JPH08503614A - Ｇｍ−ｃｓｆおよびｉｌ−３を含む融合タンパク質の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質の精製法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質の精製 発明の背景 本発明は、概して、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ ）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）タンパク質の類似体、ＧＭ−ＣＳＦ およびＩＬ−３を含む融合タンパク質のタンパク質化学、更に詳しくは、このよ うな類似体および融合タンパク質を精製する方法に関する。 造血系細胞の分化および増殖は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）として集合的に 知られる分泌された糖タンパク質によって調節される。ヒトにおいて、これらの タンパク質としては、正常な骨髄からの顆粒球およびマクロファージ産生を促進 し、そして更に、成熟分化した顆粒球およびマクロファージの活性を調節すると 考えられる顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）がある。インターロ イキン−３（ＩＬ−３；マルチ−ＣＳＦとしても知られる）は、更に、顆粒球、 マクロファージ、好酸球、マスト細胞、巨核球および赤血球系細胞を含む広範囲 の造血系細胞の生成を刺激する。したがって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の広 範囲の生物学的活性はかなり重複している。 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の生物学的活性は、一次細胞およびインビトロ細 胞系で発現された特異的細胞表面受容体に対する結合によって媒介される。これ ら細胞表面受容体のあるものはＧＭ−ＣＳＦのみを結合するが、他のものはＩＬ −３のみを結合する。更に、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３受容体と称するＩＬ−３お よびＧＭ−ＣＳＦ両方を結合する受容体クラスも存在すると考えられる（パーク （Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６４：５４２０，１９８９年）。 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質並びにこのような融合タン パク質をコードしているＤＮＡ配列はそれそれ、両方とも本明細書中に参考とし て包含されている米国特許第５，０７３，６２７号明細書および同第５，１０８ ，９１０号明細書に記載されている。融合タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ若しくは ＩＬ−３単独または組合せよりも生物学的に活性であり、しかもＩＬ−３に関し て、ＩＬ−３若しくはＧＭ−ＣＳＦのみを結合する受容体を含む細胞系と比較し て、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３受容体を発現する細胞系に対する有意に高い結合親 和性を有する。 米国特許第５，０７３，６２７号明細書および同第５，１０８，９１０号明細 書は、更に、融合タンパク質の精製法を開示している。開示された方法は、イオ ン交換クトグラフィー工程および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰ ＬＣ）の組合せを必要とする。ＲＰ−ＨＰＬＣは、商業的に有意のタンパク質収 率を達成するレベルまで拡大することが難しく、更に、有機溶剤の使用を必要と する。有機溶剤は、有毒且つ有害なガスの発生から爆発の危険まで、多数の安全 性の障害を与える。更に、有機溶剤は、危険な廃棄物処理操作の実行を必要とし 、そして生理学的状態をほぼ模擬する操作よりも一層生物学的材料の変性または 失活を引き起こすと考えられる。 通常は一連のイオン交換工程を伴うイオン交換クロマトグラフィーを用いてタ ンパク質を精製することができる。イオン交換工程の数および配列並びに最適精 製条件は、通常、個々のタンパク質につい経験的に決定される。融合タンパク質 の精製に必要な工程および条件は、融合タンパク質が由来するタンパク質の物理 化学的性質を分析することによっても予測しえない。この一例として、ＧＭ−Ｃ ＳＦおよびＩＬ−３を含む本明細書中に記載の組換え融合タンパク質は、陰イオ ン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基を有する樹脂に対 して吸着し且つかなり酸性のｐＨで溶離することができるが、ＩＬ−３は、ＤＥ ＡＥ側基を有する陰イオン交換樹脂に対してこれらの条件下で吸着することはな かった。 したがって、当該技術分野において、ＲＰ−ＨＰＬＣの使用を避け且つ商業的 成功に必要なレベルまで拡大される、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え 融合タンパク質の精製法を開発する必要がある。 発明の概要 本発明は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融合タンパク質を水溶液 から精製する方法であって、組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂に対して 吸着させ、組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂から溶離し；陽イオン交換 樹脂から溶離された組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂に対して吸着 させ、組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂から溶離し；第一陰イオン 交換樹脂から溶離された組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂に対して 吸着させ、そして組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂から溶離するこ とを含む上記方法を提供する。第二陰イオン交換工程から溶離された組換え融合 タンパク質は、第二陽イオン交換樹脂に対して吸着させ、そして溶離することが できる。 発明の詳細な説明 本発明の方法は、一連のイオン交換クロマトグラフィー工程によって、ＧＭ− ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融合タンパク質を、該組換え融合タンパク質 を含む流体から精製することを行なう。イオン交換工程は、逆相高速液体クロマ トグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いる必要性を回避し、したがって、ＲＰ− ＨＰＬＣに必要である有機溶剤の使用に関係した危険を除去する。有機溶剤の使 用を避けることにより、該方法は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融 合タンパク質を商業的量で提供するように拡大するのに理想的に適している。 本明細書中で用いられる「ＧＭ−ＣＳＦ」という用語は、天然ヒト顆粒球−マ クロファージコロニー刺激因子アミノ酸配列（例えば、ＡＴＣＣ５３１５７）と 実質的に同様であり、しかもそれらがＧＭ−ＣＳＦ受容体に対して結合すること ができ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を結合することによって開始された生物学的シグナ ルを伝達することができ、またはＧＭ−ＣＳＦに対して生じた抗体と交差反応す ることができるという点で生物学的に活性であるアミノ酸配列を有するタンパク 質を意味する。このような配列は、例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ） ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６２５０，１９ ８５年）に開示されている。更に、「ＧＭ−ＣＳＦ」という用語は、天然ヒトＧ Ｍ−ＣＳＦと同様に少なくとも若干の生物学的活性を示すＧＭ−ＣＳＦ分子の類 似体を含む。ＧＭ−ＣＳＦの典型的な類似体は、酵母宿主におけるＧＭ−ＣＳＦ の発現を増加させるように失活させたＫＥＸ２プロテアーゼ開裂部位を有するＧ Ｍ−ＣＳＦ類似体を記載している欧州特許公開第２１２９１４号明細書（ＵＳＳ Ｎ０６／７６３，１３０号）、および種々のグリコシル化部位が除去されている ＧＭ−ＣＳＦ類似体を記載しているＷＯ公開第８９／０３８８１号明細書（米国 特許第５，０３２，６７６号明細書）に開示されている。 「ＩＬ−３」という用語は、天然ヒトインターロイキン−３アミノ酸配列と実 質的に同様であり、しかもそれらがＩＬ−３受容体に対して結合するか若しくは ＩＬ−３受容体に対する結合によって開始された生物学的シグナルを伝達するこ とができ、またはＩＬ−３に対して生じた抗ＩＬ−３抗体と交差反応することが できるという点で生物学的に活性であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味 する。このような配列は、例えば、欧州特許公開第２７５，５９８号明細書およ び同第２８２，１８５号明細書に開示されている。「ＩＬ−３」という用語は、 更に、天然ＩＬ−３と同様に少なくとも若干の生物学的活性を示すＩＬ−３分子 の類似体を含む。ＩＬ−３の典型的な類似体は、米国特許第５，１２８，４５０ 号明細書にも開示されている。 本明細書中で用いられる「融合タンパク質」という用語は、ＧＭ−ＣＳＦおよ びＩＬ−３のＣ末端−Ｎ末端融合を意味する。典型的な融合タンパク質は、本明 細書中に参考として包含されている米国特許第５，０７３，６２７号明細書およ び同第５，１０８，９１０号明細書に開示されている。本発明の融合タンパク質 としては、ＧＭ−ＣＳＦのＣ末端部分がＩＬ−３のＮ末端部分に融合されている 構築物、更にはＩＬ−３のＣ末端部分がＧＭ−ＣＳＦのＮ末端部分に融合されて いる構築物がある。具体的には、本発明の融合タンパク質は、 Ｒ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂およびＲ₂−Ｌ−Ｒ₁ （式中、Ｒ₁はＧＭ−ＣＳＦであり；Ｒ₂はＩＬ−３であり；そしてＬはリンカー ペプチド配列である） から成る群より選択される式を有する。ＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩ Ｌ−３の生物学的活性を保持する１種類のタンパク質を生じるような様式でＩＬ −３に結合している。特定の融合タンパク質構築物は、融合タンパク質中のＧＭ −ＣＳＦおよびＩＬ−３ドメインをそれらの分布順序で挙げることによって（最 初にＮ末端ドメインを、次にＣ末端ドメインを明記して）名付けられる。例えば 、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３は、ＧＭ−ＣＳＦの後にＩＬ−３を含む（すなわち、 ＧＭ−ＣＳＦのＣ末端がＩＬ−３のＮ末端に結合している）融合タンパク質を意 味し、そしてｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷Ｇｌｕ³⁹］／ｈｕＩＬ−３［ Ｐｒｏ⁸Ａｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰］は、融合構築物のＮ末端部分がｈｕＧＭ−ＣＳＦ［ Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷Ｇｌｕ³⁹］であり且つＣ末端部分がｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ⁸Ａ ｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰］である融合タンパク質を意味する。特に断らない限り、ＧＭ− ＣＳＦ／ＩＬ−３およびＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦという用語は、リンカー配列が 加えられた融合タンパク質を意味する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融合タンパク質源 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を生産する典型的な方法は 、本明細書中に参考として包含されている米国特許第５，０７３，６２７号明細 書および同第５，１０８，９１０号明細書に記載されている。要約すると、融合 タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、適当な 発現ベクター中にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３をコードしている別々のＤＮＡフ ラグメントを集合して構築される。ＧＭ−ＣＳＦをコードしているＤＮＡフラグ メントの３′末端を、ＩＬ−３をコードしているＤＮＡフラグメントの５′末端 に対して、１種類の生物学的活性融合タンパク質中への配列のｍＲＮＡ翻訳を可 能にする局面での配列の読み枠と一緒に連結する。得られたタンパク質は、例え ば、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷Ｇｌｕ³⁹］／ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ⁸ Ａｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰］である。或いは、ＩＬ−３をコードしているＤＮＡフラグメ ントの３′末端を、ＧＭ−ＣＳＦをコードしているＤＮＡフラグメントの５′末 端に対して、１種類の生物学的活性融合タンパク質中への配列のｍＲＮＡ翻訳を 可能にする局面での配列の読み枠と一緒に連結することができ、タンパク質ｈｕ ＩＬ−３［Ｐｒｏ⁸Ａｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰］／ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷ Ｇｌｕ³⁹］を生成する。 ＤＮＡフラグメントは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来 する適当な転写または翻訳調節要素に対して機能的に結合される。このような調 節要素としては、転写プロモーター、転写を調節する任意のオペレーター配列、 適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、並びに転写および翻 訳の終結を調節する配列がある。複製起点によって通常与えられる宿主において 複製する能力および形質転換細胞の認識を促進する選択遺伝子を更に包含するこ とができる。ＤＮＡのｍＲＮＡ中への転写に関与する調節要素は、二つのＤＮＡ 配列のうち第一の配列で保持されるが、第二ＤＮＡ配列に対するリードスルーを 妨げる結合シグナルまたは停止コドンは除去される。逆に、調節要素は第二ＤＮ Ａ配列から除去されるが、翻訳を終結するのに必要な停止コドンは保持される。 リンカー配列は、周知の突然変異誘発の標準法によって融合タンパク質構築物 中に包含させることができる。リンカー配列は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３ド メインが二次および三次構造に折りたたまれることを確実にするのに十分な距離 によってそれぞれのドメインを隔てるのに用いられる。適当なリンカー配列は、 （１）可変性の伸長されたコンホメーションをとる、（２）機能的ＧＭ−ＣＳＦ およびＩＬ−３ドメインと相互作用しうる一定順序の二次構造に発展する性質を 示さない、そして（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進しうる最 小限の疎水性または帯電特性を有する。可変性タンパク質部分の典型的な表面ア ミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒがある。実際上、Ｇｌｙ、Ａｓｎ およびＳｅｒを含むアミノ酸配列の任意の順列は、リンカー配列についての上記 基準を満たすと考えられる。他の近中性アミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ もリンカー配列に用いることができる。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３のリンカー として有用なアミノ酸配列としては、例として、Ｇｌｙ残基４個に続いてＳｅｒ 残基１個、Ｇｌｙ残基４個、Ｓｅｒ残基もう１個、更にＧｌｙ残基４個および最 後にＳｅｒ残基１個の列、並びにもう一つの例として、Ｇｌｙ残基４個に続いて Ｓｅｒ残基１個、更にＧｌｙ残基５個および最後にＳｅｒ残基１個がある。 リンカー配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に有意に影響を及ぼす ことなく変化しうる。リンカー配列は、融合されているタンパク質が、機能的ド メインを隔てるようにおよび立体的干渉を妨げるように用いることができる非本 質的なＮ−またはＣ末端アミノ酸を有する場合は不必要である。本発明の一つの 好ましい実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦのＣ末端はＩＬ−３のＮ末端に対して 直接的に融合しうる。本発明のもう一つの好ましい態様において、約１１アミノ 酸のリンカー配列長さを用いて、機能的タンパク質ドメインを適当に隔離するが 、更に長いリンカー配列を用いてもよい。リンカー配列は、１〜５００アミノ酸 長さ、または更に好ましくは、１〜１００アミノ酸長さでありうる。本発明の最 も好ましい態様において、リンカー配列は約１〜２０アミノ酸長さである。本明 細書中に開示された特定の実施態様において、リンカー配列は約５〜約１５アミ ノ酸であり、そして約１０〜約１５アミノ酸であるのが好都合である。 本発明の最も好ましい実施態様において、ヒトＩＬ−３をコードしているｃＤ ＮＡは、単離された末梢血液リンパ球からのポリＡ⁺ＲＮＡから製造されたライ ブラリーから単離された。組換え体は、標準的なプラークハイブリッド形成技術 により、ｈｕＩＬ−３遺伝子の選択された５′および３′配列に相補的な配列を 有する二つのオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされた。ＤＮ Ａは、プローブに対してハイブリッド形成したこれらのクローンから単離され、 そして更に別のハイブリッド形成実験によって分析された。プローブそれぞれに ハイブリッド形成した単クローンを単離後、ＩＬ−３遺伝子を有するハイブリッ ド形成性ｃＤＮＡを慣用的な技法によってサブクローン化し、且つ配列決定した 。ｃＤＮＡは、成熟タンパク質の８位のプロリン残基をコードした。天然ＩＬ− ３に存在する２か所のアスパラギン結合グリコシル化部位（Ａｓｎ¹⁵およびＡｓ ｎ⁷⁰）は、これらの位置のコドンをアスパラギン酸をコードするコドンに変化さ せることによって変更されて、酵母細胞による分泌タンパク質のＮ結合グリコシ ル化（しばしば高グリコシル化）を妨げた。インビトロ突然変異誘発は、ワルダ ー（Ｗａｌｄｅｒ）およびワルダー、Ｇｅｎｅ ４２：１３３（１９８６）によ って記載されたのと同様の方法によって実施された。最終酵母ベクターをｐＩＸ Ｙ１５１と称した。このベクターは、酵母中に存在する場合、ｒｈｕＩＬ−３（ Ｐｒｏ⁸Ａｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰）のグルコースに調節された発現および分泌を可能に する。 プラスミドｐＨＧ２３上にあるヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする野生型遺伝子は 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１２３０１パーク ローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２、米国に、受託番号３ ９９００として寄託された。酵母発現ベクター中に挿入された野生型遺伝子ｐＹ αｆＨｕＧＭも、ＡＴＣＣに受託番号５３１５７として寄託された。ヒト ＧＭ−ＣＳＦの非グリコシル化類似体を提供するために、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／ ０３８８１号明細書に記載のように、オリゴヌクレオチドに支配された部位特異 的突然変異誘発法を用いて、Ｎ−グリコシル化され得る部位を除去した。この類 似体ｈｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷Ｇｌｕ³⁹）をコードしているプラスミ ドを、ＡＴＣＣに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＲＲＩのプラスミドＬ２０７− ３として受託番号６７２３１で寄託した。 リンカー配列によって隔てられたヒトＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＩＬ−３を有す る融合構築物を発現するための分泌ベクターを生成するために、最初に、読み枠 または介在配列を考慮することなく、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３をコードして いるＤＮＡを互いに直接的に融合することによって前駆体プラスミドを構築した 。非グリコシル化ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードしているｃＤＮＡフラグメントは、 プラスミドＬ２０７−３から９７７ｂｐ制限フラグメント（Ｓｐｈ１〜Ｓｓｐ１ ）として作成された。ＩＬ−３ ｃＤＮＡは、ｐＩＸＹ１５１から、Ａｓｐ７１ ８によって消化した後、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，コールド・ スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），１９８２年 ，１１８頁）のＴ４ポリメラーゼ反応を用いて平滑末端付きにし、そして更にＸ ｈｏ１で消化して８０３ｂｐフラグメントを与えることによって作成された。次 に、これら二つのフラグメントを直接的に連結し；このプラスミドをＧＭ／ＩＬ −３直接融合と称した。 ＧＭ／ＩＬ−３直接融合プラスミドは、ワルダーおよびワルダー（上述）に記 載されたのと同様の方法を用いるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発におけ る鋳型として用いられた。ＧＭ−ＣＳＦの３′末端と１３ｂｐが重複し（停止コ ドン不含）、Ｇｌｙ Ｓｅｒリンカーを含み、そしてＩＬ−３の５′末端と１３ ｂｐが重複しているオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド特異的 突然変異誘発は、ワルダーおよびワルダー（上述）に記載のように、オリゴヌク レオチドを一本鎖プラスミドＤＮＡに対してアニールし且つ酵母菌株ＸＶ２１８ １をアニールされたＤＮＡによって形質転換することによって実施された。酵母 形質転換細胞を、トリプトファンを欠いた培地での増殖によって選択し、プール し、そしてホルム（Ｈｏｌｍ）ら（Ｇｅｎｅ ４２：１６９，１９８６年）に記 載のようにＤＮＡを抽出した。突然変異体および野生型プラスミドＤＮＡの混合 物を含むこのＤＮＡを用いて、大腸菌ＲＲ１をアンピシリン耐性に形質転換した 。得られたコロニーは、放射性標識オリゴヌクレオチドに対する標準的な技法を 用いるハイブリッド形成によってスクリーニングされた。ＧＭ−ＣＳＦ／リンカ ー／ＩＬ−３をコードしているＤＮＡを含むプラスミドは、リンカーを含む放射 性標識オリゴヌクレオチドに対するストリンジェントな条件下でのそれらのハイ ブリッド形成によって識別され且つヌクレオチド配列決定によって確認された。 ヌクレオチド配列決定により、リンカー部分中で突然変異が生じ、それによっ てアミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙが欠失したタンパク質の発現が引き起 こされたことが発見された。この突然変異は読み枠を変化させず、又、生物学的 に活性なタンパク質の発現を妨げなかった。得られたプラスミドはｐＩＸＹ３２ １と称され、融合タンパク質ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷Ｇｌｕ³⁹］／ Ｇｌｙ₄ＳｅｒＧｌｙ₅Ｓｅｒ／ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ⁸Ａｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰］を発 現した。 本発明のもう一つの実施態様において、Ｎ末端ＩＬ−３およびＣ末端ＧＭ−Ｃ ＳＦを含む融合タンパク質をコードしているプスミドを、ｐＩＸＹ３２１につい て記載されたのと同様に構築した。ｐＩＸＹ３４４と称するプラスミドは、融合 タンパク質ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ⁸Ａｓｐ¹⁵Ａｓｐ⁷⁰］／（Ｇｌｙ⁴Ｓｅｒ）₃／ ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ²³Ａｓｐ²⁷Ｇｌｕ³⁹］を発現した。組換え微生物系におけるタンパク質発現 形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された融合タンパ ク質発現ベクターによって形質転換されるたかまたはトランスフェクトされた細 胞である。精製された哺乳動物融合タンパク質または類似体は、本発明のＤＮＡ の組換え翻訳生成物を発現する適当な形質転換された宿主細胞を培養した後、培 地または細胞抽出物から精製することによって製造された。融合タンパク質の発 現に適当な宿主細胞としては、適当なプローモーターの調節下における原核生物 、酵母または高等真核生物細胞がある。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物 に由来するＲＮＡを用いて融合タンパク質を製造するのに用いることができる。 細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と一緒に用いるのに適当なクローニン グおよび発現ベクターは、ポーウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，エルセビア（Ｅ ｌｓｖｉｅｒ），ニューヨーク，１９８５年）によって記載されており、その関 連の開示は本明細書中に参考として包含されている。 細菌培養において製造された組換えタンパク質は、通常、最初に細胞ペレット から抽出した後、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグ ラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離される。組換え 融合タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理 、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の慣用法によって破壊すること ができる。組換え融合タンパク質は、本明細書中に記載のように更に精製される 。 最も好ましい実施態様において、融合タンパク質を分泌タンパク質として発現 する酵母の発酵は、精製を極めて簡単にする。例えば、組換えタンパク質を水性 培地中に分泌する系からの上澄みは、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィル ター、例えば、アミコン・スパイラル・ウルトラフィルトレーション（Ａｍｉｃ ｏｎ Ｓｐｉｒａｌ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）カートリッジまたはミ リポア・ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置を用 いて最初に濃縮することができる。濃縮工程後、組換え融合タンパク質を本明細 書中に記載のように更に精製する。 組換え融合タンパク質の発現に好ましい酵母宿主としては、サッカロミセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えばＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）がある。他の属の酵母、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカ ロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはクルイベロミセス 属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を用いてもよい。特に好ましい酵母宿主菌株 は、ワシントン大学遺伝学部酵母菌株銀行（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｙｅａｓｔ Ｓｔｒａｉｎ Ｂａｎｋ）、シアトル、ＷＡ、米国から入手した 、ＸＶ６１７−１−３Ｂ［ａ，ｈｉｓ６，ｌｅｕ２−１，ｔｒｐ−１，ｕｒａ３ ，ｓｔｅ５］と、カリフォルニア大学酵母遺伝子貯蔵センター（ｔｈｅ Ｙｅａ ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、バークレー、ＣＡ、米国から入手したＸ２１８１ −１Ｂ［ａ，ｔｒｐ−１，ｇａｌｌ，ａｄｅ１，ｈｉｓ２］とを交配することに よって生成された二倍体Ｓ．セレビシエ菌株であるＸＶ２１８１である。ＸＶ２ １８１は、トリプトファンについては独立栄養性であり且つウラシルおよびヒス チジンについては原栄養性であり、組換え融合タンパク質を発現し且つ分泌する ように選択培地中で増殖させることができる。選択培地中の各種栄養素の種類お よび量は、最適タンパク質発現を確実にするように変更しうる。宿主菌株は、シ ャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎ ｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，コー ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８６年の方法によって発現プラスミドを 用いて形質転換される。 酵母ベクターは、概して、２μ酵母プラスミドからの複製起点または自律複製 配列（ＡＲＳ）、プロモーター、融合タンパク質をコードしているＤＮＡ、ポリ アデニル化および転写終結のための配列並びに選択遺伝子を含む。好ましくは、 酵母ベクターは、複製起点並びに酵母および大腸菌両方の形質転換を可能にする 選択可能なマーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびトリプト ファン中で増殖する能力を欠いている酵母の突然変異株に選択マーカーを与える Ｓ．セレビシエｔｒｐ１遺伝子、並びに構造配列下流の転写を誘導する高度に発 現された酵母遺伝子に由来するプロモーターを含む。酵母宿主細胞ゲノム中のｔ ｒｐ１障害の存在は、トリプトファン不存在下の増殖によって形質転換を検出す るのに有効な環境を与える。或いは、転写単位および選択可能なマーカーは、酵 母染色体中に１か所若しくは多数の部位に、および／または１部位につき多重コ ピーで安定して組み込まれることができる。 酵母ベクター中の適当なプロモーター配列としては、メタロチオネイン、３− ホスホグリセリン酸キナーゼ（ヒッツマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．２５５ ：２０７３，１９８０年）または他の解糖酵素（ヘス（Ｈ ｅｓｓ）ら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８年；お よびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７ ８年）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ 、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピ ルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ ーゼおよびグルコキナーゼがある。酵母発現において用いるのに適当なベクター およびプロモーターは、Ｒ．ヒッツマンら、欧州特許出願第７３，６５７号明細 書に更に記載されている。 好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２ ２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）、並びにグルコース抑制 性ＡＤＨ２プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を用い て組立てることができる。ＡＤＨ２プロモーターは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２年）およびベイア （Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２年）によって記載 された。酵母α因子リーダーは、異種タンパク質の分泌を支配し、プロモーター および発現される構造遺伝子間に挿入することができる。例えば、カージャン（ Ｋｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３，１９８２年；およびビター（Ｂｉ ｔｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３ ０，１９８４年を参照されたい。リーダー配列は、その３′末端付近に１か所ま たはそれ以上の有用な制限部位を含むように修飾されて、外来遺伝子に対するリ ーダー配列の融合を容易にすることができる。 適当な酵母形質転換プロトコルは当業者に知られており；典型的な技術は、ヒ ネン（Ｈｌｎｎｅｎ）らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５ ：１９２９，１９７８年によって記載されており、０．６７％酵母窒素基剤、０ ．５％カザミノ酸、２％グルコース、アデニン１０μｇ／ｍｌおよびウラシル２ ０ｐｇ／ｍｌから成る選択培地中のＴｒｐ⁺形質転換細胞について選択する。 ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主菌株は、ア デニン８０μｇ／ｍｌおよびウラシル８０μｇ／ｍｌを補足した１％酵母抽出物 、２％ペプトンおよび１％グルコースから成る豊富な培地中で発現用に増殖させ ることができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グルコースの消耗に よって引き起こされる。粗製酵母上澄みを濾過によって採取し、そして更に精製 する前に４℃で保持する。 種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させ ることができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産用バキュロウイルス系 は、ラッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６ ：４７（１９８８）によって論及されている。適当な哺 乳動物宿主細胞系の例としては、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）（Ｃｅｌｌ ２ ３ ：１７５，１９８１年）によって記載されたサル腎細胞のＣＯＳ−７系、並び に適当なベクターを発現することができる、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３ 、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒーラおよびＢＨＫ細胞系を含む他 の細胞系がある。哺乳動物発現ベクターは、非転写要素、例えば、複製起点、適 当なプロモーターおよび発現される遺伝子に結合したエンハンサー、並びに他の ５′または３′フランキング非転写配列、そして５′または３′非翻訳配列、例 えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体およ び受容体部位並びに転写終結配列を含むことができる。 脊椎動物細胞を形質転換するのに用いるための発現ベクター中の転写および翻 訳調節配列は、ウイルス源によって提供されることができる。例えば、一般的に 用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ（Ｐｏｌｙｏｍａ） 、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）２、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａ ｎ Ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する 。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起原、初期 および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス並びにポリアデニル化部位 は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝的要素を提供するのに用いることが できる。初期および後期プロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルス複製起点を 更に含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので特に有用である（ フィアス（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９ ７８年）。更に小さいまたは更に大きいＳＶ４０フラグメントも、ウイルス複製 起点に位置したＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌ１部位に対して伸長した約２５０ ｂｐ配列が含まれるという条件で用いることができる。典型的なベクターは、オ カヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ ｏｌ．３ ：２８０，１９８３年）によって開示されたように構築することができ る。 Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞における哺乳動物受容体ＤＮＡの安定な高レベル 発現に有用な系は、コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２ ３ ：９３５，１９８６年）によって記載されたように構築することができる。 ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３ ＤＮＡの発現に特に好ましい真核性ベクターとして は、両方ともｐＢＣ１０２．Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７，２５５）に由来する酵母発 現ベクターであるｐＩＸＹ３２１およびｐＩＸＹ３４４があり、これらは米国特 許第５，０７３，６２７号明細書および同第５，１０８，９１０号明細書に記載 されたように、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮ Ａ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）および酵母のＤＮＡ配列を含む。 組換え体培養において合成された融合タンパク質は、培養物から融合タンパク 質を回収するのに用いられた精製工程に応じた量および特性の、タンパク質を含 む非ヒト細胞成分の存在を特徴とする。これらの成分は、通常、酵母、原核生物 または非ヒト高等真核生物起原であり、好ましくは、走査デンシトメトリーまた はクロマトグラフィーにより約５％未満程度の無害な混入物量で存在する。更に 、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３と通常結合しうるタンパク質は、天然においてそ れらの起原のそれぞれの種中で、例えば、細胞、細胞浸出液または体液中で見出 されるが、組換え体細胞培養はそれらを含まない融合タンパク質の生産を可能に する。組換え融合タンパク質の精製 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融合タンパク質は、形質転換された 宿主細胞を、組換え融合タンパク質を発現するのに必要な培養条件下において培 養することによって製造することができる。次に、得られる発現された融合タン パク質を、上澄み液または細胞中物から製造された流体から精製することができ る。本発明の最も好ましい実施態様において、組換え融合タンパク質は、組換え 融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する形質転換された酵母細胞の上澄 み液（発酵ブイヨン）から精製される。組換え融合タンパク質を含む流体（上澄 みまたは細胞抽出物）を濾過によって透明にする。好ましくは、流体のｐＨを、 濾過の前に塩基を加えることによって増加させ；更に好ましくは、ｐＨを８〜９ に調整する。最も好ましくは、５０％ＮａＯＨを発酵ブイヨンに加えて、ｐＨを ８．５まで増加させ、そして得られた流体を、０．１〜１．０μｍフィルター（ 例えば、ミリポア・プロスタク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰｒｏＳｔａｋ）フィル ターシステム）を介する接線流動濾過によって透明にする。或いは、他の細胞分 離技術を用いて流体を透明にすることができる。組換え融合タンパク質を含む透 明な流体を、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン ・スパイラル・ウルトラフィルトレーションカートリッジまたはミリポア・ペリ コン限外濾過装置を用いることによって最大約２０倍まで濃縮して、更に精製す るのに好都合な容量にする。次に、濃縮された流体を水によってダイアフィルト レーションを行なって、流体のイオン強度を減少させる。最も好ましくは、ダイ アフィルトレーションを行なった流体のイオン強度は約１０ｍＳ未満である。 濃縮工程後、組換え融合タンパク質を含む流体のｐＨを低下させ、そして流体 を陽イオン交換樹脂に適用する。組換え融合タンパク質は陽イオン交換樹脂に対 して吸着し、酸性ｐＨにおいて一層精製された状態で溶離することができる。次 に、溶離された組換え融合タンパク質を陰イオン交換樹脂に適用する。組換え融 合タンパク質は陰イオン交換樹脂に対して吸着し、僅かに酸性ｐＨにおいてなお 一層精製された状態で溶離することができる。或いは、陽イオンおよび陰イオン 交換クロマトグラフィー工程を逆の順序で実施してよく、この場合、濃縮された 流体のｐＨを、陰イオン交換樹脂に対して加える前に低下させない。陽イオンお よび陰イオン交換工程（および引続きのクロマトグラフィー工程全部）の進行は 、カラムから洗浄されたまたは溶離された流体の吸光度を２８０ｎｍの波長で監 視することによって追跡される。 陽イオン交換樹脂に適用される直前に、流体のｐＨを３〜５に、好ましくは４ ．５〜５．０に調整する。最も好ましくは、氷酢酸を加えることによってｐＨ４ ．７を達成する。適当な陽イオン交換樹脂としては、スルホネート基、スルホプ ロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスがあり、ス ルホプロピル基が好ましい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デ キストラン、セルロース、シリカ、またはタンパク質精製において一般的に用い られる他の種類でありうる。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融合タン パク質の陽イオン交換クロマトグラフィーに特に有用な材料は、発酵ブイヨン１ ００Ｌにつき約１．７Ｌが用いられるＳＰ−トーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒ ｌ）^TM（トーソー・コーポレーション（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） 、日本；バイオセパレーションズ・スペシャリスト（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｉｏｎ ｓ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ）、フィラデルフィア、ＰＡによって配給された） である。適当な寸法のカラムを陽イオン交換樹脂によって製造し、そして適当な 緩衝液で平衡させて陽イオン交換基を帯電させる。結合および溶離条件は、用い られる種々の適当なイオン交換樹脂にとって最適にすることができる。ＳＰ−ト ーヨーパール^TMのための適当な緩衝液のｐＫ_aは約３〜約５の範囲である。好ま しくは、カラムを２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．８〜４．２（平衡用 緩衝液）で平衡させる。更に好ましくは、カラムを最初に２５０ｍＭ酢酸ナトリ ウム緩衝液で洗浄した後、平衡用緩衝液で洗浄してイオン強度を減少させる。最 も好ましくは、平衡用緩衝液および溶出液のイオン強度の差は約０．２ｍＳ未満 であり、双方のｐＨは４．０である。スルホプロピル基を用いる場合、組換え融 合タンパク質を含む濃縮された流体を、酢酸などの適当な酸で約４．５のｐＨに 調整する。更に好ましくは、濃縮された流体のｐＨは４．３〜４．７である。最 も好ましくは、濃縮された流体のｐＨは４．５である。次に、調整された流体を 、平衡されたスルホプロピルカラムに適用する。混入タンパク質は、吸光度がベ ースラインに戻るまで酢酸ナトリウムなどの適当な緩衝液でカラムを洗浄するこ とによって除去される。更に好ましくは、緩衝液のｐＨは約５．３〜約５．７で ある。最も好ましくは、緩衝液は２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５で ある。組換え融合タンパク質は、陽イオン交換樹脂に対して吸着し、塩を含む緩 衝液の適用によってより高度に精製された状態で溶離することができる。好まし くは、緩衝液は酢酸ナトリウムであり、塩は塩化ナ トリウムである。更に好ましくは、緩衝液のｐＨは約５．３〜約５．７である。 最も好ましい緩衝液は２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、４００ｍＭ 塩化ナトリウムである。単一溶出プールは、吸光度の上昇が見られたら開始し且 つピークを越えて吸光度が最大限ピーク高さの１０％未満に戻るまで続けて集め られる。溶出液は２〜８℃で貯蔵するのが最も好ましい。或いは、溶出液を約− ２０℃未満で冷凍貯蔵し、そして次の精製工程の前に融解させることができる。 組換え融合タンパク質の存在は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または他の適当な手段によって決定され、そし てタンパク質濃度を適当なタンパク質検定を用いて決定する。組換え融合タンパ ク質は、更に、適当な機能検定、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（イ ライザ（ＥＬＩＺＡ））によって定量することができる。 適当な陰イオン交換樹脂としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基、 第四アミノ（ＱＡＥ）側基またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）側基を含む種々 の不溶性マトリックスがあり、ＤＥＡＥ基が好ましい。マトリックスは、アクリ ルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、シリカ、またはタンパク質 精製に一般的に用いられる他の種類でありうる。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を 含む組換え融合タンパク質の陰イオン交換クロマトグラフィーに特に有用な材料 は、発酵ブイヨン１００Ｌにつき約１．２〜約２．９Ｌが用いられるＤＥＡＥセ （ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）であり；好ましくは、その量は発酵 ブイヨン１００Ｌにつき約２．９Ｌである。適当な寸法のカラムを陰イオン交換 樹脂によって製造し、そして適当な緩衝液で平衡させて陰イオン交換基を帯電さ せる。結合および溶離条件は、用いられる種々の適当なイオン交換樹脂にとって 当な緩衝液のｐＫ_aは約７〜約９の範囲である。好ましくは、カラムを２５ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８〜８．２で平衡させる。更に好ましくは、カラ ムを最初に５００ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で洗浄した後、２５ｍＭトリスＨＣｌ 緩衝液で洗浄してイオン強度を減少させる。最も好ましくは、洗浄用緩衝液およ び溶出液のイオン強度の差は約０．２ｍＳ未満であり、双方のｐＨは８．０であ る。ＤＥＡＥ基を用いる場合、組換え融合タンパク質を含む流体を水で希釈して イオン強度を減少させ、塩基を加えることによってｐＨを増加させる。好ましく は、導電率が約９ｍＳ未満にそしてｐＨが約７より大きくなるように調整する。 更に好ましくは、十分な０．５ＭトリスＨＣｌを加えて流体を１０ｍＭトリスＨ Ｃｌとし、そして１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを約７．８〜約８．２に調整する 。最も好ましくは、ｐＨは８．０である。次に、希釈調整された流体を、平衡さ れたＤＥＡＥカラムに適用する。混入タンパク質は、酢酸ナトリウムなどの適当 な緩衝液でカラムを洗浄することによって除去される。更に好ましくは、緩衝液 のｐＨは約４．８〜約５．２である。最も好ましくは、緩衝液は５０ｍＭ酢酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ５．０である。組換え融合タンパク質は、陰イオン交換樹 脂に対して吸着し、酢酸ナトリウムなどの適当な緩衝液を加えることによりｐＨ を僅かに減少させることによって一層高度に精製された状態で溶離することがで きる。更に好ましくは、緩衝液のｐＨは約４．３〜約４．７である。最も好まし くは、緩衝液は５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５である。単一溶出プ ールは、吸光度の上昇が見られたら開始し且つピークを越えて吸光度が最大限ピ ーク高さの１０％未満に戻るまで続けて集められる。溶出液は２〜８℃で貯蔵す るのが最も好ましい。或いは、溶出液を約−２０℃未満で冷凍貯蔵し、そして次 の精製工程の前に融解させることができる。組換え融合タンパク質の存在は、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥまたは他の適当な手段によって決定され、そしてタンパク質濃度 を適当なタンパク質検定を用いて決定する。組換え融合タンパク質は、更に、イ ライザなどの適当な機能検定によって定量することができる。 第二のイオン交換樹脂工程後、組換え融合タンパク質を含む流体を第二陰イオ ン交換樹脂に適用する。適当な陰イオン交換樹脂としては、ＤＥＡＥ基若しくは ＱＡＥ基またはＰＥＩのような弱陰イオン交換基を含む種々の不溶性マトリック スがあり、ＰＥＩ基が好ましい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース 、デキストラン、セルロース、シリカ、またはタンパク質精製に一般的に用いら れる他の種類でありうる。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え融合タンパ ク質の陰イオン交換クロマトグラフィーに特に有用な材料は、発酵ブイヨン１０ ０Ｌにつき約０．９Ｌが用いられるベーカーボンド・ワイド・ポア （Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ）^TMＰＥＩ−シリカ（Ｊ．Ｔ．ベー カー（Ｂａｋｅｒ）、フィップスバーグ、Ｎ．Ｊ．）である。適当な寸法のカラ ムを陰イオン交換樹脂によって製造し、そして適当な緩衝液で平衡させて陰イオ ン交換基を帯電させる。結合および溶離条件は、用いられる種々の適当なイオン 交換樹脂にとって最適にすることができる。ベーカーボンド・ワイド・ポア^TMＰ ＥＩ−シリカのための適当な緩衝液のｐＫ_aは約６〜約７の範囲である。好まし くは、カラムをリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．３〜６．７で平衡させる。更 に好ましくは、カラムを最初に５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で、続いて１ ０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄してイオン強度を減少させる。最も好まし くは、洗浄用緩衝液および溶出液のイオン強度の差は約０．２ｍＳ未満であり、 双方のｐＨは６．５である。ＰＥＩ基を用いる場合、組換え融合タンパク質を含 む流体を１０ｍＭリン酸ナトリウムとし、そしてｐＨを塩基で調整する。更に好 ましくは、ｐＨは約６．３〜約６．７である。最も好ましくは、ｐＨを５０％Ｎ ａＯＨで６．５に調整する。次に、組換え融合タンパク質を含むｐＨ調整された 流体を、平衡されたＰＥＩカラムに適用する。混入タンパク質は、リン酸ナトリ ウムなどの適当な緩衝液でカラムを洗浄することによって除去される。更に好ま しくは、緩衝液のｐＨは約６．３〜約６．７である。最も好ましくは、緩衝液は １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５である。組換え融合タンパク質は 、陰イオン交換樹脂に対して吸着し、塩を含むリン酸ナトリウム緩衝液の適用に よって一層高度に精製された状態で溶離することができる。更に好ましくは、緩 衝液のｐＨは約６．３〜約６．７であり、塩は塩化ナトリウムである。最も好ま しくは、緩衝液は２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、４００ｍＭ塩化ナトリ ウムである。単一溶出プールは、吸光度の上昇が見られたら開始し且つピークを 越えて吸光度が最大限ピーク高さの１０％未満に戻るまで続けて集められる。溶 出液は２〜８℃で貯蔵するのが最も好ましい。或いは、溶出液を約−２０℃未満 で冷凍貯蔵し、そして次の精製工程の前に融解させることができる。組換え融合 タンパク質の存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは他の適当な手段によって決定され 、そしてタンパク質濃度を適当なタンパク質検定を用いて決定する。組換え融合 タンパク質は、更に、イライザなどの適当な機能検定によって定量すること ができる。 第二陽イオン交換樹脂を用いて、組換え融合タンパク質を更に精製することが できる。適当な陽イオン交換樹脂としては、スルホネート基、スルホプロピル基 またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスがあり；スルホプロ ピル基が好ましい。マトリックスは、マトリックスは、アクリルアミド、アガロ ース、デキストラン、セルロース、シリカ、またはタンパク質精製において一般 的に用いられる他の種類でありうる。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む組換え 融合タンパク質の陽イオン交換クロマトグラフィーに特に有用な材料は、発酵ブ イヨン１００Ｌにつき約１．２５Ｌが用いられるフラクトゲル シュタット、ドイツ；ＥＭセパレーション（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、ギブズタ ウン、Ｎ．Ｊ．によって配給された）である。適当な寸法のカラムを陽イオン交 換樹脂によって製造し、そして適当な緩衝液で平衡させて陽イオン交換基を帯電 させる。結合および溶離条件は、用いられる種々の適当なイオン交換樹脂にとっ 液のｐＫ_aは約３〜約５の範囲である。好ましくは、カラムを酢酸ナトリウム、 ｐＨ３．８〜４．２で平衡させる。更に好ましくは、カラムを最初に２５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄して イオン強度を減少させる。最も好ましくは、洗浄用緩衝液および溶出液のイオン 強度の差は約０．２ｍＳ未満であり、双方のｐＨは４．０である。スルホプロピ ル基を用いる場合、組換え融合タンパク質を含む流体を水で希釈して、流体のイ オン強度を減少させ、そしてｐＨを減少させる。好ましくは、流体のイオン強度 は約１０ｍＳ未満であり、ｐＨは約３．８〜約４．２である。最も好ましくは、 流体を酢酸ナトリウムで１０ｍＭとし、そしてｐＨを酢酸で４．０に調整する。 次に、調整された流体を、平衡されたスルホプロピルカラムに適用する。混入タ ンパク質は、酢酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄することによって除去される 。好ましくは、酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨは約３〜約５である。更に好ましく は、酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨは約３．８〜約４．２である。最も好ましくは 、酢酸ナトリウム緩衝液は２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０である。次に、 カラムを、僅かに高いｐＨの第二洗浄用緩衝液で洗浄する。好ましくは、第二洗 浄用緩衝液のｐＨは約５〜約６である。更に好ましくは、緩衝液は４−モルホリ ンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液である。最も好ましくは、緩衝液は２５ｍ Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．５（バッファーＡ）である。組換え融合タンパク質は陽イ オン交換樹脂に対して吸着し、直線塩勾配によって溶離することができる。好ま しくは、直線塩勾配は、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で達成される。更に好ましく は、直線塩勾配のｐＨは約５．３〜約６．２である。最も好ましくは、２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ（バッファーＢ）の１５カラム容量 直線勾配を、１００％バッファーＡ〜１００％バッファーＢまで達成する。カラ ム容量の約２０％の画分を集め；精製融合タンパク質を含むこれらの画分を、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥまたは他の適当な手段によって同定し、そしてプールした。或い は、単一溶出プールを、吸光度の上昇が見られたら開始し且つピークを越えて吸 光度が最大限ピーク高さの１０％未満に戻るまで続けて集める。画分またはプー ルは２〜８℃で貯蔵するのが最も好ましい。或いは、画分またはプールを約−２ ０℃未満で冷凍貯蔵し、そして次の精製工程の前に融解させることができる。タ ンパク質濃度を適当なタンパク質検定を用いて決定する。組換え融合タンパク質 は、更に、イライザなどの適当な機能検定によって定量することができる。 前述の精製工程のいくつかまたは全部を様々な組合せで用いても、均一の組換 え融合タンパク質を提供することができる。更に、追加の工程を用いて組換え融 合タンパク質標品の製造を最適にすることができる。濾過工程を含んで、組換え 融合タンパク質の無菌状態を確実にすることができる。このような濾過工程は、 組換え融合タンパク質を含む流体を、ミリポア・ミリパク２０などの絶対的０． ２μｍフィルターによって滅菌容器中に濾過することを含む。精製タンパク質を 濃縮して貯蔵用に好都合な容量または注入用組成物の標品を提供することができ るし且つ適当な緩衝液中に交換することができる。精製組換え融合タンパク質が 少なくとも約５ｍｇ／ｍｌまでの濃縮が好ましい。好ましい緩衝液は、０．１Ｍ トリス、ｐＨ７．４である。例えば、精製タンパク質を限外濾過によって濃縮し た後、少なくとも５容量の０．１Ｍトリス、ｐＨ７．４に対してダイアフィルト レーションを行なって、ｐＨが約７．２〜約７．６の、組換え融合タンパク質が 少なくとも５ｍｇ／ｍｌの溶液を生成することができる。或いは、追加の陽イオ ン交換工程を実施して、組換え融合タンパク質を濃縮し且つ緩衝液を交換するこ とができる。例えば、精製タンパク質のｐＨを４．０に調整し、そして精製タン パク質を別の陽イオン交換樹脂に対して極めて高タンパク質濃度まで適用する。 製タンパク質を陽イオン交換樹脂から０．１Ｍトリス、ｐＨ７．４で溶離して、 ｐＨが約７．２〜約７．６の、組換え融合タンパク質が少なくとも５ｍｇ／ｍｌ の溶液を生成する。組換え融合タンパク質の投与 組換え融合タンパク質を、所望の純度を有する融合タンパク質と生理学的に許 容しうる担体とを混合することによって投与用に製造する。このような担体は、 用いられる投薬量および濃度において受容者にとって無害である。通常、このよ うな組成物の製造は、融合タンパク質を、緩衝剤；酸化防止剤、例えば、アスコ ルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸； グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物；キレート剤、例え ば、ＥＤＴＡ；グルタチオン；並びに他の可溶化剤および賦形剤と混合すること を伴う。 融合タンパク質組成物を用いて、骨髄細胞などの造血系前駆細胞の増殖、分化 および機能的活性化を促進することができる。具体的には、融合タンパク質を含 む組成物を用いて、骨髄抑制患者における末梢血白血球数を増加させ且つ循環顆 粒球計数を増加させることができる。この結果を達成するために、治療的有効量 の融合タンパク質組成物を哺乳動物、好ましくはヒトに対して薬学的担体または 希釈剤と一緒に投与する。 以下の実施例を、制限としてではなく、例証として提供する。 実施例１ｐＩＸＹ３２１からのＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質の発現および精製 選択培地のフラスコに、発現プラスミドｐＩＸＹ３２１を含むＳ．セレビシエ ＸＶ２１８１を接種することによって予備培養を開始した。得られた予備培養を 約２４時間増殖させた後、組換え融合タンパク質の大規模生産において用いた。 大規模発酵の培養条件（温度、撹拌、通気、ｐＨ、背圧および栄養供給量を含む ）を監視し且つ発酵の間中最適パラメーターの範囲内で維持した。発酵工程の最 後に、発酵槽を室温まで冷却し、そして酵母発酵ブイヨンのｐＨを８．０〜９． ０に調整した。次に、発酵ブイヨンを透明にしてブイヨンをバイオマスから分離 した。透明なブイヨンを絶対的０．２μｍフィルターによって滅菌タンク中に濾 過し且つ２〜８℃で次の精製工程まで保持した。 透明なブイヨンを約５倍に濃縮した後、２容量の精製水を用いる定容量ダイア フィルトレーションを行なった。ダイアフィルトレーションされたブイヨンのｐ Ｈを、氷酢酸を用いてｐＨ５．０に調整した。濃縮されたダイアフィルトレーシ ョンブイヨンを一連のイオン交換樹脂を用いてさらに精製した。濃縮されたダイ アフィルトレーションブイヨンを、陽イオン交換樹脂ＳＰ−トーヨーパール^TM（ 樹脂約１ｍｌ／発酵ブイヨン６０）を充填し、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４ ．０で平衡された３５ｃｍＸ３．７ｃｍカラム（３．６Ｌ）に適用した。溶出液 の吸光度を２８０ｎｍで監視した。濃縮されたダイアフィルトレーションブイヨ ンの適用後、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５でベースライン吸光度までカ ラムを洗浄した。ミリパク２０フィルターをカラム出口に取付け、そして２５ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、４００ｍＭ ＮａＣｌを用いてＳＰ−トーヨー パール^TMから組換え融合タンパク質を段階溶離した。単一溶出プールを集めた。 吸光度が増加し始めた時点で採取を開始し、そして吸光度がピークを形成する間 、吸光度が最大限ピーク高さの１０％未満に戻るまで続けた。溶出プール（約８ Ｌの容量）を２〜８℃で次の精製工程まで貯蔵した。 ＳＰ−トーヨーパール^TMカラムからの溶出プールを、精製水を用いて５倍に希 釈して導電率を約９ｍＳに調整した。希釈された溶出プールのｐＨは、１．０Ｍ トリスＨＣｌを加えることにより希釈された溶出プールを約１０ｍＭトリスＨＣ ｌとし、そして１Ｍ ＮａＯＨで調整することによってｐＨ８．０±０．２に調 整された。次に、希釈された溶出プールを、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０ ファスト・フローカラム（樹脂約１ｍｌ／発酵ブイヨン３５ｍｌ）に充填した。 溶出液の吸光度を２８０ｎｍで監視した。カラムを少なくとも２容量の２５ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０±０．２で、続いて５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５ ．０±０．２で、ベースライン吸光度まで洗浄した。ミリパク２０フィルターを カラム出口に取付け、そして組換え融合タンパク質を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、 ｐＨ４．５±０．２で段階溶離した。吸光度が増加し始めた時点で採取を開始し 、そして吸光度がピークを形成する間、吸光度が最大限ピーク高さの１０％未満 に戻るまで続けた。溶出プールの容量は約８．５Ｌであった。 ＤＥＡＥセファロースカラムからの溶出プールをリン酸ナトリウムで約１０ｍ Ｍとし、５０％ＮａＯＨを用いてｐＨを６．５±０．２に調整した。次に、調整 された溶出プールを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５±０．２で平衡さ れた１４ｃｍｘ１２ｃｍ（１．９Ｌ）ベーカーボンド・ワイド・ポア^TMＰＥＩ（ ＷＰ−ＰＥＩ；樹脂約１ｍｌ／発酵ブイヨン１１０ｍｌ）カラムに充填した。溶 出液の吸光度を２８０ｎｍで監視した。カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ６．５±０．２によってベースライン吸光度まで洗浄した。ミリパク２０フィ ルターをカラム出口に取付け、そして組換え融合タンパク質を、２５ｍＭリン酸 ナトリウム、ｐＨ６．５±０．２中４００ｍＭ ＮａＣｌで段階溶離した。吸光 度が増加し始めた時点で採取を開始し、そして吸光度がピークを形成する間、吸 光度が最大限ピーク高さの１０％未満に戻るまで続けた。組換え融合タンパク質 を含むＷＰ−ＰＥＩ溶出プールの容量は約２．３リットルであった。 ＷＰ−ＰＥＩ溶出プールを水で約５倍に希釈し、酢酸ナトリウムで約２５ｍＭ とし、そして濃塩酸を用いてｐＨを４．０Ａ±０．２に調整した。次に、材料を 、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０±０．２で平衡された１４ｃｍｘ１７ｃ ｍ ／発酵ブイヨン８０ｍｌ）に充填した。溶出液の吸光度を２８０ｎｍで監視した 。カラムを最小限２カラム容量の２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０±０．２ で洗浄した。次に、カラムを２５ｍＭ ４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥ Ｓ）、ｐＨ５．５（バッファーＡ）で、緩衝液および溶出液のｐＨが０．２の範 囲内になるまで洗浄した。２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５、５００ｍＭ ＮａＣ １（バッファーＢ）の直線勾配を１００％Ａ〜１００％Ｂまで約０．３％／分の 速度で達成し、そしてカラムを１２１ｍｌ分の流量で溶離した。５００ｍｌ画分 を集め；精製組換え融合タンパク質を含むこれらの画分をプールして全容量約１ １．５Ｌを生成した。溶出プールを限外濾過によって少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ の濃度まで濃縮し、そして緩衝液を０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４によって 交換した。得られた精製濃縮融合タンパク質標品（精製薬剤濃厚物）を、実施例 ２に記載のように分析して純度および活性を決定した。 実施例２ ｐＩＸＹ３２１からの精製組換え融合タンパク質の分析 精製薬剤濃厚物は、ＤＮＡ １０ｐｇ未満／ｍｇ（タンパク質）およびリムル スアメーバ細胞検定によって内毒素１０単位未満／ｍｇ（タンパク質）を含む透 明無色液体であった。精製組換え融合タンパク質を含むプール試料を、還元剤（ ２％ ２−メルカプトエタノール）含有および不含の試料緩衝液（０．１Ｍトリ ス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ）２０％グリセロール、０．１％ピロニンＹ、０． ０１％ブロムフェノールブルー）中で希釈し、そして１０〜２０％勾配ポリアク リルアミドゲル（濃縮用ゲル：０．１２Ｍトリス、ｐＨ６．８、４．６％アクリ ルアミド、０．１２％ビス−アクリルアミド、０．１％ＳＤＳ；ランニングゲル ：０．３７Ｍトリス、ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳ）１０〜２０％アクリルアミ ド、０．５４〜０．２６％ビス−アクリルアミド）のウェルに適用した。試料を ３０〜４０ｍＡ定電流で、追跡用色素がゲルの底部に達するまで電気泳動させた 。次に、ゲルを０．２％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０、４５％メタノ ール、１０％酢酸に入れて約１時間染色した後、２５％メタノール、７．５％酢 酸によって、背景が透明になり且つタンパク質バンドが可視になるまで脱染色し た。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをデンシトメトリー走査によって分析して、精製 組換え融合タンパク質標品の相対純度を評価した。クーマシーブルーによって染 色されたゲルの走査デンシトメトリーは、プール中に存在するタンパク質が９８ ％より大の組換え融合タンパク質から成ることを示した。 同様に１０〜２０％ゲルを製造し、試料を試料緩衝液中で希釈し且つ実質的に 同様の方法で電気泳動を行なった。電気泳動されたゲルを５％メタノール、７％ 酢酸中に３０〜３５分間入れた後、精製水で２回洗浄し、そして２．５％グルタ ルアルデヒド中に３０〜３５分間浸漬した。次に、ゲルを精製水で４回洗浄し、 ９５％エタノール１００ｍｌ中に５〜１０分間入れた。９５％エタノールを精製 水で５０％まで希釈し、そしてゲルを更に１０〜１５分間インキュベートした。 次に、ゲルを１０％エタノール溶液に最低３０分間移した後、それを銀染色液（ ０．７８％ｗ／ｖ硝酸銀）で１２〜１５分間染色した。次に、ゲルを精製水で少 なくとも５回洗浄し、そして展開溶液（０．５％クエン酸、１．９％ホルムアル デヒド、１０％エタノール）に移し、そしてタンパク質バンドが分離されるまで インキュベートした。展開は、１０％酢酸中にゲルを入れることによって停止さ れた。銀染色により、組換え融合タンパク質標品中に存在する組換え融合タンパ ク質以外のタンパク質は存在しなかった。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を電気泳動によってニトロセ ルロースに移し、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよび組換えヒトＩＬ−３に対する単 クローン性抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。電気泳動後、ゲ ルを移動用緩衝液（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭトリス、２０％メタノール） 中に浸漬した後、移動カセット上の３ｍｍ濾紙の上においた。移動用緩衝液中に 浸漬されたニトロセルロース（０．４５μｍ細孔度）を各ゲル上においた。ニト ロセルロースの上に２枚の３ｍｍ濾紙を重ね、そして移動カセットを組立てた。 組立てられた移動カセットを、移動用緩衝液が入っている電気泳動室に入れ、ニ トロセルロースがゲルと陽極との間に位置するように方向付けた。ゲルからニト ロセルロースへのタンパク質の移動は、１ａｍｐで１〜２時間の電気泳動によっ て達成された。移動カセットを電気泳動室から取出し、５０ｍＭトリス、ｐＨ７ ．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中３％ウシ血清アルブミン（ＴＢＳ−３％ＢＳ Ａ）を用いて３０〜３５分間ブロックした。次に、ニトロセルロースをリン酸緩 衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてヒトＧＭ−ＣＳＦに対する単クローン性 抗体（ＴＢＳ−３％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌ）と一緒に約１時間インキュベートし た。二重反復試験ブロットを、ＩＬ−３に対する単クローン性抗体（ＴＢＳ−３ ％ＢＳＡ中１０μｇ／ｍｌ）と一緒に約１時間インキュベートした。次に、ブロ ットをＰＢＳで洗浄し、そしてＴＢＳ−３％ＢＳＡ中１：２００に希釈されたヤ ギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体と一緒に約１時間インキュベートし た。２回目のインキュベーション工程完了後、ブロットをＰＢＳで洗浄し、そし てペルオキシダーゼの基質として４−クロロナフトールを用いて発色試薬と一緒 にインキュベートした。ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＩＬ−３に対する単クロー ン性抗体は両方とも、組換え融合タンパク質に対して結合し且つウェスタンブロ ットによって陽性の結果を生じた。 更に、組換え融合タンパク質の純度を、分析用逆相−ＨＰＬＣにより、０．１ ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で平衡されたビダク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ１８カラ ム（４．６ｍｍｘ２５ｃｍ、１０μｍ、３００オングストローム）を用いて評価 した。アセトニトリル、０．１％ＴＦＡの勾配は２％／分の変化率で達成されて （０〜８０％）、組換え融合タンパク質をカラムから溶離した。組換え融合タン パク質に対応するピークは、組換え融合タンパク質の対照標準標品（予め精製さ れて且つほぼ純粋であることが分かった標品）のそれに対応する保持時間に検出 された。結果は、組換え融合タンパク質が、精製薬剤濃厚物中に存在するタンパ ク質の９９％より大を構成していることを示した。 精製組換え融合タンパク質のアミノ酸組成およびアミノ末端配列を更に決定し た。アミノ酸組成は、組換え融合タンパク質の対照標準のそれと一致した。アミ ノ末端も対照標準組換え融合タンパク質のそれと一致した。更に、等電点電気泳 動を行なって、組換え融合タンパク質の等電点を決定した。観察されたｐＩバン ドは、対照標準組換え融合タンパク質のものと一致した。 精製組換え融合タンパク質の力価は、ＴＦ−１細胞を用いる細胞増殖検定で評 価された。ＴＦ−１細胞は、ヒト赤血球性白血病細胞に由来する連続的継代細胞 系であり、増殖についてＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦに依存する。ＴＦ−１細胞 は、ＧＭ−ＣＳＦ含有培地中で維持された。検定において用いる前に、細胞をＧ Ｍ−ＣＳＦ不含であるように洗浄し、そして検定培地（イスコヴ修飾ダルベッコ 培地（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ′ｓ Ｍｅｄｌｕｍ）中５ｘ１０⁴個／ｍｌの細胞濃度で再懸濁させた。懸濁細 胞を、組換え融合タンパク質標品、陽性対照または陰性対照の希釈液が入ってい る９６ウェル微量滴定プレートのウェルに加えた。細胞を３７℃で７２時間イン キュベートし；トリチウム化チミジンをインキュベーションの最後に４時間加え ることによって増殖を測定した。細胞をガラス繊維フィルター 上に採取し、そして取込まれた放射能量をシンチレーション計数によって決定し た。精製組換え融合タンパク質の力価は２．１ｘ１０⁸Ｕ／ｍｇ（単位は、ＴＦ −１バイオアッセイにおいて半最大増殖を誘導する組換え融合タンパク質の量と して定義される）であった。 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３双方の受容体に対する組換え融合タンパク質の結 合親和性は、実質的に、パーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ４ ：５４２０；１９８９年およびパークら、Ｂｌｏｏｄ ７４：５６；１９８９ 年に記載のように決定された。ＧＭ−ＣＳＦ受容体に対する結合親和性は１．０ ｘ１０¹⁰Ｍ^-1であり；ＩＬ−３受容体に対しては２．２ｘ１０¹⁰Ｍ^-1であった。 実施例３ｐＩＸＹ３４４からのＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の発現および精製 プラスミドｐＩＸＹ３４４を含む酵母細胞を培養して、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳ Ｆ融合タンパク質を適当な培地中に発現させ且つ分泌させた。培養は発酵ブイヨ ン約９５０ｍｌを生じ、それを遠心分離によって透明にして酵母細胞を除去した 。遠心分離後、透明なブイヨンの量は約７２０ｍｌであり；０．４５μｍカット オフフィルターを介する濾過によってブイヨンを更に透明にした。透明なブイヨ ンを、１０Ｋ ＭＷカットオフ膜を用いる接線流動濾過によって約７０ｍｌの量 まで濃縮した。濃縮ブイヨンを水約２４０ｍｌによってダイアフィルトレーショ ンを行なってイオン強度を７．６ｍＳまで減少させた。ダイアフィルトレーショ ンシステムは、水約５０ｍｌによって瞬間蒸発させて、濃縮された流体約１５ｍ ｌを生じ、結果として透明なブイヨンが約５倍に濃縮された。濃縮ブイヨンは僅 かに濁りがあり、２〜８℃で一晩中貯蔵された。 翌日、濃縮ブイヨンのｐＨを２Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に調整した後、ブイヨ ンを、ＳＰ−トーヨーパール^TMを充填され、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４． ０で平衡された３．２ｃｍＸ５．５ｃｍカラムに適用した。カラムを約１２０ｍ ｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５によって、溶出液のｐＨが５．５にな るまで洗浄した。組換え融合タンパク質は、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５． ５／４００ｍＭ塩化ナトリウムで溶離されて、溶出液約６０ｍｌを生じた。 ＳＰ−トーヨーパール^TMカラムからの溶出液を水で約３倍に希釈し、そして１ ０ｍＭトリスＨＣｌとした後、そのｐＨを２Ｍ水酸化ナトリウムで調整した。調 整された材料の最終ｐＨは約８．０であり、イオン強度は９．７５ｍＳであった 。調整された材料を、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０±０．２で平衡された ラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０±０．２によって、溶出液のｐＨが ５．０になるまで（約５００ｍｌ）洗浄した。組換え融合タンパク質は、５０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５±０．２によって段階溶離されて、溶出液約１０ ０ｍｌを生じた。 ＤＥＡＥセファロースカラムからの溶出液を１０ｍＭリン酸ナトリウムとし、 ２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを６．５±０．２に調整し、そして１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５±０．２で平衡された２．２ｃｍｘ１．８ｃｍベ ーカーボンド・ワイド・ポア^TMＰＥＩ（ポリエチレンイミン）カラムに充填した 。組換え融合タンパク質を結合させた後、カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、 ｐＨ６．５±０．２で洗浄し、続いて２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５± ０．２中４００ｍＭ ＮａＣｌを用いて段階溶離を行なった。組換え融合タンパ ク質を含むＷＰ−ＰＥＩ溶出プールは約１１ｍｌであった。ＷＰ−ＰＥＩ溶出プ ールをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そして均一な組換え融合タンパク質を 含んでいることが分かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびイン ターロイキン−３（ＩＬ−３）を含む組換え融合タンパク質を水溶液から精製す る方法であって、 （ａ）組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂に対して吸着させ； （ｂ）組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂から溶離し； （ｃ）工程（ｂ）からの組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂に対し て吸着させ； （ｄ）組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂から溶離し； （ｅ）工程（ｄ）からの組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂に対し て吸着させ； （ｆ）組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂から溶離する工程を含む 上記方法。 ２． 陽イオン交換樹脂が、スルホネート基、スルホプロピル基およびカルボ キシメチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、アガロ ース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリックス から成る群より選択され；第一陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基およびジエチ ルアミノエチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、ア ガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリッ クスから成る群より選択され；そして第二陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基、 ジエチルアミノエチル基およびポリエチレンイミン基から成る群より選択される 官能基を有するセルロース基剤、アガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基 剤および合成ポリマー基剤マトリックスから成る群より選択される請求項１に記 載の方法。 ３． 陽イオン交換樹脂がＳＰ−トーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）^TMで ファスト・フロー（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）であり、そして第二陰イオン交換樹脂 がベーカーボンド・ワイド・ポア（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ）^TMＰＥＩである請求項１に記載の方法。 ４． （ａ）第二陰イオン交換樹脂から溶離された組換え融合タンパク質を第 二陽イオン交換樹脂に対して吸着させ；そして （ｂ）組換え融合タンパク質を第二陽イオン交換樹脂から溶離することを更に 含む請求項１に記載の方法。 ５． 第二陽イオン交換樹脂が、スルホネート基、スルホプロピル基およびカ ルボキシメチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、ア ガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリッ クスから成る群より選択される請求項４に記載の方法。 ＳＯ₃−６５０である請求項５に記載の方法。 ７． 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびイン ターロイキン−３（ＩＬ−３）を含む組換え融合タンパク質を、ＧＭ−ＣＳＦお よびＩＬ−３を含む組換え融合タンパク質含有水溶液から精製する方法であって 、 （ａ）組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂に対して吸着させ； （ｂ）組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂から溶離し； （ｃ）工程（ｂ）からの組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂に対して吸 着させ； （ｄ）組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂から溶離し； （ｅ）工程（ｄ）からの組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂に対し て吸着させ；そして （ｆ）組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂から溶離する 工程を含む上記方法。 ８． 第一陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基およびジエチルアミノエチル基 から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、アガロース基剤、デ キストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリックスから成る群よ り選択され；陽イオン交換樹脂が、スルホネート基、スルホプロピル基およびカ ルボキシメチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、ア ガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリッ クスから成る群より選択され；そして第二陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基、 ジエチルアミノエチル基およびポリエチレンイミン基から成る群より選択される 官能基を有するセルロース基剤、アガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基 剤および合成ポリマー基剤マトリックスから成る群より選択される請求項７に記 載の方法。 り、陽イオン交換樹脂がＳＰ−トーヨーパール^TMであり、そして第二陰イオン交 換樹脂がベーカーボンド・ワイド・ポア^TMＰＥＩである請求項８に記載の方法。 １０．（ａ）第二陰イオン交換樹脂から溶離された組換え融合タンパク質を第 二陽イオン交換樹脂に対して吸着させ；そして （ｂ）組換え融合タンパク質を第二陽イオン交換樹脂から溶離することを更に 含む請求項７に記載の方法。 １１．第二陽イオン交換樹脂が、スルホネート基、スルホプロピル基およびカ ルボキシメチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、ア ガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリッ クスから成る群より選択される請求項１０に記載の方法。 １１に記載の方法。 １３．顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびイン ターロイキン−３（ＩＬ−３）を含む組換え融合タンパク質を精製する方法であ って、 （ａ）ｐＩＸＹ３２１およびｐＩＸＹ３４４から成る群より選択されるプラス ミドを含む細胞を培養して、組換え融合タンパク質を水性培地中に発現させ且つ 分泌させ； （ｂ）水性培地を透明にして、組換え融合タンパク質を除去することなく培養 細胞を除去し； （ｃ）水性培地中の組換え融合タンパク質を濃縮して、更に処理するのに好都 合な量の流体を生じ； （ｄ）組換え融合タンパク質を含む濃縮された流体を陽イオン交換樹脂に適用 し； （ｅ）組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂に対して吸着させ； （ｆ）陽イオン交換樹脂を洗浄して混入タンパク質を除去し； （ｇ）組換え融合タンパク質を陽イオン交換樹脂から溶離して、組換え融合タ ンパク質を含む溶出プールを生成し； （ｈ）工程（ｇ）からの溶出プールを第一陰イオン交換樹脂に対して適用し； （ｉ）溶離された組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂に対して吸着 させ； （ｊ）第一陰イオン交換樹脂を洗浄して混入タンパク質を除去し； （ｋ）組換え融合タンパク質を第一陰イオン交換樹脂から溶離して、組換え融 合タンパク質を含む溶出プールを生成し； （ｌ）工程（ｋ）からの溶出プールを第二陰イオン交換樹脂に対して適用し； （ｍ）組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂に対して吸着させ； （ｎ）第二陰イオン交換樹脂を洗浄して混入タンパク質を除去し；そして （ｏ）組換え融合タンパク質を第二陰イオン交換樹脂から溶離して、組換え融 合タンパク質を含む溶出プールを生成する 工程を含む上記方法。 １４．陽イオン交換樹脂が、スルホネート基、スルホプロピル基およびカルボ キシメチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、アガロ ース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリックス から成る群より選択され；第一陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基およびジエチ ルアミノエチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、ア ガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリッ クスから成る群より選択され；そして第二陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基、 ジエチルアミノエチル基およびポリエチレンイミン基から成る群より選択される 官能基を有するセルロース基剤、アガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基 剤および合成ポリマー基剤マトリックスから成る群より選択される請求項１３に 記載の方法。 １５．陽イオン交換樹脂がＳＰ−トーヨーパール^TMであり、第一陰イオン交換 換樹脂がベーカーボンド・ワイド・ポア^TMＰＥＩである請求項１４に記載の方法 。 １６．組換え融合タンパク質を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５ 、４００ｍＭ塩化ナトリウムを加えることによって陽イオン交換樹脂から、５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５を加えることによって第一陰イオン交換 樹脂から、そして２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、４００ｍＭ塩 化ナトリウムを加えることによって第二陰イオン交換樹脂ＰＥＩから溶離する請 求項１５に記載の方法。 １７．（ａ）工程（ｏ）からの水性溶出液を第二陽イオン交換樹脂に対して適 用し； （ｂ）組換え融合タンパク質を第二陽イオン交換樹脂に対して吸着させ； （ｃ）第二陽イオン交換樹脂を洗浄して混入タンパク質を除去し；そして （ｄ）組換え融合タンパク質を第二陽イオン交換樹脂から溶離して、組換え融 合タンパク質を含む水性溶出液を生成すること を更に含む請求項１３に記載の方法。 １８．第二陽イオン交換樹脂が、スルホネート基、スルホプロピル基およびカ ルボキシメチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤、ア ガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マトリッ クスから成る群より選択され；第一陰イオン交換樹脂が、第四アミノ基およびジ エチルアミノエチル基から成る群より選択される官能基を有するセルロース基剤 、アガロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤および合成ポリマー基剤マト リックスから成る群より選択され；そして第二陰イオン交換樹脂が、第四アミノ 基、ジエチルアミノエチル基およびポリエチレンイミン基から成る群より選択さ れる官能基を有するセルロース基剤、アガロース基剤、デキストラン基剤、シリ カ基剤および合成ポリマー基剤マトリックスから成る群より選択される請求項１ ７に記載の方法。 １８に記載の方法。 ２０．組換え融合タンパク質を、０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ ４−モル ホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ５．５〜５００ｍＭ塩化ナトリ ウム、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０の塩化ナトリウム勾配を加えること によって第二陽イオン交換樹脂から溶離する請求項１９に記載の方法。