JPH08504084A - 芳香物質、特にイオノン及びｃ▲下６▼〜ｃ▲下１▼▲下０▼のアルデヒドの、酵素による調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つのリポキシゲナーゼ及びヒドロペルオキシドリアーゼ供給源と不飽和脂肪酸供給源との接触により、芳香物質、特にＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒドを酵素により調製する方法において、反応が、少なくとも１つの固相及び油相を含む複数の相をもつ媒質中で、酸素の存在下でかつ撹拌しながら行なわれる方法であって、この媒質には、固相１００部に対して約３〜１５０部の油相及び場合によっては約０〜２５０部の水相が含まれていることを特徴とする調製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 芳香物質、特にイオノン及びＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒドの、酵素による調製方法 本発明は、芳香物質、特にイオノン（ヨノン）類及びＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒド 類を酵素により調製する新しい方法に関する。本発明はより特定的には、光学的 に活性なα−イオノン、β−イオノン、ｎ−ヘキサナールやトラス−２−ヘキセ ナールのようなＣ₆のアルデヒド、トランス−２，シス−４−デカジエナール及 びトランス−２，トランス−４−デカジエナールのようなＣ₁₀のアルデヒドの調 製方法に関する。 大部分の食品において、芳香物質によって再現しようとしている天然の芳香は 、正確に見極めることがきわめて困難である数多くの化学成分の混合の結果であ ることから、香味づけ添加物の製造は複雑な問題を提起する。 芳香物質の研究には２つの方法があることがわかっている：すなわち ｉ）天然分子と厳密に同一である合成分子の産生； ii）微小挿し木繁殖、細胞培養、微生物発酵、酵素工学のようなバイオテクノ ロジー方法の利用。 である。 本発明で利用されるのは、この最後の技術である。 イオノン、特にα−イオノン及びβ−イオノンは、キイチゴの実、クワの実、 クロスグリ、モモ、アンズ、メロン、トマトのような数多くの果物の芳香、スミ レ、Boronia megastigmaのような植物 の芳香、紅茶、タバコ、ニンジン、バニラのような加工された植物の芳香、さら にはアンズタケのようなキノコの中に再び見い出される。 これらの物質は、非常に低い濃度で存在するものの、これらの植物の芳香の中 で重要な役割を果たしている。 なお、例えばｎ−ヘキサナール（青リンゴの香り）又はトランス−２−ヘキセ ナール（摘みとったばかりの草の香り）による「グリーンノート」は、植物の中 で広く存在するものである。これらの物質は、製品の新鮮さのノート（香りの調 子）に貢献することから、最も重要な芳香物質である。 イオノンのように、その他の化合物も、同じ酵素的方法により、アルファ及び ベータ−カロチンの酸化分解からもたらされる。なかでも、本発明の目的である 方法に従って得ることのできる次のような化合物をとり上げる： − 強力な香りが茶の香りを思い起こさせるラクトンであるジヒドロアクチニジ オリド。従ってこの化合物は、香料産業にとって有用なものである； − ヒマラヤスギの木の香りに近い香りをもつエポキシ−５，６−ベーターイオ ノンは、ベーターイオノンよりもさらに木材らしい香りがある。従って、この化 合物も同様に芳香産業にとって有用なものである。 これらの化合物を、それらが一般に微量でしか存在しておらず、経済的理由の ため抽出が有利なものでなくなっている天然供給源から全て得ようとすることは 、あきらめられている。 GROSCH及びその協力者等の研究（J．Agric．Food Chem．24，456-459，1976） を含め、さまざまな研究が、カロチノイドの同時酸化によりリポキシゲナーゼ及 び不飽和脂肪酸を用いてイオノンを得る酵素メカニズムについて記述している。 なお、FISCHER及びGROSCH（Z．Lebenson．Unters.-Forsch，165，137-139，19 77）は、リノール酸及び大豆のリボキシゲナーゼＬ₂を存在させることにより、 ヘキサナール、２−４−デカジエナール（２つのジアステレオ異性体）、トラン ス−２−ヘキセナール及びトランス−２−オクテナールのようなさまざまなアル デヒドを得た。 一方、米国特許第４，７６９，２４３号は、大豆粒粉砕物、水（大豆粒重量の ３〜２０倍の割合）の存在下の不飽和脂肪酸及びリパーゼ添加物から成る混合物 を利用することによる、ｎ−ヘキサナール、１−ペンテン−３−オル、トランス −２−ヘキサナール及びシス−２−ペンテノール（例１及び２、５欄）のような グリーンノートの調製方法について記述している。反応温度は５〜６０℃（好ま しくは２５℃〜５０℃）の間にある。混合物は、反応中に空気又は酸素を取り入 れながら、５分〜２４時間（好ましくは３０分〜１０時間）、撹拌下で維持され る。 最後に、CHAN及びその協力者等（Biochem．Biophys．Acta，398，347-350，19 75）は、酸素が制限的なものである場合、２，４−デカジエナールのような長鎖 をもつアルデヒドの形成がＣ₆のアルデヒドの形成に比べて有利になるというこ とを示している、ということにも言及しておきたい。 これらの異なる酵素的方法は、アルデヒド及びイオノンの産生を導くものの、 つねに工業レベルでは開発利用の困難な量でしか産生できない。 本発明者は、高い濃度で芳香物質を得ることができるようにする方法を完成し た。 本発明の方法に従うと、天然アルデヒド、そして場合によってはイオノンを生 物生成させる目的で、リポキシゲナーゼ及びヒドロペルオキシド−リアーゼの供 給源又は調製物と不飽和脂肪酸の天然供給源及び場合によってはカロチンの天然 供給源とを接触させる。 本発明に従うと、酵素反応は、高粘度の「ペースト状」媒質の中で推移し、か くして、媒質中での産物の移動を制限し、その結果、反応に対して産物が及ぼす 阻害作用を最少限におさえることが可能となる。換言すると、本発明の酵素酸化 は、その含水量が比較的低く、従って生体反応成分が濃縮した媒質の中で行なわ れる。このため、酵素−基質の接触を増大させることになるあらゆる要因が、酵 素反応の展開を加速することになる。気体移動は、媒質の撹拌によって確保され る。従って、さまざまな成分の強化した練り上げを確保することによって酵素反 応を有利に運ぶことになる。本発明の方法に従って得られる芳香物質収量は、先 行技術に従って得られるものに比べはるかに高いものである。 本発明の方法のペースト状媒質は、特に１つの固相、単数又は複数の液相及び 単数又は複数の気相を含む複数の相をもつ反応媒質であり、固相及び単数又は複 数の液相は、約１００：３００（固体：液体）の重量比率で存在する。固体相は 、異なる固体、 例えば異なる穀物粉、異なる植物、又は穀物粉と植物の混合物のような固体の混 合物で構成されていてもよい。ここでは液相は少なくとも１つの油相を含む。複 数の液相が存在する場合、それらは混和不可能な液体である。 より特定的に言うと、本発明は、少なくとも１つのリポキシゲナーゼ及びヒド ロペルオキシド−リアーゼ供給源とポリ不飽和脂肪酸との接触により、芳香物質 、特にＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒドを酵素を用いて調製する方法において、反応を、 少なくとも１つの固相及び油相を含む複数の相をもつ媒質中で酸素の存在下で撹 拌しながら行なわせる方法であって、この媒質には固相１００部に対して約３〜 １５０部の油相及び場合によっては約０〜２５０部の水相が含まれていることを 特徴とする調製方法から成る。 標準的には、媒質は、固相、油相及び気相の３相媒質であるか、又は固相、油 相、水相及び気相の４相媒質である。これらの異なる相は、完全に又は部分的に 機能的である。すなわちこれらの相は、酵素反応に関与する試薬で構成されてい てよいが、同様に、媒質の「ペースト状」のテクスチュアに寄与するテクスチュ ア作用物質を含んでいてもよい。 リポキシゲナーゼ、ヒドロペルオキシド−リアーゼ、ポリ不飽和脂肪酸、そし て場合によってはカロチンの供給源、ならびにテクスチュア作用物質は、反応媒 質が、ペーストを得るため適切な比率で上述の相を全て含むような形で選択され る。例えば、リポキシゲナーゼ及びヒドロペルオキシド−リアーゼの供給源は、 固相又はこの相の一部分を構成することができ、又、ポリ不飽和脂肪酸は油相 を構成することができる。固相の存在は、「ペースト状」媒質を得るのに必要不 可欠である。異なる相において、試薬の濃度は以下のとおりである： ｉ）固相 − リポキシゲナーゼ活性：最高１．５mmo1e/分/g； − カロチン：ニンジン汁の固体部分のような固相１，０００部に対して２．５ 〜３部（重量／重量）； − ポリ不飽和脂肪酸：最高２％のリノール酸、最高２％のリノレン酸； ii）油相： − ポリ不飽和脂肪酸：最高７８％のリノール酸、最高６０％のリノレン酸； − カロチン：最高１０％（含油樹脂） 試薬の濃度について以上に記した百分率は、該当する相の重量対重量の百分率 である。 媒質は、有利には、固相１００部に対して３〜１２０部の油相（例えば４〜５ ０）、及び２０〜２５０部の水相（例えば５０〜２００）を含む４相媒質であり 、油相及び水相は全体で３００部未満、より特定的には２５０部未満を占めてい る。標準的には、媒質がカロチン水性供給源を含む場合、これは固相１００部に 対して１０〜４０部の油相及び８０〜２００部の水相を含む。媒質がカロチン水 性供給源を含まない場合には、好ましくは、固相１００部に対して３〜１００部 の油相及び最高１００部の水相が含まれている。 この方法に従って得られるアルデヒドは、ポリ不飽和脂肪酸の酸化分解に由来 するものである。これらの芳香化合物は、利用される不飽和脂肪酸の性質に応じ て異なる。 得られるイオノンは、α−及びβ−イオノン及びエポキシ−イオノンであり、 不飽和脂肪酸の酸化反応の間に遊離されたペルオキシルラジカルによるカロチノ イドの同時酸化によって産生される。 特に、この方法によって得られるα−イオノンが基本的にＲ（＋）トランス− α−イオノンであるということに留意されたい。ところで、この鏡像異性体は、 キイチゴ、スミレ、Boronia megastigma、紅茶、ニンジン、さらにはバニラの天 然芳香の中に９０％以上の割合で大半を占めているのである。 最後に、アルコールデヒドロゲナーゼを利用する生物学的方法を使用すること により、アルデヒド（ヘキサナール、ヘキセナール）からアルコール（ヘキサノ ール、ヘキセノール）へと移行させることも可能である、という点に留意された い。 本発明の好ましい一実施態様に従うと、この方法には、リポキシゲナーゼ及び ヒドロペルオキシド−リアーゼの供給源又は調製物と、ポリ不飽和脂肪酸の天然 供給源及びカロチンの天然供給源との接触工程が含まれ、反応は、高粘度の濃縮 媒質中で練り混ぜ機内で行なわれ、反応混合物の酸素補給は、練混ぜの間に、空 気又は酸素又は空気／酸素の混合物を取入れることによって行なわれる。反応媒 質中で支配的な圧力は、少なくとも大気圧に等しい。 生体反応混合物の異なる成分の由来に関しては、供給源は以下のようなもので あると考えられる。すなわち、 リポキシゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１３．１１．１２）供給源としては、植物、 動物又は微生物に由来する、多少の差こそあれ精製された物質を利用する。植物 性供給源、例えば、大豆、ナタネ、ヒマワリのような採油植物；エンドウ、ソラ マメ、ルピナスのようなタンパク質含有植物；小麦、トウモロコシ、オオムギ、 カラスムギ、イネ、ライムギ、ソバ、モロコシ、ライコムギのような穀物；ジャ ガイモ又はキャッサバのような塊茎植物が特に好ましい。穀物は、全粒；分粒（ 例えば、粒の酵素処理、化学処理、熱処理又は機械処理の結果として得られるも の）又は穀物粉又はセモリナのような穀粒の粉砕物からのその他全ての生成物の 形で利用できるが、この場合それらの酵素活性が保たれることが条件である。例 えば、リポキシゲナーゼの供給源は、酵素的に活性な大豆粉、発芽した又はして いない大豆の粒であってよい。この後者の場合、発芽した又はしていない大豆の 粒は、好ましくは、存在する酵素の熱不活性化無しに、粉砕機又はホモジナイザ ーを用いて粉砕されなくてはならない。これらの調製物の酵素活性は、GROSCH e t al．（前出）により記述されている方法を応用して確認することができる。 好ましくは、リポキシゲナーゼ及びヒドロペルオキシド−リアーゼの供給源と して大豆の粉、小麦粉又はトウモロコシの粉砕した芽を利用する。酵素がこの形 状で利用される場合、これらは固相を構成する。 ヒドロペルオキシド−リアーゼ供給源は、通常リポキシゲナーゼの供給源と同 じである。この酵素は、脂肪酸の酸化反応の間に形成 されたヒドロペルオキシドの分割の触媒として作用し、かくしてアルデヒドの産 生を確保する。 この方法において利用される不飽和脂肪酸は、好ましくは８〜２０個の炭素原 子を有し、有利にはポリ不飽和である。 脂肪酸供給源としては、オレイン酸、リノール酸、α−リノール酸、エイコサ ペンタエン酸、アラキドン酸及びリシノール酸のような天然脂肪酸を利用する。 又、これらの脂肪酸を封じ込めている植物、動物又は微生物由来の脂肪又は油を 利用することもでき、これを、好ましくは、単数又は複数のリパーゼにより酵素 的に脂肪分解反応に付す。 これらの植物由来の脂肪又は油は、例えば、大豆、ヒマワリ、ベニバナ、オリ ーブ、ブドウのたね、トウモロコシの芽、小麦の芽、ラッカセイ、ゴマ、クルミ 、アマ、綿の粒、ルリジサ、マツヨイグサ、cynaraの油ならびにカカオ脂である 。 これらの脂肪は、バター、ラード、タラ油、イワシ油及びその他のさまざまな 魚又は咄乳動物の油のような動物性のものであってもよい。 微生物、植物又は動物由来の単数又は複数のリパーゼ又はリパーゼ調製物を用 いて加水分解を行なう。リパーゼの調製物は精製されていてもいなくてもよい。 選択された脂肪又は油に対して作用することのできる全てのリパーゼを利用する ことができる。ここでは、リパーゼの活性を示す単一の酵素又は代替的には複数 の酵素の混合物を含む精製された調製物であってもよい。リパーゼ活性を有する 酵素は、固体支持体上に固定化されうる。この反応は、リポキシゲ ナーゼ反応に先立って、又はこれと同時に行なうことができる。添加するリパー ゼの量は、一般に、油又は脂肪１グラムあたり数十から数百単位まで変動する。 リパーゼを伴う又は伴わないポリ不飽和脂肪酸供給源は、連続的又は不連続的 な要領で、その他の原料の混合又は粉砕の前、途中又は後で、添加することがで きる。 媒質がカロチン供給源を含んでいる場合、高等植物、藻類又は微生物からの天 然カロチンが利用される。つまり、α及びβ−カロチンである。最良の供給源は 、ニンジン、ヤシ油及び或る種の藻類である。カロチンは含油樹脂の形であって もよく、その場合、それは油相の一部を成す。これは同様に、水溶液又は懸濁液 の形、例えば２０％の懸濁固体を含む濃縮ニンジン汁の形で利用することもでき る。 カロチノイドを封じ込めている水もしくは溶液又はその他の水相 対応する量だけ添加する。水相は、不連続的又は連続的な要領で、その他の原料 の混合又は粉砕の前、途中又は後に添加することができる。 媒質は同様に、例えばグリセリンのようなテクスチュア作用物質ならびにその 他の添加物、例えば乳化剤；酵素活性を最適化させることのできる作用物質、例 えば塩化カルシウム、硫酸第一鉄及びアスコルビン酸も含んでいてもよい。各々 の相の部分の計算にはこれらの添加物の割合を包含させることが重要である。 反応は、加圧下で、空気及び／又は酸素の存在下で、撹拌しなが ら、高い粘度をもつ濃縮媒質中で行なわれる。 好ましくは、酸素は、少なくとも２１％の酸素を含む気体、例えば空気、酸素 が富化された空気又は純粋酸素の形で存在する。この少なくとも２１％の酸素を 含む気体は、反応媒質の気相を構成する。媒質中へのその取り込みは、好ましく は、最終的単位容積重量つまり反応終了時点の単位容積重量が０．９〜０．４kg /lの間に含まれ、例えば０．５kg/lであるようなものであり、酸素又は空気の流 量、反応が行なわれる圧力及び撹拌という３つのパラメーターの関数である。「 単位容積重量」というのは、取込まれた気相を含む媒質の密度を意味する。 生体反応の間に注入される空気及び／又は酸素の最大流量は、１分あたりの生 体反応混合物の体積の１５倍に達する可能性があり、例えば２倍又は４倍である 。流量が過度に大きい場合、結果として、エントレインメントによる高い芳香損 失がもたらされることになる。媒質１リットルにつき０〜１５l/分、例えばペー スト状混合物２リットルに対して１〜２l/分の空気及び／又は酸素を注入する。 反応装置（混合−練混ぜ機）の内部の空気及び／又は酸素の圧力は、大気圧と ５０バール（約５０×１０⁵Pa）の間、例えば８バール（約８×１０⁵Pa）と２５ バール（約２５×１０⁵Pa）の間に含まれている。 反応装置の中に注入された空気及び／又は酸素に由来する酸素の量及びそこに 支配的な圧力の強度に応じて、この反応は「短鎖」のアルデヒド（例えばｎ−ヘ キサナール、トランス−２−ヘキセナー など…）又は「長鎖」のアルデヒド（例えば２，４−デカジエナールなど…）の 形成に至る。 媒質の撹拌は、適切なあらゆる手段、好ましくは２０〜２００回転／分の間、 例えば６０〜１５０回転／分の間の回転速度で利用される遊星（プラネタリー） タイプの撹拌装置により行なわれる。 生体反応の間、温度は、一般に１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃の間に 含まれることになる。 ペースト状媒質の粘度に関しては、２つのタイプの尺度、すなわち、 ａ）実施された試験中、その値が３N（５５％の水での混合物について）と５N （４５％の水での混合物）の間に含まれていた、圧縮力； ｂ）実施された試験中、その値が５Nと８Nの間に含まれていた接着力 という尺度を用いて、これを特徴づけすることができる。 反応時間は、一般に５時間から４８時間、好ましくは１０時間から２４時間の 間に含まれる。 反応は、一般に４．５と１０の間、より一般的には５と７の間のpHで行なわれ る。 芳香物質を封じ込めている揮発性分画は、例えばターボ抽出器の中での急速加 水蒸留（Hydrodistillation）又は蒸気エントレインメントさらには超臨界圧の ＣＯ₂のような適切なあらゆる手段により抽出されることになる。 特にシクロデキストリンでの分別蒸留を利用することのできる究極的精製工程 へと進む。 イオノン及びアルデヒドの収量は、本発明に従うと、工業規模で開発利用可能 なものである。例えば、α−及びβ−イオノンの濃度は、１００〜４００mg/kg 媒質に達する可能性がある。アルデヒド濃度は、１，０００mg/kg媒質に達しう る。 本発明の方法は、好ましくは、光学的に活性なα−イオノン、β−イオノン、 ｎ−ヘキサナール、トランス−２−ヘキセナール、トランス−２，シス−４−デ カジエナール、トランス−２，トランス−４−デカジエナール、エポキシ−５， ６−β−イオノン及びジヒドロアクチニジオリドの産生に応用される。 本発明は、同様にアルコール、特にＣ₆〜Ｃ₁₀のアルコールを酵素を用いて産 生する方法において、 ｉ）上述の本発明の方法に従ってＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒドを調製する工程、 ii）単数又は複数のアルコールデヒドロゲナーゼと、ｉ）に従って得たアルデ ヒドとを接触させる工程； iii）かくして得られたアルコールを回収する工程、 を含むことを特徴とする産生方法にも関する。 本発明のこの変形態様に従うと、単数又は複数のアルコールデヒドロゲナーゼ が使用される。手順のこの工程は、酸化反応と同時に、又は連続的な形で行なう ことができる。シス−３−ヘキセノール及びヘキサノールの産生が特に好ましい 。 上述の特徴ならびにその他の二次的な特徴及び利点は、添付の 単一図面の対象となっている装置を利用する以下の実施例により、制限的な意味 の無い一例として与えられた実施態様の詳細な記述の中でより完全な形で現われ ることだろう。 この図では、ペースト状混合物の均質化及び練り混ぜ、粘性混合物の酸素処理 の作業、ならびに酵素による酸化を用いた芳香物質の形成を生じさせる生体反応 が内部で有利な形で行なわれる反応装置を概略的に表わした。 この反応装置は、気密なエンクロージャー又は槽１で構成され、その上部部分 は、回転する主軸３の支持体である可動テーブル２ａが中で回転できる固定カバ ー２によって閉塞されている。回り対偶（ジョイント）４が、槽１を不動の状態 にしながら、かつ気密性を保ちながら、このテーブル２ａの回転を可能にしてい る。 固定カバー２は、円形固定継手５を介して気密な形で槽１に組立てられている 。遊星運動により混合及び練り混ぜを確保する回転工具６が、回転する二次軸７ により回転駆動される。粘性媒質８の機械式撹拌装置を構成するこの回転工具６ は、同時に気密エンクロージャー１の内部で、その均質化及び酸素処理を行なう 。この回転工具は、金属又は化学的に不活性のその他の物質でできたループ、又 はブレード、又はパレット又は格子状のあらゆる要素であってよい。 約１〜８バールの圧力下の空気、空気／酸素混合物又は純粋酸素から成る、粘 性媒質の上に乗った自由大気９は、回転工具６により撹拌される粘性媒質と接触 している。気体媒質は、補給用導管１０ａのレベルで反応装置のエンクロージャ ーの中に注入される が、一方、エンクロージャー内の圧力を生体反応に望まれる値に維持しながら１ 分につき流体体積の２倍のペースで気体流量の常時入替えを確実に行なうような 形で制御された流出を確保する導管１０ｂを介して、同じ気体媒質の常時流出が 見込まれている。 大気の入替えと圧力の組合せ効果の結果、粘性媒質の酸素処理条件が完璧なも のとなる。 上述の反応装置を利用する以下の例は、イオノン及びＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒド を酵素によって得る目的で本発明に従った方法を使用する混合物の特徴的な組成 をいくつか示している。すべての例において、組成は、さまざまな成分の合計質 量を基礎として計算された重量百分率として規定されている。 実施例 例１ 撹拌しながら、６リットルの内部容積をもつ前述の反応装置のタイプの混合− 練り混ぜ機の中で生体反応混合物を調製した。 この混合物は、３５．２５％の割合の大豆の粉（酵素的に生full-fat）、４． ４１％の割合のニンジンの含油樹脂、９．３０％の割合のベニバナ油及び４８． ９６％の割合の水で構成されている。 これらの割合は、１００部の固相、３８．９部の油相及び１３８．９部の水相 に相当する。 かくして、水相中の成分のエマルジョンを作り上げる。ベニバナ油の加水分解 は、８２８KUのリパーゼの添加による芳香物質の生成と同時に起こる。作用する 酵素活性には、塩化カルシウム（１．１８％の割合で）、硫酸第一鉄（０．０９ ％の割合で）及び アスコルビン酸（約０．０１％の割合で）が必要である。 ９０回転／分の割合で２５℃で練り混ぜられたペースト状媒質が得られた。混 合物に対する酸素の導入は、大気圧の下で、０．５l/分の割合で純粋酸素の連続 流量によって確保された。 媒質の単位容積重量は、０．７〜０．８kg/lの間に含まれる。 合成された芳香物質は、異なる生体産生時間で、大気圧下で上記エントレイン メントによって抽出した。気相クロマトグラフィ及び場合によっては質量分析法 により、揮発性分画を分析した。 ２６時間の試験時間の後に得られたイオノンの最高の濃度は、α−イオノンに ついてペースト１kg当たり９５mgであり、β−イオノンについてはペースト１kg 当たり３００mgである。エポキシ−５，６−β−イオノンの濃度は、ペースト１ kg当たり５７５mgであり、ジヒドロアクチニジオリドの濃度はペースト１kg当た り１３０mgである。 産生されたα−イオノンは光学的に活性である。 得られた鏡像異性体は、ほとんどがＲ（＋）トランス−α−イオノンである。 例２ 生体反応混合物に対して導入される酸素の流量が２倍である（１l/分）ことを 除いて、例１に記述されているプロトコールを反復した。 生体反応時間はここでも２６時間であり、イオノン及びジヒドロアクチニジオ リドの濃度は例１で得られたものと類似したものであることが確認された。 考慮の対象となった４つの化合物について、最大濃度がさらに急速に達成され ることを確認した。 例３ 生体反応混合物に対する酸素の導入を１．５l/分の割合で空気の連続流量によ り確保したことを除いて、例１に記述されたプロトコールを反復した。 生体反応時間はここでも２６時間であり、エポキシ−５，６−β−イオノン及 びジヒドロアクチニジオリドの濃度が試験時間全体を通して増大し続け、それぞ れ２６時間目にペースト１kg当たり１，０００mg及び３００mgの値に達したこと が確認された。 β及びα−イオノンの濃度に関しては、これらは２０時間目にその最大値に達 し、生体反応時間の最後に至るまで安定した状態にとどまった。２６時間目に、 β−及びα−イオノンの濃度はそれぞれペースト１kg当たり２３０mg及び１００ mgであった。 例４ 撹拌しながら、６リットルの内部容積をもつ前述の反応装置のタイプの混合− 練り混ぜ機の中で、生体反応混合物を調製した。 この例では、混合物は、６５．８７％の割合のニンジン汁（懸濁固体２０％） 、２５．８０％の割合の大豆の粉及び６．８１％の割合のベニバナ油で構成され ている。 これらの割合は、１００部の固相、１７．４７部の油相及び１３４．９部の水 相に相当する。 ５９５KUのリパーゼを添加し、塩化カルシウム（０．８６％の割合で）、硫酸 第一鉄（０．０７％の割合で）及びアスコルビン酸 （約０．０１％の割合で）を導入した。 例２と同じ条件下で作用を受けた（大気圧下で１l/分の割合での純粋酸素の連 続流量）ペースト状の媒質が得られた。 １２時間の生体反応の後、β−及びα−イオノンの濃度はそれぞれペースト１ ｋｇ当たり２１０mg及び１８５mｇの値に達した。 エポキシ−５，６−β−イオノン及びジヒドロアクチニジオリドの濃度に関し ては、１２時間の生体反応の後、これらはそれぞれペースト１kg当たり１４０mg 及び２０mgの値に達した。 ２４時間目に、これらの濃度はそれぞれペースト１kg当たり５１０mg及び５０ mgであった。 その上、２４時間目には、かなりの濃度のｎ−ヘキサナール及び２，４−デカ ジエナール（トランス−２，トランス−４−デカジエナール及びトランス−２， シス−４−デカジエナールの形態）が得られ、これはそれぞれペースト１kg当た り９５０mg及び１，０２０mgの値に達した。 例５ 硫酸鉄及びアルコルビン酸の導入を省いたという点を除いて、例４に記述され たプロトコールを反復した。 生体反応時間は２８時間であり、β−及びα−イオノンの濃度は、１６時間の 生体反応の後、それぞれペースト１kg当たり２５５mg及び１８０mgの値に達した ことが確認された。 エポキシ−５，６−β−イオノン及びジヒドロアクチニジオリドの濃度に関し ては、１６時間の生体反応の後、これらはそれぞれペースト１kg当たり８０mg及 び８５mgの値に達した。 その上、１６時間目には、それぞれペースト１kg当たり１５５mg及び２００mg というｎ−ヘキサナール及び２，４−デカジエナールの濃度が得られた。生体反 応２１時間目に行なった測定は、ペースト１kg当たりそれぞれ２２０mg及び２１ ０mgという値を示した。 例６ 生体反応混合物中に２倍の酸素流量（大気圧下で２l/分）を通過させたという 点を除いて、例５に記述したプロトコールを反復した。 生体反応時間はここでも２８時間であり、β−及びα−イオノンの濃度は、１ ６時間の生体反応の後、それぞれペースト１kg当たり１８０mg及び１３０mgの値 に達したことが確認された。２８時間目に行なった測定は、それぞれペースト１ kg当たり２７０mg及び１７５mgの値、つまり約５０％増大した値を示した。 エポキシ−５，６−β−イオノンの濃度に関しては、これは１６時間目でペー スト１kg当たり１３０mgであり、２８時間目にはペースト１kg当たり２５５mgの 値に達した。このときジヒドロアクチニジオリドの濃度は、ペースト１kg当たり １００mgに達した。 ｎ−ヘキサナール及び２，４−デカジエナールの濃度に関しては、これらは２ １時間の生体反応後、それぞれペースト１kg当たり９２０mg及び２８０mgの値に 達した。 例７ 撹拌しながら、６リットルの内部容量をもつ前述の反応装置のタイプの混合− 練り混ぜ機の中で生体反応混合物を調製した。 この例では、混合物は、７７．６７％の割合の濃縮ニンジン汁 （懸濁固体２０％）、１６．０５％の割合の大豆の粉及び５．１８％の割合のベ ニバナ油で構成されている。 これらの割合は、１００部の固相、１６．４０部の油相及び１９６．３６部の 水相に相当する。 ４５０KUのリパーゼを添加し、塩化カルシウム（０．６５％の割合で）を導入 した。 この例では、例４、５及び６に比較して、ニンジン汁の濃度が増し、相関して 大豆の粉、ベニバナ油及びリパーゼの濃度が減少したということがわかるだろう 。 得られた生体反応混合物は、例２と同じ条件下で作用を受けた（大気圧下、酸 素流量１l/分）。 生体反応時間は３５時間で、β−及びａ−イオノンの濃度はそれぞれ３５時間 目でペースト１kg当たり７８mg及び７０mgにすぎなかったことが確認された。そ の上、反応の進行中３５時間目までこれらの濃度はきわめてわずかにしか増大し なかった。 エポキシ−５，６−β−イオノンの濃度に関しては、この濃度は、３５時間の 生体反応の後、ペースト１kg当たり７０mgであった。同じ時点で、ジヒドロアク チニジオリドの濃度は、ペースト１kg当たり８０mgの値に達した。 ｎ−ヘキサナール及び２，４−デカジエナールの濃度に関しては、これらは３ ５時間の生体反応の後、それぞれペースト１kg当たり２５０mg及び７５mgの値に 達した。 例８ 撹拌しながら８０リットルの内部容積をもつ前述の反応装置のタ イプの混合−練り混ぜ機の中で生体反応混合物を調製した。 この混合物は、５５．５０％の割合の濃縮ニンジン汁（懸濁固体２０％）、３ ７．５０％の割合の大豆の粉、及び５．７２％の割合のベニバナ油で構成されて いる。 これらの割合は、１００部の固相、１１．７６部の油相及び９１．０２部の水 相に相当する。 １６，５００KUのリパーゼを添加し、塩化カルシウム（０．７２％の割合で） を導入した。 ２６゜±１℃で７０回転／分の割合で練り混ぜられたペースト状の媒質を得た 。混合物に対する酸素の導入は、約１０l/分の割合で空気の連続流量により確保 した。生体反応媒質の上に載った大気は２バールの圧力下にあった。 生体反応時間は４０時間であり、産生されたα−イオノンの濃度は、２４時間 の生体反応後にはペースト１kg当たり１１０mgにすぎなかったのに対して、４０ 時間目にはペースト１kg当たり２３０mgであることが確認された。 β−イオノンは、微量しか存在しないことが確認された。 エポキシ−５，６−β−イオノンの濃度に関しては、これは、生体反応全体に わたり低いままにとどまり、３０時間目にペースト１kg当たり２３mgの値にしか 達しなかった。 ｎ−ヘキサナール濃度に関しては、これは、生体反応全体にわたって断えず増 大しつづけ、２４時間目にはペースト１kg当たり８０２mgに、又４０時間目には ペースト１kg当たり９８０mgに達し た。 ２，４−デカジエナールに関しても同様であったが、２４時間目にペースト１ kg当たり１１６mgに達していたその濃度は、４０時間目にはペースト１kg当たり ２３２mgまで、つまりその値の倍増にまで上昇したことから、割合はさらに一層 極立ったものであった。 例９ 撹拌しながら６リットルの内部容積をもつ上述の反応装置のタイプの混合−練 り混ぜ機の中で生体反応混合物を調製した。 この混合物は、４７．３０％の割合の大豆の粉、１．９７％の割合のベニバナ 油及び４９．２７％の割合の水により構成されている。かくして、水相中の成分 のエマルジョンを作り上げた。 これらの割合は、１００部の固相、４．１６部の油相、１０３．９部の水相に 相当する。 ３４７KUのリパーゼを添加し、塩化カルシウム（０．８０％の割合で）、硫酸 鉄（０．０７％の割合で）及びアスコルビン酸（約０．０１％の割合で）を導入 した。 ２６゜±１℃で１１０回転／分の割合で練り混ぜられたペースト状の媒質を得 た。大気圧下で１．６６l/分の割合での空気の連続流量によって、混合物に対す る酸素の導入を確保した。 合成した芳香物質は、異なる生体反応時間で、大気圧の下で蒸気エントレイン メントにより抽出した。 生体反応の時間は２３時間であり、この試験において得られた主要な芳香物質 であるｎ−ヘキサナール及び２，４−デカジエナールの濃度は、２３時間の生体 反応の後、それぞれペースト１kg当た り１．７１ｇ及び０．７０ｇの値に達したことが確認された。 気相クロマトグラフィによる揮発性分画の分析は、さらに特にトランス−２− ヘキセナール、トランス−２−ノネナール、２，６−ノナジエナルの存在を明ら かにした。 例１０ 大豆の粉の濃度（４５．３３％）を犠牲にして濃度が増大したベニバナ油の量 を増大させた点を除いて、例９に記述されたプロトコールを繰り返した（１００ 部の固相、８．７６部の油相及び１０８．４部の水相）。 ２５゜±１℃で１００回転／分の割合で練り混ぜたペースト状の媒質を得た。 生体反応時間は２３時間で、ｎ−ヘキサナール及び２，４−デカジエナール濃度 がそれぞれ２３時間目でペースト１kg当たり３．４０ｇ及び０．８６ｇの値に達 したことが確認された。 例１１ 撹拌しながら、８０リットルの内部容積をもつ前述の反応装置のタイプの混合 練り混ぜ機の中で、生体反応混合物を調製した。 この混合物は、５０．２３％の割合の大豆の粉、３．５９％の割合のベニバナ 油及び４４．８５％の割合の水により構成されている。かくして、水相中の成分 のエマルジョンを作り上げた。 これらの割合は、１００部の固相、６．９６部の油相及び８９．２５部の水相 に相当する。 １４，６００KUのリパーゼを添加し、塩化カルシウム（０．７３％の割合で） 、硫酸鉄（０．０７％の割合で）、及びアスコルビン 酸（約０．０１％の割合で）を導入した。 ３２゜±１℃で７０回転／分の割合で練り混ぜられたペースト状の媒質を得た 。混合物に対する酸素の導入は、約１０l/分の割合で空気の連続流量によって確 保した。生体反応媒質の上に載っていた大気は２バールの圧力下にあった。 生体反応時間は１７時間であった。揮発性分画中に存在する２つの主要な芳香 物質がｎ−ヘキサナール及び２，４−デカジエナールであることが確認された。 これらの物質はそれぞれ、生体反応１７時間目にペースト１kg当たり２．９９ｇ 及び０．４０ｇの濃度に達した。 この方法は、特定の実施例を参照しながら記述されてきたが、当業者にとって は、本発明の枠から逸脱することなくさまざまな詳細変更を加えることも可能で あるということは明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 49/203 Ａ 9049−4Ｈ 49/21 Ｃ０７Ｄ 301/02 7329−4Ｃ Ｃ１１Ｂ 9/00 Ｊ 9547−4Ｈ 9/02 9547−4Ｈ Ｃ１１Ｃ 1/04 9547−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 7/04 9548−4Ｂ 7/26 9548−4Ｂ // Ｃ０７Ｍ 7:00 (72)発明者 ロペール，フランソワーズ フランス国、エフ―63730 レ・マルト ル・ドゥ・ベール、リュ・ドゥ・ミルフル ール、25

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つのリポキシゲナーゼ及びヒドロペルオキシド−リアーゼ供給 源と不飽和脂肪酸供給源との接触により、芳香物質、特にＣ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒ ドを酵素を用いて調製する方法において、反応を、少なくとも１つの固相及び油 相を含む複数の相をもつ媒質中で酸素の存在下で撹拌しながら行なわせる方法で あって、この媒質には固相１００部に対して約３〜１５０部の油相及び場合によ っては約０〜２５０部の水相が含まていれることを特徴とする調製方法。 ２．酸素が、空気、酸素が富化された空気又は純粋酸素のように少なくとも２１ ％の酸素を含む気体の形で存在し、媒質の最終的な単位容積重量が約０．９〜０ ．４kg/lの間に含まれるような形で気相が反応媒質中に取り込まれていることを 特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．反応が、大気圧と５０バールの間に含まれる圧力下で行なわれること、及び 酸素流量が媒質１kgにつき０〜１５リットルの間に含まれていることを特徴とす る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．反応媒質が、さらに、イオノンの調製を可能にするカロチン供給源を含むこ とを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．反応媒質に、固相１００部に対して３〜１２０部の油相及び２０〜２５０部 の水相が含まれ、この油相と水相が合わせて３００部未満を占めていることを特 徴とする、請求の範囲第１ 項〜４項のいずれか１項に記載の方法。 ６．反応が、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜４０℃の間の温度で行なわれ ることを特徴とする、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７．反応時間が、５時間から４８時間の間、好ましくは１０時間から２４時間の 間で行なわれることを特徴とする、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に 記載の方法。 ８．不飽和脂肪酸供給源が、脂肪分解された油又は脂肪で構成されており、その ため反応媒質には単数又は複数のリパーゼが含まれていることを特徴とする、請 求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９．光学的に活性なα−イオノン、β−イオノン、ｎ−ヘキサナール、トランス −２−ヘキセナール、トランス−２，シス−４−デカジエナール、トランス−２ ，トランス−４−デカジエナール、エポキシ−５，６−β−イオノン及びジヒド ロアクチニジオリドを、酵素により調製するために利用される、請求の範囲第１ 項〜第８項のいずれか１項に記載の方法。 10．撹拌が、好ましくは２０〜２００回転／分の回転速度をもつ遊星タイプの攪 拌器により行なわれることを特徴とする、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか １項に記載の方法。 11．アルコール、特にＣ₆〜Ｃ₁₀のアルコール、例えばシス−３−ヘキセノール 又はヘキサノールを酵素により産生させる方法において、 ｉ）Ｃ₆〜Ｃ₁₀のアルデヒドを、請求の範囲第１項〜第１０項の いずれか１項に記載の方法に従って調製する工程、 ii）単数又は複数のアルコールデヒドロゲナーゼとｉ）に従って得たアルデヒ ドとを接触させる工程、 iii）かくして得られたアルコールを回収する工程、 を含むことを特徴とする産生方法。