへの結合に加えてＥ ＧＦリピート11および12はまた、セレートとの相互作用を仲介することが分かっ た（図２；構築物＃1，7-10，13，16，17，19，28および32）。さらに、これら のリピートのセレート結合機能もまた、ツメガエルノッチの対応する２つのＥＧ Ｆ（＃33ΔCla＋ＸＥＧＦ（10−13））において保存されていたようである。こ れらの結果は、ノッチがデルタおよびセレートの両者と相互作用し、ノッチの同 じ２つのＥＧＦリピートが両方の相互作用を仲介することを明確に示す。ノッチ ／セレート凝集に不可欠なセレート領域も規定された。ヌクレオチド676-1287（ すなわち、アミノ酸79-282）（図５；配列番号３および４参照）の欠失は、ノッ チと凝集するセレートタンパク質の能力を消去する。 ノッチとセレートの凝集は、ノッチとデルタよりも効率的ではないようである 。おそらく、ノッチーセレート相互作用が弱いた めであろう。この減少した量の凝集についての一つのありふれた説明は次のよう なものだろう。セレート構築物は単にデルタ構築物ほど細胞表面で多くのタンパ ク質量を発現せず、それにより、相互作用の強さが低下したのだろう。あるいは 、相互作用の強さの違いは、in vivoで顕著であるかもしれないノッチ−デルタ およびノッチ−セレート相互作用間の基本的な機能的差異を示すのかも知れない 。 9. ヒトノッチのクローニング、配列決定及び発現 9.1 ヒトノッチの単離及び配列決定 ヒトノッチ配列についてのクローンは、最初にLambda Zap IIベクター（Strat agene）中の17〜18週ヒト胎児脳ｃDNAライブラリーからのDNAを増幅するポリメ ラーゼチェーンリアクション（PCR）を使用して得た。 この方法により得た400bp断片を次にプローブとして使用し、これにより同じ ライブラリーをヒトノッチクローンについてスクリーニングした。最初のスクリ ーニングにより３種のユニークなクローン、hN3k、hN2k及びhN5kを得たが、その 後の配列分析によりこれらは全てヒトノッチの３’末端にあるものであることが 判明した（図６）。hN3kの５’末端をプローブとして使用する２番目のスクリー ニングを行い、ヒトノッチの５’末端を包含するクローンを探した。１つのユニ ークなクローン、hN4kがこのスクリーニングから得られ、予備的な配列決定デー タによりそれが前記遺伝子の５’末端の殆どを含んでいることが判明した（図６ ）。クローンhN4k、hN3k及びhN5kはこれら全部で、EGF-リピートの初期から始ま り前記遺伝子の３’非翻訳領域に伸びるヒトノッチ相同体の約10kbを包含するも のである。３種のクローンの全てはpBluescriptSK-（Stratagene）のEcoRI部位 中のｃDNA挿入物である。宿主E．Coli株はXLI-Blueである（Maniatis，T.，1990 ，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Lab oratory，Cold Spring Harbor，New York，p．A12参照）。ヒトノッチ配列をシ ョウジョウバエノッチと並べたものを図７に示す。 前記ｃDNAクローンに含まれるノッチの種々の部分の配列を決定 により）、hN2k及びhN4kについて図８（配列番号５〜７）及び図９（配列番号８ 、９）にそれぞれ示す。さらにhN2kの配列分析を行った結果、hN5kに含まれるも のとオーバーラップするヒトノッチ配列をコードすることが判った。 hN3k及びhN5kに含まれるヒトノッチｃDNAの全ヌクレオチド配 ジデオキシチェーンターミネーション法により決定した。これらのヒトノッチを コードするヌクレオチド配列は、適当なリーディングフレーム内で容易に同定す ることができ、これはそこにイントロンがなく、３つの可能性のあるリーディン グフレームのうち１つのみにおける翻訳が、刊行物に記載されたショウジョウバ エノッチの推定アミノ酸配列との比較においてショウジョウバエノッチ配列に対 して実質的な相同度を有する配列を生成する配列を生成するからである。hN3k及 びhN5kにおけるヒトノッチｃDNAのDNA及び推定タンパク質配列は、図10（配列番 号10、11）及び図11（配列番号12、13）にそれぞれ示した。クローンhN3kは、３ 番目のノッチ／lin-12リピート付近から始まり、カルボキシ末端アミノ酸に数ア ミノ酸届かない位置まで伸びるノッチポリペプチドの部分をコードする。クロー ンhN5kは、cdcl0領域の前付近から始まりポリペプチドの末端までのノッチポリ ペプチドの部分をコードし、３’非翻訳領域も含む。 図10に示したDNA及びタンパク質配列（配列番号10、11）を図11のもの（配列 番号12、13）と比較すると、配列間の有意な相違が明らかであり、これはhN3k及 びhN5kが２つの別のノッチ-相同 遺伝子の部分を表すことを示している。従って、データはヒトゲノムが１より多 いノッチ-相同遺伝子を含んでいることを示している。これはノッチが単一コピ ー遺伝子であるように見えるショウジョウバエとは異なるものである。 hN3k及びhN5kに含まれるヒトノッチ相同体のDNA及びアミノ酸配列と、対応す るショウジョウバエノッチ配列（Wharton et al.，1985，Cell 43：567-581に記 載されたもの）及び対応するアフリカツメガエルノッチ配列（Coffman et al.， 1990，Science 249： なもの（受託番号M33874））との比較においても相違が示された。 図10（hN3k）に示したアミノ酸配列を、Ellisen et al.，1991年８月，Cell 6 6：649-661の図２に示されたTAN-1ポリペプチドの予想配列と比較した。推定ア ミノ酸配列間にいくらかの相違が見られたが、全体としてhN3kノッチポリペプチ ド配列は対応するTAN-1領域（TAN-1アミノ酸1455〜2506）と99%同一であった。 ４つの相違が挙げられる：３番目のノッチ／lin-12リピート及び最初のcdc10モ チーフの間の領域において、Ｘ（TAN-1，アミノ酸1763）の代わりにアルギニン が存在する（hN3k）；（2）Ｘ（TAN-1アミノ酸1787）の代わりにプロリンが存在 する（hN3k）；（3）グルタミン酸残基（TAN-1アミノ酸2495）の代わりにアスパ ラギン酸の保存的変化が存在する（hN3k）；及び（4）TAN-1アミノ酸2507及び25 35の間でカルボキシ末端領域が実質的に異なる。 図11に示したアミノ酸配列（hN5k）を、Ellisen et al.，1991年８月，Cell 6 6：649-661の図２に示されたTAN-1ポリペプチドの予想配列と比較した。推定ア ミノ酸配列間に相違が見られた。hN 5kの推定ノッチポリペプチドは、ccl0モチーフ（TAN-1アミノ酸1860〜2217）及 びよく保存されたフランキング領域の両方を包含するcdc10領域中のTAN-1ポリペ プチド（ショウジョウバエノッチに64%同一）に79%同一である（図12）。cdc10 領域はTAN-1配列のアミノ酸1860〜2217をカバーする。さらに、hN5kがコードす るポリペプチドは、PEST（プロリン、グルタミン酸、セリン、スレオニン）リッ チ領域（TAN-1アミノ酸2482〜2551）を含む分子のカルボキシ末端において、TAN -1ポリペプチド（ショウジョウバエノッチに44%同一）に65%同一である（図12B ）。前記領域の間にある215アミノ酸鎖は、hN3k、hN5k及びTAN-1により示される ノッチ相同クローンのいずれの間においてもよく保存されていない。hN5kポリペ プチド及びショウジョウバエノッチはいずれも、この領域中の他のタンパク質に 対するアミノ酸同一性の有意なレベルを示さない（例えば、hN5k/TAN-1 = 24%同 一性；hN5k／ショウジョウバエノッチ = 11%同一性；TAN-1／ショウジョウバエ ノッチ = 17%同一性）。これに対し、アフリカツメガエルノッチ（Xotch）（配 列番号16）、ラットノッチ（配列番号17）、及びTAN-1（配列番号18）は互いに 配列同一性の有意なレベルを共有し続けている（例えば、TAN-1／ラットノッチ = 75%同一性、TAN-1／アフリカツメガエルノッチ = 45%同一性、ラットノッチ／ アフリカツメガエルノッチ = 50%同一性）。 図12Bに示した脊椎動物ノッチ相同体の細胞内領域の配列の調査により、予測 されなかった知見が示された。即ち、hN5kを含むこれらのタンパク質の全てが、 ６個のcdc10リピートの最後に続く保存領域において、核標的化機能に関連する 推定CcNモチーフ を含む（図12B）。ショウジョウバエノッチはそのような明確なモチーフを欠く ものの、その配列をより詳細に観察することにより、可能性のある２つに分かれ た核局在性配列（Robbins et al.，1991，Cell 64：615-623）、並びに可能性の あるCKII及びcdc2リン酸化部位の存在が明らかにされ、これらは全て互いに近接 しており、従って別のタイプのCcNモチーフを規定している可能性がある（図12B ）． hN（一部hN5kに含まれているヒトノッチ相同体）の５’末端をカバーするクロ ーンを単離するために、クローンhN2kをプローブとして使用して、Stratageneか ら市販されているヒト胎児脳ファージライブラリーの260,000プラークを交差ハ イブリダイズするクローンについてスクリーニングした。標準的な方法（Maniat is etal.，1982，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or Laboratory，Cold Spring Harbor，New York）を用いて、４つのクローンを 同定し、そして単離した。４つのクローンは、ＡＴＣＣから得たAdams et al.， 1992，Nature 355：632-655のノッチ-相同配列に対するハイブリダイゼーション によっても単離された。 TAN-1の５’末端をカバーするクローンを単離するため、Stratageneから市販 されているヒト胎児脳ライブラリーを、配列を５’末端に延長するクローンにつ いてスクリーニングした。880,000プラークをスクリーニングし、hN3k配列と交 差ハイブリダイズする４つのクローンを同定した。配列決定によりこれらの配列 のTAN-1によりコードされたノッチタンパク質内での相対的位置を確認した。 我々が単離したTAN-1相同体の５’配列をヌクレオチド番号972（ヌクレオチド 番号１はATG開始コドンのＡである）まで決定し、Ellisen et al（1991，Cell 6 6：649-661）により記載された配列と比較した。ヌクレオチド559において、我 々のTAN-1相同体はＧを有しており、一方Ellisen et al．はＡと記載しており、 この変化の結果異なるアミノ酸がコードされている。即ち、最初の324アミノ酸 内で、我々のTAN-1コード化タンパク質はEllisen etal．により教示されたもの とは異なっており、我々のタンパク質は187位置にGlyを有するのに対し、Ellise n et al．はその位置においてArgと記載している（図13に示した通り）。 hN（配列番号19）及びTAN-1-コード化（配列番号20）タンパク質の両方、並び にアフリカツメガエル及びショウジョウバエノッチタンパク質の完全長アミノ酸 配列を図13に示す。hNの完全長DNＡコード配列（イニシエーターMetをコードす るものを除く）（配列番号２１中に含まれる）及びコードされたアミノ酸配列（ 但しイニシエーターMetは示していない）（配列番号19中に含まれる）を図17に 示す。 9.2 ヒトノッチの発現 上記9.1の項に記載したヒトノッチｃDNAクローンを使用して発現構築物を作製 した。hN3k及びhN2kの場合、クローン全体をそのベクターからEcoRI制限断片と して切り出し、３つのpGEXベクター（グルタチオンS-トランスフェラーゼ発現ベ クター；Smithand Johnson，1988，Gene 7，31-40）のそれぞれのEcoRI制限部位 にサブクローン化した。これにより、正確なリーディングフレ ーム中のサブクローンからのノッチタンパク質生成物の発現の可能性が与えられ る。hN5kの場合は、クローンは２つの内部EcoRI制限部位を含んでおり、2.6、1. 5及び0.6 kb断片を生成する。前記2.6及び1.5 kb断片の両方もpGEXベクターのそ れぞれにサブクローン化した。 前記pGEXベクター系を使用して、以下に記載する構築物からのヒトノッチ融合 （キメラ）タンパク質の発現を得た。クローン化されたノッチDNAをそれぞれの 場合について同期させて適当なpGEXベクター中に挿入した。それぞれの構築物を エレクトロポレーションにより細菌（E．Coli）中に導入し、グルタチオンS-ト ランスフェラーゼタンパク質のカルボキシ末端に融合したノッチタンパク質配列 を含む融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質の発現は、細菌タンパ ク質抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、挿入されたノッチ DNAを有するpGEXプラスミド及び有さないpGEXプラスミドを含む細菌からのタン パク質抽出物を比較することによって確認した。融合タンパク質は水性溶液中に 可溶であり、グルタチオン被覆アガロースを使用したアフィニティークロマトグ ラフィー（グルタチオンS-トランスフェラーゼのカルボキシ末端はグルタチオン に結合するため）により細菌溶解物から精製した。発現した融合タンパク質は、 ウェスタンブロットによりアッセイしたところ、ショウジョウバエノッチに対す る抗体に結合した。 ヒトノッチ-グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質を生成するの に使用した構築物は以下の通りである。 hNFP#2 - PCRを使用して、cdc10リピートの直前のhN5k挿入物 のヌクレオチド192に始まって、PESTリッチ領域のヌクレオチド1694の直前に至 る断片を得た。次にこのDNAをBamHI及びSmalにより消化し、得られた断片をpGEX -3中に結合した。発現の後、融合タンパク質をグルタチオンアガロースに結合す ることにより精製した。精製したポリペプチドについて4-15%勾配のポリアクリ ルアミドゲル上で分子量を測定した。得られた融合タンパク質は83kDの概算分子 量を有していた。 hN3FP#1 - EcoRIで消化することにより、全hN3k DNA挿入物（ヌクレオチド１ 〜3235）をBluescript（SK）ベクターから切り出した。該DNAをpGEX-3中に結合 した。 hN3FP#2 - Xmalで消化することにより、hN3k DNAの３’セグメント（ヌクレオ チド1847〜3235）とポリリンカーのいくつかをBluescript（SK）ベクターから切 り出した。該断片をpGEX-1中に結合した。 精製の後、これらの融合タンパク質を使用してヒトノッチに対するポリクロー ナル及び／またはモノクローナル抗体を作製した。 10．正常及び悪性細胞におけるノッチ発現 正常及び広範な種類の悪性細胞を示す、種々のヒト患者組織サンプル及び細胞 系をアッセイしてノッチの発現を検出及び／または定量した。患者組織サンプル は、エール大学医学部病理学教室から得た。 以下のアッセイを、患者組織サンプルにおけるノッチ発現を測定するのに使用 した；（ａ）ノーザンハイブリダイゼーション、（ｂ）ウェスタンブロット、（ ｃ）in situハイブリダイゼーション及び（ｄ）免疫細胞化学測定。アッセイは 標準的な技術を使用して 行った。ノーザンハイブリダイゼーション及びin situハイブリダイゼーション は、（i）クローンｈＮ３ｋのノッチ配列に特異的なDNAプローブを使用し、また （ii）クローンhN5kのノッチ配列に特異的なDNAプローブを使用して行った。ウ ェスタンブロット及び免疫細胞化学測定は、ショウジョウバエノッチタンパク質 に対する抗体（これはヒトノッチタンパク質も認識する）を使用して行った。 ノーザンハイブリダイゼーション及びウェスタンブロットは、上記したように 、種々の正常又は癌組織を示す多くのヒト細胞系を分析するのにも使用した。試 験した細胞系を表２に挙げる。 上記のようにノッチを特異的に発現することが示された悪性細胞組織タイプの 悪性度は5.1の項以下に記載したように処置できる。 10.1 ヒトノッチタンパク質の発現は種々の悪性度において増加される 以下に記載するように、我々はヒトノッチタンパク質発現は少なくとも３種の ヒト癌、即ち、子宮頚癌、乳癌及び結腸癌において増加することを見出した。ヒ ト患者の子宮頚癌、乳癌及び結腸癌からの組織サンプルの免疫細胞化学染色によ り、悪性組織が、 相対的に非悪性組織切片に対して増加したレベルで、高いレベルのノッチを発現 することが明らかに示された。この高いノッチ発現を示す種々の新生形成の広い スペクトルは、多くのより癌性の強い条件がノッチを高める方向に調整するのが 観察されるであろうことを示している。 ヒト腫瘍サンプルのスライド（乳癌、結腸癌及び子宮頚癌についてのもの）は 、エール大学医学部病理学教室の組織バンクから得た。染色は、hN及びTAN-1の 配列からそれぞれ生成したP1及びP4融合タンパク質に対して作製されたモノクロ ーナル抗体を使用して行った。 P1及びP4融合タンパク質は、所望のヒトノッチ配列を適当なpGEX発現ベクター （Smith and Johnson，1988，Gene 7：31-40；AMRAD Corp.，Melbourne，Austra lia）に挿入することにより得、製造者（AMRAD Corp．）の説明書に従ってアフ ィニティー精製した。P1融合タンパク質の製造については、pGEX-2をBamHIによ り切断し、hNの518 bp BamHI-BgIIl断片の３つのコピーからなるコンカテマー（ concatamer）に連結した。ラットを発現されたタンパク質で免疫し、標準的な方 法によりモノクローナル抗体を製造した。P4融合タンパク質の製造については、 pGEX-2をBamHIにより切断し、TAN-1の473 bp BamHI-BgIIl断片の３つのコピーか らなるコンカテマーに連結した。ラットを発現されたタンパク質で免疫し、標準 的な方法によりモノクローナル抗体を製造した。 試験した全ての腫瘍において、ヒトノッチ相同体TAN-1及びhNによりコードさ れるノッチタンパク質は両方とも、正常な部分と比較して、組織の悪性部分にお いて増加したレベルで存在した。 代表的な染色を添付した写真に示す（図14-16）。 染色の手順は以下の通りである。組織はパラホルムアルデヒド中で固定し、パ ラフィン中に埋め込み、５マイクロメーターの厚さの切片に切断し、ガラススラ イド上に置いた。そして以下の段階を行った。 １．各４分間、キシレンを４回交換することによる脱パラフィン。 ２．各４分間、無水エタノールを３回交換することによるキシレンの除去。 ３．スライドを95%、90%、80%、60%及び30%エタノールに各４分間浸潰すること による組織の漸次の再水和。最後にスライドを蒸留水中で５分間リンスした。 ４．メタノール中の0.3%過酸化水素中で30分間インキュベートすることによる内 因的ペルオキシダーゼのクエンチング。 ５．PBS（10mMリン酸ナトリウム，pH 7.5，0.9%NaCl）中での20分間の洗浄。 ６．ブロッキング溶液（ブロッキング溶液：4%正常ウサギ血清及び0.1 Triton X -100を含むＰＢＳ）中での１時間のインキュベーション。 ７．ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体との４℃での一晩のインキュベーシ ョン。一次抗体の最終濃度は20〜50μg/ml。 ８．PBS + 0.1%Triton X-100での20分間の洗浄（３回交換）。 ９．ビオチニル化ウサギ抗ラット抗体：10mlのブロッキング溶液中の50μｌのビ オチニル化抗体（VECTOR）との30分間のインキュベーション。 10．PBS + 0.1%Triton X-100での20分間の洗浄（３回交換）。 11．ABC試薬（VECTOR）との30分間のインキュベーション（試薬はPBS + 0.1%Tri ton X-100中で作製）。 12．PBS + 0.1%Triton X-100での20分間の洗浄。続いてのPBS+ 0.5%Triton X-10 0中での２分間のインキュベーション。 13．ペルオキシダーゼ基質溶液中での2-5分間のインキュベーション。ペルオキ シダーゼ基質溶液：等容量の、蒸留水中の0.02%過酸化水素及び0.1Mトリスバッ ファー，pH7.5中の0.1%ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（DAB）を 組織とのインキュベーションの直前に混合する。Triton X-100を0.5%の濃度の最 終溶液まで添加する。 14．水道水中での15分間の洗浄。 15．マイヤーのヘマトキシリンによる10分間のカウンター染色。 16．水道水中での15分間の洗浄。 17．30%、60%、80%、90%、95%及び無水エタノール中での交換（各４分間）による 脱水。 18．キシレンへの浸漬（２回交換、各４分間）。 19．マウンティング、光学顕微鏡。 11．微生物の寄託 それぞれヒトノッチの部分をコードするプラスミドを有する下記の組換え細菌 は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条文に基 づき、1991年５月２日にAmericanType Culture Collection，1201 Parklawn Dri ve，Rockville，Maryland 20852に寄託された。 細菌 有するプラスミド ATCC受託No． E．coli XLl-Blue hN4k 68610 E. coli XLl-Blue hN3k 68609 E. coli XLl-Blue hN5k 68611 本発明は、その範囲において寄託された微生物あるいは本明細書中に記載した 特定の態様に限定されるものではない。実際に、本明細書中に記載したものに加 えて、本発明の種々の改変が上記の記載及び添付の図面から当業者には明らかと なるであろう。そのような改変は添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図さ れるものである。 本明細書中においては種々の刊行物が引用されるが、これらの開示はその全体 として引用により本明細書に含まれるものとする。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：2892 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：142..2640 配列 配列番号：２ 配列の長さ：833 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：３ 配列の長さ：1320 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 卜ポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：442..1320 配列 配列番号：４ 配列の長さ：293 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：５ 配列の長さ：267 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：６ 配列の長さ：574 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：７ 配列の長さ：295 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：８ 配列の長さ：248 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：９ 配列の長さ：323 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：10 配列の長さ：3234 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..3234 配列 配列番号：11 配列の長さ：1078 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：12 配列の長さ：4268 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：2..1972 配列 配列番号：13 配列の長さ：657 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：14 配列の長さ：77 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：15 配列の長さ：78 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：16 配列の長さ：654 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：17 配列の長さ：666 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：18 配列の長さ：681 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：19 配列の長さ：2471 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：20 配列の長さ：2556 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：21 配列の長さ：9723 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：10..7419 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＳ 38/00 ＡＡＡ ＡＣＳ ＡＤＵ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ Ｎ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＳ ＡＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ザグーラス，パナイオティス アメリカ合衆国 06511 コネチカット州 ニュー ヘイブン，オレンジ ストリー ト 595番地 (72)発明者 ブローミューラー，クリスティン マリー アメリカ合衆国 06511 コネチカット州 ニュー ヘイブン，プロスペクト スト リート 219番地 エール ユニバーシテ ィー，デパートメント オブ バイオロジ ー―ケイビーティー

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．治療上有効な量のノッチタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有 する医薬組成物。 ２．ノッチタンパク質がヒトのノッチタンパク質である、請求項１に記載の組成 物。 ３．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質がノッチタンパク質に対する抗体によって結合 され得る図８Ａ（配列番号５）、８Ｂ（配列番号６）、８Ｃ（配列番号７）、９ Ａ（配列番号８）、または９Ｂ（配列番号９）に示したＤＮＡ配列によりコード されるアミノ酸配列を含むものである、上記の組成物。 ４．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質が全長のノッチタンパク質と関連した１以上の 機能的活性を示す図８Ａ（配列番号５）、８Ｂ（配列番号６）、８Ｃ（配列番号 ７）、９Ａ（配列番号８）、または９Ｂ（配列番号９）に示したノッチアミノ酸 配列を含むものである、上記の組成物。 ５．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質が本質的にヒトノッチタンパク質の細胞外ドメ インからなる該タンパク質の断片を含むものである、上記の組成物。 ６．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質がノッチタンパク質のＥＧＦ相同リピートを含 む該タンパク質の領域からなるもの である、上記の組成物。 ７．治療上有効な量のノッチタンパク質の断片および製剤学的に許容される担体 を含有する医薬組成物であって、該断片がノッチタンパク質のＥＧＦ相同リピー トの部分を欠失しており、しかもノッチタンパク質に対する抗体によって結合さ れ得るものである、上記の組成物。 ８．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質がノッチタンパク質の機能的に活性な部分を含 むものである、上記の組成物。 ９．ノッチタンパク質がヒトのノッチタンパク質である、請求項８に記載の組成 物。 10．治療上有効な量のキメラタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有 する医薬組成物であって、該キメラタンパク質がノッチタンパク質と異なるタン パク質の配列にペプチド結合で結合されたヒトノッチタンパク質の機能的に活性 な部分を含むものである、上記の組成物。 11．ノッチタンパク質の機能的に活性な部分が、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号 68609を指定されたプラスミドｈＮ３ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列によりコ ードされるか、またはＡＴＣＣに寄託されて受託番号68611を指定されたプラス ミドｈＮ５ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列によりコードされる、請求項10に記 載の組成物。 12．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質が図10（配列番号11）に示したアミノ酸配列を 含むものである、上記の組成物。 13．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質が図11（配列番号13）に示したアミノ酸配列を 含むものである、上記の組成物。 14．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質が図４（配列番号14）に示したショウジョウバ エのノッチ配列の上皮増殖因子様リピート１１および１２に対して最大の相同性 を有するヒトノッチタンパク質の部分を含むものである、上記の組成物。 15．治療上有効な量のノッチタンパク質の誘導体または類似体および製剤学的に 許容される担体を含有する医薬組成物であって、該誘導体または類似体が、第１ の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現されたデルタタンパク 質とin vitroで結合し得る点に特徴がある、上記の組成物。 16．治療上有効な量のキメラタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有 する医薬組成物であって、該キメラタンパク質がノッチタンパク質と異なるタン パク質の配列にペプチド結合で結合されたノッチタンパク質を含むものである、 上記の組成物。 17．治療上有効な量のノッチタンパク質の断片および製剤学的に許容される担体 を含有する医薬組成物であって、該断片が、第１の細胞の表面に発現されるとき 、第２の細胞の表面に発現されたデルタタンパク質とin vitroで結合し得る点に 特徴がある、上記の組成物。 18．治療上有効な量のキメラタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有 する医薬組成物であって、該キメラタンパク質がノッチタンパク質と異なるタン パク質の配列にペプチド結合で結合 されたノッチタンパク質の断片を含むものであり、該断片が、第１の細胞の表面 に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現されたデルタタンパク質とin vitro で結合し得る点に特徴がある、上記の組成物。 19．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質がデルタタンパク質の誘導体または類似体から なり、該誘導体または類似体が、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細 胞の表面に発現されたノッチタンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴がある 、上記の組成物。 20．治療上有効な量のキメラタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有 する医薬組成物であって、該キメラタンパク質がデルタタンパク質と異なるタン パク質の配列にペプチド結合で結合されたデルタタンパク質の断片を含むもので あり、該断片が、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現 されたノッチタンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴がある、上記の組成物 。 21．治療上有効な量のタンパク質および製剤学的に許容される担体を含有する医 薬組成物であって、該タンパク質がセレートタンパク質の誘導体または類似体か らなり、該誘導体または類似体が、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の 細胞の表面に発現されたノッチタンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴があ る、上記の組成物。 22．治療上有効な量のノッチタンパク質の誘導体または類似体および製剤学的に 許容される担体を含有する医薬組成物であって、該 誘導体または類似体が、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面 に発現された第２のタンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴があり、該第２ のタンパク質がデルタタンパク質およびセレートタンパク質よりなる群から選ば れる、上記の組成物。 23．治療上有効な量のノッチタンパク質をコードする核酸および製剤学的に許容 される担体を含有する医薬組成物。 24．治療上有効な量の、ヒトノッチタンパク質の機能的に活性な部分をコードす る核酸、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 25．治療上有効な量の、図10（配列番号11）に示したアミノ酸配列をコードする 核酸、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 26．治療上有効な量の、図11（配列番号13）に示したアミノ酸配列をコードする 核酸、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 27．治療上有効な量のノッチタンパク質の断片をコードする核酸および製剤学的 に許容される担体を含有する医薬組成物であって、該断片が、第１の細胞の表面 に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現されたデルタタンパク質とin vitro で結合し得る点に特徴がある、上記の組成物。 28．治療上有効な量のキメラタンパク質をコードする核酸および製剤学的に許容 される担体を含有する医薬組成物であって、該キメラタンパク質がノッチタンパ ク質と異なるタンパク質の配列にペプチド結合で結合されたヒトノッチタンパク 質の機能的に活性な 断片を含むものである、上記の組成物。 29．治療上有効な量のデルタタンパク質の断片をコードする核酸および製剤学的 に許容される担体を含有する医薬組成物であって、該断片が、第１の細胞の表面 に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現されたノッチタンパク質とin vitro で結合し得る点に特徴がある、上記の組成物。 30．治療上有効な量のセレートタンパク質の断片をコードする核酸および製剤学 的に許容される担体を含有する医薬組成物であって、該断片が、第１の細胞の表 面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現されたノッチタンパク質とin vit roで結合し得る点に特徴がある、上記の組成物。 31．核酸が核酸ベクターである、請求項24に記載の組成物。 32．治療上有効な量のノッチタンパク質と結合する抗体および製剤学的に許容さ れる担体を含有する医薬組成物。 33．治療上有効な量の、ノッチタンパク質に対する抗体の断片または誘導体（該 抗体のイディオタイプを含む）および製剤学的に許容される担体を含有する医薬 組成物。 34．治療上有効な量の、ノッチタンパク質の機能に拮抗する分子を被検者に投与 することからなる、被検者の疾病または障害を治療または予防する方法。 35．疾病または障害が、同様の非悪性疾患試料におけるノッチ活性または発現と 比べて、増大したノッチ活性またはノッチタンパク質の増大した発現あるいは抗 ノッチ抗体によって結合され得るノッチ誘導体の増大した発現により特徴づけら れる悪性疾患である、請求項34に記載の方法。 36．疾病または障害が子宮頸癌である、請求項34に記載の方法。 37．疾病または障害が乳癌である、請求項34に記載の方法。 38．疾病または障害が結腸癌である、請求項34に記載の方法。 39．悪性疾患が黒色腫、精上皮腫、および肺癌よりなる群から選ばれる、請求項 35に記載の方法。 40．被検者がヒトである、請求項35に記載の方法。 41．分子がノッチに対する抗体またはその結合ドメインを含む該抗体の一部であ る、請求項36、37または38に記載の方法。 42．分子がノッチタンパク質の少なくとも細胞外ドメインからなるタンパク質ま たはノッチリガンドと結合することができるその一部である、請求項36、37また は38に記載の方法。 43．分子がノッチタンパク質の少なくともＥＧＦ相同リピートからなるタンパク 質である、請求項36、37または38に記載の方法。 44．分子がノッチタンパク質の少なくとも接着性断片からなるタンパク質である 、請求項36、37または38に記載の方法。 45．分子が（a）少なくとも６ヌクレオチドからなり、（b）ノッチ遺伝子のＲＮ Ａ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、そして（c）ＲＮＡ転写物と ハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドである、請求項36、37ま たは38に記載の方法。 46．治療上有効な量の、ノッチタンパク質の機能を促進する分子を被検者に投与 することからなる、被検者の疾病または障害を治療または予防する方法。 47．有効な量のノッチタンパク質を被検者に投与することからなる、被検者の悪 性疾患を治療または予防する方法。 48．有効な量のノッチタンパク質の機能的に活性な部分を被検者に 投与することからなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法。 49．ノッチタンパク質がヒトのノッチタンパク質である、請求項47に記載の方法 。 50．ノッチタンパク質と異なるタンパク質の配列にペプチド結合で結合されたノ ッチタンパク質の機能的に活性な部分を含んでなるキメラタンパク質を有効な量 で被検者に投与することからなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法 。 51．ヒトのノッチタンパク質が図10（配列番号11）または図11（配列番号13）に 示したアミノ酸配列を含むものである、請求項49に記載の方法。 52．有効な量のノッチタンパク質の誘導体または類似体を被検者に投与すること からなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法であって、該誘導体また は類似体は、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現され た第２のタンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴があり、該第２のタンパク 質がデルタタンパク質およびセレートタンパク質よりなる群から選ばれる、上記 の方法。 53．有効な量のデルタタンパク質の誘導体または類似体を被検者に投与すること からなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法であって、該誘導体また は類似体は、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現され たノッチタンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴がある、上記の方法。 54．有効な量のセレートタンパク質の誘導体または類似体を被検者に投与するこ とからなる、被検者の悪性疾患を治療または予防す る方法であって、該誘導体または類似体は、第１の細胞の表面に発現されるとき 、第２の細胞の表面に発現されたノッチタンパク質とin vitroで結合し得る点に 特徴がある、上記の方法。 55．有効な量の、ノッチタンパク質をコードする核酸を被検者に投与することか らなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法。 56．有効な量の、ノッチタンパク質の機能的に活性な部分をコードする核酸を被 検者に投与することからなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法。 57．被検者がヒトであり、ノッチタンパク質がヒトのノッチタンパク質である、 請求項55に記載の方法。 58．有効な量の、ノッチタンパク質の断片をコードする核酸を被検者に投与する ことからなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法であって、該断片が 、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現された第２のタ ンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴があり、該第２のタンパク質がデルタ タンパク質およびセレートタンパク質よりなる群から選ばれる、上記の方法。 59．有効な量の、デルタタンパク質の断片をコードする核酸を被検者に投与する ことからなる、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法であって、該断片が 、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細胞の表面に発現されたノッチタ ンパク質とin vitroで結合し得る点に特徴がある、上記の方法。 60．有効な量の、セレートタンパク質の断片をコードする核酸を被検者に投与す ることからなる、被検者の悪性疾患を治療または予 防する方法であって、該断片が、第１の細胞の表面に発現されるとき、第２の細 胞の表面に発現されたノッチタンパク質とinvitroで結合し得る点に特徴がある 、上記の方法。 61．有効な量のノッチタンパク質に対する抗体を被検者に投与することからなる 、被検者の悪性疾患を治療または予防する方法。 62．抗体がモノクローナルである、請求項61に記載の方法。 63．有効な量のオリゴヌクレオチドを患者に投与することからなるノッチ遺伝子 の発現により特徴づけられるタイプの腫瘍を有する患者を治療する方法であって 、該オリゴヌクレオチドが（a）少なくとも６ヌクレオチドからなり、（b）ノッ チ 遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、そして（c） ＲＮＡ転写物とハイブリダイズすることができるものである、上記の方法。 64．患者がヒトであり、ノッチ遺伝子がヒトの遺伝子である、請求項63に記載の 方法。 65．少なくとも６ヌクレオチドからなり、ノッチ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なく とも一部に相補的な配列を含み、そしてＲＮＡ転写物とハイブリダイズすること ができる、単離されたオリゴヌクレオチド。 66．請求項65のオリゴヌクレオチドおよび製剤学的に許容される担体を含有する 医薬組成物。 67．有効な量の請求項65のオリゴヌクレオチドを細胞に供給することからなる、 細胞においてノッチタンパク質をコードする核酸配列の発現を阻止する方法。 68．患者から得られた試料のノッチタンパク質の発現または活性レベルを測定す ることからなる、患者におけるノッチタンパク質ま たは活性の異常なレベルによって特徴づけられる疾病または障害を診断する方法 であって、患者の試料中のノッチタンパク質または活性が、正常な個体から得ら れた試料中に存在するレベルと比べて、増加または減少していることがその患者 の疾病または障害の存在を示すこととなる、上記の方法。 69．悪性細胞を含むかまたはその疑いがある患者由来の試料中のノッチタンパク 質の量または抗ノッチ抗体によって結合され得るノッチ誘導体の量を測定するこ とからなる、ノッチタンパク質または抗ノッチ抗体によって結合され得るノッチ 誘導体の増大した量によって特徴づけられる悪性疾患を診断する方法であって、 患者の試料中のノッチタンパク質または抗ノッチ抗体によって結合され得るノッ チ誘導体の量が、非悪性細胞の同様の試料中に存在する量と比べて、増加してい ることがその患者の疾病または障害の存在を示すこととなる、上記の方法。 70．悪性疾患が子宮頸癌である、請求項69に記載の方法。 71．悪性疾患が乳癌である、請求項69に記載の方法。 72．悪性疾患が結腸癌である、請求項69に記載の方法。 73．悪性疾患が黒色腫、精上皮腫、および肺癌よりなる群から選ばれる、請求項 69に記載の方法。 74．ノッチタンパク質または誘導体の量が、免疫特異的結合が起こり得るように 試料と抗ノッチ抗体とを接触させ、生じた該抗体の免疫特異的結合の量を測定す ることからなる方法によって測定される、請求項69に記載の方法。 75．有効な量のノッチタンパク質の機能的に活性な部分を被検者に投与すること からなる、被検者の神経系の障害を治療または予防 する方法。 76．有効な量のノッチタンパク質の機能的に活性な部分を被検者に投与すること からなる、被検者における組織の再生または修復を促進する方法。 77．有効な量のノッチタンパク質の機能的に活性な部分を被検者に投与すること からなる、肝硬変、乾癬、ケロイドおよびはげよりなる群から選ばれる被検者の 良性増殖不良障害を治療する方法。 78．図13のアミノ酸番号１から2169（配列番号19）に示された、ｈＮ相同体によ りコードされるアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたヒトノッチタンパク質 。 79．図13のアミノ酸番号約26から2169（配列番号19に含まれる）に示された、ｈ Ｎ相同体によりコードされるアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたヒトノッ チタンパク質。 80．図13のアミノ酸番号約26から1677（配列番号19に含まれる）に示された、ｈ Ｎ相同体によりコードされる成熟ヒトノッチタンパク質の細胞外ドメインを含む 、実質的に精製されたタンパク質。 81．図13のアミノ酸番号26から1413（配列番号19に含まれる）に示された、ｈＮ 相同体によりコードされる成熟ヒトノッチタンパク質のＥＧＦ相同リピートを含 む、実質的に精製されたタンパク質。 82．図13（配列番号19に含まれる）に示された、ｈＮ相同体によりコードされる 成熟ヒトノッチタンパク質のＥＧＦ様リピート１１および１２を含む、実質的に 精製されたタンパク質。 83．図13のアミノ酸番号約26から1677（配列番号19に含まれる）に示された、ｈ Ｎ相同体によりコードされる成熟ヒトノッチタンパク質の細胞外ドメインから本 質的になる、実質的に精製されたタ ンパク質。 84．請求項78のタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸。 85．請求項79のタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸。 86．請求項80のタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸。 87．請求項82のタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸。 88．図17のヌクレオチド番号82から7419（配列番号21に含まれる）に示された配 列を含むＤＮＡ分子である、請求項85に記載の核酸。 89．細胞外ドメインをコードする配列が図17（配列番号21に含まれる）に示した とおりである、請求項80に記載の核酸。 90．請求項84、87または88の核酸を含有する組換え細胞。 91．ノッチタンパク質が図13のアミノ酸番号26から2169（配列番号19に含まれる ）に示されたｈＮ相同体によりコードされるアミノ酸配列を含むものである、請 求項２に記載の組成物。 92．医薬として使用するための、ノッチタンパク質または抗ノッチ抗体によって 結合され得るノッチ誘導体を治療上有効な量で含有する組成物。 93．医薬として使用するための、ノッチタンパク質の機能に拮抗する分子を治療 上有効な量で含有する組成物。 94．子宮頸癌、乳癌または結腸癌の治療用医薬を調製するための、ノッチタンパ ク質の機能に拮抗する分子を含有する組成物の使用。
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