JPH08503620A - Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属およびｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌の検出のための核酸プローブ、および麦酒腐敗の原因となる細菌物質の検出方法 - Google Patents
Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属およびｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌の検出のための核酸プローブ、および麦酒腐敗の原因となる細菌物質の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
麦酒の腐敗の原因となる微生物のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに優先的に結合する核酸配列が開示される。麦酒腐敗微生物は、主としてLactobacillus属およびPediococcus属である。この核酸は、これらの微生物の存在を検出するためのアッセイにおいて用いることができる。２以上のプローブを含むキットもまた開示される。
Description
【発明の詳細な説明】
PEDIOCOCCUS属およびLACTOBACILLUS属の細菌の検出のための核酸プローブ、
および麦酒腐敗の原因となる細菌物質の検出方法
本発明は、麦酒醸造環境中において麦酒の腐敗に関与する、Pediococcus sp．
およびLactobacillus sp．を含む生物の検出のための核酸、プローブ、キットお
よび方法に関する。
発明の背景
微生物のコンタミネーションによる麦酒腐敗を防止することは、商業的麦酒醸
造所の主要な関心事である。麦酒を腐敗させることが示されている、または麦酒
腐敗と関連づけられてきた主要な生物は、Lactobacillus属およびPediococcus属
のメンバーである（The Prokaryotes，Vol．II，2nd Edition，Balows，et al，
Eds.，1991を参照のこと）。これらの細菌は、非常に少ない数で存在するかもし
れず、伝統的な培養方法によればその検出には３日から５日あるいはそれ以上が
必要である。
Pediococcus属のメンバーは、しばしば四分子を形成するグラム陽性球菌であ
る。これらは、複雑な栄養要求性を有しており、種々の糖を発酵させることがで
きる。これらは、種々の生息地において見いだされる条件的嫌気性菌であり、極
めて頻繁に植物の発酵に関与する。この属には８つの種がある；麦酒腐敗の原因
となることが知られている属の主要メンバーはP．damnosusである。
Lactobacillus属は、グラム陽性非胞子桿状菌を含み、厳格に発酵性の代謝を
利用し、複雑な栄養要求性を有している。これらは、水、乳製品、肉製品および
魚製品、植物および発酵植物、ならびに哺乳動物の口腔および腸管を含む、種々
の生息地において見いだされる。
いくつかの研究により、麦酒を腐敗させうる細菌の株が同定されており、それ
らの種の中でそのように関連づけられた株の相対的な数は、重要な順に、Lactob
acillus brevis、P．damnosus、L．casei、L．1indneri、L．coryniformis、L．
buchneri、L．plantarumおよびL．curvatusである。
麦酒腐敗生物を検出するための現行の方法は、古典的な微生物学および細菌に
よるコンタミネーションの存在または不在の一般的な検出に頼っている。これら
の方法としては、（ａ）培養；（ｂ）直接蛍光抗体（ＤＦＡ）；および（ｃ）培
養確認のための核酸プローブがある。腐敗生物の正確な同定には、古典的な生化
学試験およびコッホの条件の満足、すなわち新鮮な麦酒を”再感染”させてそれ
が腐敗することを示すことが必要である。
発明の記述
本発明の１つの目的は、麦酒の腐敗の原因となるが腐敗していない麦酒には存
在しない生物のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびリボソームＤＮＡ（ｒＤＮ
Ａ）中の独特の核酸配列に相補的な核酸を提供することである。本発明の別の目
的は、通常のアッセイ条件下においてプローブに対してアクセス可能とされうる
標的領域にハイブリダイズすることができる核酸プローブを提供することである
。本発明の目的は更に、（１）P．damnosusと非Pediococcus種とを特異的に識別
する；（２）麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半と他の種とを特異的に
識別する；（３）L．brevisと非Lactobacillus種とを特異的に識別する；（４）
Lactobacillus種のクラスター（クラスターは、L．fructivorans、L．casei、L
．curvatus、L．brevisおよびL．buchneriからなる細菌の群である）と非クラス
ター種とを特異的に識別する；（５）P．damnosusおよびL．brevisの群と他の種
とを特異的に識別する；（６）麦酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLacto
bacillus種の大半と他の種とを特異的に識別する；あるいは（７）Pediococcus
およびLactobacillus（および関連する種）の大半と他の種とを特異的に識別す
る；プローブを提供することである。
細菌のリボソームには３種の異なるＲＮＡ分子があり、少なくともEscherichi
a coliにおいては、５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡと称されている。真核生
物においては、一般に５Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓおよび５．８Ｓと称される４種の異
なるｒＲＮＡがある。これらの名前は、歴史的に、沈降速度で決定されるＲＮＡ
分子の大きさに関連している。しかし、実際には、ｒＲＮＡ分子の大きさは生物
によって異なる。それにもかかわらず、５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡは、
いかなる細菌のｒＲＮＡ分子についても称されている、当該技術分野で認知され
た名前であり、本明細書においてもこの慣用法を使用する。
図面の説明
図１はサンドイッチアッセイの図である。
定義
本明細書および請求の範囲を通して用いられる場合、“プローブ”の語は、合
成または生物学的に製造される、１０から２５０塩基の長さの核酸を表し、これ
は設計または選択によって、予め決められた条件下で標的核酸配列と特異的かつ
優先的にハイブリダイズしうる特異的なヌクレオチド配列を含み、さらに、場合
により検出のための、またはアッセイの性能を上げるための部分を有する。最小
限度の１０ヌクレオチドは、統計的に特異性を獲得し、安定なハイブリダイゼー
ション生産物を形成するために一般に必要であり、最大限度の２５０ヌクレオチ
ドは、一般にミスマッチ配列を決定し、優先的なハイブリダイゼーションを行な
うために反応パラメーターを調整しうる配列の上限を示す。従って、一般に、好
ましいプローブの長さは１０から２５０ヌクレオチドの間であろう。場合によっ
ては、プローブはある特定のアッセイ条件下で的確にまたは最適に機能するため
に適する成分を含有してもよい。例えば、（エンドキャッピング等により）核酸
分解酵素による分解に対する抵抗性を改良するため、（フルオレセイン、32Ｐ、
ビオチン等のような）検出リガンドを付与するため、あるいは固体の支持体への
捕捉を容易にする（例えばポリ−デオキシアデノシンの“テール”をつける）た
めにプローブを修飾してもよい。
“優先的なハイブリダイゼーション”または“優先的にハイブリダイズする”
とは、相対的な意味において用いられる。すなわち、１つのハイブリダイゼーシ
ョン反応生産物は、同一の条件下において他のハイブリダイゼーション反応生産
物よりも安定である。条件によっては、ハイブリダイゼーション反応生産物は、
１つの標的に関して形成されるが他の潜在的結合相手については形成されない。
ハイブリダイゼーション反応生産物の安定性を比較し、どちらがより安定かを評
価する、すなわちどちらが“優先的に”結合しているかを決定することは通常の
技術者の能力の範囲内である。
本明細書において用いる場合、“ホモロジー”および“相同である”の語は、
２個またはそれ以上の核酸配列間の類似の度合を表すことを意味し、生物間の分
類学的な類似度合を意味するものではない。類似の度合はパーセンテージで表わ
し、例えば２個の配列間が９０％ホモロジーであるとは、第１の配列の塩基の９
０％が第２の配列の塩基と同一にマッチすることを意味する。
“Lactobacillus種のクラスター”とはL．fructivorans、L．casei、L．curva
tus、L．brevisおよびL．buchneriからなる群より選択されるLactobacillus種の
群を意味する。
“特異的”とは、ヌクレオチド配列が予め決められた標的配列にハイブリダイ
ズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしないこと、または非標的配列に
対するハイブリダイゼーションが最小限であることを意味する。
“ハイブリダイゼーション”は、予め決められた反応条件下において、核酸の
２本の部分的にもしくは完全に相補的な鎖が逆平行になるように並び、特異的か
つ安定な水素結合で核酸の２本鎖を形成し、核酸の塩基が互いに対になるという
明白な規則に従って行われる過程である。
“実質的なハイブリダイゼーション”とは、その結果を観察した者がその結果
を臨床的な状態において陽性と考えるであろうハイブリダイゼーションの程度を
意味する。“バックグラウンドノイズ”と考えられるデータは実質的なハイブリ
ダイゼーションではない。
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”とは、約０．９モルＮａ
Ｃｌの塩溶液中で約３５℃から６５℃の条件を意味する。ストリンジェンシーは
また、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度およびタイプ、
存在する変性剤のタイプおよび濃度、およびハイブリダイゼーションの温度等の
反応パラメーターによって左右されるかもしれない。一般に、ハイブリダイゼー
ション条件がよりストリンジェントになるにしたがって、安定なハイブリッドが
形成されるためにはより長いプローブが好ましい。一般に、ハイブリダイゼーシ
ョンが行なわれる条件のストリンジェンシーによって、用いられるべき好ましい
プローブの性質が決められるだろう。当業者はそのような関係をよく理解してお
り、たやすく操作することができる。
“Lactobacillus sp.”とは、種にかかわらず、Lactobacillus属のいずれのメ
ンバーをも指す。
“Pediococcus sp.”とは、種にかかわらず、Pediococcus属のいずれのメンバ
ーをも指す。
“大半”とは、株に言及する場合には、既知の株の半分以上、または少なくと
も２５株の代表的標品が試験されるときには試験された株の半分以上を意味する
。種に言及する場合には、既知の種の半分以上、または代表的な数の種が試験さ
れるときには試験された種の半分以上を意味する。
本発明によれば、（１）他の非Pediococcus種と比較して、P．damnosusのｒＲ
ＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする；（２）他の種と比較して、
麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半に優先的にハイブリダイズする；（
３）非Lactobacillus種と比較して、L．brevisに優先的にハイブリダイズする；
（４）他の種と比較して、Lactobacillus種のクラスター（L．fructivorans、L
．casei、L．curvatus、L．brevisおよびL.buchneriからなる群より選択される
）に優先的にハイブリダイズする；（５）他の種と比較して、P．damnosusおよ
びL．brevisの群に優先的にハイブリダイズする；（６）他の種と比較して、麦
酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLactobacillus種の大半に優先的にハイ
ブリダイズする；および（７）PediococcusおよびLactobacillus（および関連す
る種）の大半と他の種とを特異的に識別する；約１０−２５０ヌクレオチドを含
む核酸が提供される。本発明の核酸は、同一のハイブリダイゼーション条件下に
おいて、被験試料中に存在するかもしれない非標的生物または宿主もしくは環境
的マトリックスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに実質的にハイブリダイズしない。
本発明の核酸は、麦酒の腐敗の原因となるであろう生物の存在を検出するため
に有用である。上記ヌクレオチドの少なくとも１０個の連続した核酸に対して相
補的であるか、またはそれと少なくとも９０％相同であるプローブも、本発明の
他の観点をなす。
本発明の１つの態様は、麦酒腐敗微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの
領域に対して相補的であるかまたはそれにハイブリダイズする核酸およびプロー
ブである。特に重要な１６Ｓ ｒＲＮＡの領域には、当業者によく知られた標準
である大腸菌（E．coli）の相同の領域の番号を参照して、下記に示すものが含
まれる。
P．damnosus：16S rRNA 位置 285-320，450-485および1435-1470；
L．brevis：16S rRNA位置75-105および450-485；
P．damnosusまたはL．brevis：16S rRNA位置805-840；
PediococcusおよびLactobacillus：16S rRNA位置120-150，210-245，280-31
5，485-515および750-785。
本発明の他の態様は、麦酒腐敗微生物の２３Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの領
域にハイブリダイズする核酸およびプローブである。特に重要な２３Ｓ ｒＲＮ
Ａの領域には、当業者によく知られた標準である大腸菌（E.coli）の相同の領域
の番号を参照して、下記に示すものが含まれる。
P．damnosus：23S rRNA位置700-740，870-910，925-960，1130-1165および1
205-1245。
L．brevis：23S rRNA位置280-320，325-363，1130-1165，1265-1300および1
480-1512。
P．damnosusおよびL．brevis：23S rRNA位置600-635。
好ましくは、核酸組成物は、下記よりなるプローブの群により定義される配列
の群から選択される配列中のいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列
の少なくとも９０％に対して相補的であるかまたはそれと相同である：２８５８
、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、２８６９、２８８０、
２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２
８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２。
これらのプローブの配列は後記に提示される。
本発明のさらに他の態様には、麦酒腐敗微生物の存在を検出するためのキット
が含まれる。このキットは、少なくとも２種類の核酸を含む１組の核酸を含む。
それぞれの核酸は長さ１０−２５０ヌクレオチドであり、異なる塩基配列組成の
ものである。それぞれの核酸は、下記プローブにより定義される配列の群から選
択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列の少なくとも９０％
に対して相補的であるかまたはそれと相同である：２８５８、２８６１、２８６
７、２８７６、２８７７、２８６８、２８６９、２８８０、２８９１、２８９２
、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２８８１、２８８７、
２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２。２プローブサンドイ
ッチアッセイにおける１組の核酸は、麦酒腐敗微生物の検出に特に適している。
このキットはさらに試薬、組成物、指示書、使い捨て器具、および簡便なアセン
ブリー中で市販しうる適当なパッケージを含む。
本発明のさらに他の態様には、麦酒腐敗微生物の存在を検出するための方法が
含まれる。この方法は、標的を含有する疑いのある試料を少なくとも１種類の核
酸と接触させる工程を含む。この核酸は、（１）P．damnosus；（２）他の種で
はなく、麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半；（３）他のLactobacillus
種ではなく、L．brevis；（４）他の種ではなく、Lactobacillus種のクラスター
（L．fructivorans、L．casei、L．curvatus、L．brevisおよびL．buchneriから
なる）；（５）他の種ではなく、P．damnosusおよびL．brevisの群；（６）他の
種ではなく、麦酒腐敗の原因となるPediococcus株およびLactobacillus種の大半
；および（７）他の種ではなく、PediococcusおよびLactobacillus（および関連
する種）の大半；のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリダイズする約１
０−２５０ヌクレオチドを有する。この方法は、核酸が標的ｒＲＮＡまたはｒＤ
ＮＡと優先的に結合して核酸複合体を形成するようにハイブリダイゼーション条
件を試料に付与し、そして標的生物（１または２以上）の存在を指示するものと
して複合体を検出する工程を含む。好ましくは本発明の核酸は、下記プローブに
より定義される配列よりなる群から選択されるいずれか１０個の連続したヌクレ
オチドを含む配列に対して少なくとも９０％相同である：２８５８、２８６１、
２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、２８６９、２８８０、２８９１、２
８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２８８１、２８
８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２。
本発明のプローブは、麦酒または環境試料中の麦酒腐敗生物の特異的検出のた
めの核酸ハイブリダイゼーションアッセイの開発の基礎を提供する。本発明のプ
ローブはまた、麦酒を腐敗させることが示されている微生物の存在を確認するた
めの基礎を提供する。
本発明のプローブの開発に際して最初にとられた段階は、目的とする感受性を
備えた特異的核酸プローブに対して標的として作用する可能性のある１６Ｓまた
は２３Ｓ ｒＲＮＡの領域を同定することであった。これには、どのプローブ標
的部位が、（１）P．damnosus；（２）麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大
半；（３）L．brevis；（４）Lactobacillus sp．のサブグループ；（５）P．da
mnosusおよびL．brevisの群；（６）麦酒を腐敗させることが示されているPedio
coccus種およびLactobacillus種の大半の群；および（７）PediococcusおよびLa
ctobacillusおよび関連する種の大半の群；に対して独特であるかを発見するこ
とを含んでいた。これは、次のような部位を見いだすことを含んでいた。
１．P．damnosusと他のPediococcusおよび非Pediococcus種との間では相違する
；
２．試験されたPediococcus株の大半と他の種との間では相違する；
３．L．brevisと他のLactobacillusおよび非Lactobacillus種との間では相違す
る；
４．Lactobacillus種のクラスター（L，fructivorans、L．casei、L．curvatus
、L．brevisおよびL．buchneri）と他の種との間では相違する；
５．P．damnosusおよびL.brevisの群と他の種との間では相違する；
６．２５株の代表的試料により表して、麦酒腐敗の原因となることが示されてい
るすべての生物について同様であるが、次に近い進化的隣接生物の配列との間で
は相違する；および
７．PediococcusおよびLactobacillusおよび関連する種の大半の間では同様であ
るが、L．minutus、L．lacti、Micrococcus属のメンバーおよびPectinatus属の
メンバーを除く他の種との間では相違する。
上記の分析を行うために、P．damnosusおよびL．brevisの１６Ｓおよび２３Ｓ
ｒＲＮＡ配列の正確な並び方を明らかにした。P．damnosusおよびL．brevis双
方の本質的に完全な１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を、標準的な実験室プロ
トコルにより決定した。このようにして得られたｒＤＮＡを酵素増幅法（例えば
Weissburg，1991，J．Bacteriol．173：697-703に記載されたもの，これを本明
細書の一部としてここに引用する）により生産された生成物からプラスミドベク
ター中にクローニングした。P．damnosusおよびL．brevisの配列を他のLactobac
illus種、グラム陽性生物およびE．coli（標準参照配列として当業者に広く使用
されている）を含む他のユーバクテリアｒＲＮＡ配列の相同配列と対比した。
決定されたP．damnosusおよびL．brevisの１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列
に基づいて、２２個のプローブを設計し、合成し、試験した。これらのプローブ
の特異的挙動は、それらを用いるアッセイ形式に著しく依存する。逆にアッセイ
形式は特定のプローブのある最適な特性を指示するであろう。
不都合なレベルの交差反応性を生じることなく、P．damnosusおよびL．brevis
に関して本発明の異例な包括性および排他性を備えたプローブを形成しうるとい
う発見は、予想も予期もできないものであった。
第１群の好ましいプローブは、P．damnosusと他の種とを識別することができ
る。
P．damnosus特異的16S rRNAプローブ
P．damnosusプローブ2858（28mer 46% G+C）（SEQ ID NO:1）
5'-TCA CAG CCT TGG TGA GCC TTT ATC TCA T-3'
P．damnosusプローブ2861（29mer 48% G+C）（SEQ ID NO:2）
5'-CAC TGC ATG AGC AGT TAC TCT CAC ACA CT-3'
P．damnosusプローブ2867（28mer 61% G+C）（SEQ ID NO:3）
5'-CGG CTA GCT CCC GAA GGT TAC TCC ACC T-3'
第２群の好ましいプローブは、Pediococcus麦酒腐敗株の大半を検出すること
ができる。
Pediococcus属の大半の23S rRNAプローブ
Pediococcus属プローブ2876（32mer 50% G+C）（SEQ ID NO:4）
5'-CCA CAG TCT CGG TAA TAT GTT TAA GCC CCG GT-3'
Pediococcus属プローブ2877（31mer 58% G+C）（SEQ ID NO:5）
5'-CGC TCC AAC AGT CCT CAC GGT CTG CCT TCA T-3'
第３群の好ましいプローブは、L．brevisに特異的である。
L．brevis特異的16S rRNAプローブ
L．brevisプローブ2868（28mer 43% G+C）（SEQ ID NO:6）
5'-CAA CGT CTG AAC AGT TAC TCT CAA ACG T-3'
L．brevisプローブ2869（32mer 41% G+C）（SEQ ID NO:7）
5'-CCG ATG TTA AAA TCC GTG CAA GCA CTT CAT TT-3'
L．brevis特異的23S rRNAプローブ
L．brevisプローブ2880（31mer 45% G+C）（SEQ ID NO:8）
5'-TGA GGG TTA TTG GTT TCG TTT ACG GGG CTA T-3'
L．brevisプローブ2891（33mer 48% G+C）（SEQ ID NO:9）
5'-CAG GCT TCC CAA CCT GTT CAA CTA CCA ACA AＣＴ−3'
L．brevisプローブ2892（30mer 53% G+C）（SEQ ID NO:10）
5'-CCA CAA TTT GGT GGT ATC CTT AGC CCC GGT-3'
L．brevisプローブ2895（32mer 53% G+C）（SEQ ID NO:11）
5'-CAA CCC GGC TGC CAG CAT TTA ACT GGT AAC CT-3'
第４群のプローブは、Lactobacillus種のクラスターに特異的である。好まし
いものは次のものである。
Lactobacillus sp．のクラスター 23S rRNAプローブ
Lactobacillusクラスタープローブ2899（32mer 47% G+C）（SEQ ID NO:12）
5'-TCG GTG GAT CAG ATT CTC ACT GAT CTT TCG CT-3'
第５群のプローブは、P．damnosusおよびL．brevisの両方を検出することがで
きる。好ましいものは次のものである。
P．damnosusおよびL．brevis 16S rRNAプローブ
P．damnosusおよびL．brevisプローブ2904（30mer 43% G+C）（SEQ ID NO:13）
5'-CCA ACA CTT AGC ATT CAT CGT TTA CGG CAT-3'
P．damnosusおよびL．brevis 23S rRNAプローブ
P．damnosusおよびL．brevisプローブ2896（32mer 44% G+C）（SEQ ID NO:14）
5'-TTC GCT ACG GCT CCG TTT TTT CAA CTT AAC CT-3'
第６群のプローブは、Pediococcus種およびLactobacillus種の大半およびすべ
ての麦酒腐敗生物とハイブリダイズする。好ましいものは次のものてある。
16S rRNA麦酒腐敗生物プローブ
麦酒腐敗生物プローブ2873（28mer 64% G+C）（SEQ ID NO:15）
5'-CCC CTG CTT CTG GGC AGG TTA CCC ACG T-3'
麦酒腐敗生物プローブ2881（28mer 57% G+C）（SEQ ID NO:16）
5'-TCG CTA CCC ATG CTT TCG AGC CTC AGC T-3'
麦酒腐敗生物プローブ2887（30mer 63% G+C）（SEQ ID NO:17）
5'-CGC CGC GGG TCC ATC CAG AAG TGA TAG CCT-3'
23S rRNA麦酒腐敗生物プローブ
麦酒腐敗生物プローブ2875（32mer 50% G+C）（SEQ ID NO:18）
5'-CTG AAT TCA GTA ACC CTA GAT GGG CCC CTA GT-3'
麦酒腐敗生物プローブ2901（32mer 44% G+C）（SEQ ID NO:19）
5'-TAT CAC TCA CCG TCT GAC TCC CGG ATA TAA AT-3'
第７群のプローブは、PediococcusおよびLactobacillus種の大半とハイブリダ
イズするであろう。好ましいものは次のものである。
PediococcusおよびLactobacillus種の大半16S rRNAプローブ
Pediococcus/Lactobacillusプローブ2854（27mer 48% G+C）（SEQ ID NO:20）
5'-TAG TTA GCC GTG GCT TTC TGG TTG GAT-3'
Pediococcus/Lactobacillusプローブ2879（28mer 54% G+C）（SEQ ID NO:21）
5'-CGA TTA CCC TCT CAG GTC GGC TAC GTA T-3'
PediococcusおよびLactobacillus種の大半23S rRNAプローブ
Pediococcus/Lactobacillusプローブ2902（31mer 58% G+C）（SEQ ID NO:22）
5'-TTC GGG CCT CCA GTG CGT TTT ACC GCA CCT T-3'
本発明のプローブは「サンドイッチ」アッセイに用いることができる。図１に
示すように、「サンドイッチ」アッセイでは１対のプローブを同時に使用する。
「捕捉」プローブ１２と命名される１つのプローブは、好ましくは高い標的特異
性を有するプローブにホモポリマー３’テールを加えることによって作製される
二官能性ヌクレオチドである。このテールは、ガラスビーズまたはフィルターデ
ィスク等の固体表面１０上で、相補的ホモポリマー１１とハイブリダイズする。
Pediococcus/Lactobacillus ｒＲＮＡの場合における、捕捉プローブ１２のそ
の標的１５へのハイブリダイゼーションは、標的１５と固体支持体１０との複合
体形成をもたらす。好ましくはある程度の特異性を有する検出プローブ１３は、
放射能活性、蛍光、化学発光、着色またはその他の検出部分を含む実際上あらゆ
る種類の検出部分１４を使用することのできる検出機構の一部を構成する。検出
プローブは、KramerおよびLizardi（Nature 339）に記載されるように、ＲＮＡ
配列として増幅可能なＱ−ベータミディバリアント中に組み込むことができる。
綿棒または液体アリコート等の試料は、総核酸含量を放出するように処理され
る。破砕された麦酒腐敗生物を含むと推定される試料を、グアニジンイソチオシ
アネート等のカオトロピックバッファ一中において、捕捉プローブ、検出プロー
ブ、ならびにオリゴーデオキシチミジンであらかじめ誘導化しておいた磁気粒子
ビーズの存在下でインキュベートする。
もしも標的分子（PediococcusまたはLactobacillus属の麦酒腐敗微生物）が存
在するならば、図１に示されるように、ビーズ一捕捉プローブ−標的−検出プロ
ーブのハイブリダイゼーション複合体が形成される。反応管の底部付近に磁石が
存在すると、磁気粒子−ハイブリダイゼーション複合体が管の側面に付着し、試
料マトリックス、未結合プローブおよびハイブリダイズしないその他の成分を除
去することができる。ビーズ−捕捉プローブ−標的−検出プローブ複合体の再水
和および変性を繰り返すと、有意にバックグラウンドを減少することができる。
最終的検出は、ビーズを膜上にスポットして、適当な方法、例えば検出プローブ
が放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等の方法に
よってアッセイすることにより実施する。もしくは、検出プローブは増幅可能な
ミディバリアントプローブでありうる。
本発明をよりよく説明するために、以下の非限定的な実施例を示す。
実施例１ プローブのハイブリダイゼーション挙動のドットブロット分析
周知の方法によるドットブロット分析は、市販品として容易に入手可能なニト
ロセルロース、ナイロンまたは他の誘導化膜等のフィルター上に、核酸または一
群の核酸を固定化することを含む。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをそのように
固定化し、続いて種々の条件下（ストリンジェンシー）で、興味ある核酸配列も
しくはプローブとのハイブリダイゼーションを試験することができる。ストリン
ジェントな条件下では、標的配列に対する相補性が大きい核酸配列を有するプロ
ーブは、配列の相補性が小さいプローブに比べて、高レベルのハイブリダイゼー
ションを示す。
本発明のプローブをドットブロットで試験する。１００ナノグラムのＲＮＡを
フェノール抽出およびトリフルオロ酢酸セシウム勾配上での遠心分離により精製
し、変性させ、そしてナイロン膜上にスポットする。オリゴヌクレオチドの５’
末端に、確立されているポリヌクレオチドキナーゼ反応によって32Ｐ−リン部分
を付加して、プローブを放射性標識する。プローブのハイブリダイゼーションは
、１．０８Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭリン酸ナトリウムおよび６ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４の存在下で、６０℃の温度で実施する。ハ
イブリダイズしなかったプローブはハイブリダイゼーション条件の３分の１の塩
濃度で洗浄して除去する。フィルターをＸ線フィルムに露光し、３時間のオート
ラジオグラフィー露光の後、ハイブリダイゼーションシグナルの強さを調べる。
次の表１は結果の要約である。16S rRNAを標的としたP．damnosusプローブ
プローブ2858： すべてのP．damnosus株
プローブ2861： すべてのP．damnosus株；Lactobacillusの１つの単離物
プローブ2867： すべてのP．damnosus株16S rRNAを標的としたL．brevisプローブ
プローブ2868： L．brevisに特異的。このプローブはL．brevisとして同定され
たいくつかの単離物を検出しなかったが、これは、いくつかの
環境的単離物の不正確な同定のためであると考えられる。
プローブ2869： L．brevisに特異的16S rRNAを標的としたP．damnosusおよびL．brevisプローブの群
プローブ2904： P．damnosusおよびL．brevisoまた、L．buchineriおよびLacto
bacillusの他の関連する種を検出する。16S rRNAを標的としたすべての麦酒腐敗生物
プローブ2873： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；１つの腐敗単離
物を除くすべて。
プローブ2881： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；また、多くのグ
ラム陽性ユーバクテリアを検出する。
プローブ2887： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；腐敗単離物のす
べて。16S rRNAを標的としたPediococcus種およびLactobacillus種の大半のプローブの 群
プローブ2854： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半および２つのBacil
lus種。
プローブ2879： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半。また、いくつか
のグラム陽性バクテリアを検出する。23S rRNAを標的としたPediococcus麦酒腐敗生物の大半の群のプローブ
プローブ2876： Pediococcus株のほとんど。また、いくつかのLactobacillus単
離物を検出する。
プローブ2877： Pediococcus株のほとんど。また、いくつかのLactobacillus単
離物を検出する。23S rRNAを標的としたL．brevisプローブ
プローブ2880： L．brevis特異的。L．brevisとして同定されたいくつかの単離
物を検出しないが、これはいくつかの環境的単離物の不正確な
同定のためであろう。
プローブ2891： L．brevis特異的。
プローブ2892： L．brevis特異的。
プローブ2895： L．brevis特異的。23S rRNAを標的としたLactobacillus属の亜群のプローブ
プローブ2899： Lactobacillus種のほとんど。おそらくいくつかのPediococcus
株を検出する。23S rRNAを標的としたP．damnosusおよびL．brevisの群のプローブ
プローブ2896： P．damnosusおよびL．brevisoまた、少々のLactobacillusの他
の種を検出する。23S rRNAを標的としたすべての麦酒腐敗生物
プローブ2875： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；いくつかの腐敗
単離物を検出しない。
プローブ2901： Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；いくつかの腐敗
単離物を検出しない。23S rRNAを標的としたPediococcus株およびLactobacillus種の大半の群のプロー ブ
プローブ2902： PediococcusおよびLactobacillus株の大半。また、いくつかの
グラム陽性ユーバクテリアを検出する。
ドッドブロットアッセイの結果を下記の表２に示す。この表中で、++++は最も
強いシグナルの観察を示し；+++は強いシグナルの観察を示し；++は若干弱いシ
グナルが観察されたが、確かにハイブリダイゼーション陽性であることを示し；
+は弱いシグナルを示し；+-は非常に弱い、ようやく検知できるシグナルを示し
；-はシグナルが観察されないことを示す。ＮＤはアッセイを実施しなかったこ
とを示す。プローブが少なくとも一つの標的に強く結合する（++++または+++）
が、第二の標的に対しては弱いハイブリダイゼーション（+または+-）しか示さ
ない場合には、該プローブは、++++または+++の結果を与える標的にのみ実質的
にハイブリダイズするとみなされる。
実施例２ 二重プローブハイブリダイゼーション
工程内試験のためには、広範な通常の麦酒醸造ミクロフローラの中から特定の
腐敗微生物を検出することが最も適切であろう。このタイプのサンドイッチアッ
セイのためには、次の補足プローブと検出プローブの組が好ましい対または組の
例である。
P．damnosus 16S rRNA：プローブ2858＋プローブ2861
プローブ2861＋プローブ2867
L．brevis 16S rRNA：プローブ2868＋プローブ2869
P．damnosusおよびL．brevis 16S rRNA：プローブ2904＋プローブ2868+2861
すべての麦酒腐敗微生物の群16S rRNA：プローブ2881＋プローブ2873+2887
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群16S rRNA：
プローブ2854＋プローブ2879
L．brevis 23S rRNA：プローブ2880＋プローブ2891
プローブ2892＋プローブ2895
P．damnosusおよびL．brevis 23S rRNA：プローブ2896＋プローブ2880+2876
すべての麦酒腐敗微生物の群23S rRNA：プローブ2875＋プローブ2901+2899
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群23S rRNA：
プローブ2902＋プローブ2875+2901
実施例３ 麦酒醸造および最終製品についての麦酒腐敗生物の検出
瓶、缶、樽または他の容器からの綿棒またはアリコートを処理してＤＮＡを得
る。本発明のプローブを逆向き相補性の本発明の第二プローブと一緒に用いて、
ポリメラーゼ連鎖反応により、LactobacillusのｒＲＮＡをコードする標的生物
の遺伝子セグメントを酵素的に増幅する。得られた材料を続いてサンドイッチア
ッセイでアッセイする。本明細書に記載したプローブ／プライマーを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応自体を非常に特異的にしてもよく、または同時出願中のUSSN 3
59,158に記載されているようなプローブを用いて反応をより一般化し、次にサン
ドイッチアッセイを用いて増幅産物を標的生物として同定してもよい。
最終製品試験のためには、ほとんどの正常麦酒醸造ミクロフローラは除去され
ているかまたは不活性化されているであろうから、より一般的に標的化されたプ
ローブが適当であろう。この特定のアッセイのためには、次の補足プローブ及び
検出プローブが好ましい対の例である。
P．damnosus 16S rRNA：プローブ2858＋プローブ2861
プローブ2861＋プローブ2867
L．brevis 16S rRNA：プローブ2868＋プローブ2869
P．damnosusおよびL．brevis 16S rRNA：プローブ2904＋プローブ2868+2861
すべての麦酒腐敗微生物の群16S rRNA：プローブ2881＋プローブ2873+2887
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群16S rRNA：
プローブ285４＋プローブ2879
L．brevis 23S rRNA：プローブ2880＋プローブ2891
プローブ2892＋プローブ2895
P．damnosusおよびL．brevis 23S rRNA：プローブ2896＋プローブ288+2876
すべての麦酒腐敗微生物の群23S rRNA：プローブ2875＋プローブ2901+2899
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群23S rRNA：
プローブ2902＋プローブ2875+2901
実施例４ 細胞染色によるin situハイブリダイゼーション
本発明のプローブは細胞学的染色試薬として使用することができる。液体サン
プルを顕微鏡スライドに載せる。固定および溶解の後、プローブのハイブリダイ
ゼーションをその場で行う。例えば、プローブ2858を蛍光標識で標識して、検体
の染色に用いる。試料中にP．damnosusが存在すると、蛍光顕微鏡下に蛍光を発
する小体が観察される。
実施例５ 培養後の麦酒腐敗生物の存在の確認
修飾ＭＲＳ寒天プレート（Lawrence et al.，1979，J．Instit．forBrewing85
:119）上または液体濃厚培養等のPediococcus/Lactobacillus/麦酒腐敗生物用の
標準的培養工程の後、試料をPediococcus/Lactobacillus/麦酒腐敗生物の存在に
ついて試験する。一つの方法は実施例２に記載したサンドイッチアッセイを用い
ることによる。純粋な培養物は必要ない。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：２
配列の長さ：２９塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：３
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：４
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：５
配列の長さ：３１塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：６
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：７
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：８
配列の長さ：３１塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
ァンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：９
配列の長さ：３３塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１０
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１１
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１２
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１３
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１４
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１５
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１６
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１７
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１８
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：１９
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：２０
配列の長さ：２７塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：２１
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
配列番号：２２
配列の長さ：３１塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．麦酒の腐敗の原因となる微生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブ リダイズする、単離および精製された核酸。 ２．微生物がLactobacillus属およびPediococcus属からなる群より選択される、 請求項１記載の核酸。 ３．次の核酸： （a）P．damnosusと非Pediococcus種とを特異的に識別する核酸； （b）麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半と他の種とを特異的に識別する 核酸； （c）L.brevisと非Lactobacillus種とを特異的に識別する核酸； （d）Lactobacillus種のクラスターと非クラスター種とを特異的に識別する核酸 ；ここで該クラスターは、L．fructivorans、L．casei、L．curvatus、L．brevi sおよびL．buchneriからなる； （e）P．damnosusおよびL．brevisからなる群と他の種とを特異的に識別する核 酸； （f）麦酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLactobacillus種の大半と他の 種とを特異的に識別する核酸； （g）PediococcusおよびLactobacillusおよび関連する種の大半と他の種とを特 異的に識別する核酸； からなる群より選択される、請求項１記載の核酸。 ４．１６Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイズする、請求項１記載の核酸。 ５．２３Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイズする、請求項１記載の核酸。 ６．プローブ２８５８、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、 ２８６９、２８８０、２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２ ８９６、２８７３、２８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８ ７９および２９０２からなるプローブの群により定義される配列の群より選択さ れる配列中のいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に相補的である かまたは少なくとも９０％相同である、請求項１記載の核酸。 ７．麦酒の腐敗の原因となる微生物のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに優先的にハイ ブリダイズする核酸プローブ。 ８．微生物がLactobacillus属およびPediococcus属からなる群より選択される、 請求項７記載のプローブ。 ９．次のプローブ： （a）P．damnosusと非Pediococcus種とを特異的に識別するプローブ； （b）麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半と他の種とを特異的に識別する プローブ； （c）L．brevisと非Lactobacillus種とを特異的に識別するプローブ； （d）Lactobacillus種のクラスターと非クラスター種とを特異的に識別するプロ ーブ；ここで該クラスターは、L．fructivorans、L．casei、L．curvatus、L．b revisおよびL．buchneriからなる； （e）P．damnosusおよびL．brevisからなる群と他の種とを特異的に識別するプ ローブ； （f）麦酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLactobacillus種の大半と他の 種とを特異的に識別するプローブ； （g）PediococcusおよびLactobacillusおよび関連する種の大半と他の種とを特 異的に識別するプローブ； からなる群より選択される、請求項７記載のプローブ。 １０．１６Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイズする、請求項７記載のプロー ブ。 １１．２３Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイズする、請求項７記載のプロー ブ。 １２．プローブ２８５８、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８ 、２８６９、２８８０、２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、 ２８９６、２８７３、２８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２ ８７９および２９０２からなるプローブの群により定義される配列の群より選択 される配列中のいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に相補的であ るかまたは少なくとも９０％相同である、請求項７記載のプローブ。 １３．麦酒の腐敗の原因となる微生物の存在を検出する方法であって、 標的を含むと疑われる試料を、次の生物： （a）P．damnosusおよび非Pediococcus種； （b）他の種ではなく、麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半； （c）他のLactobacillus種ではなく、L．brevis； （d）他の種ではなく、L．fructivorans、L．casei、L．curvatus、L．brevisお よびL．buchneriからなるLactobacillus種のクラスター； （e）他の種ではなく、P．damnosusおよびL．brevisの群； （f）他の種ではなく、麦酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLactobacillu s種の大半；および （g）他の種ではなく、PediococcusおよびLactobacillusおよび関連する種の大 半； からなる群より選択される生物のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに優先的にハイブリ ダイズする少なくとも１つの核酸と接触させ； 核酸が標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的に結合して核酸複合体を形成するよ うに試料にハイブリダイゼーション条件を付与し；そして 標的生物の存在を指示するものとして複合体を検出する の各工程を含む方法。 １４．核酸が、プローブ２８５８、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、 ２８６８、２８６９、２８８０、２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２ ９０４、２８９６、２８７３、２８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８ ５４、２８７９および２９０２により定義される配列からなる群より選択される 、いずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列と少なくとも９０％相同で ある、請求項１３記載の方法。 １５．麦酒の腐敗の原因となる微生物の存在を検出するために用いられるキット であって、少なくとも２つの核酸を含み、各核酸が１０から２５０ヌクレオチド を含みかつ異なる塩基配列組成を有し；ここで各核酸がプローブ２８５８、２８ ６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、２８６９、２８８０、２８９ １、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２８８１ 、 ２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２により定義 される配列の群より選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配 列に相補的であるかまたは少なくとも９０％相同である核酸の組を含むキット。 １６．さらに、試薬および指示書を含む、請求項１５記載のキット。
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