JPH08503128A - 転写因子ｄｐ−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、配列番号１または配列番号１の相補体と選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドの連続配列を含む、実質的に単離された形態のポリヌクレオチド、ならびに（ａ）配列番号２のタンパク質；または（ｂ）その対立遺伝子変異体または種相同体（species homologue）；または（ｃ）少なくとも７０％（ａ）に相同なタンパク質；または（ｄ）Ｅ２Ｆ−１タンパク質またはその関連ファミリーのメンバーと複合体を形成することが可能な（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片；または（ｅ）少なくとも１５個のアミノ酸からなる（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片を含む、実質的に単離された形態のポリペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 転写因子ＤＰ−１ 本発明は、新規な転写因子、その産生ならびに使用に関する。 細胞周期中に起こる分子的現象（event）は、遺伝子発現が細胞周期の進行と 同時に起こりうるように、転写装置に調和させる必要がある。最近、ＤＲＴＦ１ またはＥ２Ｆと呼ばれる転写因子が同定され、この因子は癌抑制遺伝子すなわち 腫瘍サプレッサー遺伝子である網膜芽腫感受性遺伝子のタンパク質産物ｐＲｂに 結合することが示された（例えば、WagnerおよびGreen，Nature 352，189-190， 1991参照）。細胞性転写因子ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは、細胞周期制御において鍵と なる構成要素（key component）として機能すると広く信じられている。なぜな ら、この転写因子は重要な細胞周期調節タンパク質、例えば、網膜芽腫遺伝子産 物（ｐＲｂ）、ｐ１０７、サイクリン、およびサイクリン依存性キナーゼ等と結 合するからであり、さらにまた、その転写活性がある種のウイルス性癌タンパク 質、例えば、アデノウイルスＥｌａ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、およびヒトパピロー マウイルスＥ７タンパク質等によって変調されるからである。 転写因子ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは、細胞周期現象を転写装置に調和させるのに重 要な役割を果たしていると考えられる。なぜなら、哺乳動物細胞の細胞周期進行 中に、この転写因子は細胞増殖の重要な調節物質であることが知られている複数 の分子との一連の周期的相互作用を経るからである。例えば、Ｇ１期からＳ期へ の進行を負に調節し、そしてしばしば癌細胞中では修飾されている網 膜芽腫サプレッサー遺伝子産物（ｐＲｂ）は、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆに結合する。 同様に、ｐＲｂ関連タンパク質ｐ１０７は、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦとのＳ期複合体 として主に存在する。ｐＲｂおよびｐ１０７は両方とも、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの 転写活性を抑制する。この事は、細胞増殖を調節するのに根本的に重要であるら しい。なぜなら、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ結合部位（Ｅ２Ｆ部位）は増殖に関与する 種々の遺伝子、例えば、ｃ−ｍｙｃおよびｐ３４^cdc2等の制御領域に存在するか らである。さらに、癌細胞より単離された対立遺伝子によってコードされる変異 体Ｒｂタンパク質は、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと結合せず、よってＥ２Ｆ部位依存性 転写活性化を妨げることはできない。ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの別の重要な特徴は、 ある種のウイルス性癌タンパク質（例えば、アデノウイルスのＥ１ａ、ＳＶ４０ の大型Ｔ抗原、およびヒトパピローマウイルスのＥ７等）がｐＲｂおよびｐ１０ ７を不活性な転写因子から隔離することによってＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの活性を変 調することである。この効果は、これらウイルス性タンパク質の中に、組織培養 細胞の形質転換および増殖コントロールの克服のために必要な領域を要求する。 したがって、これらの癌タンパク質がＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆを調節する能力は、そ れらが細胞増殖コントロールの正常な作用機構を狂わす手段となっているかもし れず、また逆にｐＲｂによる転写抑制は、ｐＲｂが仲介する負の増殖コントロー ルの基礎であるかもしれない。 ｐＲｂおよびｐ１０７の持つ転写制御特性を他の細胞周期現象と調和させるた めの可能性のある作用機構が、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ複合体中のサイクリンＡおよ びｃｄｃ２関連サイクリン依存性 キナーゼｐ３３^cdk2の同定によって示唆された。サイクリンＡは、Ｓ期からの進 行に必要で、この進行はサイクリン依存性キナーゼｐ３３^cdk2をＤＲＴＦ１／Ｅ ２Ｆに補充するサイクリンＡの能力によっておそらく仲介され得るであろう機能 である。これらのデータを考え合わせると、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆはその主な役割 が細胞周期現象をｐＲｂ、ｐ１０７、サイクリンおよびｃｄｋ等の分子を介して 転写装置に中継する転写因子であり、こうして遺伝子発現が細胞周期の進行と同 時になり、それと調和することを確実にすることが示唆される。 より最近になって、Ｅ２Ｆの特性を有する転写因子がクローン化され、配列決 定された（Helinら、Cell 70（1992），337-350およびKaelinら、Cell 70（1992 ），351-364）。 今回、本発明者らは、驚くべきことに、Ｅ２Ｆと呼ばれるタンパク質が、Heli nら、およびKaelinらによってクローン化された因子と、ｃＤＮＡ配列が配列番 号２として以下に示される新規なタンパク質とから成る因子の複合体であること を見いだした。このタンパク質（Ｅ２Ｆ）をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号 １として以下に示す。上記の新規タンパク質は、発明者らによってＤＰ−１と呼 ばれる。いかなる特定の理論によっても縛られたくないが、Helinら、およびKae linらによってクローン化された因子は、ＤＰ−１と二量体化しうると考えられ る。本明細書の実施例に提示される証拠が、ＤＰ−１およびHelinらのタンパク 質（Ｅ２Ｆ−１と呼ばれる）は転写の制御に関与する複合体を形成することを示 す。 また、Ｅ２Ｆ−１は、関連転写因子成分のファミリーのメンバ ーであることが判明した。このファミリーのメンバーは、ＤＰ−１と相互作用し て、一連の上記転写因子を形成すると考えられている。図面の簡単な説明 図１は、Ｆ９ ＥＣ細胞由来のＤＰ−１タンパク質のアフィニティー精製の結 果を示す。 図２は、ＤＰ−１がＥ２Ｆ複合体におけるＤＮＡ結合ポリペプチドであること を示す。 図３は、ＤＰ−１の配列特異的ＤＮＡ結合を示す。 図４は、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との比較を示す。 図５は、ＤＰ−１がＥ２Ｆ部位依存性転写をin vivoで活性化することを示す 。実験に用いた構築物および得られた結果を要約するものである。 図６は、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１が同一のタンパク質複合体中にin vivoで 存在することを示す。 図７は、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１が１つの複合体としてＥ２Ｆ部位に結合す ることを示す。 図８は、酵母細胞におけるＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との相互作用を示す。 図９は、ショウジョウバエ細胞においてＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の間に、機能的 共同作用があることを示す。 図１０は、ＤＰ−１がＦ９ ＥＣ細胞においてＥ２Ｆ部位依存性転写に寄与し ていることを示す。 図１１は、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１が酵母細胞におけるＥ２ Ｆ部位依存性転写を活性化することを示す。 よって本発明は、配列番号１、または配列番号１の相補体（complement）と選 択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドの連続配列を含有する、実 質的に単離された形態のポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチ ドは、配列番号１のＤＮＡ、および配列番号１と選択的にハイブリダイズするこ とが可能なその断片を含む。本発明の別な態様は、配列番号２のタンパク質をコ ードするＤＮＡまたはその断片を提供する。 上記のポリヌクレオチドはＲＮＡであってもよい。また、このポリヌクレオチ ドは、その内部に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって もよい。オリゴヌクレオチドへの多数の異なるタイプの修飾が、当分野の技術で 公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、 分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が 含まれる。本発明の目的のためには、ここに記述されるオリゴヌクレオチドは、 当分野の技術で利用可能な任意の方法によって修飾されうることが理解されるは ずである。このような修飾は、治療方法に用いられる本発明のオリゴヌクレオチ ドのin vivo活性または寿命を増大させるために実施することができる。 配列番号１のＤＮＡと選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオ チドは、一般的には少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なく とも４０、６０または１００もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドからなる 領域にわたって、 少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、そしてより好まし くは少なくとも９５％、配列番号１のＤＮＡと相同性である。このようなポリヌ クレオチドを、これ以後、本発明のポリヌクレオチドと称することにする。 本発明のポリヌクレオチドは、身体の自然環境のもとではそれらと結合してい るかもしれない他のポリヌクレオチドを含まない形態で存在するならば、実質的 に単離された形態にある。このポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの意 図された目的を妨げない担体または希釈剤と混合することが可能で、この混合後 もなお実質的に単離されていると見なされることが理解されるであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、お よびプローブ〔例えば、放射性または非放射性標識を用いる従来の手段によって 顕示（revealing）標識で標識化されたプローブ〕の作成に使用することができ る。または、このポリヌクレオチドをベクター中にクローン化することも可能で ある。このようなプライマー、プローブおよび配列番号１のＤＮＡの他の断片は 、長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、 ３０、または４０ヌクレオチドであり、そしてこれらもまた本明細書で用いられ る「本発明のポリヌクレオチド」という表現に包含される。 ＤＮＡポリヌクレオチドのような本発明のポリヌクレオチドは、組換えによっ て、合成によって、または当業者にとって利用可能な任意の手段によって作成可 能である。このポリヌクレオチドは、ここに開示する技法を参考にしてクローン 化することも可能であ る。 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドおよびその相補体を含有する２本 鎖ポリヌクレオチドを提供する。 本発明の別な態様は、本発明のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたはＲＮＡポ リヌクレオチドの複製および発現のためのベクターを提供する。これらのベクタ ーは、複製起点、場合により上記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター および場合によりプロモーターの調節物質を備えた、例えばプラスミド、ウイル スまたはファージベクターでありうる。ベクターは、１つまたは複数の選択マー カー遺伝子（例えば、細菌のプラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、また は哺乳類のベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子）を含有することが出来る 。ベクターは、例えばＲＮＡの産生のために、または宿主細胞をトランスフェク トまたは形質転換するために、in vitroで使用できる。ベクターは、例えば遺伝 子治療法において、in vivoで使用するために適合させることも可能である。 本発明の別な態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のための配 列番号１のＤＮＡまたはそのオープンリーディングフレームを含むベクターによ って形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。この宿主細胞 は、上記ベクターと適合するように選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫または 哺乳動物の細胞でありうる。 本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡの産生を提供するため、ア ンチセンス方向に上記のベクター内に挿入することも可能である。アンチセンス ＲＮＡまたは他のアンチセンスポ リヌクレオチドは、合成的手段によって作成することも可能である。これらのア ンチセンスポリヌクレオチドは、細胞における配列番号２のタンパク質のレベル をコントロールする方法に使用できる。このような方法は、ＤＰ−１ ｍＲＮＡ のタンパク質への翻訳を阻止する、またはそのレベルを低下させるのに有効な量 のアンチセンスポリヌクレオチドを細胞内に導入する過程を含む。その細胞は、 癌細胞のように、制御されない状態で増殖している細胞でありうる。 本発明はさらに、哺乳動物の転写因子として機能することが可能な、配列番号 ２、その相同体、およびその配列の断片ならびにその相同体のタンパク質を提供 する。特に、本発明は以下のものを含有する実質的に単離された形態のポリペプ チドを提供する： （ａ）配列番号２のタンパク質；または （ｂ）その対立遺伝子変異体または種相同体（species homologue）； または （ｃ）（ａ）に少なくとも７０％相同なタンパク質；または （ｄ）Ｅ２Ｆ−１タンパク質またはその関連ファミリーメンバーと複合 体を形成することが可能な、（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片；または （ｅ）少なくとも１５アミノ酸からなる、（ａ）から（ｃ）のいずれか の断片。 この定義の範囲内にあるすべてのポリペプチドは、以後、本発明のポリペプチ ドと称する。 本発明のポリペプチドは、身体の自然環境のもとではそれらと 結合しているかもしれない他のポリペプチドを含まない形態で存在するならば、 実質的に単離された形態にある。このポリペプチドは、このポリペプチドの意図 された目的を妨げない担体または希釈剤と混合することが可能で、この混合後も なお実質的に単離されていると見なされることが理解されるであろう。 本発明のポリペプチドは、実質的に精製された形態で存在することも可能であ る。その場合、この形態は一般的に、調製物中のポリペプチドの９０％以上（例 えば９５％、９８％または９９％）が本発明のポリペプチドである調製物中にこ のポリペプチドを含有する。 本発明のポリペプチドの対立遺伝子変異体は、ネズミ科動物において天然に存 在する変異体であって、配列番号２のタンパク質と実質的に同様な方法で遺伝子 発現を調節するために機能する変異体である。同様に、配列番号２のタンパク質 の種相同体は、別の動物種（ヒトを含む）に天然に存在する対応タンパク質であ って、その種において、配列番号２のＤＰ−１タンパク質がネズミ科動物におい て果たすのと同等の機能を果たす対応タンパク質である。任意の１動物種内にお いて、相同体は数個の対立遺伝子変異体として存在することがあり、これらはす べて配列番号２タンパク質の相同体であると見なされる。対立遺伝子変異体およ び種相同体は、ここに記述する配列番号２のタンパク質を産生するための手順に したがって、例えば対立遺伝子変異体を有する齧歯動物または他の種由来の適切 な細胞源を用いてその手順を実施することにより、得ることができる。上記のタ ンパク質は進化の過程で保存されてきたように思われるので、対立遺伝子または 種変異 体をコードするクローンを得るために、本発明のポリヌクレオチドをプローブと して用いて齧歯動物または他の細胞から作成されたライブラリーを釣り上げるこ とも可能であろう。それらのクローンは、本発明のポリペプチドを同定するため の、従来の技法によって操作することが可能である。そして次に、そのポリペプ チドをそれ自体は公知の組換えまたは合成技法によって産生することが可能であ る。好ましい種相同体は、哺乳動物または水陸両生動物の種相同体である。 配列番号２に少なくとも７０％相同なタンパク質は、配列番号２のタンパク質 と、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０ または１００もしくはそれ以上の連続するアミノ酸からなる領域にわたって、好 ましくは少なくとも８０％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、相 同である。タンパク質の相同性を測定する方法は当分野の技術において周知であ り、本文において、相同性はアミノ酸同一性〔時々「ハードホモロジー」（hard homology）と称される〕に基づいて計算されることが当業者には理解されるで あろう。 一般的に、Ｅ２Ｆ−１タンパク質と複合体を形成することが可能な、配列番号 ２の断片、またはその対立遺伝子変異体、またはその種相同体は、長さが少なく とも１０、好ましくは少なくとも１５、例えば少なくとも２０、２５、３０、４ ０、５０または６０アミノ酸であろう。 断片がＥ２Ｆ−１タンパク質と複合体を形成するかどうかは、Ｅ２Ｆ−１タン パク質および断片を、Ｅ２Ｆ−１タンパク質とＤＰ−１が通常トランス活性化転 写因子を形成する条件下に置き、 複合体が形成されたかどうかを確認することによって決定することが可能であろ う。この決定は、例えば、その複合体がin vitroでＥ２Ｆ結合部位と結合する能 力を測定することによって、または、その推定上の複合体の分子量をＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ等の方法によって測定することによって行うことができる。 好ましい断片には、Ｅ２Ｆ−１またはその関連ファミリーメンバーと、トラン ス活性化複合体を形成することが可能な断片が含まれる。本明細書の実施例には 、ＤＰ−１タンパク質の機能を分析する多数の方法が記述されている。これらの 方法は、あるポリペプチドがＥ２Ｆ−１タンパク質とトランス活性化複合体を形 成できるかどうかを評価するために、適合させることが可能である。例えば、断 片を、図１０に示されるＤＰ−１／Ｅ２Ｆ−１複合体によって活性化されるよう に適合させたレポーター遺伝子構築物の存在下で、Ｅ２Ｆ−１に添加することが できる。このような実験から、そのポリペプチド断片が必要な活性を有するかど うかを判定できるだろう。 本発明のポリペプチドは、顕示標識によって標識化することができる。顕示標 識は、そのポリペプチドの検出を可能とする任意の適切な標識でありうる。適切 な標識は、放射性同位体（例えば¹²⁵Ｉ）、酵素、抗体およびビオチン等のリン カーを含む。本発明の標識化ポリペプチドは、試料中のＤＰ−１タンパク質の量 を測定するためのイムノアッセイ等の診断処置に使用できる。 本発明のポリペプチドまたは標識化ポリペプチドは、例えばイムノアッセイ皿 の壁などの、固相に固定することもできる。 本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ オチド（例えば２本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド）を提供する。このようなポリヌ クレオチドは、組換え複製ベクターに組み込むことができる。このベクターはＤ ＮＡを複製するのに使用できる。好ましくは、ベクター中のＤＮＡは、コード配 列の発現を宿主細胞によってもたらすことが可能な制御配列に、機能しうる形で 連結される。「機能しうる形で連結される（operably linked）」という表現は 、記述された複数の構成要素が、意図された方法で機能することを可能にする関 係で存在している並置をいう。コード配列に「機能しうる形で連結される」制御 配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法 で連結される。このようなベクターを前述のように適切な宿主細胞中に導入して 、本発明のポリペプチドの発現をもたらすことが可能である。 したがって、本発明は別な側面において、本発明のポリペプチドを調製する方 法を提供する。この方法は、前述のように発現ベクターによって形質転換または トランスフェクトされた宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベ クターによる発現をもたらす条件下で培養し、そして発現されたポリペプチドを 回収することを含む。 本発明はまた、本発明のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクロ ーナル抗体を提供する。本発明はさらに、配列番号２のタンパク質または本発明 のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する方 法を提供する。モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技法により免疫原 として上記のタンパク質またはそのペプチド断片を使用して調製す ることができる。ポリクローナル抗体もまた、宿主動物（例えば、ラットまたは ウサギ）に本発明のペプチドを接種し、免疫血清を回収することを含む従来の手 段によって調製することができる。 抗原結合活性を保持している本発明のモノクローナル抗体の断片、例えばＦｖ 、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ₂）’断片は、本発明の別な側面を形成する。さ らに、本発明のモノクローナル抗体を分析し（例えば、そのような抗体を発現す る遺伝子のＤＮＡ配列解析によって分析し）、そして、例えばEP-A-0239400（Wi nter）に開示されている方法にしたがって、本発明の抗体の相補性決定領域を有 するヒト化抗体を作成することができる。 本発明はまた、本発明のポリペプチドと共に担体または希釈剤を含有する組成 物を提供する。このような組成物には医薬組成物が含まれ、この場合上記担体ま たは希釈剤は製薬上許容されるものである。 本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片と共に担体または希釈剤を含有 する組成物を提供する。このような組成物には医薬組成物が含まれ、この場合上 記担体または希釈剤は製薬上許容されるものである。 製薬上許容される担体または希釈剤は、経口、直腸、鼻、局所（頬および舌下 を含む）、膣または腸管外（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内および硬膜上を 含む）投与に適する製剤に使用される担体または希釈剤を含む。これらの製剤は 、単位剤形として好都合に提供することができ、製薬技術において周知の任意の 方法によって調製することができる。このような方法は、有効成分を、１つまた は複数の補助成分を構成する担体と会合させる過程 を含む。一般的に、これらの製剤は有効成分を均一に、かつ密接に液体担体また は微細に分割した固体担体またはその両方に会合させ、次に必要であれば生成物 を成形して調製される。 例えば、腸管外投与に適する製剤は、以下のものを含む。すなわち、抗酸化剤 、緩衝液、静菌薬および該製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含 有することができる水性および非水性無菌注射液；および、懸濁化剤ならびに増 粘剤、およびポリペプチドを標的の血液成分または１つあるいは複数の臓器に向 けるように設計されたリポソームまたは他の微粒子系を含むことができる、水性 および非水性無菌懸濁液である。 本発明のペプチド、本発明のペプチドに対する抗体またはその断片、および上 記の組成物は、ヒトを含む哺乳動物における増殖性疾患を含む症状の治療、調節 または診断に使用することができる。このような症状は、１つまたは複数の転写 因子（例えば、Helinらによってクローン化されたＥ２Ｆ因子、または配列番号 ２のタンパク質、またはＥ２Ｆ−１タンパク質、または関連ファミリーメンバー 等）の異常な（例えば、常軌を逸した高レベルまたは低レベルの）および／また は迷入性の（例えば、遺伝子配列の突然変異による）発現に伴う症状を含む。こ れらの症状はまた、その遺伝子産物が配列番号２のタンパク質によって調節され る遺伝子の異常な発現によってもたらされる症状をも含む。上記のペプチド、抗 体、その断片、および組成物を用いた症状の治療または調節は、通常そのような 治療を必要とする受容者に有効量のポリペプチド、抗体、その断片または組成物 を投与することを含む。 本発明のポリペプチドの好ましい１群は、配列番号２のアミノ 酸第１６０〜２２０番の領域に基づくポリペプチドである。上記タンパク質のこ の領域は、Helinら（同上）によって記述されるＥ２Ｆ−１タンパク質の類似領 域に対し約４０％の相同性を有し、また両領域とも推定上のα−ヘリックス領域 である。いかなる特定の学説に縛られることも望まないが、本発明者らはＥ２Ｆ と本発明のタンパク質とのヘテロ二量化は、これらの相同領域によって仲介され ると信じる。したがって、本発明の好ましい態様は、Ｅ２Ｆ−１−配列番号２タ ンパク質複合体の形成を破壊させることにより転写因子の活性化を阻止する方法 に使用するための、上記の領域に基づく本発明のポリペプチド、およびそのよう なポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。 本発明はまた、上記の効果を達成するために、配列番号２の上記領域に標的を 定めた抗体およびその断片を提供する。 本発明はさらに、試料中の本発明のポリペプチドの存在または不在を検出する ためのイムノアッセイを提供する。このイムノアッセイは： （ａ）本発明の抗体を供給し； （ｂ）試料を該抗体と共に、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下 でインキュベートし；そして （ｃ）該抗体−抗原複合体を検出する ことを含む。 本発明の別の側面において、本発明は、増殖性またはウイルス性疾患を治療す るための推定上の化学療法剤を同定するための新規なアッセイを提供する。この アッセイは、Ｅ２Ｆ−１タンパク質またはその誘導体、本発明のポリペプチド、 および推定上の化 学療法剤を接触させ、該化学療法剤によるＥ２Ｆ−１−配列番号２タンパク質複 合体の形成阻止の程度を測定することを含む。このアッセイにおいては、該化学 療法剤の不在下においてアッセイの条件下でＥ２Ｆ−１および配列番号２タンパ ク質がヘテロ二量体を形成するように、それぞれ十分な量が提供されるならば、 完全なＥ２Ｆ−１および／または配列番号２タンパク質を使用する必要はないで あろう。このように、本発明は、増殖性疾患を治療するための推定上の化学療法 剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、 （Ａ）以下の成分： （ｉ）本発明のポリペプチド、 （ii）（ａ）Ｅ２Ｆ−１タンパク質、または （ｂ）該タンパク質の対立遺伝子変異体または種相同体、または （ｃ）ＤＮＡ結合領域において少なくとも７０％の相同性を有する Ｅ２Ｆ−１ファミリーのメンバー、または （ｄ）配列番号２のタンパク質と機能性トランス作用複合体を形成 することが可能な、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片；または （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）を含む融合タンパク質 ；および （iii）推定上の化学療法剤； を上記成分（ｉ）および（ii）が成分（iii）の不在下で複合体を形成す る条件下で接触させ、そして （Ｂ）成分（iii）がどの程度まで該複合体を破壊することができるかを測定す る ことを含む。このアッセイでは、上記の３成分の任意の１つまたは複数を、例え ば放射性または比色定量標識で標識し、アッセイの結果を測定可能なものとする ことができる。推定上の化学療法剤は、本発明のペプチドを含む。 Ｅ２Ｆ−１タンパク質の変異体、相同体および断片は、ＤＰ−１タンパク質の 変異体、相同体および断片の定義に対応する方法で定義される。 上記（ｉ）と（ii）との複合体は、例えば、in vitroでＥ２ＦＤＮＡ結合部位 に結合するその能力によって測定できる。または、そのアッセイは、レポーター 遺伝子に連結したＥ２Ｆ結合部位を含有するプロモーターを活性化する該複合体 の能力を測定するinvivoアッセイであってもよい。このin vivoアッセイは、例 えば、酵母、昆虫、水陸両生動物または哺乳動物細胞におけるアッセイを示して いる実施例を参照して、実施することができる。 かかるアッセイによって測定されうる候補治療剤としては、 （ａ）配列番号２のタンパク質 （ｂ）上記タンパク質の対立遺伝子変異体または種相同体；または （ｃ）（ａ）に対して少なくとも７０％相同なタンパク質の１０個以上の アミノ酸から成る断片を挙げることができる。 本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドをコードする核酸を 担うベクターは、遺伝子治療法に使用することができる。このような遺伝子治療 は、細胞（例えば、癌細胞）の制 御されない増殖を治療するのに用いうる。遺伝子治療の方法は、治療を必要とす る患者の細胞に、ＤＰ−１ ｍＲＮＡからＤＰ−１タンパク質への翻訳を阻止ま たは減少させるための本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、または、ＤＰ− １とＥ２Ｆ−１もしくは関連ファミリーメンバーとの結合を妨げるポリペプチド を細胞内で発現できる、有効量のベクターを送達（デリバリー）することを含む 。 そのベクターは、適切にはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、癌 細胞を標的とするのに適切な、当分野の技術で利用可能な任意のベクターであり うる。例えば、Huberら［Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1991）88，8039］は、 肝癌、乳房、結腸または皮膚細胞の形質転換のためにアンフォトロフィック（am photrophic）なレトロウイルスの使用を報告している。Culverら［Science（199 2）256；1550-1552］もまた、Ramら［Cancer Research（1993）53；83-88］同様 、ウイルス特異的（virus-directed）酵素プロドラッグ療法におけるレトロウイ ルスベクターの使用を記述している。Englehardtら［Nature Genetics（1993）4 ； 27-34］は、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス産物（ＣＦＴＲ）を細胞へ送 達するのに、アデノウイルスに基づくベクターの使用を記述している。 配列番号２のタンパク質は、細胞中で細胞質と核の両方に分布していることが 判明した。タンパク質が細胞質から核へ運ばれるためには、そのタンパク質のプ ロセシング〔例えば、リン酸化またはタンパク質分解クリッピング（clipping） 等〕が起こるのが普通である。リン酸化を阻止する化合物は当分野の技術で公知 で ある。タンパク質分解クリッピングを阻止する化合物には、クリッピングに関与 する酵素を阻止するようにアンタゴニストとして作用する本発明のペプチドが含 まれうる。したがって、本発明は別な側面において、配列番号２のタンパク質の 細胞質から細胞核への輸送を阻止する方法に使用するための、リン酸化またはタ ンパク質分解クリッピングを阻止する化合物を提供する。 以下に述べる実施例は、マウス源由来の本発明の新規タンパク質およびＤＮＡ の単離ならびに特徴付けを記述する。しかし、他の源、例えばヒトまたは他の哺 乳動物も、本発明の範囲内にあり、また、上記タンパク質のヒトまたは他の哺乳 動物における相同体は類似の方法で単離可能である。 実施例 セクションＡ Ｆ９ ＥＣ細胞由来のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆのアフィニティー精製 アフィニティー精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ（約５ｘ１０¹⁰個のＦ９ ＥＣ細 胞由来の約５μｇ）中のポリペプチドを、図１（トラック２）に示すようにＳＤ Ｓゲル電気泳動により分離し、クーマシーブルーで染色した；トラック１は分子 量基準を示す。アフィニティー精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中のＤＮＡ結合ポリ ペプチドを、競合する野性型（トラック５）または変異型（トラック６）のＥ２ Ｆ結合部位の不在下で（トラック４）、または存在下で、アデノウイルスＥ２Ａ プロモーター遠位Ｅ２Ａ部位（結合部位の詳細は図に示されている）に架橋する ことによってアッセイした；分子量基準をトラック３に示す。ｐ４６ポリペプチ ド が示されている；上部の括弧は、分子量約５５，０００で、これもまたＥ２Ｆ部 位に特異的に結合するペプチドの別の１群を示す。方法 ：ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆを、Ｆ９ ＥＣ細胞より調製した全細胞抽出物から、 ShivjiおよびLa Thangue（1991）Mol．Cell．Biol．11，1686-1695が記述するよ うに、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター（−７１から−５０）より取った野性 型Ｅ２Ｆ部位を含有するアフィニティーマトリックスを用いてアフィニティー精 製した。その際、結合活性を、変異型Ｅ２Ｆ結合部位（ヌクレオチド−６２から −６０において変異させた）を含有するマトリックスにアプライすることを含む 、１つの付加的工程を含めた。平均で、約５．０μｇのタンパク質が、約１０¹⁰ 個のＦ９ ＥＣ細胞から調製した全細胞抽出物より精製された。ＤＲＴＦ１／Ｅ ２ＦのＥ２Ｆ部位へのＵＶ架橋は、約５０ｎｇのアフィニティー精製タンパク質 を用いて実施した。競合は、約１００倍モル過剰の野性型（−７１から−５０） または変異型（ヌクレオチド−６２から−６０において変異させた）オリゴヌク レオチドを用いて実施した。マウスＤＰ−１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列 アフィニティー精製したＤＲＴＦ１をＴＣＡを用いて沈降させ、ＳＤＳポリア クリルアミドゲルで電気泳動させ、ｐ４６を電気溶出させた；ｐ４６の純度を、 電気泳動ならびに溶出させた物質の少量を銀染色することにより確認した。ｐ４ ６をリシルエンドペプチダーゼで切断し、ペプチドをAquapore AX-300およびRP- 300 を連続して0.1%TFA中で1%/minのアセトニトリル勾配で使用する高速液体クロマ トグラフィーにより精製した。ピークフラクションを４７７Ａ／１２０Ａ気−液 パルスシークエンサー（Applied Biosystems社）で自動化エドマン分解により配 列決定した。 １組の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、ペプチド６（７５から９１）お よびペプチド５（２３５から２４９）のアミノ酸配列に基づいて以下のように合 成した：すなわちペプチド６のＣ末端領域（ＰＮＴＨＦＶ）、５’ＣＧＣＧＧＡ ＴＣＣＣＣ（ＡＣＧＴ）ＡＡ（ＣＴ）ＡＣ（ＡＣＧＴ）ＣＡ（ＣＴ）ＴＴ（ＣＴ ）ＧＴ３’およびペプチド５のＣ末端領域（ＡＱＥＳＱＮ）、アンチセンス鎖、 ５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡ（ＡＧ）（ＡＧ）ＴＴ（ＣＴ）ＴＧ（ＡＣＧＴ）（Ｃ Ｇ）（ＡＴ）−（ＣＴ）ＴＣ（ＣＴ）ＴＧ（ＡＣＧＴ）ＧＣ３’である；これら のオリゴヌクレオチドは両方とも５’末端にリンカー配列を含んでいた。ペプチ ド５のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｆ９ ＥＣ細胞ＲＮＡからｃＤＮＡ を合成するのに使用し、このｃＤＮＡを次にペプチド６およびペプチド５プライ マーの両方と共に、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物をサブクローン化し、配列決 定を行い、ＤＰ−１ ＲＮＡから誘導したｃＤＮＡをペプチド２１および３の存 在によって同定した。ペプチド２１および３とは、ｐ４６から誘導したペプチド をマイクロシークエンシング（microsequencing）して得られた別の２つのペプ チドで、ペプチド６と５の間に位置するものである。上記のｃＤＮＡ断片を、数 個のマウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。ＤＰ−１ ｃＤＮＡクローンは頻繁に再配列されており、図に示した最終ヌクレオ チド配列は、あるＦ９ ＥＣ細胞ライブラリーより単離したｃＤＮＡから得たも のである。ＤＰ−１はＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中のＤＮＡ結合ポリペプチドで、ｐＲｂとin viv oで結合する 。 ペプチド１５（ＤＰ−１アミノ酸残基２３５から２４９に相当する）およびペ プチドＡ（ＤＰ−１アミノ酸残基３から１５に相当する）をＫＬＨに結合し、ウ サギを免疫感作するのに使用した。抗体の作成およびイムノブロッティングを標 準的手順により実施した。ゲル遅延アッセイにより、約５．０ｎｇのアフィニテ ィー精製ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆまたは約５．０μｇのＦ９ ＥＣ粗細胞抽出物を、 野性型Ｅ２Ａプロモーター（−９６から６８）またはＥ２Ａプロモーター配列− ７１から−５０を含有するオリゴヌクレオチドを用いて、約１００倍モル過剰の −６２／−６０〔−６２、−６１および−６０の位置で突然変異させたＥ２Ａ配 列−７１から−５０（ｒｅｆ．２３）〕の存在下でアッセイした。抗ペプチドＡ 血清または前免疫血清をプレインキュベーション期間中に添加した。ＪＭ全細胞 抽出物からのｐＲｂの免疫沈降を、標準的手順により実施した。ＩＦ８免疫沈降 物におけるｐＲｂの存在を、イムノブロッティングにより確認した。結果は図２ に以下のように示されている： ａ） ＤＰ−１はアフィニティー純化ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中に存在する：アフィ ニティー精製ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆおよび抗ペプチド１５（アミノ酸残基２３５か ら２４９）を用いたイムノブロット。ｐ４６およびｐ５５との反応性は、免疫血 清（Ｉ、トラック ２）にのみ存在し、前免疫血清（ＰＩ、トラック３）には存在しなかった。この 活性は特異的であった。なぜなら、それはペプチド１５によって競合的に阻止さ れたが、非関連ペプチドであるペプチド１によっては阻止されなかったからであ る（トラック５と６を比較されたい）。ｐ４６はｐ５５（トラック３に示す）の 誘導体のようである。なぜなら、抗ペプチドＡ（下記参照、ＤＰ−１のＮ末端領 域より誘導された）はｐ５５のみを検出したからである（データはここに示して いない）。分子量基準はトラック１に示され、＊印は非特異的反応を示す。 ｂ） ＤＰ−１はアフィニティー純化ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合複合体中 に存在する：アフィニティー精製ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦおよびアデノウイルスＥ２ Ａプロモーター（−９６から＋６８）を用いて、免疫（トラック３から６）また は前免疫（トラック２）抗ペプチドＡの存在下で、非関連ペプチド１（トラック ４および６）またはペプチド１５（トラック５）も共に存在させて、ゲル遅延を 実施した。結合反応の特異性は、１００倍モル過剰の野性型Ｅ２Ｆ結合部位（Ｅ ２Ａプロモーター−７１から−５０）を反応に含有させることによって確認され た（トラック６）；他の反応はすべて１００倍過剰の変異型部位を含有した。 ｃ） ＤＰ−１はＦ９ ＥＣ細胞抽出物中のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合複 合体の中に存在する：Ｅ２Ｆ結合部位（Ｅ２Ａプロモーター配列−７１から−５ ０）を有するＦ９ ＥＣ全細胞抽出物（ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは複合体ａ，ｂおよ びｃとして分割される）を用いて、前免疫（トラック２）または免疫（トラック ３）抗ペプチドＡ血清の存在下で、ゲル遅延を実施した。スーパ ーシフト（super shift）は、結合反応にペプチドＡを含有させることにより防 止された（重複するトラック７および８を９および１０と比較されたい）。 ｄ） ＤＰ−１はｐＲｂとin vivoで結合する：ＪＭ細胞抽出物からの免疫沈降 を、抗ｐＲｂモノクローナル抗体ＩＦ８または対照モノクローナル抗体Ａ７を用 いて実施した。免疫沈降物を１．０％デオキシコール酸塩で処理し、界面活性剤 で放出させた物質をＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ活性について、上記のようにゲル遅延に よってアッセイした。ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ結合活性は、抗ｐＲｂ免疫沈降物にの み検出された（トラック２と３を比較されたい）；抗ｐＲｂを枯渇させたＪＭ細 胞抽出物は、ｐＲｂ複合体のレベルを減少させた（トラック４と５を比較された い、複合体はａと表示）。界面活性剤で放出させたＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆを、さら に抗ペプチドＡとの反応性についてアッセイした。免疫血清はスーパーシフトを 生じたが、前免疫血清では生じなかった（トラック６と７を比較されたい；＊印 で示してある）。ＤＰ−１は、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質である ＤＰ−１ｃＤＮＡの領域をＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔ（１４）にサブ クローニングした。ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204ならびにＧＳＴ−ｃｄｋ２を、Band ara et al．（1991）Nature，352，249-251に既に記載されているようにして、 グルタチオン−セファロース上でアフィニティ精製した。ゲル遅延を、上述のよ うにして、Ｅ２Ａプロモーター、あるいはＥ２Ａ配列の−８２から−５０までを 含むオリゴヌクレオチドを用いて行った。変異型の結合部位は、ヌクレオチド− ６２、−６１、ならびに−６０が変化していた。約５．０μｇのＧＳＴ融合タン パク質を用いて、紫外線による架橋を実施した。 ａ）図示のＧＳＴ融合タンパク質であり、ＤＰ−１タンパク質配列のアミノ 酸残基８４から２０４までを含むＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204を発現させ、均質とな るまでアフィニティ精製した。トラック１はアフィニティ精製したＤＰ−１^{84-2 04} を示し、トラック２は標準分子量マーカーを示す。 ｂ）ＤＰ−１は、Ｅ２Ｆ結合部位と結合する：アフィニティ精製したＧＳＴ −ＤＰ−１^84-204（約１．０μｇ）を、Ｅ２Ａプロモーター（トラック２）、又 はＥ２Ａプロモーター配列の−８２から−５０までを含むオリゴヌクレオチド（ ＷＴ及びＭＴの結合部位の詳細については図の下部に記載）（トラック５）若し くはＥ２Ｆプロモーター配列の−８２から−５０までを含み、Ｅ２Ｆ部位が変異 型であるオリゴヌクレオチド（トラック８）のいずれかとともにインキュベート した。対照のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ｃｄｋ２（約１．０μｇ）は 結合活性を有してお らず（トラック３、６および９）、トラック１、４および７は、タンパク質を含 んでいない。 ｃ）ＤＰ−１のＤＮＡへの架橋：アフィニティ精製したＧＳＴ−ＤＰ−１^{84 -204} （トラック４）あるいはＧＳＴ−ｃｄｋ２（トラック３）を、Ｅ２Ａプロモ ーター配列の−８２から−５０まで（トラックの下側に図示）とともにインキュ ベートした。架橋の後、ポリペプチドをＳＤＳゲル電気泳動で分離させた。架橋 したＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204を括弧で示す。トラック２では融合タンパク質を加 えておらず、トラック１には分子量の標準を示す。 ｄ）アフィニティ精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中のＤＰ−１の結合特性：精 製したＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204あるいは対照の融合タンパク質ＧＳＴ−ｃｄｋ２ のＥ２Ａプロモーターとの結合を、単独で（トラック５および６；約１．０μｇ ）、あるいはアフィニティ精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの存在下のいずれかで（ トラック３および４、約５．０μｇ）調べた。同量のアフィニティ精製したＤＲ ＴＦ１／Ｅ２Ｆの結合活性をトラック２において単独で調べ、Ｅ２Ａプロモータ ーをトラック１に示す。ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204とＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆとの結合 の特徴が、両者を一緒にして調べた場合には異なることに注意されたい（トラッ ク２、３および５を比較のこと）。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との比較 両者の比較を、以下のように図４に示す。 ａ）ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の線図。図には、両者のＤＮＡ結合ドメイン（Ｄ Ｐ−１のアミノ酸残基８４から２０４、ならびに Ｅ２Ｆ−１のアミノ酸残基８９から１９１、ｒｅｆ．２４を参照のこと）と、有 意な類似性を有する領域（ＤＡＰ−１のアミノ酸残基１６３−２３６、ならびに Ｅ２Ｆ−１のアミノ酸残基１６２−２２６）の位置が示してある。類似領域が、 ＤＮＡ結合領域の外側の配列も含んでいることに注意されたい。 ｂ）アミノ酸配列の相互対照：ＤＰ−１の配列（上側）とＥ２Ｆ−１の配列 （下側）の類似領域の比較。縦棒は、アミノ酸残基が同一であること（太線）、 あるいは類似していること（細線）を示す。 ｃ）ＤＰ−１の類似領域とＥ２Ｆ−１の類似領域は、両親媒性のαヘリック スを形成している。ＤＰ−１の類似領域（右側、アミノ酸１６７−１８３）とＥ ２Ｆ−１の類似領域（左側、アミノ酸１６６−１８２）を、ヘリックス輪として 示す。ＤＰ−１は、インビボで、Ｅ２Ｆ部位依存性の転写を活性化する 図５（構築物は、ａに図示）に示すように、ＳＡＯＳ−２細胞に、２．０若 しくは６．０μｇのｐＧ４、または２．８若しくは８．８μｇのｐＧ−Ｂ９（Ｄ Ｐ−１発現ベクター）を、ｐ３ｘＷＴ（５．０μｇ）、ｐ３ｘＭＴ（５．０μｇ ）又はｐＣＭＶｃａｔ（０．５μｇ）とともにコトランスフェクションした。 ｐ３ｘＷＴならびにｐ３ｘＭＴレポーター構築物は、アデノウイルスのＥ２ Ａプロモーターから取り出した３つの野性型のＥ２Ｆ結合部位あるいは３つの変 異型のＥ２Ｆ結合部位（−７１から−５０で、ヌクレオチド−６２、−６１及び −６０で変異）のいずれかを、最小の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプ ロ モーターの上流側の位置に含んでおり、これらの構築物は、すでに記載されてい る。ｐＣＭＶｃａｔは、ヒトサイトメガロウイルスの即時型遺伝子から取り出し たエンハンサーならびにプロモーター領域（−３０１から＋７２）を含んでいる 。ｐＧ−Ｂ９は、ＤＰ−１タンパク質のアミノ酸残基６３から４２９までの配列 を含んでおり、ｐＧ４ｍｐｏｌｙＩＩのＧａ１４ＤＮＡ結合ドメインを、ＤＰ− １のｃＤＮＡであるＢ９で置換することによって調製した。ＳＡＯＳ−２細胞へ のトランスフェクションを行い、ＣＡＴ活性を測定し、ＴＬＣプレートをリン光 イメージャーによって定量した。ＤＰ−１をコードしているｃＤＮＡの単離 Ｆ９ ＥＣ全細胞抽出物からのＤＲＴＦ１の精製を、野性型あるいは変異型 のいずれかの結合部位を含むＤＮＡ結合部位のアフィニティマトリクスに順次適 用し、ゲル遅延によってＤＮＡ結合活性を調べる（２６）という緊縮性の高い方 法を使用することによって行った。ＤＮＡ結合部位は、親和性の高いＥ２Ｆ結合 部位を含む領域を、アデノウイルスのＥ２Ａプロモーターから取り出した（−７ １から−５１）。この方法によって、インビトロで、結合部位依存的に転写を効 率的に活性化しうる一群のポリペプチド（図１、トラック２）が定常的に精製さ れた。アフィニティ精製物質中のポリペプチドのいくつかは、野性型のＥ２Ｆ部 位とは特異的に結合したものの、変異型のＥ２Ｆ部位とは結合しなかった（図１ 、トラック５と６を比較のこと）。特異的結合を示したポリペプチドのうち最も 多量に存在していたポリペプチドは、見 かけ分子量が約４６ｋＤであった（図１、トラック２、ｐ４６と表示）。その後 、このｐ４６を切り出し、リシルエンドペプチターゼで消化し、得られたペプチ ドを精製して配列決定した。１０個のペプチドについてのアミノ酸配列が得られ た。我々は、これらのペプチドのうち２個をコードしているＤＮＡ配列を予測し ていたので、これらの配列を、Ｆ９ ＥＣのＲＮＡ由来のｃＤＮＡ断片を増幅す るにあたってのオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。クローニングさ れたｃＤＮＡ断片を用いて、いくつかのマウスｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニングしたところ、Ｆ９ ＥＣのｃＤＮＡライブラリーから、ｐ４６の完全なコ ード配列を示すクローン（以下ではＤＰ−１と称する）が最終的に単離された。ＤＰ−１の分子特性 ２．４ｋｂのｃＤＮＡ断片から、ＤＰ−１の完全なコード配列を決定した。 このｃＤＮＡは、４２９個のインフレームのアミノ酸残基をコードするオープン ・リーディング・フレームを有しており、その中には、ｐ４６の配列決定によっ て得られたペプチドのうち８つが含まれていた。このｃＤＮＡ配列は、おそらく 開始メチオニンを有しており、これは、このメチオニンのすぐ上流側にインフレ ームの終止コドンが存在しているからである。さらに、このメチオニンを挟み、 包含している一連のヌクレオチドは、効率的な翻訳開始シグナルとなるはずであ る。これまで単離されたうちで最長のｃＤＮＡのクローンは、この想定上の開始 メチオニンから、５’方向に５５ヌクレオチド延在している。しかし、 Ｆ９ ＥＣ細胞のＲＮＡを用いたプライマー伸長分析で、転写開始部位が２５０ ヌクレオチド上流であることが示されているので、このクローンは、転写開始部 位までは延在していない。このｃＤＮＡは、約１．１ｋｂの３’側未翻訳配列も 含んでおり、その一部を示す。 ポリアデニル化したＦ９ ＥＣのＲＮＡのノーザン分析によって、ＤＰ−１ 転写物のサイズが約２．６ｋｂであることが推定された。ＤＰ−１のＲＮＡは、 多種の異なった細胞で構成的に発現されており、また、in situハイブリダイゼ ーションによって調べると、マウスの胚の発生の間に多岐にわたる組織で構成的 に発現されていることが観察された。Ｆ９ ＥＣ細胞の分化の間、ＤＰ−１のＲ ＮＡは、Ｆ９ ＥＣ幹細胞が分化するにつれて、周辺的に負に調節されているこ とが見いだされた。サザン分析によって、ＤＰ−１が単一の遺伝子によってコー ドされていることが示された。 とりあえずアクセス可能なタンパク質のデータベース（Leads and Swiss） で相同性を調べたところ、ＤＰ−１と他の全てのタンパク質との間に有意な類似 性を見つけることはできなかった。しかし、我々は、ＤＰ−１のＤＮＡ結合ドメ インのうちの狭い領域が、やはりＥ２Ｆ部位に結合する最近特徴付けされたタン パク質であるＥ２Ｆ−１（後述）のＤＮＡ結合ドメインのうちの同様な領域と、 有意な類似性を有していることがわかった。ＤＰ−１の特徴づけ ＤＰ−１がＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの構成成分であることを確認 し、ＤＰ−１がＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合複合体中に存在しているのかど うかを決定するために、ＤＰ−１タンパク質の異なる領域に対して、いくつかの 抗ペプチド抗血清を作製した（図２）。アフィニティ精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２ Ｆを抗ペプチド１５で免疫ブロッティングしたところ、見かけ分子量が４６ｋＤ ならびに５５ｋＤの２種のポリペプチドが示された（図２ａ、トラック２）。反 応がペプチド１５によって競合的に阻害されるのに対し、非関連ペプチドである ペプチド１によっては阻害されないので（図２ａ、トラック５と６を比較のこと ）、双方のポリペプチドとも、抗血清によって特異的に認識されていた。 別の抗ペプチド血清（抗ペプチドＡ）がゲル遅延検定に及ぼす影響を測定す ることによって、ＤＰ−１がＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合複合体の一部であ ることを確認した。なお、抗ペプチド１５は変性タンパク質とのみ反応するため 、こうした検定には使用できなかった。抗ペプチドＡをアフィニティ精製したＤ ＲＴＦ１／Ｅ２Ｆとともにインキュベートしたところ、免疫血清ではスーパーシ フトがはっきりしていたのに対し、前免疫血清でははっきりしていなかった（図 ２ｂ、トラック２と３を比較のこと）。このスーパーシフトは特異的であった。 何故ならば、ペプチドＡを含むものによって競合的に阻害されるのに対し、非関 連のペプチド１を含むものによって阻害されないためである（図２ｂ、トラック ４と５を比較のこと）。こうしたゲル遅延条件で分離された結合活性がいずれも Ｅ２Ｆ結合部位に対して特異的であったので（図２ｂ、トラック４−６を比較の こと）、これらの結果から、ＤＰ−１がＤＲＴＦ１／ＥＦ ２ＤＮＡ結合活性の 一部 であることがわかる。 抗ペプチド抗体によっても、全細胞抽出物中で、スーパーシフトが生じた。 Ｆ９ ＥＣ細胞抽出物中では、ＤＲＴＦ１は、ＤＲＴＦ１ａ、ｂ、およびｃと称 される一連のＤＮＡ−タンパク質複合体として分離される。前免疫血清ではなく 抗ペプチドＡを加えると、スーパーシフトが生じ、それとともに、ＤＲＴＦ１ａ 、ｂ、およびｃが減少した（図２ｃ、トラック２および３を比較のこと）、こう した現象は、ペプチドＡで競合させることができた（図２ｃ、トラック７および ８をトラック９および１０と比較のこと）。同様の効果が、ＨｅＬａを含む他種 の細胞に由来する多岐にわたる全細胞抽出物で示された。このことから、ＤＰ− １が、当初Ｆ９ ＥＣ細胞抽出物で規定され、ＨｅＬａ細胞抽出物中でも特徴づ けされているＤＮＡ結合活性であるＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの構成成分であることが 示唆された。ＤＰ−１は、インビボで、網膜芽腫の遺伝子産物と会合する ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは、インビトロならびにインビボで、ｐＲｂと結合する 。ＤＰ−１がインビボでｐＲｂと会合するかどうかを決定するために、高レベル のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ−ｐＲｂ複合体を含有するヒト白血病細胞株ＪＭから調製 した全細胞抽出物からの抗ｐＲｂモノクローナル抗体ＩＦ８を用いて免疫沈降実 験を行った。免疫沈降の後、免疫複合体を穏やかな界面活性剤で処理することに よって、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合活性をｐＲｂから遊離させた。こうし た条件下では、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合活性は、ｐＲｂ免疫沈降物のみ から遊離され、対照 抗体の免疫沈降物からは遊離されなかった（図２ｄ、トラック２および３を比較 のこと）。ｐＲｂと会合したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中にＤＰ−１が存在することを 、抗ペプチドＡで界面活性剤によって遊離された物質を処理すると、ＤＲＴＦ１ ／Ｅ２Ｆがスーパーシフトすることによって確認した（図２ｄ、トラック６と８ を比較のこと、＊で表示）。このことから、ＤＰ−１が、インビボでｐＲｂと会 合することが実証された。ＤＰ−１はＥ２Ｆ部位と特異的に結合し、新規なＤＮＡ結合ドメインを有してい る ＤＰ−１がＥ２Ｆ部位と配列特異的に結合しうるのかどうかを決定するため に、ＤＰ−１をコードしている配列の領域を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ ラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させ、アフィニティ精製し、ＤＮＡ 結合活性について調べた。これまでに、ＤＮＡ結合活性を保持していると決定さ れた最小の領域は、ＤＰ−１タンパク質のアミノ酸残基８４から２０４までの配 列を含んでいる（図３ａ、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204）。ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204 がアデノウイルスのＥ２Ａプロモーターと結合したのに対し、非関連のＧＳＴ融 合体（ＧＳＴ−ｃｄｋ２）は結合しなかった（図３ｂ、トラック２と３を比較の こと）。また、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204は、変異型のＥ２Ｆ部位に対してより、 野性型のＥ２Ｆ部位に対して効率的に結合したので、ＤＮＡ結合活性は、Ｅ２Ｆ 部位に対して特異的であった（図３ｂ、トラック５から８を比較のこと）。この ように、ＤＰ−１は、全細胞抽出物中のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ、ならびにアフィニ ティ精製 ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中のｐ４６と類似したＤＮＡ結合特異性を有している。対照 のＧＳＴ融合タンパク質は、ＤＮＡ結合活性を何ら有していなかった（図３ｂ、 トラック６から９を比較のこと）。ＤＰ−１／ＤＮＡ複合体の移動度が抗ＧＳＴ 血清によって変化したので、ＤＮＡ結合複合体中にＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204が存 在することが確認された。さらに、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204は、Ｅ２Ｆ部位と特 異的に架橋させることができるという特性も、ｐ４６と共通であった（図３ｃ、 トラック３と４を比較のこと）。したがって、ＤＰ−１は、Ｅ２Ｆ部位と配列特 異的に結合し、このＤＮＡ結合特異性に寄与しているのがＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中 のポリペプチドで、ある可能性が高い。 ＤＮＡ結合ドメインをさらに細かく画定しようとしても、うまくいかなかっ た。すなわち、ＤＰ−１のこの領域は、配列特異的認識を可能とする最小量のタ ンパク質に近い可能性が高く、したがって、おそらく、ＤＮＡ結合ドメインを画 定している。結局、この領域は、これまで特定されているいずれのＤＮＡ結合構 造とも関連性がなく、したがって、新たなグループのＤＮＡ結合ドメインである 。Ｅ２Ｆ−１のＤＮＡ結合ドメイン内に存在する領域と有意な類似性を有し、４ ２％のアミノ酸残基が同一で７０％が類似している（図５ｂ）狭い領域（ＤＰ− １のアミノ酸残基１６０から２００）が見いだされた（図４ａ）。二次構造を推 定したところ、これらの領域が２つのαヘリックスを有しており、その一方が両 親媒性であることが示唆された（図４ｃにヘリックスの輪として図示）。ＤＰ− １とＥ２Ｆ−１が同一のＤＮＡ配列と結合するため、この類似領域が、Ｅ２Ｆ結 合部位を構成しているＤ ＮＡ配列の認識に関与している可能性が高い。 この知見は、酵母の細胞周期の間に転写を調節している２種の別のＤＮＡ結 合タンパク質が、潜在的な類似性を有していることによっても支持される。すな わち、ＳＷＩ４ならびにｃｄｃ１０によってコードされている、酵母の出芽なら びに分裂の細胞周期調節タンパク質は、いずれもＥ２Ｆ部位と似たＤＮＡ配列と 結合し、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン内に、上述のＤＰ−１／Ｅ２ Ｆ−１のαヘリックス領域と共通の特徴を有する領域を含んでいる（図４ｃ）。 以上のことからすると、このＳＷＩ４／ｃｄｃ１０のタンパク質ドメインも、Ｄ ＮＡ配列の認識に関与している可能性がある。 ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との間のもう一つの類似領域が、ＤＮＡ結合ドメイン の外側に見いだされ（ＤＰ−１のアミノ酸残基２１０から２４０、同一のアミノ 酸残基は４１％、図４ｂ）、この領域も、前述の領域同様、両親媒性のαヘリッ クスを形成している可能性がある。この領域も、ＤＮＡ結合活性に寄与している 可能性がある。 ＤＰ−１^84-204は、タンパク質二量体化の作用領域も含んでいる可能性があ る。何故ならば、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204をアフィニティ精製したＤＲＴＦ１／ Ｅ２Ｆに加えると、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204あるいはアフィニティ精製したＤＲ ＴＦ１／Ｅ２Ｆ単独の場合より移動速度の遅いタンパク質−ＤＮＡ複合体が生じ るのに対し、対照のＧＳＴ融合タンパク質を加えてもほとんど影響がなかったか らである（図３ｄ）。この移動速度の遅い複合体は、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204が 、ＤＰ−１^84-204中に含まれる二量体 化ドメインを介して、アフィニティ精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中の別のタンパ ク質と相互作用した結果生じたものである可能性が高い。この領域でＤＰ−１と Ｅ２Ｆ−１との間でタンパク質配列が類似性を有していることからは、Ｅ２Ｆ− １が、こうした二量体化の相手として強力な候補であることが示唆される。ＤＰ−１は、インビボで転写を活性化する Ｅ２Ａプロモーターの遠位のＥ２Ｆ部位（−７１から−５０）は、最小の単 純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの上流側に位置させると、各 種の細胞、たとえばＳＡＯＳ−２ならびにＦ９ ＥＣ細胞で活性化配列として機 能する。ＤＰ−１が、Ｅ２Ｆ部位を介して、転写をトランス活性化しうるか否か を決定するために、ＤＰ−１のコード配列（アミノ酸残基６３から４２９）の発 現が、３つの野性型Ｅ２Ｆ結合部位あるいは３つの変異型Ｅ２Ｆ結合部位のいず れかによってそれぞれ誘導されるレポーター構築物ｐ３ｘＷＴならびにｐ３ｘＭ Ｔ（図５ａ）の転写活性に及ぼす影響を調べた。ＳＡＯＳ−２細胞では、ｐＧ− Ｂ９をｐ３ｘＷＴとともに用いてコトランスフェクションしたところ、ｐ３ｘＷ Ｔの転写活性が剌激されたのに対し、プラスミドｐＧ４では影響がなかった（図 ５ｂ）。同一トランスフェクション条件でも、ｐ３ｘＭＴあるいはｐＣＭＶｃａ ｔの活性は有意な影響を受けなかったので、ｐＧ−Ｂ９による転写の活性化は、 野性型のＥ２Ｆ部位に依存性であった（図５ｂおよびｃ）。このことから、ＤＰ −１が、野性型のＥ２Ｆ部位を介して転写を特異的に活性化していることが示さ れた。 このように、ＤＰ−１は、各種の細胞ならびに組織から調製された抽出物中 で調べられているＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ複合体中に存在する配列特異的なＤＮＡ結 合タンパク質である。 ｐＲｂもｐ１０７も、細胞周期依存的にＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと結合し、この 相互作用によって、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの転写活性が低減する。これらの複合体 は、転写活性を有する遊離形態のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆとともに、非同調培養の組 織培養細胞の抽出物で分離されうるものである。 ＤＰ−１タンパク質の驚くべき特徴は、このタンパク質が、ＤＲＴＦ１／Ｅ ２Ｆと類似した特性を有する最近記載されたタンパク質であるＥ２Ｆ−１と類似 した編成を有していることである。すなわち、これらのタンパク質のＤＮＡ結合 ドメインならびに類似領域は、タンパク質のそれら以外の部分が極めて異なって いるにもかかわらず、極めて似た位置に位置している（図４ａ）。Ｅ２Ｆ−１に 対する抗体によって、ＤＰ−１も含んでいる複合体がスーパーシフトするので、 Ｅ２Ｆ複合体中には、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１がともに存在している可能性が高い 。こうしたことから想起されるのは、他の転写因子活性、たとえばＡＰ−１に存 在するような、極めて異なったタンパク質同士が関連ドメインを介して相互作用 するという状況である。しかし、ＤＰ−１が、Ｅ２Ｆ結合部位上で形成されるす べてのＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ複合体中に存在しているのに対し、Ｅ２Ｆ−１は、抗 体スーパーシフト実験で、必ずしもすべての複合体中に存在しているわけではな いことが示されたので、ＤＰ−１には２種以上の相手が存在しており、おそらく 、こうした複合体では、Ｅ２Ｆ−１と似た別のポリペプチド がＤＰ−１とともに存在しているものと考えられる。 セクションＢ 哺乳動物細胞の細胞周期の調節では、細胞転写因子ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆが重 要な役割を果していることが、いくつかのセルラインの証拠から示唆されている 。たとえば、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性は、細胞周期が進行する間に 定期的に誘導されており、そのピークはＳ期の間であり（Mudryj et al.，1992 ；Shirodkar et al.，1992）、分化の間は負に調節されている（La Thangue and Rigby，1987）。この結合活性は、細胞が増殖する際に必要とされる特定の遺伝 子、たとえばＤＨＦＲ、ＤＮＡポリメラーゼα及びｐ３４^cdc2の転写活性と相関 しており、これらの遺伝子のプロモーターには、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ結合部位が 含まれている（Blake and Azizkhan，1989；Means et al.，1992；Dalton，1992 ）。さらに、細胞周期のＧ１期からＳ期への進行を負に調節し、腫瘍細胞では往 々にして変異している網膜芽腫抑制遺伝子産物が、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと結合す る（Bandara and La Thangue，1991；Chellapan et al.，1991）。この相互作用 の機能的な帰結として、ｐＲｂによって、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆが転写を活性化す ることが阻害される（Zamanian and La Thangue，1992）。細胞周期の制御に関 与していると考えられるいくつかの他の分子、たとえばＲｂに関連したｐ１０７ 、サイクリンＡおよびＥ、並びにｐ３３^ckd2も、細胞周期が進行する間に、ＤＲ ＴＦ１／Ｅ２Ｆと会合する（Bandara et al.，1991，1992；Mudryj et al.，199 1；Devoto et al.，1992；Lees et al.，1992）。こうした 観察結果を総合すると、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆによって細胞周期の現象が転写装置 と統合され、細胞周期が進行する間の適正な時点に、細胞が遺伝子の発現に適切 な変化を確実に生じさせるようになっていることを示唆する。 ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの重要性は、ウイルスの癌タンパク質の作用機構につい ての研究からも立証されている。すなわち、特定の癌タンパク質、たとえばアデ ノウイスルのＥｌａ、ＳＶ４０の大型Ｔ抗原及びヒトパピローマウイルスのＥ７ は、ｐＲｂならびに他の関連タンパク質を封鎖して、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆを転写 に関して不活性な形態から活性の形態へと転化することによって、ＤＲＴＦ１／ Ｅ２Ｆの活性を調節している（Zamanian and La Thangue，1992；Hiebert et al ，1992；Zamanian and La Thangue，1993）。この効果では、これらウイルスの 癌タンパク質中の、細胞の不死化ならびにトランスフォーメーションにとって必 要であることが既に示されている各種の領域が必要とされるので（Bandara and La Thangue，1991；Zamanian and La Thangue，1992）、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは こうした過程で重要な役割を果たしている可能性が高い。 ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと相互作用を生じる細胞タンパク質の特定に関しては進 歩がみられるものの、最近まで、その分子の詳細についてはほどんどわかってい なかった。現在では、ともにＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合成分である２つの 別個のポリペプチドが分子的に特徴づけされている。第一のＥ２Ｆ−１と称され るポリペプチドは、そのＣ末端領域によってｐＲｂと直接結合する能力を有して いることから単離された（Helin et al.，1992；Ka elin et al.，1992）。これに対し、ＤＰ−１は、分化過程の間にＤＲＴＦ１／ Ｅ２Ｆがダウンレギュレートされるような細胞系であるＦ９胚癌（embryonal ca rcinoma、ＥＣ）の幹細胞から生化学的にＤＲＴＦ１を精製した後に、ＤＲＴＦ １／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性の一成分として見いだされたものである（La Thang ue and Rigby，1987；La Thangue et al.，1990）。ＤＰ−１をコードしている ｃＤＮＡは、アフィニティ精製したＤＰ−１からのアミノ酸配列も得た後に単離 されたものである（Girling et al.，1993）。 Ｅ２Ｆ−１とＤＰ−１の双方とも、各ポリペプチドが配列特異的に、ホモ二 量体としてＥ２Ｆモチーフと結合することを可能とする領域を含んでいる（Heli n et al.，1992；Kaelin et al.，1992；Girling et al.，1993）。ＤＮＡ結合 ドメインは、これまでに画定されているいずれのＤＮＡ結合構造とも密接には関 連していないものの、酵母の細胞周期を調節している転写因子のいくつかと多少 の関連性を有している（La Thangue and Taylor，1993）。しかし、ＤＰ−１と Ｅ２Ｆ−１との間の機能上の関係性ははっきりしないままであった。本研究で、 我々が示すように、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、インビボで、Ｅ２Ｆ結合部位を認 識する複合体として存在している。さらに、インビトロでの検定によって、ＤＰ −１とＥ２Ｆ−１が、効率的かつ選択的に複合体としてＥ２Ｆ部位と結合し、そ の相互作用に際しては、この二種のタンパク質間の類似領域が必要であることが 立証された。さらに、ショウジョウバエならびに酵母細胞中でＤＲＴＦ１／Ｅ２ Ｆを再構築したところ、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１がＥ２Ｆ部位依存性の転 写活性化に際して相乗的に相互作用していることが示唆された。こうしたデータ から、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は機能的に相互作用しうるものであり、哺乳動物の 細胞では、そうした相互作用が生理学的に関連している可能性が高いことが示唆 される。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、ＨｅＬａ細胞中で複合体として存在している ＤＰ−１は、発達によって調節を受け、細胞周期によって調節を受けている マウスのＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ複合体中に存在するＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの構成成分 であり、したがって、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性の一般的な構成成分 である可能性が高い。さらに、本発明の発明者が、両生類ならびにショウジョウ バエで密接に関連したタンパク質が発現されることを観察していることからする と、ＤＰ−１は、保存遺伝子の産物である。このように、ＤＰ−１は、ＤＲＴＦ １／Ｅ２Ｆにほぼ常在する、進化上保存されたＤＮＡ結合成分であるようである 。ｐＲｂと直接結合する能力を有することによって単離されたＥ２Ｆ−１も、Ｅ ２Ｆ部位と配列特異的に相互作用する（Helin et al.，1992；Kaelin et al.，1 992）。双方のタンパク質とも、配列特異的なＤＮＡ結合活性に必要であること がすでに示されているドメインと重複する短い類似領域を含んでいる（Girling et al.，1992）。 ＤＰ−１ならびにＥ２Ｆ−１がＨｅＬａ細胞抽出物中で複合体として存在し ているのかどうかを、各タンパク質を特異的に認識する抗体を使用して調べた。 我々は、まず、ゲル遅延によって、ＤＰ−１がＨｅＬａ細胞のＤＲＴＦ１／Ｅ２ Ｆの構成成分である かどうかを決定した。抗ＤＰ−１抗血清の影響が、結合反応に、相同であって非 関連性ではないペプチドが存在すると競合されたので、Ｆ９胚癌（ＥＣ）細胞抽 出物の場合と同様、抗ＤＰ−１ペプチド抗血清は、ＨｅＬａ細胞のＤＲＴＦ１／ Ｅ２Ｆを特異的に阻害した（図６ａ、トラック２から５をトラック６から８と比 較のこと）。抗ＤＰ−１抗血清を使用してＨｅＬａ細胞抽出物からＤＲＴＦ１／ Ｅ２Ｆを免疫沈降させ、続いてこの免疫沈降物を遊離させて抗Ｅ２Ｆ−１モノク ローナル抗体で免疫ブロッティングした。抗Ｅ２Ｆ−１モノクローナル抗体で免 疫沈降物を免疫ブロッティングすると、Ｅ２Ｆ−１に関して予測される分子量を 有するポリペプチドが得られたので（図６ｃ、トラック４、矢印で表示）、抗Ｄ Ｐ−１によって免疫沈降したＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性（図６ｂ、ト ラック４と７を比較のこと）は、Ｅ２Ｆ−１タンパク質を含んでいた。免疫沈降 を相同なペプチドの存在下で行った場合には、Ｅ２Ｆ−１は存在していなかった ので（図６ｃ、トラック３と４を比較のこと）、Ｅ２Ｆ−１の存在は、抗ＤＰ− １活性に依存性であった。このように、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、ＨｅＬａ細胞 抽出物中で複合体として存在している。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、インビトロで、ＤＮＡ結合ヘテロ二量体中で相互に作 用する ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の双方とも、配列特異的なＤＮＡ結合ドメインを各タ ンパク質の類似した位置に有しており（ＤＰ−１ではアミノ酸残基８４から２０ ４まで、Ｅ２Ｆ−１ではアミノ酸残基８９から１９１まで、Girling et al.，19 93）、このＤＮＡ 結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインの外側まで（ＤＰ−１ではアミノ酸残基２ ４９まで）延在する類似領域を含んでいる。これまでの研究（Helin et al.，19 92；Kaelin et al.，1992；Girling et al.，1993）と同じく、ＤＰ−１とＥ２ Ｆ−１の双方とも、Ｅ２Ｆ部位がアデノウイルスのＥ２Ａプロモーターの状況に あっても（図７ａ、トラック２および３）、単一のＥ２Ｆ部位であっても（図７ ａ、トラック６で露出が増大していることで示されている。データ示さず）、Ｅ ２Ｆ部位とそれぞれ単独で結合することができた。ＤＰ−１のＤＮＡ結合活性は 、Ｅ２Ｆ−１のＤＮＡ結合活性より多少低かったが、その理由は現在のところ定 かではない。しかし、双方のタンパク質が同じ結合反応中に存在していると、Ｅ ２Ｆ部位へのＤＮＡ結合活性が増大することが示された（図７ａ、トラック２お よび３をトラック４と、トラック６および７をトラック８と比較されたい）。こ のＤＮＡ結合活性は、２種のＤＮＡ結合活性の相加効果から予測されるよりはる かに高く、このことから、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が協同してＥ２Ｆ部位を相乗的 に認識していることが示唆された。 ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の双方がＤＮＡ結合複合体中に存在することは、それ ぞれのタンパク質に特異的な抗血清を使用することによって確認された。抗Ｅ２ Ｆ−１ペプチド抗血清がＤＮＡ結合複合体をスーパーシフトさせたのに対し（図 ７ａ、トラック８と１０を比較のこと）、抗ＤＰ−１ペプチド抗血清はＤＮＡ結 合活性を阻害した（図７ａ、トラック１１と１２を比較のこと）。しかし、抗Ｄ Ｐ−１抗血清の効果は、さほど劇的ではなく、その理由はさだかではないが、こ の抗体に対するエピトープが、ＤＰ −１のＤＮＡ結合ドメインに近接して位置していて、利用可能であったことと関 連している可能性がある（Girling et al.，1993）。 この検定を使用して、Ｅ２Ｆ−１とともにＤＮＡ結合複合体を生成するうえ で必要なＤＰ−１中の領域を決定した。すなわち、ＤＰ−１の各種の誘導体をＧ ＳＴ融合タンパク質として発現させ、トロンビンで開裂させ、Ｅ２Ｆとの相互作 用について検定した。ＤＰ−１のこれらの誘導体は、野性型タンパク質の端部を 切り取ったものとしたので、こうした誘導体がＥ２Ｆ−１と相互に作用して機能 的ＤＮＡ結合活性を生成しえた場合には、生じたＤＮＡ結合複合体は、ＤＰ−１ の場合より小型で、したがって、より移動速度が速いはずである。また、移動速 度の速い複合体が一種のみ示された場合には、２種のタンパク質のヘテロ二量体 が生じたというのが、もっとも有力な説明だということになる。実際、ＤＰ−１^84-249 あるいはＤＰ−１^84-204をＥ２Ｆ−１（ＧＳＴ−Ｅ２Ｆ−１^89-437）と混 合すると、Ｅ２Ｆ−１単独（図７ｂ、トラック１をトラック２および３と比較の こと）、あるいはＥ２Ｆ−１／ＤＰ−１（図７ａ）より移動速度の速いＤＮＡ結 合複合体が形成され、ＤＰ−１のこれらの２種の誘導体がＥ２Ｆ−１と相互作用 しうるものであり、二量体を形成しているらしいことが示唆された。この場合も 、Ｅ２Ｆ−１／ＤＰ−１^84ー249複合体のＤＮＡ結合活性は、Ｅ２Ｆ−１単独（図 ７ｂ、トラック１を２および３と比較のこと）、あるいはＤＰ−１^84-249より高 かった。ちなみに、ＤＰ−１^84-249は、この検定で用いた条件ではＤＮＡ結合活 性が低かったものの（データ示さず）、Ｅ２Ｆ部位を特異 的に認識することができる（Girling et al.，1993）。Ｅ２Ｆ−１／ＤＰ−１^{84 -204} 反応のＤＮＡ結合活性は、Ｅ２Ｆ−１／ＤＰ−１^84-249より低く、ＤＰ−１ のアミノ酸残基２０４と２４９の間の、Ｅ２Ｆ−１と有意な類似性を示す（Girl ing et al.，1993）領域が、ＤＮＡ結合活性にも影響を及ぼしていることが示唆 された。ＤＰ−１^84-249とＤＰ−１^84-204が有する相乗的なＤＮＡ結合活性は、 非開裂ＧＳＴ融合タンパク質をＥ２Ｆ−１と混合した場合にも示されたものの、 サイズが大きいのでＤＮＡ結合複合体の移動速度の上昇は生じなかった（図７ｂ 、トラック１をトラック４および５と比較のこと）。この領域を、Ｎ末端（ＤＰ −１^146-249）あるいはＣ末端（ＤＰ−１^84-166）のいずれかからこれ以上欠失 させると、得られた誘導体は、ＧＳＴ融合タンパク質としても（図７ｂ、トラッ ク１をトラック６および７と比較のこと）、開裂させても（データ示さず）、Ｅ ２Ｆ−１とともにＤＮＡ結合複合体を形成することはなく、ＤＰ−１^84-204が、 これまで規定された中で、Ｅ２Ｆ−１とともにＤＮＡ結合複合体を生成しうる最 小の領域であることが示唆された。 Ｅ２Ｆ−１／ＤＰ−１^84-249複合体の、アデノウイルスのＥ２Ａプロモータ ーの遠位のＥ２Ｆ部位から誘導した一連の結合部位（La Thangue te al.，1990 ；Shivji and La Thangue，1991）に対するＤＮＡ結合特異性を分析したところ 、Ｅ２Ｆ−１単独の場合のＥ２Ｆ部位とのＤＮＡ結合特異性（図７ｃ、トラック ３から６をトラック８から１１と比較のこと）、さらにはＦ９ ＥＣの細胞抽出 物で画定されたＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ部位とのＤＮＡ結合活性（図７ｃ、トラック １３から１６を比較のこと）と極めて 類似していることが示された。 ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との間の相互作用をさらに特徴づけするために、我々 は、インビトロで転写され、翻訳されたＥ２Ｆ−１ポリペプチドが、ＤＰ−１の ＧＳＴ融合タンパク質と結合しうるような検定を用いた。ＧＳＴ融合タンパク質 をグルタチオン−アガロースビーズで集め、結合したＥ２Ｆ−１ポリペプチドを 遊離させてから、Ｅ２Ｆ−１がＤＰ−１と相互作用する能力を調べた。ＧＳＴ− ＤＰ−１^84-249ならびにＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204と結合したＥ２Ｆ−１の量は、 ＧＳＴビーズ単独によって結合されたＥ２Ｆ−１の量より有意に多く（図７ｄ、 トラック２とトラック３および６と比較のこと）、ＤＰ−１^84-249とＤＰ−１^{84 -204} の双方とも、Ｅ２Ｆ−１と相互作用しうるものであり、この結果は、ＤＰ− １^84ー249とＤＰ−１^84ー204がＤＮＡ結合ヘテロマーを形成する能力を有している ことと合致していた（図７ｂ）。ＤＰ−１^146-249もＥ２Ｆ−１と結合したのに 対し、ＤＰ−１^84-166は結合しなかった（図７ｄ、トラック２をトラック４およ び５と比較のこと）。したがって、ＤＰ−１^146-249は、これまでの結果からし て二量体化ドメインである可能性の高いドメインを含んでおり、ＤＰ−１^{146ー24 9} は、このドメインによってＥ２Ｆ−１と相互作用しうるものの、このヘテロ二 量体はＤＮＡと結合するうえで十分なアミノ酸配列を欠いている。複合体がＤＮ Ａと結合するには、ＤＰ−１^84-249のもっと別の情報が必要である。したがって 、これらのデータからは、ＤＰ−１のＥ２Ｆ−１との類似領域（アミノ酸１６３ から２３６）が二量体化ドメインを含んでおり、ＤＮＡ結合活性のためには、さ らにＮ末端側の配列が 必要であることが示唆される。これらのデータのまとめを、図７ｅに示す。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、酵母細胞中で相互に作用する ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が、インビボで直接相互作用するかどうかを決定する ために、我々は、ＤＰ−１から誘導されたものと、Ｅ２Ｆ−１から誘導されたも のの２種のハイブリッドタンパク質を合成する発現ベクターを利用する、既に記 載されている（Fields and Song，1989）酵母細胞での検定システムを採用した 。第一に、ＤＰ−１をコードする配列を、細菌のＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結 合ドメインと融合して、ｐＬＥＸ．ＤＰ−１を作製し、第二に、Ｅ２Ｆ−１をコ ードする配列であるｐＧＡＤ．Ｅ２Ｆ−１を、酵母のＧａ１４タンパク質の酸性 転写活性化ドメイン（ＡＡＤ）と融合した。ｐＬＥＸ．ＤＰ−１がＬｅｘＡ結合 部位によって誘導されたレポーター構築物を活性化しなかったのに対し、ｐ５３ タンパク質から取り出したトランス活性化ドメインを含むハイブリッドタンパク 質は、レポーター構築物を活性化できた（図８）。しかし、ｐＬＥＸ．ＤＰ−１ とｐＧＡＤ．Ｅ２Ｆ−１を一緒に発現させると、ＬｅｘＡレポーター構築物の転 写活性は、ｐＬＥＸ．ＤＰ−１あるいはｐＧＡＤ．Ｅ２Ｆ−１のいずれかを単独 で発現させた場合と比べて相当増大（約７５倍）した（図８）。この結果を、本 論文に示したこれまでの結果と組み合わせると、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が、イン ビボで直接相互作用することが強力に示唆される。ＤＰ−１は、インビボで、Ｅ２Ｆ部位依存性の転写を調節する 各種の哺乳動物細胞（たとえば、Ｆ９ ＥＣ、ＳＡＯＳ−２、および３Ｔ３ ）ならびに成育条件で、ＤＰ−１タンパク質のレベルを上げても、Ｅ２Ｆ部位依 存性レポーターの転写活性を有意に剌激することはできなかった（データ示さず ）。したがって、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が機能的に相互作用するのかどうかを調 べるためには、我々はもっと別のアプローチをとる必要があった。（ａ）ショウジョウバエでの検定 第一のアプローチでは、これまでも哺乳動物の転写因子の活性を調べるため に使用されてきた細胞系であるショウジョウバエのＳＬ２細胞（Courey and Tji an、1988）での適当な検定を開発した。この細胞は、ゲル遅延によって調べた場 合の内在的なＥ２Ｆ部位ＤＮＡ結合活性が極めて低いので、こうした検定に特に 適当であった（データ示さず）。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の機能的な相互作用を調 べるために、我々は、３つのＥ２Ｆ部位によって誘導されるレポーター構築物で あるｐ３ｘＷＴ（図９ａ、Zamanian and La Thangue，1991）の転写活性に、各 タンパク質が単独で、あるいは、双方のタンパク質が一緒に発現した場合に及ぼ す効果を測定した。すなわち、Ｅ２Ｆ−１が量依存的にｐ３ｘＷＴを活性化しえ たのに対し（図９ｂおよびｃ、レーン１と２を比較のこと）、ＤＰ−１はそうで はなく（図９ｂおよびｃ、レーン３と４を比較のこと）、この結果は、哺乳動物 細胞でのＥ２Ｆ−１ならびにＤＰ−１の挙動と類似していた（Helin et al.，19 92；Kaelin et.，1993；データ示さず）。しかし、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１ を一緒に発現させると、それぞれの単独の場合と比べて、はるかに高いＥ２Ｆ部 位依存性の転写活性化が示された（図９ｂおよびｃ、レーン１、３、および５を 比較のこと）。さらに、ＤＰ−１のレベルを上昇させると、より多くのＥ２Ｆ部 位依存性の転写が生じ（図９ｂおよびｃ、レーン１、５、および６を比較のこと ）たので、この相乗効果は滴定可能であり、また、Ｇａｌ４タンパク質から誘導 され非関連性のＤＮＡ結合タンパク質と共に発現させても何ら有意な効果が生じ なかったので（図９ｂおよびｃ、レーン５および６と７および８を比較のこと） 、この相乗効果は特異的であった。また、ｐ３ｘＭＴを用いて実施した同様の実 験によって、この活性化が野性型のＥ２Ｆ部位に特異的であることが示された（ データ示さず）。したがって、Ｅ２Ｆ部位依存性の転写では、ＤＰ−１とＥ２Ｆ −１が機能的に相互作用しており、この相互作用は相乗的であると考えられる。（ｂ）Ｆ９ ＥＣ細胞での検定 別のアプローチでは、内在的なＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ転写活性を損ないうるよ うなＤＰ−１の「ドミナントネガティブ」（“dominant negative”）誘導体を 設計した。Ｎ末端領域とＣ末端領域の双方のアミノ酸配列が欠損したＤＰ−１^{73 -340} を調製した。すなわち、高レベルのＥ２Ｆ部位依存性の転写活性を含むＦ９ ＥＣ細胞（Zamanian and La Thanque，1992）でＤＰ−１^73-340を発現させる と、ｐ３ｘＷＴの活性が明らかに低減し（図１０ｃ、トラック１および２をトラ ック７および８と比較のこと、定量の結果は下側に図示）、この効果は、変異型 のＥ２Ｆ部位を有する レポーターｐ３ｘＭＴの活性もｐＣＶｃａｔの活性も影響を受けなかったことか ら、野性型のＥ２Ｆ部位に特異的であった。これまでの結果からすると、ＤＰ− １^73-340のこうした効果についての有力な説明は、ＤＰ−１^73ー340がＥ２Ｆ−１ を封鎖して、転写を活性化しえないヘテロマーが形成され、それにより、関与し うるＥ２Ｆ−１の量が限定されるというものであった。Ｅ２Ｆ−１をＤＰ−１^{73 ー340} の存在下で発現させると、「ドミナントネガティブ」な活性が克服され、Ｅ ２Ｆ部位依存性の転写活性が部分的に修復された（図１０ｃ、トラック７および ８をトラック９および１０と比較のこと）。Ｅ２Ｆ−１がＥ２Ｆ転写活性を修復 する能力を有していることは、ＤＰ−１^73-340がＥ２Ｆ−１を封鎖して不活性な 転写複合体とする考え方と一致し、哺乳動物の細胞でＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との 間の相互作用が生じているという考え方と適合するものである。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、酵母細胞中で、Ｅ２Ｆ部位依存性の転写を活性化する 次に、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が、酵母細胞中でのＥ２Ｆ部位依存性の転写の 際に機能的に相互作用しうるかどうかを決定するために、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１ を調べた。この目的で、アデノウイルスのＥ２Ａプロモーターから取り出したＥ ２Ｆ結合部位によって、酵母のｃｙｃ１プロモーターが誘導されている構築物を 使用した。ｐ４ｘＷＴ ＣＹＣ１では、４つのＥ２Ｆ結合部位がｃｙｃ１プロモ ーターを誘導しており（図１１ａ）、転写をｐ４ｘＭＴ ＣＹＣ１の活性の約１ ２倍活性化している（データ示さ ず）。この転写活性は、さらに、Ｅ２Ｆ−１発現ベクターｐＧＡＤ．Ｅ２Ｆ−１ を導入した際にも剌激可能であった。すなわち、ｐＧＡＤ．Ｅ２Ｆ−１は、ｐ４ ｘＷＴ ＣＹＣ１の転写活性を、ＤＰ−１の発現ベクターであるｐＬＥＸ．ＤＰ −１が同一のレポーター構築物に対して有していた低い効果と比較して、約１０ 倍増大させた（図１１ｂ）。しかし、Ｅ２Ｆ−１とＤＰ−１を同時に発現させる と、ｐ４ｘＷＴ ＣＹＣ１の活性はさらに増大し、通常、基準となるｐ４ｘＷＴ ＣＹＣ１の活性の約５０倍となった（図５ｂ）。ｐ４ｘＭＴ ＣＹＣ１の活性 は、Ｅ２Ｆ−１の発現ベクターによっても、ＤＰ−１の発現ベクターによっても 有意な影響を受けなかった（データ示さず）。こうしたことから、ＤＰ−１とＥ ２Ｆ−１は、片方ずつ単独で存在する場合より同時に存在する場合の方が、Ｅ２ Ｆ部位依存性の転写を効率よく活性化することが示され、Ｅ２Ｆ部位依存性の転 写の際には、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が相乗的に相互作用していることが再度示唆 された。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、哺乳動物細胞中で相互作用する これまでの研究で、Ｆ９ ＥＣ細胞では、ＤＰ−１が、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ のＤＮＡ結合活性の普遍的成分であることが示された。何故ならば、Ｅ２Ｆ部位 上で見いだされるＤＮＡ結合複合体は、いずれも、抗ＤＰ−１抗体によって阻害 されるためである（Girling et al.，1993）。同一の状況がＨｅＬａ細胞の抽出 物についても存在しており、ＨｅＬａ細胞の抽出物でも、すべてのＤＲＴＦ１／ Ｅ２ＦのＤＮＡ結合複合体が、抗ＤＰ−１抗体の影 響を受けている（図６ａ）。こうした観察結果からすると、そして、こうした観 察を他種の細胞について行われた研究（Bandara et al.、作成中）と考えあわせ ると、我々は、ＤＰ−１が、転写因子ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆにほぼ常時存在してい る構成成分であると考える。 こうした観察結果に鑑みて、我々は、ＤＰ−１が、もう一方のＥ２Ｆ部位Ｄ ＮＡ結合タンパク質であるＥ２Ｆ−１（Helin et al.，1992；Kaelin et al.，1 992）と相互作用しうるのかどうかを決定し、さらに、こうした相互作用が、生 理学的条件の下で生じるのかどうかをはっきりさせることが重要であると考えた 。我々の結果では、ＨｅＬａ細胞抽出物中で、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が複合体と して存在することが示されており、このことは、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの全ＤＮＡ 結合活性のうち、少なくとも一部がＤＰ−１とＥ２Ｆ−１を含むヘテロマー複合 体である可能性が高いことを意味している。抗Ｅ２Ｆ−１抗体を使用してゲル遅 延検定でのＤＮＡ結合活性に影響を及ぼす試みがうまくいかなかったので（デー タ示さず）、今のところ、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性のうち、どのく らいの部分がＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の複合体であるのかはわかっていない。また 、Ｅ２Ｆ−１でなく、他のタンパク質がＤＰ−１と結合している可能性も除外す ることができない。実際、アフィニティ精製したＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中の分子量 の異なる（４５から５５，０００）数種のポリペプチドが、Ｅ２Ｆ部位と特異的 に結合することができるので（Shivji and La Thangue，1991；Girling et al. ，1993）、Ｅ２Ｆ−１以外のタンパク質がＤＰ−１と結合している可能性もあり そうだ。インビトロならびに酵母細胞中でのＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との間の物理的相互作 用 我々は、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１のＤＮＡ結合特性をゲル遅延検定で研究する ことによって、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が直接相互作用しうるものであることを明 確にした。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、粗製細胞抽出物中のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆが 有しているＤＮＡ結合特異性とまさしく同一のＤＮＡ結合特異性を有するヘテロ マーＤＮＡ結合体を形成した（La Thangue et al.，1990）。さらに、このヘテ ロマーのＤＮＡ結合活性は、ＤＰ−１あるいはＥ２Ｆ−１が単独で有するＤＮＡ 結合活性より相当高いことが示され、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が相乗的に相互作用 することが示唆された。Ｅ２Ｆ−１とともにＤＮＡ結合複合体を形成するうえで 必要なＤＰ−１の領域の分子的分析により、この２種のタンパク質の間の類似領 域が、さらにＮ末端側のドメインとともに必要とされていることが示された。こ の類似領域は、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１とが互いに結合することを可能としており 、したがって、二量体化ドメインを構成している可能性が高い。 我々は、こうした観察結果を、転写因子のモジュール編成を利用した検定（ Fields and Song，1989）を使用することによって、酵母細胞で確認した。すな わち、ＤＰ−１を細菌のＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインと結合し、そしてこれとは 別の分子で、Ｅ２Ｆ−１を、酵母のＧａ１４タンパク質の酸性転写活性化ドメイ ンと結合した。この検定では、２種のハイブリッドタンパク質の間に物理的相互 作用が生じた場合にのみ、機能的な活性化ドメイン がＬｅｘＡ依存性のプロモーターに補充される。２種のハイブリッドタンパク質 を一緒に発現させると、ＬｅｘＡ依存性のレポーターが強力に活性化された。し たがって、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、酵母細胞中で物理的に相互作用しうるもの であった。さらに、この結果から、ＬｅｘＡによってＤＮＡ結合特異性が提供さ れるので、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、ＤＮＡと結合することなく相互に作用する ことができ、かくして、Ｅ２Ｆ結合部位とは独立に生じるものであることが示唆 された。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１による、インビボでの転写の相乗作用 我々は、ショウジョウバエならびに酵母の細胞で、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１と の間の相互作用がＥ２Ｆ部位依存性の転写にどのような機能的帰結を及ぼすのか を検討した。我々がこうしたアプローチをとったのは、野性型のＤＰ−１を哺乳 動物の細胞に導入することによって転写を活性化しようという試みが、理由はは っきりしないものの、内在的なＤＰ−１タンパク質のレベルに関連している可能 性のある理由から、部分的にしかうまくいかなかったからである。 ショウジョウバエの細胞で行った検定でも、酵母細胞で行った検定でも、Ｄ Ｐ−１とＥ２Ｆ−１は、Ｅ２Ｆ部位依存性の転写に際して、両者が一緒に発現さ れると、いずれかのタンパク質が単独で発現された場合よりも転写の活性化がよ り効率的であったので、両者が相乗的に相互作用していることが示唆された。こ うした効果の説明としては、ＤＰ−１／Ｅ２Ｆ−１ヘテロ二量体のＤＮＡ結合活 性は、いずれかのホモ二量体より安定であって、し たがって、転写活性化の効率が高いのだという説明が有力である。この考え方は 、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１が相乗的に相互作用していることを示唆している、本研 究でさきに示したインビトロでのＤＮＡ結合データと完全に一致する。しかし、 我々は、ＤＰ−１／Ｅ２Ｆ−１ヘテロ二量体中の潜在的な転写活性化ドメインの 活性化をはじめとする他の要因が影響している可能性を除外することはできない し、実際、最近の実験では、こうした可能性が正しいらしいことが示唆されてい る（Zamanian and La Thangue、未発表データ）。 結論を述べると、我々が実証したように、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、転写因 子であるＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ中で、相互に作用してＤＮＡ結合複合体を生成し、 このＤＮＡ結合複合体は、それぞれのホモ二量体より好適な状態である。Ｅ２Ｆ −１はｐＲｂと結合することができるので（Helin et al.，1992；Kaelin et al .，1992）、こうした複合体中では、ｐＲｂによって認識される領域がＥ２Ｆ− １によって提供されることにより、この特定のＥ２Ｆ部位ＤＮＡ結合活性の転写 活性が、ｐＲｂによって調節されることが可能となっているらしい。他の分子が Ｅ２Ｆ−１のかわりに（そしておそらくはＥ２Ｆ−１との関連で）ＤＰ−１とヘ テロ二量体を形成し、Ｅ２Ｆ／ＤＲＴＦ１と相互作用を生じることが知られてい る他のタンパク質、たとえばｐ１０７（Zamanian and La Thangue，1993）によ って認識される領域を提供し、その結果、こうした分子によるＥ２Ｆ部位依存性 の転写の調節が可能となっていることもありうる。したがって、我々は、共通の 構成成分としてＤＰ−１を有する別個のヘテロ二量体がＥ２Ｆ部位を認 識することによって、異なった分子、たとえばｐＲｂならびにｐ１０７が、それ ぞれの生物学的活性を転写装置と統合して、Ｅ２Ｆ／ＤＲＴＦ１によって作動さ れている遺伝子を調節することが可能となっていると考える。材料および方法 細胞抽出物の調製、ゲル遅延、ならびに免疫化学的技法 細胞抽出物を、既に記載されているようにして（La Thangue et al.，1990 ）調製した。抗ＤＰ−１の存在下での、Ｆ９ ＥＣ細胞抽出物ならびにＨｅＬａ 細胞抽出物（約６．０μｇ）でのゲル遅延を、既に記載されているようにして（ Girling et al.，1993）実施し、ＨｅＬａ細胞抽出物からの抗ＤＰ−１を用いた 免疫沈降を、標準的な手順によって実施した。免疫沈降物を１％ＤＯＣならびに １．５％ＮＰ４０で処理し、界面活性剤によって遊離された物質を、ゲル遅延に よってＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆについて検定し、抗Ｅ２Ｆ−１モノクローナル抗体Ｓ Ｑ４１（Kaelin et al.，1992）を用いた免疫ブロッティングによってＥ２Ｆ− １の存在について検定した。抗ＤＰ−１抗体、抗ペプチドＡ、ならびに抗ペプチ ド１８は、既に記載されている（Girling et al.，1993）。ウサギ抗Ｅ２Ｆ−１ 抗血清（抗血清１３４）を、Ｅ２Ｆ−１のアミノ酸配列の３１５から３２３であ るペプチドに対して生成した。ＤＮＡとの結合に際しての特異性を調べるにあた って使用する結合部位の配列は、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターから誘導し （−７１から−５０）、以下のとおりであった。野生型、ＴＡＧＴＴＴＴＣＧＣ ＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡ；６２／６０、 ＴＡＧＴＴＴＴＣＧＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡ；６３、ＴＡＧＴＴＴＴＣＴＣ ＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡ；６４、ＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴ ＧＡ。図２ａ（トラック１から４）では、アデノウイルスのＥ２Ａプロモーター （−９６から＋６８）を使用し、それ以外の事例では、いずれも、Ｅ２Ａプロモ ーターの遠位のＥ２Ｆ部位（−７１から−５０の配列）を使用した。ゲル遅延検 定では、約１００倍過剰量の競合結合部位を使用した。融合タンパク質ならびにインビトロでの翻訳 ＤＰ−１ならびにＥ２Ｆ−１を、既に記載されているようにして（Girling et al.，1993）ＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、発現したＧＳＴ融合タン パク質から遊離させた。ゲル遅延検定では、アデノウイルスのＥ２Ａプロモータ ーから取り出した結合部位（−７１から−５０）とともに、約１００倍過剰量の 競合結合部位を使用した。野生型のＥ２Ｆ−１をコードする配列を転写し、網状 赤血球溶解液（Promega）を使用してさらに翻訳し、³⁵Ｓメチオニンで放射標識 した。二量体化検定（図２ｄ）では、ＧＳＴ−ＤＰ−１融合タンパク質をＥ２Ｆ −１ポリペプチドとともに３０℃にて３０分間インキュベートし、グルタチオン −アガロース（Sigma）を用いて集め、ＮＰ４０の０．１％ＰＢＳＡ溶液で繰り 返し洗浄した。結合したＥ２Ｆ−１ポリペプチドを、ＳＤＳサンプル緩衝液中で の変性によって遊離させ、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離した。酵母での検定 ｐＢＴＭ１１６は、酵母のＡＤＨｌプロモーターの制御下にある完全なＬｅ ｘＡコード配列（１から２０２）を含んでいる。ｐＬＥＸ．ＤＰ−１は、ｐＢＴ Ｍｌ１６中のＬｅｘＡコード配列の下流側に、ＤＰ−１のコード配列（アミノ酸 ５９からＣ末端まで）を含んでいる。ｐＢＴＭｌ２６は、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合 ドメインの下流側に、野生型のマウスｐ５３のコード配列（アミノ酸１から３４ ６）を有している。ｐＧＡＤ．Ｌ６は、酵母のＡＤＨｌプロモーターの制御下に あるＧａｌ４転写活性化ドメイン（アミノ酸残基７６８−８８１）を含むｐＧＡ Ｄ２Ｆ（Chien et al.，1991）の誘導体である。ｐＧＡＤ．Ｅ２Ｆ−１は、Ｇａ １４活性化ドメインの下流側に、完全なＥ２Ｆ−１のコード配列（アミノ酸１− ４３７）を含んでいる。ｐ４ｘＷＴ ＣＹＣ１ならびにｐ４ｘＭＴ ＣＹＣ１は 、ｐＬＧΔ１７８（Guarente and Mason，1983）から誘導した。野生型のＥ２Ｆ 部位は、アデノウイルスのＥ２Ａプロモーターの−７１から−５０の領域から取 り出し、変異部位は、ヌクレオチド−６２から−６０を変異させた（La Thangue et al.，1990）。酵母での相互作用の検定（図３）に際しては、２コピーの７ ８ｂｐオリゴヌクレオチドを有し、各コピーがＧＡＬ１−ｌａｃＺの転写開始部 位の上流側にＬｅｘＡ二量体の２つのｃｏｌＥ１オペレーターまたは４つの結合 部位を含んでいる組込みプラスミドを含む酵母ＣＴＹ１０−５ｄ株（ＭＡＴａ ａｄｅ２ ｔｒｐ１−９０１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｈｉｓ３−２００ ｇａ ｌ４ ｇａｌ８０ ＵＲＡ３：：ｌｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺ）を、図示の発現ベク ターで形質転換した。 酵母でのＥ２Ｆ部位依存性の転写の検定（図５）に際しては、ｐ４ｘＷＴ ＣＹ Ｃ１あるいはｐ４ｘＭＴ ＣＹＣ１を有する酵母Ｗ３０３１ａ株（ＭＡＴａ ａ ｄｅ２−１００ ｔｒｙｐ１−１ ｌｅｕ２−３ １１２ ｈｉｓ３−１１ ｕ ｒａ３）を使用し、図示の発現ベクターで形質転換した。中間対数期の培養のβ −ガラクトシダーゼ活性を、既に記載されているようにして（Johnson et al.， 1986）定量した。β−ガラクトシダーゼ活性は、少なくとも３つの独立した形質 転換体について測定した。ショウジョウバエの組織培養細胞のトランスフェクション レポーター構築物は、いずれもｐＢＬｃａｔ２由来であり、これらは既に記 載されているものである（Zamanian and La thangue，1992）。白い四角と黒い 四角は、それぞれ野生型と変異型のＥ２Ｆ結合部位を示す。ｐＤＰ−１は、完全 なＤＰ−１タンパク質をコードしており、ｐＧ４ｍｐｏｌｙＩＩは、Ｇａｌ４の ＤＮＡ結合部位をコードしている（Webster et al.，1989）。ｐＥ２Ｆ−１は、 ｐＣＭＶ ＲＢＡＰ−１として既に記載されているものである（Kaelin et al. ，1982）。細胞は、リン酸カルシウム法でトランスフェクションして、その４０ から４５時間後に回収し、各トランスフェクションごとに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ ＫＳを用いて、最終ＤＮＡ濃度を一定に保った。いずれのトランスフェク ションも、内部対照としてｐＣＭＶβ−ｇａｌを含むものとした。ＣＡＴ活性の 検定、トランスフェクション効率についての補正、ならびにＴＬＣプレートの定 量は、既に記載されている（Zamanian and La Thangue，1992）。哺乳動物細胞のトランスフェクション レポーター構築物は、いずれも、ｐＢＬｃａｔ２由来であり、これらの構築 物は既に記載されている（Zamanian and La thangue，1992）。白い四角と黒い 四角は、それぞれ野生型と変異型のＥ２Ｆ結合部位を示す。プラスミドｐＤＰ− １^73-340は、ｐＧ４ＭｐｏｌｙＩＩのＧａｌ４配列（Webster et al.，1989）の 下流側に融合させた、野生型ＤＰ−１配列のアミノ酸７３−３４０の範囲のタン パク質をコードしている。ｐＣＭＶ Ｅ２Ｆ−１は、ｐＣＭＶ ＲＢＡＰ−１と して既に記載されている（Kaelin et al.，1982）。Ｆ９ ＥＣ細胞の培養とそ のトランスフェクションについても、既に記載されている（Zamanian and La Th angue，1992）。各トランスフェクションごとに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ Ｓを用いて最終ＤＮＡ濃度を一定に保った。いずれのトランスフェクションも、 内部対照としてｐＣＭＶβ−ｇａｌを含むものとした。ＣＡＴ活性の検定、なら びにＴＬＣプレートの定量は、既に記載されている（Zamanian and La Thangue ，1992）。図面の詳細な説明 図６ ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、インビボで、同一タンパク質複合体中に存在する ａ）ＤＰ−１は、ＨｅＬａ細胞抽出物中で形成されたＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合複合体中に存在する：ゲル遅延を行い、その際、Ｆ９ ＥＣならびに ＨｅＬａの全細胞抽出物（ゲル遅延 検定では、ＤＲＴＦ１は、３つの別々の複合体ａ、ｂならびにｃに分離する、図 示）を、アデノウイルスのＥ２Ａプロモーターから取り出したＥ２Ｆ結合部位（ ヌクレオチド−７１から５０）とともに、前免疫（ＰＩ；トラック２および６） あるいは免疫（Ｉ；トラック３から５ならびに７から９）抗ＤＰ−１（ペプチド Ａ）抗血清の存在下で、非関連性のペプチド１（トラック４および８）あるいは ペプチドＡ（トラック５および９）のいずれかを加えて使用した。Ｆ９ ＥＣの 細胞抽出物でも、ＨｅＬａの細胞抽出物でも、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合 複合体のすべてが抗ＤＰ−１抗体によって影響を受けた。 ｂ）抗ＤＰ−１は、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性を免疫沈降させる ：ＨｅＬａ細胞抽出物からの免疫沈降を、相同ペプチドＡ（トラック２から４） 、あるいは非関連性のペプチド１（トラック５から７）の存在下で抗ＤＰ−１を 用いて行った。免疫沈降物を１％デオキシコール酸（ＤＯＣ）ならびに１．５％ ＮＰ４０で処理し、界面活性剤によって放出された物質を、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ のＤＮＡ結合活性について調べた。免疫沈降後のＨｅＬａ細胞抽出物も示す（Ｓ ｎ；トラック２および５）。界面活性剤処理を行わなかった場合には、ＤＮＡ活 性は放出されなかった（ｃで示す；トラック３および６）。 ｃ）ＤＰ−１免疫沈降物の抗Ｅ２Ｆ−１による免疫ブロッティング：ペプチ ドＡ（トラック３）あるいはペプチド１（トラック４）のいずれかの存在下で行 われた抗ＤＰ−１の免疫沈降物を、抗Ｅ２Ｆ−１モノクローナル抗体ＳＱ４１で 免疫ブロッティングした。トラック４に存在するＥ２Ｆ−１ポリペプチドを矢印 で示 す。陽性対照として、トラック２で約１００ｎｇのＥ２Ｆ−１融合タンパク質Ｇ ＳＴ−Ｅ２Ｆ−１^89-437を免疫ブロッティングした。トラック１は、標準分子量 を示す。 図７ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、複合体としてＥ２Ｆ部位に結合する ａ）ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、Ｅ２Ｆ部位へのＤＮＡの結合にあたって、相 乗的に相互作用する：ＧＳＴ−ＤＰ−１^59-410（約２５ｎｇ）あるいはＧＳＴ− Ｅ２Ｆ−１^89-437（約５０ｎｇ）を、単独で（トラック２、３、６、および７） 、あるいは一緒にして（トラック４および８）、アデノウイルスのＥ２Ａプロモ ーター（トラック１から４）、あるいはＥ２Ａプロモーターから取り出した遠位 Ｅ２Ｆ部位（トラック５から８）との結合性について調べた。トラック１ならび に５は、結合部位のみの場合を示す。露光を増大させると、トラック６でＤＮＡ 結合複合体が現れたことに注意されたい（データ示さず）。複合体のＥ２Ｆ部位 特異性を、適当な競合実験を行うことによって確認した（データ示さず）。ＧＳ Ｔ−Ｅ２Ｆ−１^89-437を単独で用いた場合（トラック９）、あるいは、ＧＳＴ− Ｅ２Ｆ−１^89-437とＧＳＴ−ＤＰ−１^59-410を一緒に用いた場合（トラック１０ 、１１、ならびに１２）に、抗Ｅ２Ｆ−１（トラック９および１０）あるいは抗 ＤＰ−１（トラック１１および１２；抗ペプチド１８；Girling et al.，1993） が有する影響を調べた。また、トラック１１および１２の反応物質は、非関連性 のペプチド（トラック１１）あるいは相同ペプチド（ペプチド１８、トラック１ ２）のいずれかを含 んでいる。 ｂ）ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、ＤＮＡ結合ヘテロマーを形成する：ＧＳＴ− Ｅ２Ｆ−１^89-437（約５０ｎｇ）を、対照のＧＳＴ融合タンパク質（約３００ｎ ｇ；トラック１）、ＤＰ−１^84-249あるいはＤＰ−１^84-204（約１５０ｎｇ、ト ロンビンによる開裂によって放出されたもの；トラック２および３）、ＧＳＴ− ＤＰ^84-249、ＧＳＴ−ＤＰ−１^84-204、ＧＳＴ−ＤＰ−１^146-249あるいはＧＳ Ｔ−ＤＰ−１^84-166（約３００ｎｇ、開裂なし；トラック４、５、６および７） とともにインキュベートした。 ｃ）Ｅ２Ｆ−１^89-437／ＤＰ−１^84-249ヘテロマーの配列特異性：ＧＳＴ− Ｅ２Ｆ−１^89-437（約５０ｎｇ；トラック２から６）又はＧＳＴ−Ｅ２Ｆ−１^{89 -437} と、ＤＰ−１^84-249（それぞれ５０ｎｇおよび１５０ｎｇ、トラック７から １１）とによって形成された複合体のＤＮＡ配列特異性を、アデノウイルスのＥ ２Ａプロモーターから取り出した遠位のＥ２Ｆ部位の野性型あるいは変異型の誘 導体（約１００倍過剰モル量の図示の競合結合部位）と競合させることによって 決定した。比較の目的で、Ｆ９ＥＣ細胞抽出物での同様の実験を示す（トラック １２から１６）。モノマーならびにヘテロマーのＤＮＡ結合複合体の双方とも、 Ｆ９ ＥＣ細胞のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆに対して極めてよく似た配列特異性を有し ていた。トラック１は、プローブ単独の場合を示す。競合結合部位の詳細につい ては、材料および方法の項に記載してある。 ｄ）ＤＰ−１は二量体化ドメインを含んでいる：ＤＰ−１の図示の領域をＧ ＳＴ融合タンパク質として発現させ（トラック３ −６）、約２μｇを、翻訳された野性型のＥ２Ｆ−１^1-437を含んでいる網状赤 血球溶解液５μｇとともにインキュベートした。ＧＳＴ融合タンパク質あるいは ＧＳＴタンパク質単独（トラック２）をグルタチオン−アガロースビーズで集め 、結合したＥ２Ｆ−１ポリペプチドを放出させた。トラック１は、Ｅ２Ｆ−１ポ リペプチドを有する溶解液を示す。ＤＰ−１^146-249がＥ２Ｆ−１と結合するこ とに注意されたい。 ｅ）データについてのまとめ、ならびにＤＰ−１の分子特性。 ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側の境界は、破線で示す領域内に存在することはわ かっているが、未画定である。図８ ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、酵母細胞中で相互に作用する 結果についてのまとめ。発現ベクターならびにレポーター構築物の詳細につ いては、上記の通りである。図９ ショウジョウバエのＳＬ２細胞中での、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１の機能的相乗作用 ａ）構築物についてのまとめ：ｐ３ｘＷＴならびにｐ３ｘＭＴについては、 すでに記載されている（Zamanaian and La Thangue，1992）。ｐＤＰ−１ならび にｐＥ２Ｆ−１は全長のタンパク質を含んでおり、ｐＧ４ＭｐｏｌｙＩＩは、Ｇ ａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを含んでいる。 ｂ）およびｃ）。ＳＬ２細胞を、ｐ３ｘＷＴならびに図示の 発現ベクターでトランスフェクションした。各処理での発現ベクターの量は以下 の通りとした：Ｅ２Ｆ−１については５０ｎｇ（レーン１、５、６、７、および ８）又は５００ｎｇ（レーン２）、ＤＰ−１については５μｇ（レーン３および ５）又は１０μｇ（レーン４および６）、そしてｐＧ４ＭｐｏｌｙＩＩについて は３．７μｇ（レーン７）又は７．０μｇ（レーン８）。全ての値はｐ３ｘＷＴ 単独を恣意的に１．０とした場合の相対値であり、少なくとも３回の独立した 実験を代表する値である。ｂ）は生データの例を示し、ｃ）にこうしたデータを 定量的に示す。図１０ ＤＰ−１は、Ｆ９ Ｅ Ｃ細胞中で、Ｅ２Ｆ部位依存性の転写に寄与している ａ）構築物についてのまとめ。 ｂ）Ｆ９ ＥＣ細胞を、ｐ３ｘＷＴならびに図示の発現ベクターでトランス フェクションした。いずれの処理も二重反復して行い、転写効率についての補正 を行った。全ての値はｐ３ｘＷＴ単独の活性を恣意的に１．０とした場合の相対 値であり、少なくとも３回の独立した実験を代表する値である。ＤＰ−１^73-340 が内在的なＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ活性を阻害しており、Ｅ２Ｆ−１がこの影響を救 済し得ることに注意されたい。データをグラフとして図の下部に示す。図１１ ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１は、酵母細胞中で、Ｅ２Ｆ部位依存性の転 写を活性化する ａ）構築物の概要 ｂ）ｐ４ｘＷＴ ＣＹＣ１ならびに図示のエフェクター発現ベクターを有す る酵母（S.cerevisiae）のＷ３０３１ａ株中で、β−ガラクトシダーゼ活性を測 定した。全ての値はｐ４ｘＷＴ ＣＹＣ１の活性を恣意的に１．０とした場合の 相対値であり、少なくとも３回の独立した実験を代表する値である。 （２）配列番号１に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：１７００塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：５５．．１２８４ （xi）配列記述：配列番号１： （２）配列番号２に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ−４１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号２：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9284−4Ｃ Ｄ 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１または配列番号１の相補体と選択的にハイブリダイズすることが 可能なヌクレオチドの連続配列を含む、実質的に単離された形態のポリヌクレオ チド。 ２．ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．前記の連続配列が少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、請求項１または ２に記載のポリヌクレオチド。 ４．配列番号１を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。 ５．請求項１から４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドおよびその相補体 を含む２本鎖ポリヌクレオチド。 ６．顕示（revealing）標識をもつ、請求項１から５のいずれか１つに記載のポ リヌクレオチド。 ７．請求項１から６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、複製可能 な組換えベクター。 ８．請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。 ９．（ａ）配列番号２のタンパク質；または （ｂ）その対立遺伝子変異体または種相同体（species homologue）；また は （ｃ）（ａ）に少なくとも７０％相同なタンパク質；または （ｄ）Ｅ２Ｆ−１タンパク質またはその関連ファミリーのメンバーと複合体 を形成することが可能な、（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片；または （ｅ）少なくとも１５個のアミノ酸からなる、（ａ）から （ｃ）のいずれかの断片 を含む、実質的に単離された形態のポリペプチド。 １０．顕示標識をもつ、請求項９に記載のポリペプチド。 １１．請求項９または１０に記載のポリペプチドと共に担体または希釈剤を含む 組成物。 １２．固相に固定された、請求項９または１０に記載のポリペプチド。 １３．請求項９に記載のポリペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡ。 １４．請求項９に記載のポリペプチドをコードするコード配列を含む複製可能な 組換えベクター。 １５．請求項１４に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。 １６．前記のコード配列が、該配列の発現を宿主細胞によってもたらすことが可 能な制御配列に機能しうる形で連結されている、請求項１４に記載の組換えベク ターによって形質転換された宿主細胞。 １７．請求項９に記載のポリペプチドを調製する方法であって、請求項１６に記 載の宿主細胞を組換えベクターによるコード配列の発現をもたらす条件下で培養 し、発現されたポリペプチドを回収することを含む調製方法。 １８．（ａ）配列番号２のタンパク質；または （ｂ）その対立遺伝子変異体または種相同体（species homologue）；ま たは （ｃ）（ａ）に少なくとも７０％相同なタンパク質；または （ｄ）Ｅ２Ｆ−１タンパク質またはその関連ファミリーのメンバーと複合 体を形成することが可能な、（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片：または （ｅ）少なくとも１５個のアミノ酸からなる、（ａ）から（ｃ）のいずれ かの断片 と結合可能な抗体。 １９．モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。 ２０．顕示標識をもつ、請求項１８または１９に記載の抗体。 ２１．固相に固定された、請求項１８から２０のいずれか１つに記載の抗体。 ２２．請求項１９に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系 。 ２３．試料中の請求項９に記載のポリペプチドの存在または不在を検出するため のイムノアッセイであって、 （ａ）請求項１８から２１のいずれか１つに記載の抗体を供給し； （ｂ）試料を該抗体と共に、抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下でイ ンキュベートし；そして （ｃ）該抗体−抗原複合体を検出する ことを含むイムノアッセイ。 ２４．増殖性またはウイルス性疾患を治療するための推定上の化学療法剤を同定 するためのスクリーニング方法であって、 （Ａ）以下の成分： （ｉ）請求項９または１０に記載のポリペプチド； （ii）（ａ）Ｅ２Ｆ−１タンパク質、または （ｂ）その対立遺伝子変異体または種相同体、または （ｃ）ＤＮＡ結合領域において少なくとも７０％の相同性を有するＥ ２Ｆ−１ファミリーのメンバー、または （ｄ）配列番号２のタンパク質と機能性トランス作用複合体を形成す ることが可能な、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片；または （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）を含合タンパク質；およ び （iii）推定上の化学療法剤； を成分（ｉ）および（ii）が成分（iii）の不在下で複合体を形成する条件 下で接触させ、そして （Ｂ）成分（iii）がどの程度まで該複合体の活性を破壊または阻止できるかを 測定する ことを含むスクリーニング方法。 ２５．前記の（ｉ）と（ii）との複合体が、Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合部位とin vitro で結合するその能力によって測定される、請求項２３に記載のアッセイ。 ２６．前記の（ｉ）と（ii）との複合体が、レポーター遺伝子に連結したＥ２Ｆ 結合部位を含むプロモーターをin vivoで活性化するその能力によって測定され る、請求項２３に記載のアッセイ。 ２７．アッセイが酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を用いて実施される、 請求項２６に記載のアッセイ。 ２８．前記の推定上の化学療法剤が、 （ａ）配列番号２のタンパク質；または （ｂ）その対立遺伝子変異体または哺乳動物の相同体；または （ｃ）（ａ）に少なくとも７０％相同なタンパク質 の１０個以上のアミノ酸からなる断片である、請求項２３から２６のいずれか １つに記載のアッセイ。 ２９．前記の断片が配列番号２の１６０から２２０の領域内に入るポリペプチド 断片である、請求項２８に記載のアッセイ。 ３０．ヒトまたは動物の身体を治療する方法に使用するための、請求項９または １０に記載のポリペプチド、または請求項１８から２０のいずれか１つに記載の 抗体。 ３１．ヒトまたは動物の身体を治療する方法に使用するための、請求項７または １４に記載のベクター。 ３２．治療を必要とする患者における制御されない細胞増殖を治療する方法であ って、該患者に請求項７または１４に記載のベクター、または請求項１に記載の ポリヌクレオチドを有効量投与することを含む方法。