JPH08502409A - 血管形成阻害性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト臍静脈内皮細胞およびヒト臍動脈内皮細胞などの増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的なモノクローナル抗体を含む抗体、およびこれらの抗体の毒素物質または標識とのコンジュゲートは、血管形成の阻害または血管形成依存性疾患の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 血管形成阻害性抗体 発明の分野 本発明は、血管形成阻害性抗体、ならびに血管形成、特に充実性腫瘍（solidt umor）の増殖、増殖性網膜症およびある種の炎症性疾病に関連する血管形成の阻 害におけるその使用に関する。 発明の背景 循環系は、酸素および栄養分を組織に供給するため、および代謝副産物を除去 するために必須である血管の広範囲な枝分かれしている網状組織を表す。成人で は、創傷治癒の間を除き、または「血管形成依存性疾患」と称される多くの病理 的状態の結果として、新しい血管の発生または「血管形成」が稀に生じる^(1,2) 。これらのうち最も重要なものは、充実性腫瘍の増殖および増殖性網膜症に関連 する血管形成である。血管形成は、慢性関節リウマチおよび乾癬においても重要 な役割を果たす。 したがって、血管形成阻害剤は、血管形成依存性疾患の治療にかなり有用なも のであるはずである。例えば、充実性腫瘍の場合、血液供給の増加は、腫瘍の増 殖および生存のために必須である。かくして、血管形成の阻害は、腫瘍後退を誘 発する非常に選択的な手段を提供することができる。同様に、血管形成阻害剤は 、糖尿病の主な合併症のうちの１つである増殖性糖尿病性網膜症に関連する失明 を予防するためにも使用される。 本発明に至る研究において、増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対するモノク ローナル抗体（ｍＡｂｓ）を発生させて、これを使用して、血管形成を直接阻害 するか、または血管形成部位を細胞毒もしくは放射性同位体標識の標的とするこ とができる。血管形成は、成人においては、組織創傷の結果として起こる以外は 生じないので、かかるｍＡｂｓは、非常に特異的であり得る。さらにまた、腫瘍 を細胞毒の標的とする癌細胞特異的ｍＡｂｓを産生させた他の研究ラインとは異 なって、本発明は、宿主抗原に対するｍＡｂｓを産生させることに関する。この 研究は、腫瘍の「耐性」突然変異株の世代が生じることができず、理論的には、 １つのｍＡｂを使用して全ての充実性腫瘍を治療することができるという主な長 所を有する。さらなる長所は、内皮細胞が、それらの血管位置によって、循環に おいてｍＡｂｓに非常に到達しやすいということである。 発明の概要 本発明は、増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的なモノクローナル 抗体を含む抗体を提供するものである。 さらに詳しくは、本発明は、増殖性／血管形成性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶ ＥＣ）またはヒト臍動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）に対して特異的なモノクローナ ル抗体を含む抗体を提供するものである。 本発明は、当業者によく知られている方法によって生産される前記モノクロー ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系にまでも及ぶ。 前記のとおり、本発明の抗体は、患者における血管形成依存性疾患の治療にお いて抗血管形成剤として単独で使用される。 また、本発明は、増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的な抗体およ びそれにコンジュゲートされた毒素物質または標識からなる抗体コンジュゲート を提供するものでもある。 毒素物質としては、例えば、細胞毒または他の細胞毒性物質が挙げられるが、 当業者によく知られている他の毒素物質が本発明の抗体コンジュゲートに取り込 まれてもよい。標識は、放射性同位体である。好適な毒素物質としては、例えば 、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、シュードモナス（Pseudomonas）細菌外毒素Ａ およびイダルビシン（idarubicin）が挙げられる。好適な放射性標識は、テクネ チウム−９９ｍである。種々の毒素のモノクローナル抗体への結合は、公知の方 法によって行われる^(3,4,5,6)。同様に、放射性標識とのコジュゲートの製造は 、公知の方法を使用する⁽⁷⁾。 さらにまた、本発明は、前記に広範に示した抗体または抗体コジュゲートなら びに医薬的に許容される担体または希釈剤からなる組成物、特に血管形成阻害用 、 または血管形成依存性疾患治療用の治療組成物を提供するものである。 本発明は、前記の抗体または抗体コジュゲートの阻害有効量を患者に投与する ことからなる、患者における血管形成、例えば、充実性腫瘍の増殖または増殖性 網膜症に関連する血管形成の阻害方法にも及ぶ。 また、本発明は、前記抗体または抗体コジュゲートの治療有効量を患者に投与 することからなる、患者における血管形成依存性疾患の治療方法を提供するもの である。 抗体または抗体コジュゲートの投与は、いずれかの好適な経路によるものであ る。好ましくは、患者への投与は、非経口的であり、例えば注射による。 発明の詳細な説明 本発明の１つの具体例は、増殖性／血管形成性内皮細胞に対して特異的なモノ クローナル抗体（ｍＡｂｓ）を増加させることである。これらのｍＡｂｓの主な 使用は、血管形成を簡単に阻害することであるが、所望により、ｍＡｂｓは、血 管形成部位を細胞毒または標識の標的とするために使用することができる。腫瘍 の場合、この研究は、腫瘍特異性、最小副作用、および「耐性」腫瘍突然変異株 をほとんど発生させないことなどの主な長所を有する。さらにまた、これらのｍ Ａｂｓは、タイプおよび組織位置に関係なく全ての充実性腫瘍について使用する ことができ、充実性腫瘍における血管形成の阻害により、腫瘍後退が生じる。 最初の実験は、増殖性／血管形成性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対す るネズミｍＡｂｓを生じさせることであった。得られたｍＡｂｓを、まず、ＨＵ ＶＥＣ反応性についてスクリーニングし、次いで、他のヒト細胞系、例えば、ヒ ト黒色腫細胞系と反応するｍＡｂｓを削除した。最後に、新しく単離された非増 殖性／非血管形成性ヒト内皮細胞と反応しない内皮特異性ｍＡｂｓを同定した。 この研究を使用して、増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的なｍＡｂ ｓを得ることができることを明確に立証した。 図面の簡単な説明 第１図は、免疫蛍光フローサイトメトリーによって検出された、ｍＡｂｓの増 殖性／血管形成性および静止（非増殖性／非血管形成性）ヒト臍静脈内皮細胞 （ＨＵＶＥＣ）への結合を示す。ＣＯＮＴは、ｍＡｂｓと一緒にインキュベート されていないＨＵＶＥＣを表し、２０Ｇ５は、増殖性／血管形成性および静止Ｈ ＵＶＥＣと反応するＨＵＶＥＣ特異的ｍＡｂであり、９Ｂ１１は、増殖性／血管 形成性ＨＵＶＥＣとだけ反応するＨＵＶＥＣ特異的ｍＡｂである。 本発明の詳細は、本発明に関する内皮特異的ｍＡｂｓの製造の以下の詳細な説 明により明らかである。 実施例 Ａ．物質および方法 細胞 ジャフェ（Jaffe）⁽⁸⁾の方法によってヒト臍帯からヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵ ＶＥＣ）およびヒト臍動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を調製し、次いで、２０％ウ シ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、抗生物質、１３０μｇ／ｍｌヘパリン および１．２ｍｇ／ｍｌ内皮細胞増殖補足物（シグマ（Sigma））を補足した培 地１９９中で培養した。ｍＡｂ結合研究のために、２〜７継代の間のＨＵＶＥＣ を使用した。ヒト腫瘍細胞系（例えば、ＭＭ−１７０黒色腫、Ｋ５６２赤白血症 ）をＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ中で培養した。希釈した血液をポリモル フプレプ（Polymorphprep^TM）［ノルウェー国オスロのニコムド・ファルマ・ア クティー・ゼルスカブ（Nycomed Pharma Ａ．Ｓ．）］上で遠心分離することに よって、ヒト末梢血から単核細胞（リンパ球および単球）および好中球を同時に 単離した。分画遠心分離によって、クエン酸処理されたヒト血液から血球および 血小板を単離した。 ハイブリドーマの生産 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ中１５×１０⁶ＨＵＶＥＣで２〜４週間ごとに ３〜４回、腹腔内免疫し、脾臓細胞を取り出す３日前に１５×１０⁶ＨＵＶＥＣ で抗原投与した。脾臓細胞懸濁液を調製し、黒色腫ＮＳ１／１．ＡＧ４．１と融 合させ、従前に従って⁽⁹⁾ハイブリドーマを増殖させ、クローン化させた。ハイ ブリドーマ増殖およびクローニング効率を改良するために、培養培地中に１０％ 内皮細胞調整培地（ＨＵＶＥＣまたはウシ角膜ＥＣ）を含ませた。 ｍＡｂスクリーニングアッセイ まず、免疫蛍光フローサイトメトリーによって、ハイブリドーマ培養上澄み液 をＨＵＶＥＣとの反応性について試験した。すなわち、ＨＵＶＥＣ（５×１０⁴ ）を非希釈ハイブリドーマ上澄み液と一緒にインキュベートし（３０分、４℃） 、洗浄し、ＦＩＴＣ−ヒツジＦ（ａｂ’）₂抗マウスＩｇ（１００μｇ／ｍｌ） と一緒にインキュベートした。最後の洗浄の後、ベクトンーディッキンソンＦＡ Ｃスキャン（Becton−Dickinson ＦＡＣＳcan）による分析によって、ＨＵＶＥ ＣをｍＡｂ結合について試験した。次いで、正のハイブリドーマ上澄み液をヒト 黒色腫細胞系ＭＭ−１７０についてスクリーニングして、非内皮特異的ｍＡｂｓ を削除した。さらに、ヒト腫瘍細胞系ならびにヒトリンパ球、単球、好中球、赤 血球および血小板のパネルについてｍＡｂをスクリーニングすることによって、 内皮特異性を確認した。最後に、新しく単離した（非培養）ＨＵＶＥＣについて ハイブリドーマ上澄み液をスクリーニングすることによって、増殖性ＨＵＶＥＣ についての特異性を確立した。増殖性ＨＵＶＥＣについて正であったが、新しく 単離したＨＵＶＥＣについて負であるハイブリドーマを別の研究のためにクロー ン化した。内皮特異的であるが、増殖／血管形成特異的ではなかった多くのハイ ブリドーマ（例えば、２０Ｇ５）もまたクローン化した。 ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ ０．１％ゼラチンで被覆され、かつ、培養培地１５０μ１中２．５×１０⁴Ｈ ＵＶＥＣ／ウエルを含有する９６ウエルの平底マイクロプレート中でアッセイを 行った。２４時間後、さらに２４時間、³Ｈ−チミジンを用いて培養細胞にパル スを与えた。タイターテク（Titertek）５３０セルハーベスター（フロー・ラブ ズ（Flow Labs））を使用して、洗浄し、収穫した細胞において³Ｈ−チミジン取 込みを評価した。ｍＡｂブロッキング実験において、負の対照として使用される 、ＨＵＶＥＣと反応しないハイブリドーマからの上澄み液と一緒に培養の開始時 に、ハイブリドーマ上澄み液５０μｌ／ウエルを添加した。 Ｂ．結果 増殖性／血管形成性内皮細胞に対して特異的なｍＡｂｓの生産 第１表は、増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的なｍＡｂｓを得る ことができることを示す。 ａ ヒト黒色腫細胞系ＭＭ−１７０と反応しないハイブリドーマ。 ｂ ヒトＭＭ１７０細胞系、Ｕ９３７単球細胞系、リンパ球、好中球、単球、 赤血球および血小板と反応しないハイブリドーマ。 ｃ ヒト臍帯から新しく単離した内皮細胞、すなわち、「非増殖性」または「 静止」内皮細胞と反応しないハイブリドーマ。 ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍静脈内皮細胞。 スクリーニングした１１９６個のハイブリドーマの最初の融合において、８１ １個が増殖性／血管形成性内皮細胞と反応し、そのうち５４１個が特異的な、す なわち、ヒト黒色腫系ＭＭ−１７０などの他の増殖性ヒト細胞系と反応しない増 殖性／血管形成性内皮細胞であった。特に重要なことは、増殖性／血管形成性ヒ ト内皮細胞に対して特異的な５４１個のハイブリドーマのうち２５個が非増殖性 ／非血管形成性（新しく単離した）内皮細胞と反応しないという事実であった。 かくして、ハイブリドーマの４．６％は、増殖／血管形成特異的であるｍＡｂｓ を生産する。該研究の明確な確認を使用した。ＨＵＶＥＣ特異的ｍＡｂｓの１６ ．６％が血管形成特異的である第２融合において同様の結果が得られた。増殖／ 血管形成特異的ｍＡｂｓ（９Ｂ１１）および増殖／血管形成非特異的（２０Ｇ５ ）ｍＡｂｓを用いて得られた結果の典型的な例を、免疫蛍光フローサイトメトリ ーによって明らかにされるように、第１図に示す。 ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍静脈内皮細胞。 ＨＵＡＥＣ＝ヒト臍動脈内皮細胞。 第２表には、実施例として、ＨＵＶＥＣ反応性である６つのクローン化ｍＡｂ ｓの詳細な特異性分析を示す。１つのｍＡｂ（２０Ｇ５）は、静止内皮細胞およ び増殖性／血管形成性内皮細胞の両方と反応する対照であり、おそらくＣＤ３１ 抗原に対して特異的である。残りの５つのｍＡｂｓは、静止内皮細胞とではなく 、増殖性／血管形成性内皮細胞と反応する。これらのｍＡｂｓのうち３つ（１０ Ａ５、１４Ｇ１１、２１Ｆ１０）は、多くの他の増殖性細胞型と反応する。残り の２つのクローン（９Ｄ９および１２Ｅ５）は、増殖性／血管形成性内皮細胞に 対して相当な特異性を示す。９Ｄ９は、最大特異性を有するｍＡｂｓであり、血 小 板との弱い反応性を示すだけである。 ９Ｄ９ ｍＡｂは、非増殖性（静止）内皮細胞とではなく、増殖性／血管形成 性小静脈または動脈内皮細胞と反応する（第２表）。次の研究により、９Ｄ９抗 原は、培養の２４時間以内に培養されたＨＵＶＥＣＳ上に出現し、多くの継代、 すなわち、２カ月間にわたる１０継代の間、培養されたＨＵＶＥＣ上に生き残る ことが示された。９Ｄ９抗原は、また、ＨＵＶＥＣが２０％ＦＣＳ＋ウシ増殖補 足物または２０％ヒト血清のいずれで培養されても該ＨＵＶＥＣ上に出現し、こ れは、９Ｄ９抗原が培養培地成分に由来しないことを示す。 内皮細胞増殖に対するｍＡｂｓの効果 増殖特異的ｍＡｂｓのいくつかを増殖性ＨＵＶＥＣにin vitroで添加した場合 、ｍＡｂｓのいくつかがＨＵＶＥＣ増殖を直接阻害することができることが判明 した。典型的な実施例の結果を第３表に示す。 ^*ｍＡｂｓを含有する透析されたハイブリドーマ上澄み液を用いて増殖アッセイ において培養されたＨＵＶＥＣ。増殖は、培養開始から２４〜４８時間後に測定 し、３つの測定値の平均±標準誤差を表す。^** ｍＡｂｓは、増殖性／血管形成性（静止ではない）ＨＵＶＥＣと反応しない。 試験された４つの増殖／血管形成特異的ｍＡｂｓのうち、３つ（１Ｄ５、８Ｇ ４および１６Ｃ６）は、³Ｈ−チミジン取込みによって測定して、ＨＵＶＥＣ増 殖を約７５〜８５％阻害した。これと対照的に、１つの増殖／血管形成特異的ｍ Ａｂ（１９Ｄ４）ならびに増殖性および非増殖性ＨＵＶＥＣの両方と反応するｍ Ａｂである２０Ｇ５は、ＨＵＶＥＣ増殖に対して有意な効果は有しなかった。Ｈ ＵＶＥＣと反応しないｍＡｂ ９Ｂ９をこの実験の負の対照として使用した。 これらのデータは、増殖／血管形成特異的ｍＡｂｓのいくつかが血管形成を直 接阻害し、かくして、細胞毒−ｍＡｂコンジュゲートの必要性を回避することが 強く示唆される。第２表に示したデータが精製および濃縮されたｍＡｂ調製物を 用いてではなく、ハイブリドーマ上澄み液を用いて得られたことが強調されるべ きである。 参考文献： １．フォルクマン，ジェイ（Folkman，J.）、Adv.Cancer Res．４３、１７５ −２０３（１９８５）。 ２．フォルクマン，ジェイおよびクラグスブラン，エム（Klagsbrun，M.）、 サイエンス（Science）２３５、４４２−４４７（１９８７）。 ３．ブリッジズ，エス（Bridges，S.）、ロンゴ，ディ・エル（Longo，D．L. ）およびユール，アール・ジェイ（Youle，R．J.）、Methods Enzymol．１７８ 、３５６−３６８（１９８９）。 ４．コロンバッティ，エム（Colombatti，M.）、デラルシプレテ，エル（Dell ’Arciprete，L.）、ラポウリ，アール（Rappouli，R.）およびトリデンテ，ジ ー（Tridente，G.）、Methods Enzymol．１７８、４０４−４２２（１９８９） 。 ５．コンド，ティ（Kondo，T.）、フッツジェラルド，ディ（Fitzgerald，D. ）、チャウダリィ，ブイ・ケイ（Chaudhary，V．K.）、アドヒャ，エス（Adhya ，S.）およびパスタン，アイ（Pastan，I.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリー（J．Biol．Chem.）、２６３、９４７０−９４７５（１９８８ ）。 ６．ピータース，ジー・エイ（Pietersz，G．A.）、スミス，エム・ジェイ（S 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的な抗体。 ２．増殖性／血管形成性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはヒト臍動脈 内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）に対して特異的である請求項１記載の抗体。 ３．モノクローナル抗体である請求項１または２記載の抗体。 ４．請求項３記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。 ５．増殖性／血管形成性ヒト内皮細胞に対して特異的な抗体、およびそれにコ ンジュゲートされた毒素物質または標識からなる抗体コンジュゲート。 ６．抗体が増殖性／血管形成性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはヒト 臍動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）に対して特異的である請求項５記載の抗体コンジ ュゲート。 ７．抗体がモノクローナル抗体である請求項５または６記載の抗体コンジュゲ ート。 ８．抗体が細胞毒性物質にコンジュゲートされる請求項５記載の抗体コンジュ ゲート。 ９．細胞毒性物質がリシンＡ鎖、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素 Ａまたはイダルビシンである請求項８記載の抗体コンジュゲート。 １０．抗体が放射性同位体標識にコンジュゲートされる請求項５記載の抗体コ ンジュゲート。 １１．放射性同位体標識がテクネチウム−９９ｍである請求項１０記載の抗体 コンジュゲート。 １２．請求項１〜３のいずかれ１項記載の抗体または請求項５〜１１のいずか れ１項記載の抗体コンジュゲートおよび医薬的に許容される担体または希釈剤か らなる、血管形成阻害用または血管形成依存性疾患治療用の治療組成物。 １３．請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体または請求項５〜１１のいずれ か１項記載の抗体コンジュゲートの阻害有効量を患者に投与することからなる、 充実性腫瘍の増殖または増殖性網膜症に関連する血管形成を含む患者における血 管形成性の阻害方法。 １４．充実性腫瘍の増殖または増殖性網膜症に関連する血管形成を含む患者に おける血管形成阻害用医薬組成物の製造における、請求項１〜３のいずれか１項 記載の抗体または請求項５〜１１のいずれか１項記載の抗体コンジュゲートの使 用。 １５．請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体または請求項５〜１１のいずれ か１項記載の抗体コンジュゲートの治療有効量を患者に投与することからなる、 患者における血管形成依存性疾患の治療方法。 １６．血管形成依存性疾患治療用医薬組成物の製造における、請求項１〜３の いずれか１項記載の抗体または請求項５〜１１のいずれか１項記載の抗体コンジ ュゲートの使用。