JPH08502890A

JPH08502890A - ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼの阻害剤のアッセイ

Info

Publication number: JPH08502890A
Application number: JP6511357A
Authority: JP
Inventors: オマー，チヤールズ・エー; デイール，ロナルド・イー; ギブズ，ジヤクソン・ビー; コール，ナンシー・イー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 1996-04-02
Also published as: EP0667869A4; AU676241B2; WO1994010184A1; AU5544394A; CA2147496A1; EP0667869A1; US5821118A

Abstract

(57)【要約】本発明は薬剤のファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害活性の決定に有用なアッセイに関する。アッセイは大腸菌で遺伝子発現させることにより製造される精製ヒトファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼを利用する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼの阻害剤のアッセイ発明の背景ｒａｓ遺伝子は結腸直腸癌、外分泌膵癌及び骨髄性白血病を含む多数のヒト癌において活性化状態で存在する。ｒａｓ作用の生物学的及び生化学的研究によると、ｒａｓは細胞をトランスフォームさせるためには血漿膜中に局在してＧＴＰと結合しているはずなので、Ｇ調節タンパク質と同様に機能することが示されている（Ｇｉｂｂｓ，Ｊ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：１７１−２８６（１９８９））。癌細胞中のｒａｓの形態は、正常細胞中のｒａｓタンパク質とは区別できる突然変異を有する。少なくとも３種の翻訳後修飾がｒａｓ膜局在に関与し、これら３種の修飾はすべてｒａｓのＣ末端で行われる。ｒａｓＣ末端は“ＣＡＡＸ”即ち“Ｃｙｓ−Ａａａ¹−Ａａａ²−Ｘａａ”ボックスと呼称される配列モチーフを含む（Ａａａは脂肪族アミノ酸であり、Ｘａａは任意のアミノ酸である）（Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：５８３−５８６（１９８４））。他のタンパク質でこのモチーフを有するものには、ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質（例えばＲｈｏ、真菌交配因子等）、核ラミン及びトランスデューシンのγサブユニットがある。ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）は、ＣＡＡＸ末端を有するこのようなタンパク質基質のシステイン残基にファルネシル二リン酸からのイソプレノイドファルネシルを付加する反応を触媒する（Ｒｅｉｓｓ，Ｙ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｅａｂｒａ，Ｍ．Ｃ．，Ｃａｓｅｙ，Ｐ．Ｊ．及びＢｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．（１９９０）Ｃｅｌｌ６２，８１−８８；Ｓｃｈａｂｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｏ’Ｈａｒａ，Ｍ．Ｂ．，Ｇａｒｓｋｙ，Ｖ．Ｍ．，Ｍｏｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｏｏｒｅｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｐ．Ａ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｆ．及びＧｉｂｂｓ，Ｊ．Ｂ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１４７０１−１４７０４；Ｍａｎｎｅ，Ｖ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．，Ｔｏｂｉｎ，Ａ．，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｅ．，ＤｅＶｉｒｇｉｌｉｏ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．，Ａｈｍｅｄ，Ｎ．，Ｋｕｒｚ，Ｂ．，Ｒｅｓｈ，Ｍ．，Ｋｕｎｇ，Ｈ．−Ｆ．及びＢａｒｂａｃｉｄ，Ｍ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，７５４１−７５４５）。ｒａｓのファルネシル化は、腫瘍遺伝子形態のｒａｓによる有効な細胞トランスフォーメーションに不可欠な、ｒａｓの膜結合を助長する（Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．，Ｐａｐａｇｅｏｒｇｅ，Ａ．Ｇ．，Ｈｕｂｂｅｒｔ，Ｎ．Ｌ．及びＬｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３，２５８１−２５８４）。従って、ＦＰＴａｓｅの阻害剤は抗腫瘍剤であり得る。ＣＡＡＸテトラペプチドは、酵素認識に必要な重要な決定基がＣＡＡＸボックスに含まれることを示すポリペプチド基質に類似の動力学的特性を有するＦＰＴａｓｅの基質である（Ｒｅｉｓｓら，Ｃｅｌｌ．前出；Ｓｃｈａｂｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，前出；Ｐｏｍｐｌｉａｎｏ，Ｄ．Ｌ．，Ｒａｎｄｓ，Ｅ．，Ｓｃｈａｂｅｒ，Ｍ．ｄ．，Ｍｏｓｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｎ．Ｊ．及びＧｉｂｂｓ，Ｊ．Ｂ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１，３８００−３８０７；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｔｒａｄｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｒｅｉｓｓ，Ｙ．及びＧｉｅｒａｓｃｈ，Ｌ．Ｍ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５５７５−１５５７８）。哺乳動物ＦＰＴａｓｅはαβヘテロダイマータンパク質である。ウシ及びラット脳からのＦＰＴａｓｅのαサブユニットの一部又は全部をコードする相補的ＤＮＡは単離されている（Ｋｏｈｌ，Ｎ．Ｅ．ら，（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１８８８４−１８８８８；Ｃｈｅｎら（１９９１）Ｃｅｌｌ，６６，３２７−３３４；Ｃｈｅｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１３６８−１１３７２）。前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質は相互に＞９５％のアミノ酸配列を共有し、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＦＰＴａｓｅのＲＡＭ２によりコードされるサブユニットと３０％のアミノ酸配列を共有する（Ｈｅ，Ｂ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１３７３− １１３７７；Ｋｏｈｌら，前出）。ラット脳ＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするｃＤＮＡは単離されており、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＦＰＴａｓｅのＤＰＲ１／ＲＡＭ１（ＲＡＭ１）によりコードされるサブユニットと３７％のアミノ酸を共有する（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｅ．ら（１９８８）Ｙｅａｓｔ，４，２７１−２８１；Ｃｈｅｎら（１９９１）Ｃｅｌｌ６６，３２７−３３４）。しかしながら、これらのｃＤＮＡは容易に大量単離可能な完全ＦＰＴａｓｅの発現には使用されていない。薬剤の阻害活性を評価するのに有用な量のＦＰＴａｓｅがラット又はウシ脳のような動物組織から既に単離されている。しかしながら、ラット及びウシ脳に存在するＦＰＴａｓｅは比較的少量であり、酵素を精製するには多数の分離段階が必要である。ヒト細胞培養系及びヒト組織から入手可能なヒトＦＰＴａｓｅの量は限られており、ヒト細胞及び組織の取り扱いは危険であるので、ヒト抗癌剤の発見を目的とするアッセイで使用するために理想的な酵素であるヒトＦＰＴａｓｅは未だ使用されていない。発明の要約本発明は、改変された哺乳動物ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）、特にヒトファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼを発現することが可能な形質転換細菌細胞系を提供する。本発明は更に、改変された哺乳動物ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼを発現させ、抗体カラムで改変ＦＰＴａｓｅを精製することからなる、実験的に有用な量の哺乳動物ＦＰＴａｓｅの製造及び精製方法を提供する。本発明は更に、評価すべき薬剤を実質的に純粋な哺乳動物ＦＰＴａｓｅと接触させることからなる、薬剤のＦＰＴａｓｅ阻害活性の決定に有用なアッセイを提供する。図面の簡単な説明図１（Ａ〜Ｃ）：ウシ脳ＦＰＴａｓｅ酵素のβサブユニットをコードするウシｃＤＮＡのＤＮＡ配列。ＤＮＡ配列のナンバリングはＤＮＡ配列の各行の左側に示す。アミノ酸配列のナンバリングはアミノ酸配列の各行の右側に示す。図２（Ａ〜Ｃ）：ヒトＦＰＴａｓｅ酵素のαサブユニットをコードするヒトｃＤＮＡのＤＮＡ配列。ＤＮＡ配列のナンバリングはＤＮＡ配列の各行の左側に示す。アミノ酸配列のナンバリングはアミノ酸配列の各行の右側に示す。図３（Ａ〜Ｃ）：ヒトＦＰＴａｓｅ酵素のβサブユニットをコードするヒトｃＤＮＡのＤＮＡ配列。ＤＮＡ配列のナンバリングはＤＮＡ配列の各行の左側に示す。アミノ酸配列のナンバリングはアミノ酸配列の各行の右側に示す。図４：ウシＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＲＤ４２６。酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｐＩの制限部位を示す。制限部位間の距離はキロベース（ｋＢ）で示す。更に、ウシＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするプラスミドの部分は円弧により示す。図５（Ａ〜Ｅ）：ヒトＦＰＴａｓｅ酵素のα及びβサブユニットをコードするヒトｃＤＮＡを含むｐＲＤ５１６プラスミドを生成するために使用されるインサートのＤＮＡ配列。ＤＮＡ配列のナンバリングはＤＮＡ配列の各行の左側に示す。アミノ酸配列のナンバリングはアミノ酸配列の各行の右側に示す。発明の詳細な説明他方のサブユニットの翻訳に必要なリボソーム結合部位を含む一方のサブユニットのコドンにより相互に作動的に連結された、細菌細胞による哺乳動物ＦＰＴａｓｅのα及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドで細菌細胞を形質転換する。細菌細胞は翻訳可能なように組み合わされたＦＰＴａｓｅサブユニットを発現することが可能な任意の細胞であり得る。このような細胞系は大腸菌株、例えばＤＨ５、ＨＢ１０１、ＢＬ２１（ＤＥ３）等から選択され得る。哺乳動物ＦＰＴａｓｅのα及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡは、ヒトＦＰＴａｓｅ、ウシＦＰＴａｓｅ又はラットＦＰＴａｓｅ等のα及びβサブユニットのようなサブユニットから選択され得る。哺乳動物ＦＰＴａｓｅの１種（例えばヒトＦＰＴａｓｅ）のαサブユニットをコードするｃＤＮＡを、別の哺乳動物ＦＰＴａｓｅ（例えばウシＦＰＴａｓｅ）のβサブユニットをコードするｃＤＮＡと組み合わせてもよい。ｃＤＮＡの好適組み合わせは、ヒトＦＰＴａｓｅの α及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡの組み合わせである。哺乳動物ＦＰＴａｓｅのα及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡをクローニングするプラスミドベクターは、選択された細菌細胞系への形質転換に適合可能な任意のベクターであり得る。このようなベクターの非限定的な例としては、ＣｏｌＥ１（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，１９８５，Ｇｅｎｅ，３３：１０３− １１９）又はＰ１５ａ（例えばｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４等）（Ａ．Ｃ．Ｙ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ及びＳ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，１９７８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１３４：１１４１−１１５６）の誘導体が挙げられる。哺乳動物ＦＰＴａｓｅのα及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡをプラスミドに作動的に連結するためには、プロモーター配列が必要である。このようなプロモーターの非限定的な例としては、ｔａｃプロモーター（Ｅ．Ａｍｍｏｎら，１９８３，Ｇｅｎｅ，２５：１６７−１７８）、ｌａｃプロモーター（Ｕ．Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら，１９８０，Ｃｅｌｌ，２０：２６９−２８１）及びｔｒｐプロモーター（Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔら，１９７８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２１：１１３−１３７）が挙げられる。このようなプロモーターは大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡをｍＲＮＡに転写する。本発明の１態様によると、プロモーターはプラスミドｐＢＴａｃ１（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ１ｓの市販品）に存在するｔａｃプロモーターである。本発明を実施するのに有用な他のプロモーター／ＲＮＡポリメラーゼ系としては、ＤＮＡバクテリオファージプロモーターと同種ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。このような系の例としては、バクテリオファージＴ７プロモーターとＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＢ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔ，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９：１１３−１３０）。バクテリオファージＴ７プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼはｔａｃプロモーターよりもタンパク質発現レベルが高いと予想される。転写されたｃＤＮＡ配列の翻訳を確実にするためには、リボソーム結合部位をＦＰＴａｓｅ α及びβサブユニツトコーディング配列に作動的に連結しなければならない。βサブユニットのリボソーム結合部位の１例はＧＧＡＧＧであり、 αサブユニットのリボソーム結合部位は、βサブユニットコーディング配列のＣ末端に位置し得るＧｌｕ−Ｇｌｕ−ＰｈｅエピトープタッグでコードされるＧＧＡＧである。形質転換された細胞系を成長及び回収し、細胞により発現される哺乳動物ＦＰＴａｓｅを単離及び精製する。哺乳動物ＦＰＴａｓｅの単離及び精製は当業者に周知の任意の方法により実施することができる。好ましくは、発現時にＦＰＴａｓｅにエピトープタッグを組み込み、タッギングアミノ酸配列に結合する抗体を含むカラムに細胞溶解物を通す。最適にはＦＰＴａｓｅをＣ末端ＥＥＦエピトープでタッグし、モノクローナル抗体ＹＬ１／２（Ｊ．Ｖ．Ｋｉｌｍａｒｔｉｎら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，９３：５７６ −５８２（１９８２）に記載）を含むカラムを使用する。組み換えにより発現された哺乳動物ＦＰＴａｓｅを精製し、ｒａｓのＦＰＴａｓｅ媒介ファルネシル化に対する種々の医薬化合物の阻害活性を決定するために使用する。活性を決定しようとする医薬化合物の存在下に適切なインキュベーション媒体（例えば５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ₂及び１〜２ｍＭジチオトレイトールの混合物等）中で、ｒａｓタンパク質を標識ファルネシル二リン酸（例えば［³Ｈ］ファルネシル二リン酸等）に触れさせる。次いで、精製した哺乳動物ＦＰＴａｓｅをアッセイ混合物に加え、アッセイ混合物を一定時間（例えば１０〜３０分間）３０℃でインキュベートする。次にアッセイ混合物の反応を停止し、ｒａｓタンパク質を当業者に公知の方法（例えばＭ．Ｄ．Ｓｃｈａｂｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１４７０１−１４７０４及びＳ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅｓら（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１４６０３−１４６１０）により遊離ＦＰＰから単離する。単離したｒａｓタンパク質を次にシンチレーション計数法により分析し、ファルネシル化したｒａｓタンパク質の量の相対値を得る。この値を薬剤の不在下でファルネシル化したｒａｓの量の相対値及び他の薬剤の存在下でファルネシル化したｒａｓの量の相対値と比較する。以下、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。全温度は摂氏である。実施例１ウシＦＰＴａｓｅのαサブユニットをコードするｃＤＮＡからの標識化プローブＫｏｈｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１８８８４−１８８８８（１９９１）により記載されているウシＦＰＴａｓｅのαサブユニットのオープンリーディングフレームにまたがる約１０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むプローブを使用した。このフラグメントはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製し、その末端に下記構造を有する（５’末端：配列番号１）。実施例２ウシＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするｃＤＮＡ優先コドン（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３，１−１２）を使用するようにして、ラット脳ＦＰＴａｓｅのβサブユニットからのぺプチドＩＱＡＴＴＨＦＬＱＫＰＶＰＧＦＥＥ（配列番号４）のコドンを使用し、２種のオーバーラップする相補的オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号２）及び５’−ＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号３）を調製した（Ｒｅｉｓｓ，Ｙ．，Ｓｅａｂｒａ，Ｍ．Ｃ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．及びＢｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１０６７２−１０６７７（１９９１））。これらの２種のオリゴヌクレオチドをアニールし、プローブとして使用するためにＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント及び全４種の［³²Ｐ］標識デオキシヌクレオチド三リン酸を充填した。次に二本鎖フラグメントを加熱し、鎖を分離した。プラークハイブリダイゼーション法を使用してこのプローブを利用し、λｇｔ１０においてウシ脳オリゴ（ｄＴ）でプライムしたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ウシ脳ｃＤＮＡライブラリーのプラークリフトからのフィルターを５×ＳＳＣ、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液は２０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２０ｇ／ｍｌポリビニルピロリドン、２０ｍｇ／ｍｌＦｉｃｏｌｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で５０℃で一晩プレハイブリダイズ及びハイブリダイズした。フィルターを５０℃の５×ＳＳＣで洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。陽性プラークを選択し、成長させ、ＤＮＡを制限及び配列分析により分析した。実施例３ウシＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするｃＤＮＡからの標識プローブ実施例２に記載したように得たウシβサブユニットｃＤＮＡをコードするｐＲＤ４２６からの約１６６０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＳｓｐＩＤＮＡフラグメントを含むプローブを制限消化により調製した。制限部位を図４に示す。ｃＤＮＡの開始部位の上流にあるＥｃｏＲＩ部位はｃＤＮＡクローニングで使用したリンカーに由来し、ＳｓｐＩ部位はβサブユニットコーディング配列の終止コドンから約３００ｂｐ下流のｃＤＮＡの非翻訳領域にある。フラグメントは下記構造を有する。実施例４ヒトＦＰＴａｓｅのαサブユニットをコードするｃＤＮＡ上記実施例１に記載したウシＦＰＴａｓｅｃＤＮＡからの標識ＤＮＡフラグメントを使用して、λｇｔｌｌ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）におけるヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをプローブした。温度を６５℃とした以外は実施例２に記載した条件で、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーのプラークリフトからのフィルターをプレハイブリダイズ及びハイブリダイズした。次いでフィルターを６５℃で実施例２に記載したように洗浄した。スクリーンからの陽性クローンを下記実施例７に記載するように使用した。実施例５ヒトＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするｃＤＮＡ上記実施例３に記載したウシＦＰＴａｓｅｃＤＮＡからの標識ＤＮＡフラグメントを使用して、λｇｔｌｌ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）におけるヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをプローブした。温度を６５℃とした以外は実施例２に記載した条件で、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーのプラークリフトからのフィルターをプレハイブリダイズ及びハイブリダイズした。次にフィルターを６５℃で実施例２に記載したように洗浄した。スクリーンからの陽性クローンを下記実施例７に記載するように使用した。実施例６ｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定プラスミドＤＮＡを鋳型として使用して製造業者の指示に従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ IIジデオキシ配列決定キット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１Ｃｏｒｐ．）を使用して実施例２、４及び５に記載されているように得たｃＤＮＡを配列決定した。ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐソフトウェアパッケージ及び多重配列アラインメントプログラムＣＬＵＳＴＡＬ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，３８７−３９５並びにＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．及びＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３，２３７−２４４）を使用してＤＮＡ及びタンパク質配列分析を実施した。Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ並びにＳａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｓ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．及びＥｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１に記載されているようにＤＮＡサブクローニング、ＰＣＲ及び他のＤＮＡ操作を実施した。ＦＰＴａｓｅｃＤＮＡのＤＮＡ配列をＧｅｎＧａｎｋに寄託し、受託番号Ｌ００６３３（ウシβサブユニット）（ｃＤＮＡ：配列番号５；アミノ酸：配列番号６）、Ｌ００６３４（ヒトαサブユニット）（ｃＤＮＡ：配列番号７；アミノ酸：配列番号８）及びＬ００６３５（ヒトβサブユニット）（ｃＤＮＡ：配列番号９；アミノ酸：配列番号１０）を付された。図１〜３は夫々の配列を示す。実施例７大腸菌におけるｈＦＰＴａｓｅの発現のためのプラスミドの構築 αサブユニットコーディング配列の直ぐ上流及び下流にＥｃｏＲＩ部位が位置するようにヒトＦＰＴａｓｅのαサブユニットのコーディング領域をＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら）により改変し、ｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＲＤ４５２を生成した。ｐＲＤ４５２のインサートの配列は下記の通りである。プラスミドのポリリンカー領域に唯一の切断部を有するＳａｃＩでｐＲＤ４５２を切断し、両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰで平滑化した後、再環状化した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで部分消化し、末端に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント及びｄＮＴＰを充填し、再環状化した。ヒトＦＰＴａｓｅのαサブユニットのコーディング配列の下流のＥｃｏＲＩ部位を充填したこのステップからのプラスミドを同定し、ｐＲＤ４９４と命名した。ｐＲＤ４９４におけるインサートの配列は下記の通りである（３’末端：配列番号１１）。このプラスミドにおけるＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は完全に失われた。αサブユニットコーディング配列の５’末端の約７０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｎIIフラグメントをコードし、各コドンの第３の位置に主にＡ又はＴを含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｎIIで予め切断したｐＲＤ４９４に挿入し、ｐＲＤ４９３を生成した。ｐＲＤ４９３におけるαサブユニットコーディング配列及び両側の制限部位の配列は下記の通りである（５’末端：配列番号１２；３’末端：配列番号１１）。ＰＣＲを使用してｐＲＤ４９３におけるαサブユニットの開始コドンの上流の配列を改変し、開始コドンの直ぐ上流にＳｃａＩ部位を加えた。ｐＲＤ５１５におけるαサブユニットコーディング配列及び両側の制限部位の配列は下記の通りである（５’末端：配列番号１３；３’末端：配列番号１１）。コーディング配列の直ぐ上流にＥｃｏＲＩ部位が位置するように、ＰＣＲを使用してｈＦＰＴａｓｅのβサブユニットをコードするｃＤＮＡの５’末端を改変した。βサブユニットの最後のコドン（アミノ酸４３７）の後にグルタミン酸− グルタミン酸−フェニルアラニン−ストップのコドンが位置するように、ＰＣＲを使用してβサブユニットのｃＤＮＡの３’末端を改変した。更に、ストップコドンにまたがるＰａｃＩ部位を配置し、ＰａｃＩ制限部位の下流にＥｃｏＲＩ部位を配置した。このＥｃｏＲＩフラグメントをｐＢＫＣＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＲＤ４６３を生成した。ｐＲＤ４６３におけるインサート及び付加配列は以下の通りである（５’末端：配列番号１４；３’末端：配列番号１５）。開始コドンの直ぐ隣りにＥｃｏＲＩ部位が位置するように、ｈＦＰＴａｓｅの βサブユニットをコードするｃＤＮＡの５’末端をＰＣＲにより改変し、βサブユニットのアミノ酸１〜２４２のコドンを含む０．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントをＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩで切断したｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＲＤ４６４を生成した。ｐＲＤ４６４のインサートの両端は以下の通りである。 βサブユニット遺伝子の５’末端を含むｐＲＤ４６４の０．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント及びβサブユニット遺伝子の３’末端を含むｐＲＤ４６３からの０．６ｋｂＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで予め切断した発現ベクターｐＢＴａｃ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にクローニングし、ｐＲＤ４６６を生成した。ｐＲＤ４６６におけるインサートの両端は以下の通りである（３’末端：配列番号１６）。プラスミドｐＲＤ４６６をＥｃｏＲＩで部分的に切断し、両端に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント及びｄＮＴＰを充填し、両端を再連結し、大腸菌に形質転換した。βサブユニット終止コドンの後のＥｃｏＲＩ部位が充填され且つβサブユニットコーディング配列の上流のＥｃｏＲＩ部位が無傷であることにより、この形質転換を受けたプラスミドを同定した。このプラスミドｐＲＤ４７８のインサートは以下の配列を有する（３’末端：配列番号１７）。ＰＣＲを使用してβサブユニットコーディング配列の５’末端を改変し、ＥｃｏＲＩ部位とβサブユニットコーディング配列の間にリボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．及びＤａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７１，１３４２−１３４６）を配置した。ｐＲＤ４７８におけるＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの代わりにこのＰＣＲからの０．３ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを使用してｐＲＤ４８６を生成した。ｐＲＤ４８６におけるインサートは下記配列を有する（５’末端：配列番号１８；３’末端：配列番号１７）。プラスミドｐＲＤ４８６をＰａｃＩで切断し、両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。ｈＦＰＴａｓｅのαサブユニットのコーディング配列を含むｐＲＤ５１５からの１．１ｋｂＳｃａＩ−ＨｉｎｃIIフラグメントにこのＤＮＡを連結した。得られたプラスミドｐＲＤ５１６において、プラスミド上のｔａｃプロモーターにより誘発される単一ｍＲＮＡ上にヒトＦＰＴａｓｅのα及びβサブユニットのコーディング配列を転写した。αサブユニットのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）はβサブユニットコーディング配列に加えられたＧｌｕ−Ｇｌｕ− Ｐｈｅコーディング配列の中にある配列ＧＧＡＧ（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．及びＤａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，前出）であるので、αサブユニットの翻訳はβサブユニットの翻訳に結び付けられる（Ｓｃｈｏｎｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｂｅｌａｇａｊｅ，Ｒ．Ｍ．及びＳｃｏｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．（１９９０）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚ．１８５，９４−１０３）。ｐＲＤ５１６におけるヒトＦＰＴａｓｅのα及びβサブユニットのコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントの配列を図５に示す（ｃＤＮＡ：配列番号１９；アミノ酸：配列番号２０）。実施例８ヒトＦＰＴａｓｅの発現及び精製ヒトＦＰＴａｓｅを発現させるために、プラスミドｐＲＤ５１６を大腸菌ＤＨ５ａに形質転換させ、培養物が後期対数増殖期から初期定常増殖期となるまで３７℃でＬＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中で成長させた（ＡＴＣＣ−６９０９１）。下記のように細胞を回収し、ＦＰＴａｓｅを精製した。５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアンチパイン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン（約５ｇ細胞／１０ｍｌ溶液）に細胞ペレットを再懸濁することにより、ヒトＦＰＴａｓｅを大腸菌培養物から単離した。再懸濁した細胞を音波処理により破壊し、細胞破片を３０，０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離によりペレット状にした。可溶性フラクションを等容の０．１５ＭＮａＣｌ，６ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で希釈し、臭化シアノゲン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｔａｍｍｅｒｓら）に結合したモノクローナル抗体ＹＬ１／２（４ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂）の２ｍｌカラムに約０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で加えた。タンパク質をカラムに加えた後、２ｍＭＤＴＴ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアンチパイン、１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有する１／２×ＰＢＳ１０〜２０ｍｌでカラムを洗浄した。次いで２ｍＭＤＴＴを含有する１／２×ＰＢＳ１００〜２００ｍｌでカラムを洗浄した。ＦＰＴａｓｅを５ｍＭＡｓｐ−Ｐｈｅジペプチド（Ｓｉｇｍａ）、１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．５）、２ｍＭＤＴＴ３×３ｍｌで溶離した。カラムは、ＰＢＳ＋２ＭＮａＣｌで洗浄した後、ＰＢＳ＋０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＮ₃中で保存すれば再生できる。合計出発可溶性大腸菌タンパク質に基づいて０．１〜１．０％の収率で純度＞２０％のＦＰＴａｓｅを得た。場合により、ＦＰＴａｓｅを更に精製した。これは薬剤スクリーニングには不要である。ＦＰＴａｓｅを更に精製するためには、抗体カラムから溶離したタンパク質を、緩衝液Ａ（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣ１₂、５ｍＭＤＴＴ）及び緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１ＭＮａＣｌ）でＭｏｎｏＱＨＲ１０−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかけた。１０分間０→２０％Ｂ、３０分間２０→４０％Ｂ、２０分間４０→１００％Ｂの勾配でカラムから１ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた。ＦＰＴａｓｅは約３０〜３５％Ｂで溶出した。実施例９阻害剤の不在下の精製ＦＰＴａｓｅ活性のアッセイ実施例８に記載した精製ヒトＦＰＴａｓｅの活性を３０℃で生合成的に順方向にアッセイした。基質量を調節して完了度＞１０％に反応を進行させないようにした。計算のために、トランスフェラーゼの分子量を９３ｋＤと仮定し、ｒａｓ −ＣＶＬＳのそれを２１ｋＤと仮定した（Ｄ．Ｌ．Ｐｏｍｐｌｉａｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１，３８００−３８０７（１９９２）及びＳ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅｓら（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１４６０３−１４６１０））。典型的な反応混合物は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＺｎＣｌ₂、０．１％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（平均分子量２００００）、［³Ｈ］−ファルネシル二リン酸（１〜３０００ｎＭ）及び基質としてのｒａｓ−ＣＶＬＳタンパク質（２０〜１００００ｎＭ）を含有するものとした。酵素の不在下でアッセイ混合物を熱処理により予備平衡化後、トランスフェラーゼを加えることにより反応を開始した。アリコート（５０〜５００ｍＬ）を一定の時間間隔で取り出し、エタノール中１０％ＨＣｌ（１〜２ｍＬ）で希釈した。反応停止したアリコートを室温で１５分間放置（未反応ファルネシル二リン酸を加水分解）した。１００％エタノール（２ｍＬ）を加えた後、Ｂｒａｎｄｅｌ集菌装置を使用してアリコート処理物をＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃフィルターで真空濾過した。フィルターを１００％エタノール２ｍＬで４回洗浄し、シンチレーション液（１０ｍＬ）と混合した後、ＢｅｃｋｍａｎＬＳ３８０１シンチレーションカウンターで計数した。実施例８に記載したようにして得た精製ヒトＦＰＴａｓｅと、Ｓ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４６０３（１９９１）に記載されているようにして得たウシ脳ＦＰＴａｓｅに関する動力学的データを得、これを表１に示す。実施例１０化合物のＦＰＴａｓｅ阻害活性アッセイ［³Ｈ］ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒから購入した。一般に、阻害活性アッセイは３０℃で実施した。典型的なアッセイ反応混合物は（最終容量５０μＬ中に）［³ Ｈ］ファルネシル二リン酸、ｒａｓタンパク質（３．５μＭ）、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオトレイトール及びアッセイすべき化合物を含有するものとした。アッセイ混合物を熱処理により予備平衡化後、精製哺乳動物ＦＰＴａｓｅを加えることにより反応を開始し、一定の時間間隔でエタノール中１ｍＭＨＣｌ（１ｍＬ）を加えることにより反応を停止した。反応停止した混合物を１５分間放置した。１００％エタノール２ｍＬを加えた後、混合物をＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃフィルターで真空濾過した。フィルターを１００％エタノールの２ｍＬアリコートで４回洗浄し、シンチレーション液（１０ｍＬ）と混合した後、ＢｅｃｋｍａｎｎＬＳ３８０１シンチレーションカウンターで計数した。一回精製のヒトＦＰＴａｓｅを使用するアッセイとウシ脳ＦＰＴａｓｅを使用するアッセイにおける公知化合物の阻害活性値を下表２で比較する。 *=代用基質 CVIM=システイニル-バリニル-イソロイシニル-メチオニン CIFM=システイニル-イソロイシニル-フェニルアラニル-メチオニン CVIL=システイニル-バリニル-イソロイシニル-ロイシン GGPP=ゲラニル-ゲラニル-二リン酸化合物A=（Ｒ，Ｓ）-［１-ヒドロキシ-（Ｅ，Ｅ）-３，７，１１-トリメチル-2 ，6，10-ドデカトリエニル］ホスホン酸（Pompliano，D．L．ら，Biochem．31， 3800-3807（1992））。配列表配列番号：１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：２配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：３配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：４配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント配列配列番号：５配列の長さ：１３１４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：６配列の長さ：４３７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル：ＮＯフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列配列番号：７配列の長さ：１１４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：８配列の長さ：３７９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル：ＮＯフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列配列番号：９配列の長さ：１３１４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１０配列の長さ：４３７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル：ＮＯフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列配列番号：１１配列の長さ：１３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１２配列の長さ：４８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１３配列の長さ：５４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列番号：１４配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１５配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１６配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１７配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１８配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖卜ポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：１９配列の長さ：２５４６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ配列配列番号：２０配列の長さ：８１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル：ＮＯフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列配列番号：２１配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯフラグメント型：中間フラグメント配列配列番号：２２配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯフラグメント型：中間フラグメント配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月１７日【補正内容】請求の範囲１．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素のαサブユニット及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡを作動的に含むプラスミド。２．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素のαサブユニット及びβサブユニットの間にあるグルタミン酸−グルタミン酸−フェニルアラニンエピトープをコードするｃＤＮＡを更に作動的に含む、哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素のαサブユニット及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡを作動的に含むプラスミド。３．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼがヒトファルネシルタンパク質トランスフェラーゼである請求項２に記載のプラスミド。４．ｃＤＮＡがベクターｐＲＤ５１６に含まれる請求項３に記載のプラスミド。５．請求項１に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。６．細菌が大腸菌である請求項５に記載の細菌。７．請求項２に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。８．請求項３に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。９．細菌が大腸菌でありＡＴＣＣ−６９０９１と命名されたものである、請求項４に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。１０．請求項７に記載の細菌により発現される哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１１．純度＞２０％を有する、請求項７に記載の細胞により発現される哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１２．純度＞２０％を有する、請求項８に記載の細胞により発現される哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１３．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素に対する医薬化合物の阻害活性の評価方法であって、前記医薬化合物の存在下で請求項１０に記載の哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素により媒介されるタンパク質基質のファルネシル化を測定することからなる方法。１４．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素がヒトファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素である、請求項１２に記載の哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素に対する医薬化合物の阻害活性の評価方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/48 Ｚ 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者デイール，ロナルド・イーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・18932、ライン・レクシントン、メイプル・アベニユー・24 (72)発明者ギブズ，ジヤクソン・ビーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・18914、チヤルフオント、バーベリー・コート・ 117 (72)発明者コール，ナンシー・イーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19118、ウインドムーア、ステントン・アベニユー・8055

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素のαサブユニット及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡを作動的に含むプラスミド。２．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素のαサブユニット及びβサブユニットの間にあるグルタミン酸−グルタミン酸−フェニルアラニンエピトープをコードするｃＤＮＡを更に作動的に含む、請求項１に記載のプラスミド。３．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼがヒトファルネシルタンパク質トランスフェラーゼである請求項１に記載のプラスミド。４．ｃＤＮＡがベクターｐＲＤ５１６に含まれる請求項３に記載のプラスミド。５．請求項１に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。６．細菌が大腸菌である請求項５に記載の細菌。７．請求項２に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。８．請求項３に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。９．細菌が大腸菌でありＡＴＣＣ−６９０９１と命名されたものである、請求項４に記載のプラスミドでトランスフェクトした細菌。１０．請求項５に記載の細菌により発現される哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１１．純度＞２０％を有する、請求項１０に記載の哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１２．純度＞２０％を有する、請求項７に記載の細胞により発現される哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１３．純度＞２０％を有する、請求項８に記載の細胞により発現される哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素。１４．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素に対する医薬化合物の阻害活性の評価方法であって、前記医薬化合物の存在下で請求項１０に記載の哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素により媒介されるタンパク質基質のファルネシル化を測定することからなる方法。１５．哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素がヒトファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素である、請求項１３に記載の哺乳動物ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ酵素に対する医薬化合物の阻害活性の評価方法。