JPH08502917A - 組織等価物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組織等価物の製造方法が述べられている。マンドレル（Ｈ）上にポリエステル管が通され、ＡおよびＤのいずれかの一端にクリッップで固定されている。ブロック（Ｆ）はその位置にネジで固定される。ポリエステルは、コック（２）を通して酸性コラーゲン溶液を約１時間注入することにより予め含浸される。所定時間の経過後、余剰の溶液は吸引除去される。この段階に続いて、２番目のアルカリ溶液が平滑筋（ＳＭＣ）を含む装置内に注入される。こうして、管の繊維内の含浸コラーゲンが中和され、繊維隙間に自然的な繊維発生が行われ、離層の危険性が除かれる。ついで、装置は低温放置される。コラーゲンは繊維管上に収縮し、細胞−含浸収縮ゲルは予め含浸されたコラーゲンと合体する。予め含浸されたコラーゲンと水性混合物中に供給されたコラーゲンは、ＳＭＣと一体になって収縮する。組織等価物は内皮細胞でラインニングされ、装置は再び低温放置され静水圧または動水圧の増加する内腔圧が供給される。これは、血管を移植下の圧力に調整できるものと思われる。これがＥＣ区間の基質膜を組織化する。

Description

【発明の詳細な説明】 組織等価物 緒論 本発明は、組織等価物の形成およびその製造方法に関する。以下、血管移植体 の製造について述べるが、本発明は、例えば心臓弁のような組織等価物にも適用 できることを理解すべきである。本発明は、例えば自源性（autologus）であろ うがなかろうが、活性細胞のライニングに好適で移植可能ないし復元的な材料に も用いられる。 発明の背景 移植が必要な臨床例は多数ある。血管移植体は、外傷の際の血管損傷部分を交 換する場合、または、例えば冠状動脈バイパス用のように閉塞血管を迂回させる 場合に望ましい。血管移植に利用できる２つの主な方法は、体内のどこのもので あろうと自己血管を使用すること、または生物的または合成補綴物を使用するこ とである。両方法にも欠点がある。前者は外科的に時間がかかり利用に限界があ り、後者は、外科的には便利だが、実行上不便が多い。 冠状動脈バイパス移植は、最も効果的な冠状動脈疾患の長期治療法となってい る。バイパス技術の導入以 来、多くの異なるタイプの血管移植体が評価されてきた。血管用導管の最も明白 なソースは、体内のどこからでもよいが取去りまたは移された自己の静脈または 動脈の血管である。伏在静脈及び内部乳腺動脈血管が使用されてきた。伏在静脈 血管は、初期血栓閉塞と後期疾患に侵され、そのため１０年間で５０％以上が閉 塞した。自己材料を使用する場合の主な欠点は、閉塞が生じた時、しばしば再手 術用の十分な自己導管が残されていないことである。これは、特に複数のバイパ ス手術が必要な時に当てはまる。その代わり、例えば静脈瘤により、伏在静脈は 利用できなくなる。織られたダクロン（Dacron，登録商標）、ゴアテックス（Go re−Tex，登録商標）および拡張された微小孔構造ポリテトラフルオロエチレン のような多様な材料で作られた人工補綴物は程度の差こそあれすべて血栓の形成 により損害を受ける。したがって、非自己性移植体に注目が移っている。 死後提供者からの同種移植体静脈及び動脈はさまざまな成功例とともに使用さ れてきた。しかしながら、これに依存することは、需要を満たせない点で問題が ある。この問題を克服するため、ヒトの膀の静脈と動脈血管が考えられてきた。 不幸なことに、これらは貧弱な機械的強度と急激な閉塞を起こすことが明らかに なった。 グルタルアルデヒドに保存された動物の弁を、弁交換手術において使用した成 功例に続き、多くのグループが血管の交換の有望な材料として、異種移植体に注 目した。この異種移植体は、免疫遺伝性を減少させ、再吸収を減少させるように 化学的に修正を加える必要がある。グルタルアルデヒドは使用される最も一般的 な架橋結合剤であった。しかしながら、その副作用は、内皮の再移植（recoloni sation）及びひきつりや伸縮性および弾力性の欠如の原因となる、頻発する硬直 を抑制できるかもしれない細胞毒を含んでいる。あまり厳しくない架橋結合養生 が使用された時、アルデヒド蒸気を使用することにより変質に対する一時的な抵 抗が見られただけだった。これは、動脈瘤の形成の危険性の増加に通じるように 思える。 米国特許第４５４６５００号は、コラーゲン繊維（fibrils）栄養媒体および 平滑筋細胞または繊維芽細胞の水性混合物から収縮した一連のゲル層から血管等 価物を製造することを開示している。さらに、２つのラミネート層の間にダクロ ン（Dacron，登録商標）製メッシュを含むことも提案された。コラーゲン第２層 の追加は、多層ラミネート構造となり、そこではダクロンだけが機械的強さを示 した。コラーゲンの数層およびダクロンから作られたこれらの血管等価物は、層 離の問題に悩まされることが指摘されている。コラー ゲン層の生体結合剤としてフィブリンが採用されてきた。本発明の目的は、この 層離の問題を解決することにある。 さらに、本発明の目的は、組織等価物の体内で受ける圧力条件を改良すること である。 発明の概要 本発明の第一の態様では、組織等価物の製造方法が提供される。この方法は、 繊維基質（fibrous substrate）にコラーゲン繊維を含浸させ、含浸した基質に コラーゲン繊維、栄養媒体および細胞収縮剤の水性混合物を添加し、水性混合物 からゲルが形成されるように系を培養して収縮させ、そこから水性媒体を抽出す ることからなる。 繊維基質に溶解コラーゲンを予め含浸させ、コラーゲンのゲルを添加すること により、層離を避けることができる。本発明の方法によれば、コラーゲンは、合 成構造内に浸潤混合し、一体の組織になることが示された。望ましい繊維基質は ダクロンである。 繊維基質は、酸性水性コラーゲン溶液に浸すことによって含浸される。この間 はコラーゲンを溶液中に保持するのが好ましい。したがって、コラーゲン繊維、 栄養媒体および細胞収縮剤のアルカリ水性混合物は、基質の酸性を中和し、コラ ーゲンを作用させるために用いられる。細胞収縮剤は一般に平滑筋からなる。 血栓症は、組織等価物を内皮細胞（ＥＣ）で被うことにより防止できる。これ ら細胞の結合と活性は、基質膜を形成するその下にあるコラーゲン・マトリクス との相互作用により高められる。 本発明の第２の態様によると、コラーゲン繊維、栄養媒体および細胞収縮剤の 水性混合物から収縮ゲルをつくり、組織等価物を内皮細胞でライニングし、内皮 細胞でライニングされた組織等価物の単・複数面に圧力下で水性流体を添加し、 組織等価物の前記面に圧力を増す間システムを培養することを条件とする組織等 価物の製造方法が提供される。 内皮細胞は、本発明の第１の態様により製造された組織等価物に適用される。 静水圧および／または動水圧の前調整によって、コラーゲン繊維の再形成が影響 を受ける。したがって、繊維の配列は、加圧流体により課せられる圧力によって 影響されるため、構造的に重要である。 内皮細胞による組織等価物のライニングは、組織等価物を細胞支持媒体中の培 養された内皮細胞にさらす方法を含む。加圧された内皮支持媒体も同様である。 図面の簡単な説明 本発明を、脈管等価物が製造装置例を示す添付の図面を参照しながら説明する 。 詳細な説明 本発明の血管移植体は、冠状動脈バイパス手術を含むさまざまな臨床例の使用 に適し、改良された特性をもつ外科材料になる。ここで述べる実施例では、血管 移植体を製造するため、ヒトの血管細胞、細胞外マトリクス高分子、およびポリ エステルのような合成ポリマーから管が作られる。この製造プロセスは、血管の 平滑筋細胞の再生能力と無水タイプＩのコラーゲン−ゲルの組織様物質への再組 織化を利用する。この「リビング組織」を合成管構造と結合させることによって 、内腔が機能的内皮でライニングされ、生存可能な血管移植体が作られる。移植 体が成功するためには、それが理想的には非免疫源性、非血栓源性および生体適 合性であるべきである。その構造的完全性を維持するため、３００ｍｍＨｇオー ダーで内腔圧に耐え、漏出や動脈瘤を形成してはならない。 自己細胞を使用することにより、抗原性の問題は回避される。しかし、移植体 特有の免疫反応を引き出すことなく同種間の培養細胞を使用することもできる。 使用されるコラーゲンは、ラットの尻尾の鍵から抽出され、酸性溶液または、コ ラーゲン・パウダーとして市販されている。このコラーゲン溶液は、血清、培養 媒体および平滑筋細胞（ＳＭＣ）と共に、キャスティング溶液を作る。これらの 成分は、免疫源になることはない。キャスティング溶液の中和は、コラーゲンの 繊維化とゲル形成を誘発する。コラーゲンは、後に再組織化され、ＳＭＣの作用 により厚い繊維に構成される。 生体適合性は、提案される移植体の合成要素に関係がある。医療水準の材料で あれば問題はない。合成物のバイオ的構成要素、即ちコラーゲン／ＳＭＣマトリ クスは、変質し易い。実験によると、コラーゲン・マトリクスは、培養プロセス の時のようにコラゲナーゼ消化に対する耐性が増大する。これは、細胞依存の再 組織化プロセスにおけるコラーゲンの架橋結合を示している。さらに化学剤の使 用によって架橋結合が行われる。 本発明に利用される細胞は、自己細胞あるいは標準の細胞培養技術を用いて培 養される。ゲルーマトリクス用の標準溶液への添加物は、さまざまなプロテオグ リカン、例えばクロンドロイチン−６−サルフェイト（chrondoroitin 6 sulpha te）、および／またはヒアルロン酸を含んでいる。確立した殺菌技術はすべて採 用すべきである。 合成移植体の物理的な強さは、２つの要素、つまり合成支持体とコラーゲン− マトリクスから得られる。本発明の方法によれば、小さな口径の血管移植体、ま たは機能的内皮を備えた非常に大きな移植体を作ることができる。この移植体の 構造は、生きた構成要素（ コラーゲン／ＳＭＣ／ＥＣ）および生命のない合成要素からなっている。この移 植体は、真の合成物であり、両構成要素とも物理的強さをもっている。この方法 は、公知の方法と異なり、コラーゲンの再組織化が完成した後にダクロンスリー ブ管がコラーゲンの一番目の層に加えられる。 血栓症の予防物質を実際に生成する血管の内側表面に生きた内皮細胞が存在す ることは移植体の大きな利点である。コラーゲン／ＳＭＣマトリクスは血管壁の 副内皮層の擬態であり、血管壁に内皮細胞を固定する構造を提供する。そのよう な合成物により、機能的基質膜の形成が可能になる。基質膜は損傷の後でライニ ングの再形成を可能にするだけでなく、また血管の開放性（patency）を減じる 平滑筋細胞の過形成から保護する点で重要である。 実施例 以下の記述は管状血管等価物の作成方法に関する。図１の装置は現在採用され ているが、これから出発しなくとも、当業者であればこれにに多くのバリエイシ ョンを与えることができる。この実施例では、層離しない移植体を製造する。 この装置の寸法は、必要な移植体の直径および長さにより異なる。この装置は 不透明にならずに殺菌できる材料で作るべきである。本装置はその端部が現在は デルリン（Delrin，登録商標）製のブロックＥおよびＦで密封されたパースペッ クス（Perspex，登録商標）製の室Ｇからなっている。中央のマンドレルＨは、 非毒性、非変質性材料からなり−非常に細い非吸収性縫合が使用されるが、それ はゲルに付着してはならない。それは移植体を一時的に支持するものである。３ 方コック１、２、３および４は医療水準のものである。 装置の殺菌が終わると、ブロックＦはゆるめられ、所定直径で適当長のポリエ ステル管がマンドレルＨ上に通され、ＡおよびＤで一端が固定される。それから Ｆが所定の位置ねじで戻される。この実施例ではポリエステル材料ダクロン製（ Dacron，Vascutek Limited）を使用した。移植適性があり無菌で生体適合性の各 種材料が使用される。 ダクロンが所定の位置に設定されると、コック２から酸性コラーゲン溶液を注 入され約１時間、予備浸透されるが、この時間には限定がない。この溶液は、１ ：１０００酢酸溶液の純粋コラーゲン１ｍｇ／ｍｌを含んでおり、濃度はそれぞ れ異なる。この時間経過後、過剰の溶液は吸引される。これによって、繊維管へ の含浸が保証される。 続いて、第２の溶液が平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含む装置内に注入される。この 細胞の継代数（passage number）は、以下に述べる内皮細胞（ＥＣ）であるかも しれないから流動的である。この細胞の接種濃度もまた異なり、収縮時間は遅早 いずれも可能である。以下に述べる接種密度は、５ｍｌｓのマトリクス溶液あた り３．３×１０⁴である。 このマトリクス溶液は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagles Mediume）３ ６ｍｌｓを含んでいる。全部で、ヒトの保存血清９ｍｌｓ，０．１モルのＮａＯ Ｈ９ｍｌｓ，３．３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン２７ｍ１ｓおよび９ｍｌｓのＳＭＣ ２７ｍｌｓである。栄養媒体は、これと変わってもよいが、当業者が任意選定で きる範囲内である。 溶液は、またコック１および４を手動操作することによって、内腔（lumen） に注入される。こうして管の繊維組織内に含浸しているしているコラーゲンの中 和が起こり、組織内に一時的な繊維の発生が起こり、層離の危険が減少される。 ついで、この装置は、標準細胞培養装置を使って３７℃で低温放置される。３〜 ５日後、細胞濃度次第で、例えば、コラーゲンは組織管上に収縮し、細胞−含浸 ゲルは、予め浸されたコラーゲンと一体になる。 予め含浸されたコラーゲンと水性混合溶液中のコラーゲンはＳＭＣと一体に収 縮する。 たとえば、ＤＭＥＭなどの栄養媒体が、妊娠した子牛の血清の有無に関わりな く、ヒトの血清と共に、溶 液ドレン後、細胞およびマトリクスを維持するため、３〜５日毎に装置に加えら れる。約２１日後、温度および細胞接種密度、コラーゲン濃度が再び変化し、マ トリクスは次の内皮接種段階に十分収縮する。 さまざまな細胞ラインと継代数をもつ標準培養内皮細胞は、その後、へパリン （heparin）、ヒトおよび妊娠した子牛の血清並びに内皮細胞成長因子を含む標 準の内皮支持媒体で混合された後、管の内側に入れられる。内皮接種密度は、変 わっても良いが、この実施例では５×１０⁴／ｃｍ²が用いられる。 ついで、この装置を、ＥＣ区間の内腔面を広げるため、可変時間しかし限定し ない時間、静かに回転および攪拌させる。 ついで、装置で再度培養し、通常１週間以内にＥＣ区間に融合性の単層が得ら れた。その成長因子（growth factor）等を含んだ標準内皮支持媒体は、数日毎 に現流体と交換される。このようにして基質膜が短期間に作られる。管は、例え ば１週間位の比較的短期間培養され、内腔面に圧が静かにまたは激しくかけられ る。例えば、ぜん動運動モータは、一定圧力で閉じたループ内の支持媒体を循環 させる。このことは管が将来移植体として作用するときの圧力の予備調整になる と思われる。これにより、ＥＣ付着を促進し、平滑筋細胞の過形成を理論上防止 する基質膜の再組織化が可 能となる。 このような移植体は、標準冷凍保存技術を用いて、移植または冷凍保存される 。さらに、組織等価物の外側は生物学的膠で密封される。 本発明の２つの態様の本質は、細胞外ゲルのダクロン組織中および上へのキャ スチングおよび移植体の予備調整の２つの段階である。溶液の性質と成分は、標 準的細胞培養知識で容易に変えることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヘイネス，サラ イギリス国、リーズ エルエス14 ６ユー キュー、ヨーク ロード、キリングベック ホスピタル、シー／オー カーディアッ ク リサーチ ユニット（番地なし) (72)発明者 ブラウン，トム イギリス国、リーズ エルエス14 ６ユー キュー、ヨーク ロード、キリングベック ホスピタル、シー／オー カーディアッ ク リサーチ ユニット（番地なし) (72)発明者 カーニー，ジョン イギリス国、リーズ エルエス14 ６ユー キュー、ヨーク ロード、キリングベック ホスピタル、シー／オー カーディアッ ク リサーチ ユニット（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．繊維基質にコラーゲン繊維を含浸させ、含浸した基質にコラーゲン繊維、 栄養媒体および細胞収縮剤の水性混合物を添加し、水性混合物からゲルが形成さ れるように系を培養して収縮させ、そこから水性媒体を抽出することを特徴とす る組織等価物の形成方法。 ２．繊維基質を酸性コラーゲン水溶液に浸漬することを特徴とする請求項１の 方法。 ３．コラーゲン繊維、栄養媒体および細胞収縮剤の水性混合物がアルカリ性で あることを特徴とする請求項２の方法。 ４．細胞収縮剤が平滑筋からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの 項に記載の方法。 ５．組織等価物が内皮細胞でライニングされている請求項１〜４のいずれかの 項に記載の方法。 ６．コラーゲン繊維、栄養媒体および細胞収縮剤の水性混合液から収縮ゲルを つくり、組織等価物を内皮細胞でライニングし、内皮細胞でライニングされた組 織等価物の面に圧力下で水性流体を添加し、組織等価物の前記面に圧力が増す間 システムを培養することを特徴とする組織等価物の製造方法． ７．収縮された組織等価物が、圧力下の流体を組織 等価物の単・複数面に供給しながら内皮細胞でライニングされ、圧力が増加する 間に系の培養によって組織等価物が前調整されることを特徴とする請求項５に記 載の方法。 ８．組織等価物の内皮細胞によるライニングが、細胞支持媒体中の培養された 内皮細胞に組織等価物をさらすことからなることを特徴とする請求項５〜７のい ずれかに記載の方法。 ９．圧力が静水圧であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の方 法。 １０．液流が圧力下に組織等価物の面を横切ることを特徴とする請求項６または ７の方法。 １１．液が内皮支持媒体であることを特徴とする請求項６または７、または請求 項９または１０の方法。