JPH08504603A - 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト血漿血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼをコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。さらに提供されるのは、病理学的炎症状態を制御するのに有益であることが期待される血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ産物の組換え生産のための材料及び方法である。

Description

【発明の詳細な説明】 「血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ」 本出願は、1993年10月6日に出願せる、係属中の米国特許出願第08/133,803号 の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、一般に血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼに関し、さらに詳細 には、ヒト血漿の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼをコードする新規な精 製され単離されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードする血小板活 性化因子アセチルヒドロラーゼ産物、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ産 物の組換え生産のための材料及び方法、ならびに血小板活性化因子アセチルヒド ロラーゼに特異的な抗体物質に関する。 背景 血小板活性化因子（PAF）は、種々の細胞型により合成される、生物学的に活 性を有するリン脂質である。in vivoで且つ10^-10〜10^-9Mという通常濃度で、PAF は、特異的なＧタンパク質がカップリングした細胞表面受容体に結合することに より、血小板及び好中球などの標的細胞を活性化する（ベナブル（Venable）ら 、J．Lipid Res.、34巻、691〜701頁、（1993））。 PAFは１-０-アルキル-２-アセチル-sn-グリセロ-３-ホスフォコリン構造を有 する。至適な生物学的活性のためには、PAFグリセロール骨格のsn-１位が脂肪族 アルコールとエーテル結合をなしておらなければならず、また、sn-３位がホス フォコリン先頭部 （head group）を有していなければならない。 通常の生理学的プロセス（例えば、炎症、鬱血及び分娩）においてPAFは機能 し、病理学的炎症応答（例えば、喘息、アナフィラキシー、敗血病性ショック及 び関節炎）において影響を受ける（ベナブルら、前出、及びリンドバーグ（Lind sberg）ら、Ann．Neurol.、30巻、117〜129頁、（1991））。病理学的応答にお けるPAFの関与の可能性は、PAFへの活性修飾の試みを喚起し、そして、これらの 試みで主に焦点が向けられるのは、PAFの細胞表面受容体に対する結合を干渉す る、PAFの活性の拮抗剤の開発となっている。例えば、ヒュアー（Heuer）ら、Cl in．Exp．Allergy、22巻、980〜983頁、（1992）を参照されたい。 PAFの合成及び分泌は、その分解及びクリアランスと同様、厳密に制御されて いるようである。PAFの病理学的炎症作用が、過剰生産、不適切な生産または分 解の払底を増大せしめるPAF調節機構の不全が原因で起こる限りにおいては、PAF の活性を修飾する代替手段が、炎症の解消に導くような自然のプロセスを模倣す るかまたは増大させることに関与するであろう。マクロファージ（スタッフォリ ニ（Stafforini）ら、J．Biol．Chem.、265巻、17号、9682〜9687頁、（1990） ）、肝細胞及びヒト肝癌細胞系HepG２（サトー（Satoh）ら、J．Clin．Invest. 、87巻、476〜481頁、（1991）及びターベット（Tarbet）ら、J．Biol．Chem.、 266巻、25号、16667〜16673頁、（1991））は、PAFを不活性化するPAFアセチル ヒドロラーゼ（PAF-AH）の酵素活性を放出することが報告されている。PAFを不 活性化することに加えて、PAF-AHは炎症を媒介するアラキドン酸カスケードの産 物などの酸化的に断片化したリン脂質をも不活性化する。ストレムラー（Streml er）ら、J．Biol．Chem.、266巻、17号、11095〜11103頁、（1991）を参照され たい。PAF-AHによるPAFの不活性化は、主に PAFのsn-２のアセチル基の加水分解によって引起こされ、また、PAF-AHはsn-２ のアシル基を除去することにより、酸化的に断片化されたリン脂質を代謝する。 ２つの型のPAF-AHが同定されている。すなわち、内皮細胞及び赤血球などの種々 の細胞型及び組織中に見出される細胞質型、ならびに血漿及び血清中に見出され る細胞外型である。血漿PAF-AHは、PAFを除く無傷のリン脂質を加水分解せず、 そしてこの基質特異性のために、この酵素は、完全に活性な状態で有害な効果な しにin vivoで循環することができる。血漿PAF-AHによって、ex vivoでのヒト血 液におけるPAFの分解のすべてが説明されるように思われる（スタッフォリニら 、J．Biol．Chem.、262巻、９号、4223〜4230頁、（1987））。 細胞質及び血漿のPAF-AHが同様な基質特異性を有するようである一方で、血漿 PAF-AHは、細胞質PAF-AH及び特徴が明らかとなった他のリパーゼと、血漿PAF-AH とを差別化する生化学的特徴を有する。特に、血漿PAF-AHは、リポタンパク質粒 子に会合し、ジイソプロピルフルオロホスフェートによって阻害され、カルシウ ムイオンによっては影響を受けず、タンパク質分解には比較的不感性であり、そ して43,000ダルトンの見かけの分子量を有する。スタッフォリニら（1987）、前 出、を参照されたい。同じスタッフォリニらの文献に、ヒト血漿からのPAF-AHの 部分精製の手法及びその手法を用いることによって得られる血漿物質のアミノ酸 組成が記載されている。細胞質PAF-AHは、スタッフォリニら、J．Biol．Chem.、 268巻、６号、3857〜3865頁、（1993）において報告されているように、赤血球 から精製されており、そしてその文献に細胞質PAF-AHの10のアミノ末端残基もま た記載されている。ハットリ（Hattori）ら、J．Biol．Chem.、268巻、25号、18 748〜18753頁、（1993）、はウシ 脳からの細胞質PAF-AHの精製を記載している。これまでの特許出願に続いて、ハ ットリら、J．Biol．Chem.、269巻、237号、23150〜23155頁、（1994）において ウシ脳の細胞質PAF-AHのヌクレオチド配列が公表された。今日まで、PAF-AHの血 漿型のヌクレオチド配列は公表されていない。 PAF-AHの組換えによる生産により、in vivoでの炎症の消散の正常なプロセス を模倣または増大するために、外来のPAF-AHを利用することが可能となるであろ う。PAF-AHは血漿中に通常見出される産物であるので、PAF-AHの投与によって、 PAF受容体拮抗剤の投与よりも生理学上の利点が提供されるであろう。 さらに、PAFと構造的に関連性のあるPAF受容体拮抗剤は、本来のPAF-AH活性を阻 害し、PAF及び酸化的に断片化されたリン脂質の望ましい代謝が、それによって 妨げられる。このように、PAF受容体桔抗剤によるPAF-AH活性の阻害は、その拮 抗剤によるPAF受容体の競合的阻害を妨げる。ストレムラーら、前出、を参照さ れたい。加えて、急性の炎症の局所において、例えばオキシダントの放出の結果 本来のPAF-AH酵素の不活性化が起こり、次には、PAF受容体と結合させるため外 から投与されるPAF受容体拮抗剤のいずれのものとも競合するであろうPAF及びPA F様化合物の局所レベルを上昇せしめる結果となる。対照的に、組換えPAF-AHを 用いた処置により、内在性のPAF-AH活性が増大され、そして不活性化された内在 性酵素が補われるであろう。 このように、当該技術分野においてヒト血漿PAF-AHをコードするポリヌクレオ チド配列を同定及び単離し、PAF-AHの組換え生産に有用な材料及び方法を開発し 、そして血漿中でのPAF-AHの検出用の試薬を作り出す必要性がある。 発明の要約 本発明は、ヒト血漿PAF-AHまたはその酵素的に活性を有する断片をコードする 、新規な、精製され、単離されたポリヌクレオチド（すなわち、いずれもセンス 及びアンチセンスストランドの、DNA及びRNA）提供する。本発明の好ましいDNA 配列には、ゲノム及びcDNA配列ばかりでなく、全体または部分的に化学合成され たDNA配列が含まれる。配列番号：７で示されるPAF-AHをコードするDNA配列及び 、標準のストリンジェンシー（stringency）（厳密さ）の条件下で該配列の非コ ードストランドとハイブリダイズするDNA配列または余分な遺伝コード（redunda ncy of the genetic code）を伴わなければハイブリダイズするであろうDNA配列 が、本発明で企図される。さらに本発明で企図されるのは、本発明のDNA配列の 生物学的複製物（すなわち、in vivoまたはin vitroで作製された、単離されたD NA配列のコピー）である。PAF-AH配列を組込んだプラスミド及びウイルスDNAベ クターなどの自律的に複製する組換え構築物ならびに、特にPAF-AHをコードする DNAが内在性または外来性発現制御DNA配列及び転写ターミネーターと作動可能に 結合されるベクターもまた、提供される。 本発明の他の局面において、所望のDNA配列がその中で発現されることを許容 する方法で、原核性または真核性宿主細胞が、本発明のDNA配列で安定に形質転 換される。PAF-AH産物を発現する宿主細胞は、多岐にわたる有用な目的に役立つ ことができる。このような細胞は、PAF-AHと特異的に免疫反応性を有する、抗体 物質の開発のための免疫源の貴重なソースを構成する。 本発明の宿主細胞は、細胞が好適な培養培地中で生育され、そして細胞からまた は細胞が生育される培地から、例えば免疫アフィニティー精製によって、所望の ポリペプチド産物が単離される、PAF-AHの大規模な製造法において顕著に有用で ある。 血漿からPAF-AHを精製するための、本発明により企図される免疫学的でない方 法には、（a）低密度リポタンパク質粒子を単離する、（b）該低密度タンパク質 粒子を10mM CHAPSを含む緩衝液中にて可溶化し、第１のPAF-AH酵素溶液を作製す る、（c）該第１のPAF-AH酵素溶液をDEAE陰イオン交換カラムに付す、（d）１mM CHAPSを含むおよそpH7.5の緩衝液を用いて該DEAE陰イオン交換カラムを洗浄する 、（e）0〜0.5M NaClの濃度勾配でなるおよそpH7.5の緩衝液を用いて、該DEAE陰 イオン交換カラムからPAF-AH酵素を溶出して画分とする、（f）該DEAE陰イオン 交換カラムから溶出した、PAF-AH酵素活性を有する画分をプールする、（g）該D EAE陰イオン交換カラムからの、該プールした活性画分を、10mM CHAPSに調整し て、第２のPAF-AH酵素溶液を作製する、（h）ブルーダイリガンドアフィニティ ーカラムに、該第２のPAF-AH酵素溶液を付す、（i）該ブルーダイリガンドアフ ィニティーカラムから、10mM CHAPS及びカオトロピック塩を含む緩衝液を用いて PAF-AH酵素を溶出する、（j）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムから の溶出液を、Cuリガンドアフィニティーカラムに付す、（k）10mM CHAPS及びイ ミダゾールを含む緩衝液を用いて、該CuリガンドアフィニティーカラムからPAF- AH酵素を溶出する、（l）該Cuリガンドアフィニティーカラムからの溶出液をSDS -PAGEに供する、そして、（m）SDS-ポリアクリルアミドゲルから、およそ44kDa のPAF-AH酵素を単離するという工程が含まれる。好ましくは、工程（b）の緩衝 液は25mMトリス-塩酸、10mM CHAPS、pH7.5であり、工程（d）の緩衝液は25mMト リス-塩酸、１mM CHAPSであり、工程（h）のカラムはブルーセファロースファス トフローカラムであり、工程（i）の緩衝液は25mMトリス-塩酸、10mM CHAPS、0. 5M KSCN、pH7.5であり、工程（j）のカラムはCuキレーティングセファロースカ ラムであり、そして 工程（k）の緩衝液はpHが約pH7.5〜8.0の範囲にある、25mMトリス-塩酸、10mM C HAPS、0.5M NaCl、50mMイミダゾールである。 本発明により企図される、PAF-AHを生産する大腸菌（E．Coli）から酵素的に 活性なPAF-AHを精製するための方法は、（a）PAF-AH酵素を生産する、分解した （lysed）大腸菌から遠心上清を調製する、（b）ブルーダイリガンドアフィニテ ィーカラムに、該遠心上清を付す、（c）該ブルーダイリガンドアフィニティー カラムから、10mM CHAPS及びカオトロピック塩を含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素 を溶出する、（d）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムからの溶出液を 、Cuリガンドアフィニティーカラムに付す、及び、（e）10mM CHAPS及びイミダ ゾールを含む緩衝液を用いて、該CuリガンドアフィニティーカラムからPAF-AH酵 素を溶出する、という工程を含む。好ましくは、工程（b）のカラムはブルーセ ファロースファストフローカラムであり、工程（c）の緩衝液は25mMトリス-塩酸 、10mM CHAPS、0.5M KSCN、pH7.5であり、工程（d）のカラムはCuキレーティン グセファロースカラムであり、そして工程（e）の緩衝液は25mMトリス-塩酸、10 mM CHAPS、0.5M NaCl、100mMイミダゾール、pH7.5である。 本発明により企図される、PAF-AHを生産する大腸菌から酵素的に活性なPAF-AH を精製するための他の方法は、（a）PAF-AH酵素を生産する、分解した大腸菌か ら遠心上清を調製する、（b）該遠心上清を、10mM CHAPSを含む低pH緩衝液で希 釈する、（c）該希釈された遠心上清を、約pH7.5にて平衡化した陽イオン交換カ ラムに付す、（d）１Mの塩を用いて該陽イオン交換カラムからPAF-AH酵素を溶出 する、（e）該陽イオン交換カラムカラムからの該溶出液のpHをあげ、そして該 溶出液の塩濃度を約0.5Mの塩 に調整する、（f）ブルーダイリガンドアフィニティーカラムに、該陽イオン交 換カラムからの該調整された溶出液を付す、（g）該ブルーダイリガンドアフィ ニティーカラムから、約２M〜約３Mの塩を含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素を溶出 する、及び、（h）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムからの該溶出液 を、約0.1％ツイーンを含む緩衝液を用いて透析するという工程を含む。好まし くは、工程（b）の緩衝液は25mM MES、10mM CHAPS、１mM EDTA、pH4.9であり、 工程（c）のカラムは、25mM MES、10mM CHAPS、１mM EDTA、50mM NaCl、pH5.5で 平衡化したＳセファロースカラムであって、PAF-AHは、工程（d）において、１m M NaClを用いて溶出され、工程（e）における溶出液のpHは、２Mトリスベースを 用いてpH7.5に調整され、工程（f）におけるカラムはセファロースカラムであり 、工程（g）における緩衝液は25mMトリス、10mM CHAPS、３M NaCl、１mM EDTA、 pH7.5であり、また、工程（h）における緩衝液は25mMトリス、0.5M NaCl、0.1％ ツイーン80、pH7.5である。 PAF-AH産物は天然の細胞ソースからの単離物として得られることができ、また は化学的に合成されてもよいが、好ましくは、本発明の原核性または真核性宿主 細胞が関与する組換え手法によって生産される。配列番号：８で示されるアミノ 酸配列の一部またはすべてを有するPAF-AH産物が企図される。哺乳動物宿主細胞 を用いることで、本発明の組換え発現産物に至適な生物学的活性を賦与するのに 必要であるかもしれない転写後の修飾（例えば、ミリストレーション、グリコシ レーション、トランケーション、リピデーション、及び、チロシン、セリンまた はトレオニンのリン酸化）がなされることが期待される。 本発明のPAF-AH産物は、完全長のポリペプチド、断片または変異体であってよい 。変異体は、１以上の明確化された （specified）（すなわち、天然にコードされる）アミノ酸が欠失もしくは置換 されるかまたは、１以上の明確化されないアミノ酸が付加された、PAF-AH類似体 からなり、（１）PAF-AHに特異的な１以上の酵素活性または免疫学的特性を損失 することなく、または（２）PAF-AHの特定の生物学的活性を特異的に損なわせし めるとよい。PAF-AHに結合するタンパク質または他の分子を、その活性を修飾す るために用いてもよい。 本発明によりさらに企図されるものには、抗体物質（例えば、モノクローナル 及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR−移植抗体（grafted ant ibodies）等）及びPAF-AHに特異性を有する他の結合タンパク質もある。特に本 発明の実例となる結合タンパク質は、1994年９月30日に、20852 メリーランド 州、ロックビル（Rockville）、パークロウンドライブ（Parklawn Drive）12301 のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託され、それぞれHB 1 1724及びHB 11725の寄託番号を与えられた、ハイブリドーマ90G11D及び90F2Dに よって生産されるモノクローナル抗体である。PAF-AHに特異的に結合するタンパ ク質または他の分子（たとえば脂質または小分子）は、血漿から単離されたPAF- AH、組換えPAF-AH、PAF-AH変異体またはこのような産物を発現する細胞を用いて 同定することができる。さらには、結合タンパク質は、PAF-AHの精製のためばか りでなく免疫用の組成物において有用であり、また、既知の免疫学的手法による 液体及び組織試料中のPAF-AHの検出または定量に有用である。PAF-AH特異的抗体 物質に特異的な抗イディオタイプ抗体もまた企図される。 本発明のDNA及びアミノ酸配列の開示が寄与する情報の科学的価値は明白であ る。一連の例として、PAF-AHに対するcDNA配列を知ることで、PAF-AHをコードす るゲノムDNA配列のDNA／ DNAハイブリダイゼーションによる単離や、プロモーター、オペレーター等のPAF -AH発現の制御調節配列を特定することが可能となる。当該技術分野において標 準のストリンジェンシーの条件下で、本発明のDNA配列を用いて行われるDNA／DN Aハイブリダイゼーション手法により、PAF-AHの対立変異体、PAF-AHの１以上の 生化学的及び／または免疫学的特性を担う構造的に関連のある他のタンパク質、 ならびにPAF-AHと相同のヒト以外の種のタンパク質をコードするDNAの単離を許 容することが、同様に期待される。本発明により提供されるDNA配列の情報によ って、相同組換えまたは、機能を有するPAF-AH酵素を発現しない齧歯類またはPA F-AH酵素変異体を発現する齧歯類の「ノックアウト」戦略（例えば、カペッチ（ Kapecchi）、Science、244巻、1288〜1292頁、（1989）を参照されたい）による 開発もまた可能となる。 本発明のポリヌクレオチドを好適に標識付けした場合、細胞がPAF-AH酵素を合 成する能力を検出するハイブリダイゼーション分析において有用である。本発明 のポリヌクレオチドは、１または複数の疾病状態の基礎になる、PAF-AH遺伝子座 における１または複数の遺伝的変更を同定するために有用な診断法のための基礎 となるかもしれない。さらに本発明によって入手可能となるのものに、PAF-AHを 通常発現している細胞による、PAF-AHの発現調節に関係するアンチセンスポリヌ クレオチドもある。 哺乳動物、特にヒトの被験者に、病理学的炎症状態の改善を目的として、本発 明のPAF-AH調製物を投与することが企図される。病理学的炎症状態におけるPAF の関与が暗示されることに基づき、例えば、喘息（ミワ（Miwa）ら、J．Clin．I nvest.、82巻、1983〜1991頁、（1988）、シー（Hsieh）ら、J．Allergy Clin． Immunol.、91巻、650〜657頁、（1993）、及びヤマシタ （Yamashita）ら、Allergy、49巻、60〜63頁、（1994））、アナフィラキシー（ ベナブルら、前出）、ショック（ベナブルら、前出）、再潅流傷害（reperfusio n injury）及び中枢神経系虚血（リンドバーグら（1991）、前出）抗原誘発性関 節炎（ザルコ（Zarco）ら、Clin．Exp．Immunol.、88巻、318〜323頁、（1992） ）粥腫形成（atherogenesis）（ハンドレイ（Handley）ら、Drug Dev．Res.、７ 巻、361〜375頁、（1986））、クローン病（デニゾット（Denizot）ら、Digesti ve Diseases and Sciences、37巻、３号、432〜437頁、（1992））、虚血性腸壊 死／壊死性小腸結腸炎（デニゾットら、前出、及びカプラン（Caplan）ら、Acta Paedjatr.、追補、396巻、11〜17頁、（1994））、漬瘍性結腸炎（デニゾット ら、前出）、虚血性発作（サトー（Satoh）ら、Stroke、23巻、1090〜1092頁、 （1992））、虚血性脳傷害（リンドバーグら、Stroke、21巻、1452〜1457頁、（ 1990）及びリンドバーグら（1991）前出）、全身性紅斑性狼瘡（マツザキ（Mats uzaki）ら、Clinica Chimica Acta、210巻、139〜144頁、（1992））、急性膵炎 （カルド（Kald）ら、Pancreas、８巻、４号、440〜442頁、（1993））、敗血症 、カルドら、前出）、急性後天性連鎖球菌性（acute post streptococcal）糸球 体腎炎（メツツアノ（Mezzano）ら、J．Am．Soc．Nephrol.、４巻、235〜242頁 、（1993））、IL-２治療により引き起こされる肺浮腫（ラビノビッチ（Rabinov ici）ら、J．Clin．Invest.、89巻、1669〜1673頁、（1992））、アレルギー性 炎症（ワタナベ（Watanabe）ら、Br．J．Pharmacol.、111巻、123〜130頁、（19 94））、虚血性腎不全（グリノ（Grino）ら、Annals of Internal Medicine、12 1巻、５号、345〜347頁、（1994））、早期分娩（preterm labor）（ホフマン（ Hoffman）ら、Am．J．Obstet．Gynecol.、162巻、２号、525〜528頁、（1990） 及びマキ（Maki）ら、Proc．Natl．Acad．Sci． USA、85巻、728〜732頁、（1988））、ならびに成人呼吸困難症候群（adult res piratory distress syndrome）ラビノビッチら、JAppl．Physiol.、74巻、４号 、1791〜1802頁、（1993）、マツモトら、Clin．Exp．Pharmacol．Physiol.、19 巻、509〜515頁、（1992）及びロドリゲツ−ロイジン（Rodriguez-Roisin）ら、 J．Clin．Invest.、93巻、188〜194頁、（1994））などの治療において、PAF-AH を投与することが示唆される。 前記の病理学的状態の多くの動物モデルが当該技術分野において記載されてい る。例えば、喘息、鼻炎、及び湿疹に対するマウスモデルが本願明細書の実施例 １６に記載され、関節炎に対するウサギモデルがザルコら、前出、に記載され、 虚血性腸壊死／壊死性小腸結腸炎に対するラットのモデルがフルカワ（Furukawa ）ら、Ped．Res.、34巻、２号、237〜241頁、（1993）及びカプランら、前出、 に記載され、発作に対するウサギのモデルがリンドバーグら（1990）、前出、に 記載され、狼瘡に対するマウスのモデルがマツザキら、前出、に記載され、急性 膵炎に対するラットのモデルがカルドら、前出、に記載され、IL-2治療により引 き起こされる肺浮腫に対するラットのモデルがラビノビッチら、前出、に記載さ れ、アレルギー性炎症のラットのモデルがワタナベら、前出、に記載され、腎異 系移植のウサギのモデルがワトソン（Watson）ら、Transplantation、56巻、４ 号、1047〜1049頁、（1993）に記載され、ならびに成人呼吸困難症候群のラット のモデルがラビノビッチら、前出、に記載されている。 本発明により特に企図されるのは、哺乳動物中で内在性PAF-AH活性を補足し、 病因となる量のPAFを不活性化するに足る量のPAF-AHを、哺乳動物に投与するこ とからなる、PAF-AHが媒介する病理学的状態が疑われるかまたは罹患している哺 乳動物の治 療法に用いられるPAF-AH組成物である。 本発明により企図される治療用組成物は、PAF-AH及び生理学的に許容しうる希 釈剤（賦形剤）または担体を含み、また、抗炎症効果を有する他の試薬を含んで もよい。指示される投与量は、内在性PAF-AH活性を補い、且つ病理的状態をもた らす量のPAFを不活性化するに足る量であろう。一般的な投与量の考慮のために は、Remmington's Pharmaceutical Sciences、18版、Mack Publishing Co.、イ ーストン、ペンシルベニア州（1990）を参照されたい。投与量は、約0.1〜約100 0μｇ PAF-AH/kg体重の間で変動するであろう。本発明の治療用組成物は、処置 すべき病理学的状態に依存して、種々の経路により投与されうる。例えば、投与 は、静脈内、皮下、経口、座薬、及び／または肺を経由する経路により投与され てもよい。 肺の病理学的状態のためには、肺を経由する経路によるPAF-AHの投与が特に指 示される。肺を経由する投与における用途のために企図されるのは、例えば、当 該技術分野において標準的な、噴霧器、投与量吸入器（dose inhaler）、及び粉 末吸入器（powder inhaler）を含む広範な送達（delivery）デバイスである。 エアロゾル調剤の吸入による肺及び循環系への種々のタンパク質の送達は、ア ジェイ（Adjei）ら、Pharm．Res.、７巻、６号、565〜569頁、（1990（ロイプロ リド アセテート（leuprolideacetate））、ブラケット（Braquet）ら、J．Car djo．Pharm.、13巻（追補５）：ｓ．143〜146頁、（1989）（エンドセリン-１） 、ハッバード（Hubbard）ら、Annals of Internal Medicine、III巻、３号、206 〜212頁、（1989）（α１-アンチトリプシン）、スミス（Smith）ら、J．Clin． Invest.、84巻、1145〜1146頁、（1989）（α-１-プロテナーゼインヒビター） 、デブス（Debs）ら、J．Immunol.、140巻、3482〜3488頁、（1933）（組換えガ ンマインターフェロン 及び腫瘍壊死因子アルファ）、1994年9月15日公開の、特許協力条約（PCT）国際 公開番号第WO 94/20069号（組換え係留化（pegylated）顆粒球コロニー刺激因子 ）に記載されている。 図面の簡単な説明 本発明の数多くの他の局面及び利点は、下記の図面を参照して、以下の詳細な 説明を考慮すれば、明らかとなるであろう。 図１は、ヒト血漿から精製されたPAF-AHを含むPVDF膜の写真である。 図２は、組換えヒト血漿PAF-AHの酵素活性を示すグラフである。 図３は、組換えPAF-AH断片及び及びそれらの触媒活性を表す図面である。 図４は、本発明の組換えPAF-AHの局所投与による、PAFで誘発したラット足浮 腫の阻止を示す棒グラフである。 図５は、PAF-AHの静脈内投与による、PAFで誘発したラット足浮腫の阻止を示 す棒グラフである。 図６は、PAF-AHは、PAFで誘発した浮腫を阻止するものの、ザイモサン（zymos an A）で誘発した浮腫は阻止しないことを示す棒グラフである。 図７Ａ及び図７Ｂは、ラット足浮腫におけるPAF-AHの抗炎症活性の量相関の結 果を示す。 図８Ａ及び図８Ｂは、単回投与量のPAF-AHのin vivoでの経時的な有効性を示 唆する結果を示す。 図９は、ラット循環系におけるPAF-AHの薬物動態学を表す折れ線グラフである 。また、 図１０は、ラット足浮腫における、PAF-AHの抗炎症効果を、PAF拮抗剤のより 低い効果に比較して示す、棒グラフである。 発明の詳細な説明 以下の実施例により本発明を例証する。実施例１は、ヒト血漿からのPAF-AHの 新規な精製法を示す。実施例２は、精製されたヒト血漿PAF-AHのアミノ酸マイク ロ配列決定を記載する。ヒト血漿PAF-AHをコードする全長のcDNAのクローニング を、実施例３に記載する。ヒト血漿PAF-AH遺伝子の、推定されるスプライス変異 体の同定を実施例４に記載する。ヒト血漿PAF-AHをコードするゲノム配列のクロ ーニングを、実施例５に記載する。実施例６は、ヒト血漿PAF-AH cDNAと相同な 、ウサギ、マウス、ラット及びマカクのcDNAのクローニングを記載する。 実施例７は、COS７細胞で一過性に発現された組換えPAF-AHの酵素活性の証拠 となる分析結果を示す。実施例８は、大腸菌及び酵母（S．cerevisiae）におけ るヒトPAF-AHの発現を記載する。 実施例９は、大腸菌からの組換えPAF-AHの精製のためのプロトコル、及びその 酵素活性を確証する分析を示す。実施例１０は、アミノ酸置換類似体ならびにア ミノ及びカルボキシ切除産物を含む種々の組換えPAF-AH産物を記載する。種々の 組織及び細胞系におけるヒト血漿PAF-AH RNAの発現に対するノザンブロット分析 の結果を、実施例１１に示し、一方in situハイブリダイゼーションの結果を実 施例１２に示す。実施例１３には、ヒト血漿PAF-AHに特異的なモノクローナル抗 体の作製を記載する。実施例１４、１５及び１６は、それぞれ、ラットにおける 急性炎症、胸膜炎及び喘息への、本発明の組換えPAF-AH産物の投与の、in vivo での治療的効果を記載する。実施例１７はPAF-AH活性の欠損を示すヒト患者の血 清のイムノアッセイの結果を示し、また、明らかにその欠損の原因と思われる、 その患者における遺伝的傷害の同定を記載する。 実施例１ アミノ酸配列決定のための材料を供給するために、ヒト血漿からPAF-AHを精製 した。 Ａ． 精製条件の至適化 最初に、リンタングステン酸（phosphotungstate）を用いて、血漿から低密度 リポタンパク質（LDL）粒子を、沈澱させ、次いで0.1％ツイーン20中に可溶化し 、そしてスタッフォリニら（1987）、前出、の方法に従って、DEAEカラム（ファ ルマシア（Pharmacia）社、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）のクロマトグ ラフィーに供したが、可溶化の再評価及び引き続いての精製条件に必要なDEAEカ ラムからのPAF-AＨ活性体の溶出は、一致しないものであった。 ツイーン20、CHAPS（ピアスケミカル社（Pierce Chemical Co.，）ロックフォ ード（Rockford）、イリノイ州）及びオクチルグルコシドを、LDL粒子の可溶化 能について、遠心及びゲル瀘過クロマトグラフィーにより評価した。CHAPSによ れば、可溶化した活性体の回取がツイーン20よりも25％上回り、またオクチルグ ルコシドよりも300％上回る回取がなされた。次いで、10mMCHAPSで可溶化したLD L沈澱物を、DEAEセファロースファストフローカラム（陰イオン交換カラム、フ ァルマシア社）で、１mMCHAPSを含む緩衝液を用いて分画して、次なるカラムの 評価用の部分精製したPAF-AHの大量のプール（「DEAEプール」）を得た。 DEAEプールは、さらなるPAF-AH活性体の精製における有用性について、種々の クロマトグラフィーカラムをテストするための出発材料として用いた。テストし たカラムとしては、ブルーセファロースファストフロー（ファルマシア社）（ダ イリガンドアフィニティーカラム）、S-セファロースファストフロー（ファルマ シア社）（陽イオン交換カラム）、Cuキレーティン グセファロース（ファルマシア社）、（金属リガンドアフィニティーカラム）、 フラクトゲルS（イー・エム・セパレーションズ（EM Separations）社）、ギッ ブスタウン（Gibbstown）、ニュージャージー州）（陽イオン交換カラム）、及 びセファクリル（Sephacryl）-200（ファルマシア社）（ゲル瀘過カラム）が挙 げられる。これらのクロマトグラフィー手法では、１mM CHAPSで操作した場合、 すべて低く、満足のいかないレベルの精製にとどまった。引き続き１mM CHAPS中 でセファクリルS-200のゲル瀘過クロマトグラフィーを行うと、期待された44kDa のおおよそのサイズというよりもむしろ、広範なサイズ範囲にわたって溶出する 酵素的に活性な画分が得られた。まとめて考えると、これらの結果は、LDLリポ タンパク質が溶液中で凝集していることを示唆していた。 そこで、PAF-AH活性体の凝集について分析用ゲル瀘過クロマトグラフィーによ り、異なるLDL試料を評価した。DEAEプール及び新たに可溶化したLDL沈澱物から の試料は、１mM CHAPSを含む緩衝液で平衡化したスペローズ（Superose）12（フ ァルマシア社）で分析した。いずれの試料とも、殆どの活性体が150kDaを越える 、きわめて広い範囲の分子量にわたって溶出した。 次いで10mM CHAPSを含む緩衝液で平衡化したスペローズ12で試料を分析したと ころ、活性体の大半がPAF-AH活性体について期待された44kDa付近に溶出された 。しかしながら、試料には、凝集物に相当する高分子量の領域に、いくらかのPA F-AH活性体が含まれていた。 引き続き、他の試料をゲル瀘過によってテストすると、およそ44kDaの範囲に 専らPAF-AH活性体を溶出した。これらの試料とは、0.5M NaClの存在下で10mM CH APS中で可溶化したLDL沈澱物及び、DEAEカラムから溶出した後10mM CHAPSに調整 した新 たなDEAEプールであった。これらのデータにより、非凝集性のPAF-AHを維持する ために、少なくとも10mMのCHAPSが必要であることが示唆される。DEAEのクロマ トグラフィーの後、但し引き続いてのクロマトグラフィー工程の前に、１mMから 10mMへとCHAPS濃度を高めることで、精製に劇的な差が生じた。 例えば、S-セファロースファストフローでのPAF-AHの精製の度合いは、２倍か ら10倍へと増大した。PAF-AH活性体は、１mM CHAPS中でブルーセファロースファ ストフローカラムに不可逆的に結合したが、このカラムにおいて10mM CHAPSで最 も高いレベルの精製がなされた。10mM CHAPSを前もって添加しても、DEAEクロマ トグラフィーは改善されなかった。 ブルーセファロースファストフローカラムの後のCuキレーティングセファロー スのクロマトグラフィーで、PAF-AH活性体が15倍濃縮された。試料が煮沸されな い限りにおいて、還元SDS-ポリアクリルアミドゲルからPAF-AH活性体を回取でき ることも、判定された。Cuキレーティングセファロースカラムから溶出された物 質の活性は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供すると、ゲルを銀染色し た場合に見られる主たるタンパク質のバンドに一致した。 Ｂ． PAF-AH精製プロトコル かくして、アミノ酸配列決定用のPAF-AHを精製するために用いる新規のプロト コルは、４℃で実施される以下の工程からなるものであった。ヒト血漿を、１リ ットルのナルゲンボトル中、900mlアリコートづつに分割し、pH8.6に調整した。 次いで90mlの3.85％リンタングステン酸ナトリウムに続き23mlの２M MgCl₂を添 加することにより、LDL粒子を沈澱させた。 その後、血漿を3600gにて15分間遠心した。ペレットを800mlの0.2％クエン酸ナ トリウム中に再懸濁させた。10g NaCl及 び24mlの２M MgCl₂を添加することにより、再びLDLを沈澱させた。3600gにて15 分問遠心することにより、LDL粒子をペレットとした。この洗浄を２度繰り返し た。次にペレットを-20℃で凍結せしめた。５Lの血漿からのLDL粒子を、５Lの緩 衝液Ａ（25mMトリス塩酸、10mM CHAPS、pH7.5）中に再懸濁させて一晩攪拌した 。可溶化したLDL粒子を3600gにて1.5時間遠心した。上清を集めて、残っている 固形物をすべて除去するために、ワットマン（Whatman）113瀘紙を用いて濾過し た。 可溶化したLDL上清を、緩衝液Ｂ（25mMトリス塩酸、１mMCHAPS、pH7.5）で平 衡化したDEAEセファロースファストフローカラム（11cm×10cm、１L樹脂容量、8 0ml/分）に負荷した。 吸光度がベースラインに戻るまで、緩衝液Ｂを用いてカラムを洗浄した。８L の、0〜0.5M NaClの濃度勾配を用いてタンパク質を溶出し、480mlの画分を集め た。この工程は、以下のブルーセファロースファストフローカラムへの結合を得 るために必須であった。本質的に実施例４に記載の方法によって、アセチルヒド ロラーゼ活性について画分を分析した。活性画分をプールし、該プールを約10mM CHAPSとするために充分なCHAPSを添加した。0.5M NaClを含む緩衝液Ａで平衡化 したブルーセファロースファストフローカラム（5cm×10cm、200mlベッド容量） に、DEAEプールを４ml/分にて一晩かけて負荷した。吸光度がベースラインに戻 るまで、16ml/分にて平衡化緩衝液を用いてカラムを洗浄した。PAF-AH活性体は 、16ml/分にて、0.5M KSCN（カオトロピック塩）を含む緩衝液Ａを用いて段階的 に溶出し、50mlの画分を集めた。この工程の結果、1000倍を越える精製がなされ た。活性画分をプールし、１Mトリス塩酸、pH8.0を用いてそのプールをpH8.0に 調整した。ブルーセファロースファストフロークロマトグラフィーからの 活性なプールは、緩衝液Ｃ（25mMトリス塩酸、10mM CHAPS、0.5M NaCl、pH8.0（ pH7.5でも有効であった））で平衡化したCuキレーティングセファロースカラム （2.5cm×2cm、10mlベッド容量、４ml/分）に負荷し、カラムを50mlの緩衝液Ｃ を用いて洗浄した。PAF-AH活性体は、50mMイミダゾールを含む緩衝液Ｃを100ml 用いて溶出し、10mlの画分を集めた。PAF-AH活性を含む画分をプールし、緩衝液 Ａに対して透析した。PAF-AH活性体の15倍の濃縮がなされることに加えて、Cuキ レーティングセファロースカラムにより若干の精製が行われた。Cuキレーティン グセファロースプールを、37℃にて15分間、50mM DTT中で還元し、0.75mm、7.5 ％ポリアクリルアミドゲルに負荷した。0.5cm毎にゲルの薄片を切断し、200μｌ の25mMトリス塩酸、10mM CHAPS、150mM NaClを含む使い捨てのマイクロフュージ （microfuge）チューブに入れた。薄片を粉砕し、４℃にて一晩インキュベート させておいた。次いで各ゲル薄片の上清をPAF-AH活性について分析して、SDS-PA GE上のいずれのタンパク質バンドがPAF-AH活性を含むかを判定した。PAF-AH活性 は、およそ44kDaのバンドにおいて見出された。平行して実験を行った２つのゲ ルからのタンパク質をPVDF膜（イモビロン（Immobilon）-P、ミリポア（Millipo re）社）に電気を用いて転写し、クマシーブルーで染色した。そのPVDF膜の写真 を図１に示す。 以下の表１に示すように、５Lのヒト血漿からおよそ200μｇのPAF-AHが、2×1 0⁶倍精製された。それに比べて、スタッフォリニら（1987）、前出、には、PAF- AH活性体の3×10⁴倍の精製が記載されているのである。 要約すると、以下の工程、すなわち、（1）10mM CHAPS中での可溶化及びクロ マトグラフィー、（2）ブルーセファロースファストフローなどのブルーリガン ドアフィニティーカラムでのクロマトグラフィー、（3）Cuキレーティングセフ ァロースなどのCuリガンドアフィニティーカラムでのクロマトグラフィー、なら びに（4）SDS-PAGEからのPAF-AHの溶出、が独自のものであり、マイクロ配列決 定用の血漿PAF-AHを成功裡に精製するために重大である。 実施例２ アミノ酸配列決定のため、実施例１に記載のPAF-AHを含むPVDF膜からの、およ そ44kDaタンパク質のバンドを切除し、アプライドバイオシステムズ（Applied B iosystems）473Aプロテインシーケンサーを用いて配列決定した。PAF-AH活性体 に対応す る〜44kDaのタンパク質バンドのN-末端配列分析により、そのバンドが２つの主 たる配列と２つの次位の配列を含むことが示唆された。その２つの主たる配列の 割合は１：１であり、よって配列データを解読するのは困難であった。 SDSゲルで分離された２つの主たるタンパク質の配列を判別するため、およそ4 4kDaのバンドを含む平行して実験を行った２枚のPVDF膜を半分に切断し膜の上部 と下部とが別個に配列決定に供されるようにした。 膜の下半分について得られたN-末端配列は、 配列番号：１ FKDLGEENFKALVLIAF であった。タンパク質データベースの検索により、この配列がヒト血清アルブミ ンの断片であることが明らかとなった。同じPVDF膜の上半分についても配列決定 を行い、決定したN-末端アミノ酸配列は、 配列番号：２ IQVLMAAASFGQTKIP であった。この配列は、検索したデータベースの中のいずれのタンパク質にもマ ッチせず、また、スタッフォリニら（1993）、前出、における赤血球の細胞質PA F-AHについて報告された、 配列番号：３ MKPLVVFVLGG のN-末端アミノ酸配列とも異なっていた。新規配列（配列番号：２）を、以下の 実施例３に記載のように、ヒト血漿PAF-AHのcDNAクローニングに利用した。 実施例３ ヒト血漿PAF-AHをコードする全長のクローンを、マクロファ ージcDNAライブラリーから単離した。 Ａ． マクロファージcDNAライブラリーの構築 末梢血単球由来のマクロファージから、ポリA⁺RNAを採取した。インビトロゲ ンコピーキット（Invitrogen Copy Kit）（サンディエゴ、カリフォルニア州） を用いて、二本鎖の、ブラントエンドとした（blunt-ended）cDNAを作製し、哺 乳動物発現ベクター、pRc/CMV（インビトロゲン）へと挿入する前に、そのcDNA にBstXIアダプターを連結した。エレクトロポレーションにより、得られたプラ スミドを大腸菌株XL-１ブルーに導入した。形質転換された菌を、総計978枚のア ガロースプレート当たり、およそ3000コロニーの密度で播種した。各プレートか ら別々に調製したプラスミドDNAは、個々のプールとして保持し、また、それぞ れ300,000クローンを表す、より大きなプールへと集めることも行った。 Ｂ． PCRによるライブラリースクリーニング 実施例２に記載の新規なN-末端アミノ酸配列に基づく、縮重アンチセンスオリ ゴヌクレオチドPCRプライマーを利用した、ポリメラーゼ連鎖反応により、マク ロファージライブラリーをスクリーニングした。プライマーの配列を、以下にIU PAC命名法に従って記載するが、ここで「I」は、イノシンである。 配列番号：４ ５’ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA３’ プライマーの各コドンの第３位のヌクレオチドを選択するのに、ワダ（Wada）ら 、Nuc．Acids Res.、19S巻、1981〜1986頁、（1991）のコドン選択表を用いた。 プライマーは、300,000クローンのマクロファージライブラリープールをスクリ ーニングするために、いずれもpRc/CMVのクローニング部位の側に位置するSP６ またはT７プロモーター配列のどちらかに特異的なプライマー と組合わせて用いた。すべてのPCR反応には、100ngの鋳型cDNA、１μｇの各プラ イマー、0.125mMの各dNTP、10mMのトリス塩酸、pH8.4、50mM MgCl₂及び2.5単位 のTaqポリメラーゼが含まれていた。94℃、４分間で最初の変性工程を行なった 後、94℃で１分、60℃で１分そして72℃で２分の増幅を30サイクル行った。その 結果得られたPCR産物は、ｐブルースクリプトSK^-（ストラタジーン（Stratagene ）社、ラ・ジョラ（La Jolla）、カリフォルニア州）中にクローン化し、そして そのヌクレオチド配列を、ダイデオキシチェーンターミネーター法により決定し た。PCR産物は、新規ペプチド配列により予測される配列を含み、配列番号：７ のヌクレオチド1〜331に対応するものである。 以下に記すPCRプライマーは、前記のクローン化したPCR断片に特異的なもので あり、全長のクローンを同定するためにデザインした。 センスプライマー（配列番号：５） ５’TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG３’ アンチセンスプライマー（配列番号：６） ５’CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC３’ これらのプライマーを利用するPCR反応を前記のごとくに実施し、最初に300,000 クローンのcDNAプールを、次いでより小さい3000クローンのプールの適切なサブ セット（subset）をスクリーニングした。その後、期待されるサイズのPCR産物 を生産している3000クローンのプール３つを、菌の形質転換のために用いた。 Ｃ． ハイブリダイゼーションによるライブラリースクリーニング 形質転換された菌からのDNAを、元のクローン化したPCR断片をプローブとして 用いたハイブリダイゼーションによって、引 き続きスクリーニングした。コロニーをニトロセルロースに上にブロットし、50 ％ホルムアミド、0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.05Mリン 酸ナトリウム、pH6.5、１％ポリビニルピロリドン、１％フィコール、１％ウシ 血清アルブミン及び50ng/mlの超音波処理済サケ精子DNA中でプレハイブリダイゼ ーション及びハイブリダイゼーションを行った。 ハイブリダイゼーションプローブは、ランダムヘキサマープライミングによっ て標識付けした。42℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った後、ブロットを 、42℃にて、0.03M塩化ナトリウム、３mMクエン酸ナトリウム、0.1％SDS中で大 規模に洗浄した。10のハイブリダイズするクローンのヌクレオチド配列を決定し た。クローンのうちの１つ、クローンsAH406-3は、ヒト血漿から精製したPAF-AH 活性体の元のペプチド配列により予測される配列を含んでいた。ヒト血漿PAF-AH のDNA及び決定したアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：７及び８に記す。 クローンsAH 406-3は、予測される441アミノ酸のタンパク質をコードする読み 取り枠を有する1.52kbのインサートを含む。 アミノ末端において、比較的疎水性のセグメントである41残基が、タンパク質マ イクロ配列決定により同定されたN-末端アミノ酸（配列番号：８の42位のイソロ イシン）の前に存在する。しかして、コードされているタンパク質は、長いシグ ナル配列かまたは、切断されて機能を有する成熟タンパク質を生じる付加的なペ プチドをシグナル配列に加えて有しているかもしれない。シグナル配列の存在が 、分泌タンパク質の１つの特徴である。それに加えて、あらゆる既知の哺乳動物 リパーゼ、微生物リパーゼ及びセリンプロテアーゼの活性部位のセリンを含むと 信じられている、コンセンサスGxSxGモチーフが、クローン sAH 406-3がコードするタンパク質に含まれている（配列番号：８のアミノ酸271 〜275）。チャプス（Chapus）ら、Biochimie、70巻、1223〜1224頁、（1988）及 びブレンナー（Brenner）、Nature、334巻、528〜530頁、（1988）を参照された い。 以下の表２は、配列番号：８より予測される本発明のヒト血漿PAF-AHのアミノ 酸組成と、スタッフォリニら（1987）、前出、に記載の、称するところによれば 精製されたものの、アミノ酸組成の比較である。 本発明のヒト血漿PAF-AHの成熟型のアミノ酸組成と、称するところではヒト血漿 PAF-AHである、以前に精製された物質のアミノ酸組成は明らかに異なっていた。 ハットリら、前出、の、ウシ脳細胞質PAF-AHのヌクレオチド及び決定されたア ミノ酸配列と、本発明のヒト血漿PAF-AHのヌクレオチド及びアミノ酸配列とのア ラインメントを試みると、配列における有意な構造的類似性は、なんら観察され なかった。 実施例４ PAF-AH cDNAの５’非翻訳領域（配列番号：７のヌクレオチド31〜52）及び３ ’端における翻訳終止コドンにわたる領域（配列番号：７のヌクレオチド1465〜 1487）にハイブリダイズするプライマーを用いて、マクロファージ及び刺激した PBMC cDNAについてPCRを実施すると、ヒトPAF-AH遺伝子の推定されるスプライス 変異体が検出された。PCR反応により、ゲル上に２つのバンドが得られ、１つは 実施例３のPAF-AH cDNAの予期されるサイズに対応しており、いま１つはそれよ り約100bp短かった。両方のバンドの配列決定により、大きい方のバンドが実施 例３のPAF-AH cDNAであって、一方短い方のバンドは血漿PAF-AHの推定されるシ グナル及びプロペプチド配列をコードするPAF-AH配列のエキソン２（以下の実施 例５）を欠失していた。予測される、触媒活性３残基群（catalytic triad）及 びすべてのシステインが、短い方のクローンに存在していたので、該クローンが コードするタンパク質の生化学的活性は血漿の酵素の活性に匹敵するかもしれな いと思われる。 実施例５ ヒト血漿PAF-AHのゲノム配列も単離した。高いストリンジ ェンシーの条件下でのDNAハイブリダイゼーションにより、ヒトゲノムDNAを含む ラムダ及びP1ファージクローンを単離することによって、PAF-AH遺伝子の構造を 決定した。ファージクローンの断片をサブクローン化し、そしてcDNAクローンsA H 406-3全体において一定の間隔で再結合（anneal）するよう設計されたプライ マーを用いて配列決定した。さらにエキソンの側部に位置するイントロン領域と 再結合するよう設計された新たな配列決定用プライマーを、配列を確認するため に、エキソン−イントロン境界を越えて、改めて配列決定を行うために用いた。 エキソン／イントロン境界は、ゲノム配列とcDNA配列とが分岐する点として明ら かにされた。これらの分析により、ヒトPAF-AH遺伝子が12のエキソンからなるこ とが明らかとなった。 エキソン１、２、３、４、５、６、及び７の一部は、ラムダFIX（ストラタジ ーン社）中で構築された雄性胎児の胎盤のライブラリーから単離された。ニトロ セルロース上にファージプラークをブロットし、50％ホルムアミド、0.75M塩化 ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム（pH6.5）、１％ ポリビニルピロリドン、１％ フィコール、１％ ウシ血清アルブミン、及び50 ng/mlの超音波処理済サケ精子DNA中でプレハイブリダイゼーション及びハイブリ ダイゼーションを行った。エキソン２〜６及び７の一部を含むファージクローン を同定するために用いるハイブリダイゼーション用プローブは、cDNAクローンsA H 406-3全体で構成されるものであった。エキソン１を含むクローンは、cDNAク ローンの５’端由来の断片（配列番号：７のヌクレオチド1〜312）を用いて同定 した。両プローブとも、ヘキサマーランダムプライミングによって、³²Ｐで標識 付けした。42℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った後、ブロットを、42℃ にて、30mM塩化ナトリウム、 ３mMクエン酸ナトリウム、0.1％SDS中で大規模に洗浄した。 エキソン１、２、３、４、５、及び６のDNA配列に加えて、部分的な周囲のイ ントロン配列を、それぞれ配列番号：９、１０、１１、１２、１３及び１４に記 す。 エキソン７の残部ならびにエキソン８、９、１０、１１、及び１２は、ヒトP1 ゲノムライブラリーから単離したP1クローンからサブクローン化した。ニトロセ ルロース上にP1ファージプラークをブロットし、0.75M塩化ナトリウム、50mMリ ン酸ナトリウム（pH7.4）、５mM EDTA、１％ポリビニルピロリドン、１％ フィ コール、１％ウシ血清アルブミン、0.5％SDS、及び0.1mg/mlの総ヒトDNA中でプ レハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った。ヘキサマーラ ンダムプライミングによって³²Pで標識付けしたハイブリダイゼーションプロー ブは、前記のように単離したラムダクローンの３’端から由来するゲノムDNAの2 .6kbのEcoR１断片で構成されていた。この断片は、ファージクローン上に存在す るエキソン６及びエキソン７の一部を含んでいた。65℃にて一晩ハイブリダイゼ ーションを行った後、前記のようにブロットを洗浄した。エキソン７、８、９、 １０、１１、及び１２のDNA配列に加えて、部分的な周囲のイントロン配列を、 それぞれ配列番号：１５、１６、１７、１８、１９、及び２０に記す。 実施例６ 全長の血漿PAF-AH cDNAクローンを、マウス及びウサギ脾臓cDNAライブラリー から単離し、ラット胸腺cDNAライブラリーから部分的なラットのクローンを単離 した。クローンは、低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションにより 同定した（ハイブリダイゼーション条件は、50％ホルムアミドの代わ りに20％ホルムアミドを用いたこと以外は、前記実施例５のエキソン１〜６につ いて記載したと同じであった）。ヒトPAF-AH sAH 406-3 cDNAクローンの１kb Hi ndIII断片（配列番号：７のヌクレオチド309〜1322）をプローブとして用いた。 加えて、部分的なサルのクローンを、配列番号：７のヌクレオチド285〜303及び 851〜867に基づくプライマーを用いて、PCRによりマカク脳cDNAから単離した。 マウス、ウサギ、ラット、及びマカクのcDNAクローンのヌクレオチド及び決定さ れたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、及び２４に記す。 それらのcDNAクローンとヒトcDNAクローンの決定されたアミノ酸配列を比較す ることにより、以下の表８に示す、アミノ酸の同一性のパーセンテージ値が得ら れた。 実施例７ ヒト血漿PAF-AH cDNAクローンsAH 406-3（実施例３）が、PAF-AH活性を有する タンパク質をコードしているか否かを確定するため、pRc/CMV発現構築物をCOS7 細胞内で一過性に発現させた。DEAEデキストラン法によりトランスフェクトして ３日後に、COS細胞培地をPAF-AH活性について分析した。 60mm組織培養ディッシュ当たり300,000細胞の密度で、細胞を播種した。次の 日、0.5mg/ml DEAEデキストラン、0.1mMクロロキン及び5〜10μgのプラスミドDN Aを含有するDMEM中で細胞を２時間インキュベートした。次いで細胞を、10％DMS Oを含むリン酸緩衝生理食塩水中で１分間処理し、培地で洗浄し、そしてジイソ プロピルフルオロホスフェート（DFP）を用いて前処理して内在性ウシ血清のPAF -AHを不活性化しておいた子牛胎児血清10％を含有するDMEM中でインキュベート した。３日間インキュベートした後、トランスフェクトした細胞からの培地をPA F-AH活性について分析した。10mM EDTAまたは１mM DFPのいずれかの存在下また は非存在下で分析を行い、スタッフォリニら（1987）、前出、により以前に血漿 PAF-AHについて報告されたように、組換え酵素がカルシウム非依存性でありセリ ンエステラーゼ阻害剤DFPによって阻害されるか否かを判定した。陰性の対照に は、インサートを欠くpRc/CMVかまたはsAH 406-3インサートを逆方向に有するpR c/CMVを用いてトランスフェクトした細胞が含まれていた。 トランスフェクト体上清におけるPAF-AH活性は以下の変更を加えて、スタッフ ォリニら（1990）、前出、の方法により測定した。要約すると、［アセチル-³H ］PAF（ニューイングランドヌクレアー（New England Nuclear）社、ボストン、 マサチューセッツ州）からの³H-アセテートの加水分解を測定することによりPAF -AH活性を測定した。水性の遊離3H-アセテートは、オクタデシルシリカゲルカー トリッジ（ベーカーリサーチプロダクツ（Baker Research Products）社、フィ リプスバーグ（Phillipsburg）、ペンシルベニア州）を用いた逆相カラムクロマ トグラフィーにより、標識付けされた基質から分離した。50μｌの反応液容量で 0.1Mヘペス緩衝液、pH7.2中、10μｌの トランスフェクト体の上清を用いて、分析を行った。標識：非標識（cold）のPA Fの割合を１：５として、１反応当たり計50ピコモルの基質を用いた。37℃にて3 0分間反応液をインキュベートし、40μｌの10M酢酸を添加することによって停止 した。オクタデシルシリカゲルカートリッジを通して溶液を洗浄し、次いでカー トリッジは0.1M酢酸ナトリウムですすいだ。各試料からの水性溶出液を集めて、 液体シンチレーションカウンターで１分間計測した。酵素活性は、１分当たりの カウント数で表した。 図２に示すように、sAH 406-3でトランスフェクトした細胞からの培地は、バ ックグラウンドよりも４倍のレベルでPAF-AH活性を有していた。この活性は、ED TAの存在によっては影響を受けなかったが、１mM DFPにより阻止された。これら の観察から、クローンsAH 406-3が、ヒト血漿酵素PAF-AHに一致した活性体をコ ードしていることが証明された。 実施例８ 大腸菌発現ベクター内へのサブクローニングが容易に行える、クローンsAH 40 6-3からのヒト血漿PAF-AH cDNAのタンパク質をコードする断片を作製するために 、PCRを用いた。サブクローン化したセグメントは、Ile₄₂（配列番号：８、ヒト 血漿から精製された酵素のN-末端残基）をコードするコドンを有するヒト遺伝子 の５’端で始まるものであった。構築物中には、本来の終止コドンにわたる遺伝 子の残部が含まれた。利用した５’センスPCRプライマーは、 配列番号：２５ ５’TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG ３’であり、翻訳開始 コドン（下線部）のみならずXbalクローニング部 位を含むものであった。利用した３’アンチセンスプライマーは、 配列番号：２６ ５’ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG ３’であって、sAH406-3の終止 コドンにまたがり、EcoRVクローニング部位を含むものであった。PCR反応は、本 質的に実施例３に記載のように実施した。その結果得られたPCR産物は、Xbal及 びEcoRVを用いて消化し、そして、クローニング部位に近接した上流にTrpプロモ ーター（デボエ（deBoer）ら、PNAS、80巻、21〜25頁、（1983））を含むpBR322 ベクター内にサブクローン化した。大腸菌株XL-1ブルーをその発現構築物で形質 転換し、次いで100μｇ/mlのカルベニシリン（carbenicillin）を含むＬブイヨ ン（broth）中で培養した。一晩培養した培養物からの形質転換体をペレットと し、50mMトリス塩酸、pH7.5、50mM NaCl、10mM CHAPS、１mM EDTA、100μｇ/ml リソゾーム、及び0.05トリプシン阻害単位（TIU）/mlのアプロチニン（Aprotini n）を含む分解用緩衝液中に再懸濁した。氷上で１時間インキュベートし、２分 間超音波処理を施した後、実施例４に記載の方法により、PAF-AH活性について分 解物を分析した。発現構築物（trp AHと名付けた）で形質転換された大腸菌は、 PAF-AH活性を有する産物を作り出していた。実施例９の表６を参照されたい。 tacIIプロモーター（デボエ、前出）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmo nella typhimurium）からのアラビノース（ara）Bプロモーター（ホルビッツ（H orwitz）ら、Gene、14巻、309〜31頁、（1981））、及びバクテリオファージT7 プロモーターの、３つの付加的なプロモーターを含む構築物もまた、大腸菌内で のヒトPAF-AH配列の発現を行うために利用した。Trpプロモーター（pUC trp AH ）、tacIIプロモーター（pUC tac AH）、及び araBプロモーター（pUC ara AH）からなる構築物をプラスミドpUC19（ニューイ ングランドバイオラブス（New England Biolabs）社、マサチューセッツ州）の 中に組み立て、一方T7プロモーターからなる構築物（pET AH）はプラスミドpET1 5B（ノバゲン（Novagen）社、マディソン、ウィスコンシン州）の中に組み立て た。T7プロモーター領域のリボソーム結合部位に融合されたaraBプロモーターで 構成されるハイブリッドプロモーター、pHAB/PHを含む構築物もまた、pET15Bの 中に組み立てた。すべての大腸菌構築物が、20〜50U/ml/OD₆₀₀の範囲内でPAF-AH 活性を生産した。この活性体は、総細胞タンパク質の１％以上の総組換え体タン パク質量に対応していた。 組換えヒトPAF-AHは、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）内でも発現させた 。rPAF-AH発現を行なうために酵母ADH2プロモーターを用い、７U/ml/OD₆₀₀を生 産した（下記の表４）。 種々の大腸菌発現構築物を、どれが延長したアミノ末端を有するPAF-AHを生産 するかについて評価した。天然の血漿PAF-AHのN-末端は、アミノ酸配列決定（実 施例２）によりIle₄₂として同定された。しかしながら、Ile₄₂に近接した上流の 配列はシグナル配列切断部位で見出されるアミノ酸には一致していない（すなわ ち、リジンが-１位に見出されないので、「-３-１ルール」には従っていない、 フォン・ヘイネ（von Heijne）、Nuc．Acids Res.、14巻、4683〜4690頁、（198 6）を参照されたい）。 おそらくは、より古典的なシグナル配列 （M₁〜A₁₇）が、細胞分泌系により 認識され、引き続きタンパク質内部分解性切断（endoproteolytic cleavage）が 行われる。開始のメチオニンで始まるPAF-AHに対する全コード配列（配列番号： ７のヌクレオチド162〜1487）を、大腸菌内で発現するために、trpプロモーター を用いて作った。表５に示すように、この構築物は活性なPAF-AHを産生したが、 Ile₄₂で始まる元の構築物のレベルの約50分の１しか発現しなかった。val₁₈で始 まる他の発現構築物（配列番号：７のヌクレオチド213〜1487）は、元の構築物 の約３分の１のレベルで、活性なPAF-AHを生産した。これらの結果より、大腸菌 において生産される組換えPAF-AHの活性に対して、アミノ末端部の延長は重要ま たは必須ではないことが示唆される。 実施例９ 大腸菌内で発現される組換えヒト血漿PAF-AH（IIe₄₂で始まる）を、種々の方 法により単一のクマシーブルー染色SDS-PAGEバンドにまで精製し、そして本来の PAF-AH酵素が示す活性について分析した。 Ａ． 組換えPAF-AHの精製 利用した第１の精製手法は、本来のPAF-AHについて実施例１において記載した 手法と類似している。以下の工程は、４℃にて実施した。PAF-AHを生産している 大腸菌（発現構築物trpAHで形質転換したもの）50mlからのペレットを、実施例 ８に記載のように分解した。10,000gで20分間遠心することにより、固形物を除 去した。緩衝液Ｄ（25mMトリス-塩酸、10mMCHAPS、0.5M NaCl、pH7.5）に平衡化 したブルーセファロースファストフローカラム（2.5cm×４cm、20mlベッド容量 ）に、0.8ml/分で上清を負荷した。カラムは、100mlの緩衝液Ｄで洗浄し、0.5M KSCNを含む緩衝液Ａ 100mlで3.2ml/分にて溶出した。緩衝液Ｄで平衡化した１m lのCuキレーティングセファロースカラムに15mlの活性画分を負荷した。カラム を５mlの緩衝液Ｄで洗浄し、引き続き100mMイミダゾールを含む緩衝液Ｄを５ml 用いて重力の速度で溶出した。PAF-AH活性を有する画分を、SDS-PAGEにより分析 した。 精製の結果は表６に示すとおりであり、ここで単位は１時間当たりのPAF加水 分解のμmol数に等しい。４℃にて得られる精製産物は、43kDaのマーカーの下に 単一の強いバンドとして、直接その上下に染まっている拡散した染色部分ととも に、SDS-PAGE上に現れた。組換え物質は、実施例１に記載の血漿からのPAF-AH調 製物に比較して有意に、より純粋であり、より大きな比活性を呈する。 大気温で同じ精製プロトコルを実施した場合、43kDaのマーカーの下のバンドに 加えて、29kDaのマーカーの下のバンドの群が、分析したゲルスライスのPAF-AH 活性に呼応していた。これらの低分子量のバンドは、酵素活性を保持しているPA F-AHのタンパク質分解断片であるかもしれない。 大気温にて、異なる精製手法も実施した。PAF-AHを生産している大腸菌（発現 構築物pUC trp AHで形質転換したもの）のペレット（100g）を200mlの分解用緩 衝液（25mMトリス、20mM CHAPS、50mM NaCl、１mM EDTA、50μg/mlベンズアミド 、pH7.5）中に再懸濁し、次いで15,000psiにてマイクロフルイダイザー（microf luidizer）を３回通すことによって分解した。14,300×gにて１時間遠心するこ とにより、固形物を除去した。希釈用緩衝液（25mM MES（２-［N-モルフォリノ ］エタンスルホン酸）、10mM CHAPS、１mM EDTA、pH4.9）中に上清を10倍希釈し 、緩衝液Ｅ（25mM MES、10mM CHAPS、１mM EDTA、50mM NaCl、pH5.5）で平衡化 したＳセファロースファストフロ ーカラム（200ml）（陽イオン交換カラム）に25ml/分にて負荷した。１リットル の緩衝液Ｅでカラムを洗浄し、１M NaClを用いて溶出して、次いで溶出液を集め て、0.5mlの２Mトリスベースを用いてpH7.5に調整した50mlの画分とした。PAF-A H活性を含む画分をプールし、0.5M NaClに調整した。そのＳプールを、緩衝液Ｆ （25mMトリス、10mM CHAPS、0.5M NaCl、１mMEDTA、pH7.5）に平衡化したブルー セファロースファストフローカラム（2.5cm×4cm、20ml）に、１ml/分にて負荷 した。 カラムを100mlの緩衝液Ｆで洗浄し、４ml/分にて、３MNaClを含む緩衝液Ｆを1 00ml用いて溶出した。次いで、試料中の内毒素レベルを低減せしめるため、ブル ーセファロースファストフロークロマトグラフィー工程を繰り返した。PAF-AH活 性を含む画分をプールし、緩衝液Ｇ（25mMトリス、pH7.5、0.5M NaCl、0.1％ツ イーン80、１mM EDTA）に対して透析した。 精製の結果を表７に示すが、ここで単位は、１時間当たりのPAF加水分解のμm ol数に等しい。 得られた精製産物は、43kDaのマーカーの下に単一の強いバンドとして、直接そ の上下に染まっている拡散した染色部分とともに、SDS-PAGE上に現れた。組換え 物質は、実施例１に記載の血漿からのPAF-AH調製物に比較すると、有意に、より 純粋であり、より大きな比活性を呈する。 本発明により企図されるさらに別の精製手法は、以下の細胞分解、清澄化（cl arification）、及び第１のカラム工程を伴う。細胞を、分解用緩衝液（25mMト リス、pH7.5、150mM NaCl、１％ツイーン80、２mM EDTA）中に１：１に希釈する 。冷却したマイクロフルイダイザー中に、15,000〜20,000psiにて材料を３回通 すことにより分解を実施し、その結果99％を越える細胞の破壊を引き起こさせる 。分解物は、希釈用緩衝液（25mM卜リス、pH8.5、１mM EDTA）中に１：20に希釈 し、次いで、Ｑ−セファロースビッグビーズクロマトグラフィーメディア（ファ ルマシア社）を詰めて25mMトリス、pH8.5、１mM EDTA、0.015％ツイーン80に平 衡化したカラムに付す。溶出液を、25mM MES、pH5.5、1.2M硫酸アンモニウム、 １mM EDTA中に1：10に希釈し、次いで同じ緩衝液に平衡化したブチルセファロー スクロマトグラフィーメディア（ファルマシア社）に付す。25mM MES、pH5.5、0 .1％ツイーン80、１mM EDTA中にPAF-AH活性が溶出される。 Ｂ． 組換えPAF-AHの活性 PAFアセチルヒドロラーゼの最も顕著な特性は、基質のsn-2位に短い残基を持 つ基質に対する、著しい特異性である。この厳密な特異性により、PAFアセチル ヒドロラーゼがPLA₂の他の型から区別される。かくして、組換えPAF-AHがsn-2位 に長鎖脂肪酸を持つリン脂質を分解するか否かを判定するため、１-パルミトイ ル-２-アラキドノイル-sn-グリセロ-３-ホスフォコリン （アラキドノイルPC）の加水分解を分析した。その理由は、この物質が、よく特 徴付けをなされたPLA₂の型に対する好ましい基質であるからである。本来のPAF- AHを用いた以前の研究から予測されるように、組換えPAF-AHとともにインキュベ ートした場合、このリン脂質は加水分解を受けなかった。追加の実験で、アラキ ドノイルPCを、0〜125μＭの範囲の濃度で標準のPAF加水分解分析に入れ、それ が組換えPAF-AHによるPAFの加水分解を阻害するかどうかを判定した。PAFの濃度 より５倍大きい、最も高い濃度のPAF-AHにおいてさえ、PAF加水分解は何等阻害 されなかった。かくのごとく、組換えPAF-AHは、本来の酵素と同じ基質特異性を 呈し、長鎖の基質は認識しないものである。さらに、組換えPAF-AH酵素は、sn-2 脂肋酸の酸化的切断がなされていた、酸化型リン脂質（グルタロイルPC）を速や かに分解した。本来の血漿PAF-AHは、カルシウム非依存性、及びスルフヒドリル 基を修飾する化合物またはジスルフィイドを開裂せしめる化合物に対する耐性を 含めた、他のホスフォリパーゼとPAF-AHとの区別がなされる種々の他の特性を有 する。 本来の及び組換え血漿PAF-AH酵素のいずれも、DFPに対して感受性を有し、こ のことによりそれらの活性部位の一部がセリンを含んでなることが示唆される。 本来の血漿PAFアセチルヒドロラーゼの希有の特徴は、それが循環しているリ ポタンパク質と強固に会合しており、そしてその触媒効率がリポタンパク質環境 により影響を受けることである。 本発明の組換えPAF-AHをヒト血漿（内在性酵 素活性を除くためにDFPで前処理したもの）とともにインキュベートすると、本 来の活性体と同様に低密度及び高密度リポタンパク質と会合した。低密度リポタ ンパク質の修飾は、粥腫において観察されるコレステロールの沈着に必須である こと、及び脂質の酸化がこの過程における初発因子 であることの実質的な証拠があるので、この結果は重要である。 PAF-AHは、in vitroで酸化条件下に低密度リポタンパク質を修飾から保護し、 そしてそのような役割をin vivoで果たしているかもしれない。したがって、炎 症を消散させるためのみならず、アテローム性動脈硬化プラーク（atherosclero tic plaque）におけるリポタンパク質の酸化の抑制にも、PAF-AHの投与が指示さ れる。 これらの結果はすべて、cDNAクローンsAH 406-3がヒト血漿PAFアセチルヒドロ ラーゼの活性を有するタンパク質をコードしていることを確証するものである。 実施例１０ 他の種々の組換えPAF-AH産物を、大腸菌内で発現させた。産物には、単一のア ミノ酸変異を有するPAF-AH類似体及びPAF-AH断片が含まれていた。 Ａ． PAF-AHアミノ酸置換産物 PAF-AHは、リン脂質であるPAFを加水分解するので、リパーゼである。PAF-AH と他の特徴付けがなされたリパーゼの間に明らかな総体的類似性は存在しない一 方で、構造的に特徴付けがなされたリパーゼの比較において見出される保存され た残基がある。１つのセリンが、活性部位のメンバーとして同定されている。そ のセリンはアスパラギン酸残基及びヒスチジン残基とともに、そのリパーゼの活 性部位を呈する触媒活性３残基群を形成する。３つの残基は、一次タンパク質配 列においては近接していないが、構造的研究により、三次元空間においてはその ３つの残基が近接していることが証明されている。哺乳動物リパーゼの構造の比 較によれば、Asp残基が通常、活性部位のセリンに対して24アミノ酸だけC-末端 にあることが示唆さ れている。加えて、ヒスチジンは、通常、活性部位のセリンに対し、109〜111ア ミノ酸だけC-末端にある。 部位特異的突然変異及びPCRによって、ヒトPAF-AHコード配列の個々のコドン を、アラニン残基をコードするように修飾し、大腸菌内で発現させた。以下の表 ８に示すように、ここで例えば「S108A」の略語は273位のセリン残基がアラニン に変えられていることを示すのであるが、Ser₂₇₃、Asp₂₉₆、またはHis₃₅₁の点突 然変異により完全にPAF-AH活性が損なわれる。活性部位残基間の距離は、PAF-AH （SerからAspは23アミノ酸、SerからHisは78アミノ酸）と他のリパーゼについて は類似している。これらの実験により、Ser₂₇₃、Asp₂₉₆、及びHis₃₅₁が、活性に 対して重要な残基であり、それゆえに触媒活性３残基群の残基の候補となりそう そうであることが立証される。システィンは、ジスルフィド結合を形成すること ができるので、タンパク質の機能的な完全性にしばしば重要である。血漿PAF-AH は５つのシステインを含んでいる。５つのうちのいずれかが酵素活性に重要であ るかを判定するために、各システインを個々にセリンに突然変異せしめ、その結 果得られた突然変異体を大腸菌内で発現させた。以下の表８に示すように、Cys_{2 29} またはCys₂₉₁をセリンに変換することにより、PAF-AH活性はすべては喪失され ないが、有意に喪失されるという結果となった。 よって、これらのシステインは、完全なPAF-AH活性にとって必要であると思わ れる。他の点突然変異は、PAF-AH触媒活性に殆ど、またはまったく効果を有しな かった。表８において、「++++」は、約40〜60U/ml/OD₆₀₀の、野生型PAF-AH活性 を表し、「+++」は、約20〜40U/ml/OD₆₀₀活性を表し、「++」は、約10〜20U/ml/ OD₆₀₀活性を表し、「+」は、１〜10U/ml/OD₆₀₀活性を表し、そして「-」は、＜ １U/ml/OD₆₀₀活性を示す。 Ｂ． PAF-AH断片産物 種々の時間にわたりエキソヌクレアーゼIIIを用いてPAF-AHコード配列の３’ 端を消化し、その後、すべての３つの読み取り枠における終止コドンをコードす るプラスミドDNAに、短くしたコード配列を連結することにより、C-末端欠失体 を調製した。10の異なる欠失体構築物を、DNA配列分析、タンパク質発現、及びP AF-AH活性により特徴付けした。21〜23のC-末端アミノ酸を除去すると、触媒活 性が大幅に低減し、52残基を除去すると完全に活性が損なわれた。図３を参照さ れたい。 PAF-AHのアミノ末端部でも同様の欠失を行った。N-末端で大腸菌チオレドキシ ンとPAF-AHとの融合体を調製して、一貫し て高レベルにPAF-AH活性体を発現させることを容易ならしめた（ラ バリー（La Vallie）ら、Bio/technology、11巻、187〜193頁、（1993））。自然にプロセス されたN-末端（Ile₄₂）から19アミノ酸を除去すると、融合タンパク質における 酵素活性は完全に損なわれた。図３を参照されたい。 実施例１１ ヒト組織におけるヒト血漿PAF-AH mRNAの発現パターンの予備分析を、ノザン ブロットハイブリダイゼーションによって行った。 RNAは、RNAスタット（Stat）60（テル−テスト（Tel-Test）”B”、フレンズ ウッド（Friendswood）、テキサス州）を用いて、ヒト大脳皮質、心臓、腎臓、 胎盤、胸腺及び扁桃腺から調製した。加えて、ホルボールエステルである、ホル ボールミリスチルアセテート（PMA）を用いてマクロファージ様表現型に分化誘 導した、ヒト造血前駆体様細胞系、THP-１（ATCC TIB 202）からRNAを調製した 。組織のRNAならびに、誘導前及び誘導後１〜３日の、前骨髄球細胞THP-１細胞 系から調製したRNAは、1.2％アガロースホルムアルデヒドゲルで電気泳動を行い 、引き続き、ニトロセルロース膜に転写した。全長のヒト血漿PAF-AH cDNAであ るsAH 406-3は、ランダムプライミングにより標識付けを行い、ライブラリース クリーニングについて実施例３に記載したと同様の条件下で膜にハイブリダイズ させた。初期の結果では胸腺、扁桃腺、及びより低い度合いで胎盤のRNA中の1.8 kbのバンドに、PAF-AHプローブがハイブリダイズすることが示唆された。 ヒト血液から単離した単球におけるPAF-AH RNAの発現、及び培養中にそれらが マクロファージへと自発的に分化する間の PAF-AH RNAの発現も調べた。新しい単球では殆ど、またはまったくRNAが検出さ れなかったが、マクロファージへと分化する間に発現が誘導されそして維持され た。分化している細胞の培養培地においてPAF-AH活性の相伴う（concomitant） 蓄積があった。ヒト血漿PAF-AH転写物の発現は、１日目にTHP-1細胞RNAでも観察 されたが、誘導後３日目には観察されなかった。 THP-1細胞は、基底状態ではPAF-AHに対するmRNAを発現していなかった。 実施例１２ in situハイブリダイゼーションによって、ヒト及びマウス組織中のPAF-AHの 発現を調べた。 ヒトの組織は、National Disease Research Interchange及びthe Cooperative Human Tissue Networkから得た。正常マウス脳及び脊髄、ならびにEAEステージ ３マウスの脊髄は、S/JLJマウスから採取した。正常S/JLJマウスの胎児は、受胎 後11〜18日目に採取した。 組織切片を、少量のOCT化合物（マイルス社（Miles，Inc.，）、エルクハート （Elkhart）、インディアナ州）とともに、ティッシュ・テク（Tissue Tek）II クリオモールド（cryomold）（マイルスラボラトリーズ社（Miles Laboratories ，Inc.，）、ナパービル（Naperville）、イリノイ州）内に置いた。それらはク リオモールド内の中心に置き、クリオモールドにOCT化合物を満たし、その後、 ２-メチルブタン（C₂H₅CH（CH₃）₂、アルドリッチケミカルカンパニー社（Aldri chChemical Company，Inc.，）、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）入りの容 器に入れて、そして容器は液体チッ素中に入れた。クリオモールド内の組織及び OCT化合物が一旦凍結すると、切断するまで-80℃にてそのブロックを 保存しておいた。組織ブロックを６μmの厚さに切断し、ベクタボンド（Vectabo nd）（ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories，Inc.，）、バーミン ガム、カリフォルニア州）を被覆したスライドに固着させ、-70℃にて保存し、 そしてそれらを暖めて且つ凝結（condensation）を除去するためにおよそ５分間 50℃に置いて、その後、４℃にて20分間４％パラホルムアルデヒド中で固定して 、70％、95％、100％エタノールで各等級につき１分間づつ４℃にて脱水して、 次いで室温で30分間風乾させた。 70％ホルムアミド／２×SSC中で70℃にて２分間切片を変性させ、２×SSCで２ 度すすぎ、脱水した後、30分間風乾した。in vitro RNA転写³⁵S-UTP（アマーシ ャム社）取り込みによって、PAF-AH遺伝子の内部の１KbのHindIII断片（配列番 号：７のヌクレオチド308〜1323）由来のDNAから作り出された、放射能で標識し た単鎖のmRNAを用いて、組織をin situでハイブリダイズさせた。プローブは250 〜500bpの種々に異なる長さのものを用いた。ハイブリダイゼーションは、50℃ にて一晩（12〜16時間）、³⁵S-標識リボプローブ（6×10⁵cpm/切片）、tRNA（0. 5μg/切片）及びジエチルピロカーボネート（depc）処理した水を、ハイブリダ イゼーション用緩衝液に加え、50％ホルムアミド、0.3M NaCl、20mMトリス、pH7 .5、10％デキストラン硫酸、１×デンハーツ（Denhardt’s）溶液、100mMジチオ スレトール（DTT）及び５mM EDTAという最終濃度となるようにした。 ハイブリダイゼーションの後、４×SSC/10mM DTTで室温にて１時間、その後、 50％ホルムアミド／１×SSC/10mM DTTで60℃にて40分間、２×SSCで室温にて30 分、さらに0.1×SSCで室温にて30分、切片を洗浄した。切片を脱水し、２時間風 乾してコダックNTB２写真用乳濁液（photographic emulsion）で被覆し、２時間 風乾して現像（完全な暗所で４℃にて保管した後）して、ヘ マトキシリン／エオシンで対比染色した。 Ａ． 脳 小脳。 マウス及びヒトのいずれの脳においても、小脳のプルキニエ細胞 層内、ならびに歯状核（小脳内の４つの深核（deep nuclei）の１つ）内の個々 の神経細胞体上に、強いシグナルが見られた。加えて、顆粒球内の個々の細胞及 び灰白質の分子層内にシグナルが見られた。 海馬。 ヒト海馬切片では、神経細胞体らしき、切片全体にわたる個々の 細胞が強いシグナルを示した。 脳幹。 ヒト及びマウスいずれもの脳幹切片上には、灰白質内の個々の細 胞に強いシグナルが認められた。 皮質。 （大）脳、後頭、及び側頭皮質から取ったヒト皮質切片上、なら びにマウス全脳切片上において、皮質全体の個々の細胞が、強いシグナルを示し た。皮質の異なる層における発現パターンに、差異はないように思われた。これ らのinsituハイブリダイゼーションの結果は、ノザンブロッティングによって得 られる（大）脳皮質に対する結果とは異なっている。 ノザンブロッティングの感度に比べてin situハイブリダイゼーションの感度 の方がより高いことからこの差異が生じるようである。 脳下垂体。 ヒト組織切片の下垂体前葉内の個々の分散細胞上に、幾分弱 いシグナルが見られた。 Ｂ． ヒト結腸 健常及びクローン病の結腸のいずれも、切片の粘膜内に存在するリンパ凝集体 （lymphatic aggregation）内にシグナルを呈し、シグナルのレベルはクローン 病患者からの切片の方がわずかに高かった。クローン病患者の結腸では、固有層 にも強いシグナルが見られた。同様に、クローン病患者の虫垂切片におい て高レベルのシグナルが観察され、一方健常人の虫垂ではより低いものの検出可 能なシグナルを呈した。潰瘍性大腸炎患者からの切片は、リンパ凝集体にも、固 有層にも明らかなシグナルを示さなかった。 Ｃ． ヒト扁桃腺及び胸腺 扁桃腺の胚中心の中及び胸腺の中の個々の細胞の分散された群に、強いシグナ ルが見られた。 Ｄ． ヒトリンパ腺 健常な提供者から取ったリンパ腺切片上には強いシグナルが観察されたが、一 方敗血病性ショックの提供者からのリンパ節の切片においては、幾分弱いシグナ ルが観察された。 Ｅ． ヒト小腸 健常人及びクローン病患者の小腸のいずれも、パイエル集腺及び固有層におけ る切片で弱いシグナルを呈し、クローン病患者の組織でのシグナルの方がわずか に高かった。 Ｆ． ヒト脾臓及び肺 脾臓（健常及び脾臓膿瘍切片）または肺（健常及び気腫切片）組織のいずれに おいても、シグナルは観察されなかった。 Ｇ． マウス脊髄 正常及びEAEステージ３の脊髄のいずれにおいても、脊髄の灰白質内に強いシ グナルがあり、その発現はEAEステージ３の脊髄でわずかに高かった。EAEステー ジ３の脊髄において、おそらくは浸潤マクロファージ及び／または他の白血球で あろうが、白質内の細胞及び血管周囲のカフス（cuffs）で、シグナルを示し、 これは正常の脊髄にはなかった。 Ｆ． マウス胎児 11日目のマウス胎児において、第４脳室内の中枢神経系でシグナルが明瞭であ り、脳及び脳幹へと発達する間の胎児の経時 的変化にわたって、そのシグナルは一定のままであった。胎児が成熟するにつれ 、脊髄内の中枢神経系（12日目）、初期皮質及びガッセル半月神経節（14日目） 、及び下垂体（16日目）でシグナルが明瞭となった。脊髄を残す神経の末梢神経 系（14または15日目の初め）で、シグナルが観察され、さらに17日目に、胎児の 頬鬚（whiskers）の周囲に強いシグナルが出現した。14日目には肝臓及び肺に、 腸（15日目の初め）に、ならびに口／喉の後部（posterior portion）（16日目 の初め）においても、発現が見られた。18日目までには、発現パターンは皮質、 後脳（小脳及び脳幹）、脊髄の腰椎領域を残す神経、口／喉の後部、肝臓、腎臓 へと分化していき、肺及び腸においてかなり弱いシグナルが見られた。 Ｇ． 要約 扁桃腺、胸腺、リンパ腺、パイエル集腺、虫垂、及び結腸リンパ凝集体におけ るPAF-AH mRNAの発現は、これらの組織に食細胞性及び抗原作用（antigen-proce ssing）細胞として役立つ組織マクロファージが存在するので、可能性のある優 勢な、PAF-AHのin vivoでの源はマクロファージであるという結論に一致する。 炎症のある組織におけるPAF-AHの発現は、単球由来のマクロファージの役割が 、炎症を消散させることであるという仮説に一致するであろう。PAF-AHはPAF及 び前炎症性（pro-inflammatory）リン脂質を不活性化し、かくしてこれらのメデ ィエーターにより開始せしめられる結果生じる炎症カスケードをダウンレギュレ ートすることが期待されるであろう。 PAFは、脳組織内全体で検出されており、培養しているラット脳顆粒球細胞に よって分泌されている。in vitro及びin vivoでの実験により、PAFは神経組織内 の特異的な受容体に結合し、そしてカルシウムの動員、転写活性化遺伝子のアッ プ レギュレーション、及び神経前駆細胞系であるPC12の分化などの、機能的変化及 び表現型の変化を誘導することが証明されている。これらの観察により、脳内で のPAFについての生理学的役割が示唆され、そしてこれに一致して、海馬の組織 切片培養物とPAF類似体及びPAF拮抗剤を用いた最近の実験により、海馬の長期協 力作用（long term potentiation）における重要な逆行性（retrograde）メッセ ンジャーとしてPAFが関わっていることが示されている。それ故、炎症における その病理学的作用に加えて、PAFは通例の神経シグナルプロセスに関与している ようである。脳内でのPAF-AHの細胞外の発現は、PAFが媒介するシグナル発生の 持続時間及び強さを制御するのに役立つかもしれない。 実施例１３ 組換えヒト血漿PAF-AHに特異的なモノクローナル抗体を、免疫源として大腸菌 が生産したPAF-AHを用いて作った。 マウス＃1342に、0日、19日、及び40日目に組換えPAF-AHを注射した。融合前 の追加抗原刺激のため、免疫源を含むPBSをマウスに注射し、４日後にマウスを 屠殺してその脾臓を無菌的に取り出し、無血清のRPMI、10ml中に入れた。２mM L -グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mlペニシリン、及び100μｇ /mlストレプトマイシン（RPMI）（ギブコ（Gibco）社、カナダ）を補った、無血 清のRPMI 1640の中に沈めた２枚の顕微鏡スライドガラスの氷結させた端部間で その脾臓を粉砕することにより、単一細胞懸濁液を形成させた。細胞懸濁液は、 無菌の70-メッシュ ナイテックス（Nitex）セルストレーナー（ベクトンディッ キンソン（Becton Dickinson）社、パーシパニー（Parsippany）、ニュージャー ジー州）を通して瀘過し、200gで ５分間遠心し、そのペレットを20mlの無血清RPMI中に再懸濁することにより２回 の洗浄を行った。投薬を受けたことがない３匹のBalb/cマウスから取った胸腺細 胞を、同様に調製した。 11％ウシ胎児血清（FBS）（ハイクローンラボラトリーズ社（Hyclone Laborat ories，Inc.，）、ロガン（Logan）、ユタ州）を含むRPMI中で、融合前の３日間 対数増殖期に保ったNS-1ミエローマ細胞を、200gで５分間遠心して、ペレットを 前の段落に記載したように２回洗浄した。 1×10⁸の脾臓細胞を、2.0×10⁷のNS-1細胞と合わせ、遠心して、上清は吸引し た。細胞ペレットを、チューブを軽く叩くことによって動かし（dislodged）、3 7℃のPEG 1500（75mMヘペス、pH8.0中、50％）（ベーリンガーマンハイム（Boeh ringerMannheim）社）１mlを、１分間にわたって攪拌しながら添加し、引き続き 、７分にわたって７mlの無血清RPMIを添加した。追加に８mlのRPMIを添加し、細 胞を200gで10分間遠心した。上清を廃棄した後、ペレットを、15％FBS、100μＭ ヒポキサンチンナトリウム、0.4μＭアミノプテリン、16μＭチミジン（HAT）（ ギブコ社）、25単位/ml IL-６（ベーリンガーマンハイム社）、及び1.5×10⁶胸 腺細胞/mlを含むRPMI 200ml中に再懸濁して、10枚のコーニング（Corning）平底 96ウェル組織培養プレート（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）の中 に播種した。 融合後２、４及び６日に、100μｌの培地を融合プレートのウェルから除去し 、新鮮な培地に置き換えた。８日目に、ELISAによって融合をスクリーニングし 、組換えPAF-AHに結合するマウスIgGの存在について調べた。イムロン（Immulon ）４プレート（ダイナテック（Dynatech）社、ケンブリッジ、マサチューセッツ 州）を、25mMトリス、pH7.5中に希釈した組換えPAF-AH、100ng/ウェルで、37℃ にて２時間被覆した。被覆用 溶液を吸引し、200μｌ/ウェルのブロッキング溶液（CMF-PBS中に希釈した0.5％ フィッシュスキンゼラチン（シグマ（Sigma）社））を添加して、37℃にて30分 間インキュベートした。0.05％ツイーン20を含むPBS（PBST）でプレートを３回 洗浄し、50μｌの培養上清を加えた。37℃にて30分間インキュベートし前記のよ うに洗浄した後、PBSTで1：3500に希釈したホースラディッシュペルオキシダー ゼ複合ヤギ抗マウスIgG（fc）（ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoRes earch）社、ウエストグローブ（West Grove）、ペンシルベニア州）50μｌを添 加した。前記のようにプレートをインキュベートし、PBSTで４回洗浄して、100m Mクエン酸、pH4.5中、１mg/ml o-フェニレンジアミン（シグマ社）及び0.1μｌ/ mlの30％ H₂O₂で構成される基質100μＬを添加した。50μｌの15％H₂SO₄を添加 して、５分で呈色反応を停止した。プレートリーダー（ダイナテック社）でＡ_{49 0} を読み取った。 選択した融合ウェルを、96ウェルプレートの中に希釈し、５日後にコロニー数 ／ウェルを目視的に評価することにより、２回のクローン化を行った。クローン 化したハイブリドーマは、90D1E、90E3A、90E6C、90G11D（ATCC HB 11724）、及 び90F2D（ATCC HB 11725）であった。 ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体は、イソストリップ（Is ostrip）システム（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、インディ アナ州）を用いてイソタイプを判別した（isotyped）。その結果、融合90からの ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体がすべてIgG₁であることが 示された。 実施例１４ ラット足の浮腫モデル（ヘンリークス（Henriques）ら、Br．J．Pharmacol.、 106巻、579〜582頁、（1992））を用いて、急性炎症に対する本発明の組換えPAF -AHのin vivoでの治療効果を評価するために、実験研究を行った。これらの研究 の結果、PAF-AHがPAFで誘発した浮腫を阻止することが立証された。２つの市販 されているPAF拮抗剤と、PAF-AHの有効性とを比較するために、平行して実験を 行った。 Ａ． PAF-AHの調製 PAF-AH発現ベクターpuc trp AHで形質転換した大腸菌を、マイクロフルイダイ ザー内で分解し、固形物は遠心により除いて、細胞上清をS-セファロースカラム （ファルマシア社）に負荷した。50mM NaCl、10mM CHAPS、25mM MES及び１mM ED TA、pH5.5からなる緩衝液でカラムを大規模に洗浄した。緩衝液のNaCl濃度を１M にまで上げることによってPAF-AHを溶出した。 その後、ブルーセファロースカラム（ファルマシア社）を用いたアフィニティ ークロマトグラフィーを、追加の精製工程として用いた。ブルーセファロースカ ラムにPAF-AH調製物を負荷する前に試料を１：２に希釈して、0.5MにまでNaCl濃 度を下げ、さらにpHを7.5に調整した。0.5M NaCl、25mMトリス、10mM CHAPS及び １mM EDTA、pH7.5からなる緩衝液でブルーセファロースカラムを大規模に洗浄し た後、NaCl濃度を3.0Mにまで上げることでPAF-AHを溶出した。 この方法で単離したPAF-AHの純度は、通常、SDS-PAGEにより評価すると95％で あり、活性は5000〜10,000U/mlの範囲内にあった。各PAF-AH調製物に対してなさ れた追加の質のコントロールとして、内毒素レベル及び新鮮に獲得したラット赤 血球への溶血活性の測定が挙げられた。25mMトリス、10mM CHAPS、 0.5M NaCl、pH7.5を含む緩衝液が、酵素の保管用媒体としてだけでなく、投与の ための担体として機能した。実験に用いた投与量は、実験直前に行った酵素活性 分析に基づくものであった。 Ｂ． 浮腫の誘発 180〜200グラム重量の、６〜８週令の雌性ロングエバンス（Long Evans）ラッ ト（チャールスリバー（Charles River）、ウィルミントン（Wilmington）、マ サチューセッツ州）を、すべての実験に用いた。実験操作の前に、動物１匹当た り、１回の投与当たり、およそ2.5mgのケタセット（Ketaset）（フォートドッジ ラボラトリーズ（Fort Dodge Laboratories）社、フォートドッジ、アイオワ州 ）、1.6mgのロンパン（Rompun）（マイルス社、シャウニーミッション（Schawne e Mission）、カンサス州）、0.2mgのエースプロマジン（Ace Promazine）（ア ベコ（Aveco）社、フォートドッジ、アイオワ州）にて、麻酔用ケタセット、ロ ンパン及びエースプロマジンの混合物の皮下投与を用いて動物に麻酔をかけた。 PAFまたはザイモサンのいずれかを以下のように投与することにより、足に浮腫 を誘発させた。PAF（シグマ#P-1402）は、クロロホルム／メタノール（９：１） 中で-20℃にて保管している19.1mMの貯蔵溶液から、各実験用に新たに調製した 。N₂下で乾燥して必要とされる容量にまで減じ、150mM NaCl、10mMトリス、pH7. 5、及び0.25％BSAを含有する緩衝液で1：1000に希釈し、次いで５分間超音波処 理した。動物に、後足の肉跳間へ、PAF（0.96ナノモルの最終投与量）50μｌを 皮下投与し、１時間後、実験によっては２時間後にも、浮腫を評価した。ザイモ サンＡ（シグマ#A-8800）は、PBS中、10mg/mlの懸濁液として、各実験のために 新たに調製した。動物に、後足の肉跳間へ、ザイモサン（500μgの最終投与量） 50μｌを皮下 投与し、２時間後に浮腫を評価した。 PAFまたはザイモサン投与直前に、及びPAFまたはザイモサン刺激後の示された 時点で、足の容量を測定することにより、浮腫を定量化した。浮腫は、ミリリッ トルでの足の容量の増大として表した。水に漬けた足で置き換わる水の容量を計 る、プレチスモメーター（UGOバシレ（Basile）、モデル#7150）を用いて、麻酔 をかけた動物の容量置換測定を行った。ある時点と次の時点とが、足を漬けるこ とで比較できることを保証するために、後足の毛の生え際と踵の境界に消えない インクで印を付けた。この技法を用いて同じ足を繰り返し測定すると、精度が５ ％以内であることが示された。 Ｃ． PAF-AH投与経路及び投与量 PAF-AHは、足の肉趾間へ局所的に、または尾静脈内への静脈内（IV）注射によ り全身に、注射した。局所投与の場合、右後足の肉趾間皮下に送られる100μｌ のPAF-AH（4000〜6000U/ml）をラットに与えた。左足は、100μｌの担体（緩衝 化した塩溶液）を投与することにより、対照として役立った。 PAF-AHの全身投与では、尾静脈内へ静脈内投与した、300μｌの担体中示した単 位数のPAF-AHを、ラットに与えた。対照群は、尾静脈内に静脈内注射で適切な容 量の担体を与えた。 Ｄ． PAF-AHの局所投与 ラット（N=４）に、右足肉趾間へ100μｌのPAF-AH（4000〜6000U/ml）を皮下 注射した。左足には100μｌの担体（緩衝化した塩溶液）を注射した。他の４匹 のラットには担体のみを注射した。すべてのラットに、直ちに足への皮下注射を 介してPAFで刺激し、そして刺激後１時間で足の容量を評価した。 図４において、各処置群について足の容量の増大の平均値（ml）±SEMとして浮 腫が表され、PAFで誘発した足の浮腫が、PAF-AH の局所投与により阻止されることを示す。PAF刺激の前にPAF-AHの局所処置を受 けた群は、対照の注射を行った群に比べて炎症が低減することが示された。担体 で処置した対照群で足の容量の増大が0.63ml±0.14（SEM）であるのに比して、P AF-AH群では0.08ml±0.08（SEM）認められた。担体のみを足に注射した動物では 足の容量の増大を呈しなかったので、足の容量の増大は、PAFの注射の直接的な 結果である。 Ｅ． PAF-AHの静脈内投与 ラット（１群当たりN=４）に、PAF刺激の前15分に、PAF-AH（300μｌ担体中、 2000U）または担体単独を用いて静脈内へ前処置を行った。PAF刺激の後１時間及 び２時間後に、浮腫を評価した。図５において、各処置群について容量の増大の 平均値（ml）±SEMとして浮腫が表され、PAFで誘発した足の浮腫が、刺激後１及 び２時間で、PAF-AHの静脈内投与により阻止されることを示す。静脈内経路によ って2000UのPAF-AHを与えられた群は、２時間の経時変化にわたり炎症が低減す ることが示された。PAF-AH処置群では容量の増大の平均値は0.10ml±0.08（SEM ）であったが、これに対し、担体で処置した対照群では0.56ml±0.11（SEM）で あった。 Ｆ． PAFまたはザイモサンで誘発された浮腫におけるPAF-AHによる保護の比 較 ラット（１群当たりN=４）に、PAF-AH（300μｌ担体中、2000U）または担体単 独を用いて静脈内へ前処置を行った。前処置後15分に、前記群にPAFまたはザイ モサンＡを投与し、それぞれ１時間及び２時間後に、足の容量を評価した。図６ に示すように、ここで各処置群について容量の増大の平均値（ml）±SEMとして 浮腫が表され、PAF-AH（2000U）の全身投与は、PAFで誘発した足の浮腫を低減さ せるのに有効であったが、ザイモサンで誘 発した浮腫は阻止しえなかった。0.08±0.02の容量の増大の平均値がPAF-AH処置 群において認められ、これに対し、対照群については0.49±0.03であった。 Ｇ． PAF-AHによる保護の有効投与量の滴定 ２つの別個の実験において、ラットの群（１群当たりN=３〜４）に、PAF剌激 の前15分に、300μｌの容量で、PAF-AHの連続的な希釈液または担体の対照を用 いて静脈内前処置を行った。両足ともにPAFで刺激を行い（前記の通り）、１時 間後に浮腫を評価した。図７において、各処置群について容量の増大の平均値（ ml）±SEMとして浮腫が表され、PAF-AHの投与量を増大させて注射するにつれて 、ラットにおけるPAFで誘発した浮腫からの保護は増大することが示される。実 験において、静脈内経路により与えられたPAF-AHのID₅₀は、ラット１匹当たり40 Uと80Uとの間であることが見出された。 Ｈ． 投与後の時間の機能としてのPAF-AHのin vivoでの有効性 ２つの別個の実験において、２群のラット（１群当たりN=３〜４）に、PAF- AH（300μｌ担体中、2000U）または担体単独を用いて静脈内へ前処置を行った。 投与後に、PAF-AH投与の後15分から47時間の範囲内の時点で、ラットの群にPAF を投与した。PAF刺激の１時間後に、浮腫を評価した。図８に示すように、ここ で各処置群について容量の増大の平均値（ml）±SEMとして浮腫が表され、2000U のPAF-AHを投与すると、少なくとも24時間、PAFで誘発した浮腫からラットが保 護される。 Ｉ． PAF-AHの薬物動態学 ４匹のラットに、300μｌの容量で静脈内注射により、2000UのPAF-AHを投与し た。種々の時点で血漿を集め、４℃にて保存し、二重mAb捕獲分析を用いたELISA によってPAF-AHの血漿中の濃度を測定した。すなわち、モノクローナル抗体90G1 1D（実 施例１３）を50mM炭酸緩衝液、pH9.6で100ng/mlに希釈し、そして４℃にて一晩 、イムロン４ELISAプレートに固定化した。 0.05％ツイーン20を含有するPBSで大規模に洗浄した後、0.5％フィッシュスキン ゼラチン（シグマ社）を含むPBSで、室温にて１時間、プレートをブロッキング した。洗浄したELISAプレートに、15mM CHAPSを含むPBSで希釈した血清試料をデ ュプリケートで添加し、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、モノクロ ーナル抗体90F２D（実施例１３）のビオチン複合体をPBSで５μｇ/mlの濃度に希 釈してウェルに加え、次いで室温にて１時間インキュベートした。洗浄の後、エ クストラアビジン（ExtraAvidin）（シグマ社）の1：1000希釈液を50μｌウェル に加え、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、基質としてOPDを用いて ウェルを現像し、定量した。その後、標準曲線から酵素活性を計算した。図９で 、データのポイントは平均値±SEMを表すが、180〜200グラムのラットについて ５〜６mlの血漿に基づいて予測された濃度、平均値=374U/ml±58.2に、血漿の酵 素レベルが１時間で到達したことが示される。１時間を越えると、血漿中のレベ ルは徐々に減衰し、24時間で血漿中の濃度の平均値は19.3U/ml±3.4に達するが 、それでもなお、酵素的分析によりおよそ４U/mlであることが見出されている内 在性のラットPAF-AHレベルよりもかなり高い。 Ｊ． PAF-AHの有効性と、PAF拮抗剤の有効性 以下の３つの潜在力を有する抗炎症剤、腹腔内（IP）投与（200μｌ EtOH中 、２mg）されるPAF桔抗剤CV3988（バイオモル（Biomol）#L-103）、腹腔内投与 （200μｌ EtOH中、２mg）されるPAF拮抗剤アルプラゾラム（Alprazolam）（シ グマ#A-8800）、または静脈内投与されるPAF-AH（2000U）、のうちの１つを用い て、ラットの群（１群当たりN=４）を前処置した。対照の ラットには、300μｌ容量の担体を静脈内注射した。PAF拮抗剤はエタノールに溶 解されているので、腹腔内に投与した。CV3988またはアルプラゾラムを注射した ラットは、PAF拮抗剤が循環系の中に入ることを許容するよう、PAF拮抗剤の投与 後30分にPAF刺激を施し、一方PAF-AH及び担体で処置したラットは、酵素の投与 後15分で刺激を施した。確立されたPAF拮抗剤のCV3988及びアルプラゾラムによ り成し遂げられるよりはるかに、PAFで誘発した浮腫が、PAF-AHを注射したラッ トで低減されることが示された。図１０において、各処置群について容量の増大 の平均値（ml）±SEMとして浮腫が表されている。 要約すると、PAF-AHは、in vivoでPAFにより媒介される浮腫を阻止するうえで 有効である。PAF-AHの投与は、局所投与または静脈内注射による全身投与とする ことができる。投与量の研究で、160〜2000U/ラットの範囲の静脈内注射により 、PAFが介する炎症を劇的に低減させることが見出され、また、ID₅₀の量は40〜8 0U/ラットの範囲にあるようである。180〜200グラムのラットに対する血漿容量 に基づく計算により、25〜40U/mlの範囲の血漿中の濃度で、PAFで誘発した浮腫 が阻止されるはずであると予測される。この予測は、予備的な薬物動態学研究に より支持される。2000UのPAF-AH投与量で、少なくとも24時間の間、PAFが媒介す る浮腫の阻止に有効であることが見出された。PAF-AHの投与後24時間で、酵素の 血漿中の濃度はおよそ25U/mlであることが見出された。PAF-AHは、試験を行った ２つの既知のPAF拮抗剤よりもさらに有効に、PAFで誘発した浮腫を阻止すること が見出された。 まとめると、これらの結果により、PAFで誘発した炎症をPAF-AHが有効に阻止 し、PAFが第１のメディエーターである疾患においてPAF-AHは治療的価値を有す るかもしれないことが立証 される。 実施例１５ 本発明の組換えPAF-AHを、第２のin vivoモデルであるPAFで誘発した胸膜炎に おいて試験を行った。PAFが胸膜空間へと導入された際に脈管の漏泄（leakage） を誘発することが、すでに報告されている（ヘンリークら、前出）。雌性ラット （チャールスリバー、180〜200g）に対して、0.9％とした200μｌの１％エバン スブルー染色液とともに、300μｌの組換えPAF-AH（1500μmol/ml／時、実施例 １４に記載の方法で調製した）または等量の対照緩衝液を、尾静脈に注射した。 15分後に、ラットの胸膜空間にPAF（2.0nmol）の100μｌを注射した。PAF刺激の １時間後にラットを屠殺し、ヘパリン処理したリン酸緩衝化生理食塩水３mlで胸 腔を洗浄することで、胸膜液を回収した。脈管の漏泄の程度を、620nmの吸光度 で定量した胸膜空間でのエバンスブルー染色液量によって決定した。PAF-AHで前 処置されたラットが、対照動物よりも脈管の漏泄の程度がかなり小さい（80％以 上の炎症の低減が認められた）ことが判明した。 前記の結果は、本発明の組換えPAF-AH酵素の、胸膜炎に罹患した被検者の治療 効果を支持するものである。 実施例１６ 本発明の組換えPAF-AHは、抗原誘発した好酸球モデルでの有効性についても試 験を行った。気道での好酸球の蓄積は、喘息、鼻炎及び湿疹を引き起こす後期免 疫応答の特徴である。BALB/cマウス（チャールスリバー）は、２週間間隔で行っ た、４mgの水酸化アルミニウム（イムジェクト・アルム （Imject alum）、ピアスラボラトリーズ（Pierce Laboratories）社、ロックフ ォード、イリノイ州）中に１μｇのオボアルブミン（OVA）で構成される２度の 腹腔内注射によって感作させた。 ２回目の免疫処置から14日後に、感作したマウスを、エアロゾル化したOVAま たは対照として生理食塩水のいずれかで刺激を施した。 刺激を施す前に、各群に４匹ずつなるように、マウスを任意に４つの群に分け た。１及び３群のマウスには、25mMトリス、0.5M NaCl、１mM EDTA及び0.1％ ツイーン80で構成される対照緩衝液140μｌを腹腔内注射により前処置を行った 。２及び４群のマウスは、750単位（140μｌのPAF-AH緩衝液を投与した場合の活 性は、5500単位/mlであった）のPAF-AHで前処置した。PAF-AHまたは緩衝液を投 与して30分後、１及び２群のマウスを以下に記載するようにエアロゾル化したPB Sに曝し、一方で、３及び４群のマウスはエアロゾル化したOVAに曝した。 24時間後に、140μｌの緩衝液（１及び３群）または140μｌ緩衝液中750単位 のPAF-AH（２及び４群）のいずれかを静脈内に注射することにより、２回目の処 置を行った。 気管での好酸球の浸潤は、感作したマウスをエアロゾル化したOVAに曝すこと で誘発された。感作したマウスを、円錐形の50ml遠心用チューブ（コーニング社 ）の中に入れ、ネブライザー（モデル646、デビルビス社（DeVilbiss Corp.，） 、サマーセット、ペンシルベニア州）を用いて、20分間、0.9％の生理食塩水に 溶解してエアロゾル化したOVA（50mg/ml）の吸入さ強いた。 対照マウスには、ネブライザーにて0.9％の生理食塩水を用いた以外は、上記 と同様の方法にて処置した。エアロゾル化したOVAまたは生理食塩水に曝してか ら48時間後に、マウスを屠殺し、気管を摘出した。各群から摘出した気管を、OC Tに埋設 し、組織を切断するまで−70℃にて保存した。 気管の好酸球浸潤を評価するために、マウスの４群からの組織切片を、ルナ溶 液とヘマトキシリン−エオシン溶液、またはペルオキシダーゼのいずれかで染色 した。６μｍの厚みの組織切片12個を、マウスの各群から切り出し、順次番号付 けを行った。奇数番号が付与された切片を、ルナ溶液で以下のように染色した。 切片を、室温にて５分間、ホルマルアルコール中で固定し、室温にて２分間、水 道水を３回交換して洗浄し、次いで、室温にて１分間、蒸留水を２回交換して洗 浄した。組織切片を、ルナ染色液（ルナ染色液は、90mlのヴァイゲルトの鉄ヘマ トキシリン及び10mlの１％ビーブリッヒスカーレットからなる）で室温にて５分 間染色した。染色した切片スライドを、１％酸性アルコールに６回浸し、室温に て１分間、水道水で洗浄し、0.5％炭酸リチウム溶液に５回浸し、そして、室温 にて２分間、流水の水道水で洗浄した。切片スライドを、70％、95％、100％の エタノールを用いてそれぞれ、室温にて１分間で脱水させ、室温にて１分間、キ シレンを２回交換して洗浄し、そして、サイトシール（Cytoseal）60上に置いた 。 ペルオキシダーゼによる染色のために、偶数番号の切片を、４℃のアセトンに て10分間で固定し、そして、風乾させた。200μｌのDAB溶液を各切片に添加し、 室温にて５分間放置した。切片スライドを、室温にて５分間、水道水で洗浄し、 そして、２滴の１％オスミウム酸を各切片に対して３〜５秒間作用させた。切片 スライドを、室温にて５分間、水道水で洗浄し、そして、25℃の室温にて、メイ アーズのヘマトキシリンで対比染色した。切片スライドを、流水の水道水で５分 間すすぎ、70％、95％、100％のエタノールでそれぞれ、室温にて１分間づつで 脱水させた。切片スライドを、室温にて１分間、キシレ ンを２回交換して洗浄し、そして、サイトシール60上に載置した。 気管の粘膜下組織中の好酸球の数を評価した。１及び２群のマウスの気管には 、粘膜下組織全体にわたって分散した好酸球はほとんど見出されなかった。緩衝 液で前処置され、霧状のOVAに曝された、３群のマウスの気管では、予期される とおり、粘膜下組織全体にわたり、多数の好酸球が認められた。これとは対照的 に、PAF-AHで前処置され、霧状のOVAに曝された、４群のマウスの気管では、１ 及び２群の２つの対照群で見られる結果に匹敵して、粘膜下組織に好酸球がほと んど見られなかった。 このように、喘息、鼻炎及び湿疹において生じるような、気道での好酸球の蓄 積を含む後期免疫応答を呈する被検者を、PAF-AHで治療することが指示されるの である。 実施例１７ 日本人の約４％は、血漿中に、低量または検出不可能なレベルのPAF-AH活性を 有している。この欠損は、常染色体で劣性に起こる欠損を遺伝的に引き継いだと 思われる喘息小児患者の呼吸症状と厳密に相関する（ミワら、J．Clin．Invest. 、82巻、1983〜1991頁、（1988））。 酵素は存在するが不活性な状態、もしくはPAF-AHの合成不能の状態からこの欠 損が生じるのかを決定するために、PAF-AH活性が欠損している複数の患者からの 血漿を、PAF-AH活性について（形質変換体に関する実施例１０に記載した方法に よって）ならびに以下のサンドウィッチELISAにおいてモノクローナル抗体90G11 D及び90F2D（実施例１３）を用いてPAF-AHの存在についての双方に関して分析を した。イムロン４平底プレート （ダイナテック社、チャンティリー、ヴァージニア州）を、100ng/ウェルのモノ クローナル抗体90G11Dで被覆し、一晩置いた。このプレートを、CMF-PBSに希釈 した0.5％フィシュスキンゼラチン（シグマ社）で室温にて１時間ブロックし、 ３回洗浄した。患者の血漿を、15mM CHAPSを含むPBSで希釈し、プレートの各ウ ェルに添加（50μｌ/ウェル）した。このプレートを、室温にて１時間インキュ ベートし、４回洗浄した。常法によってビオチン化し、PBSTに希釈した５μｇ/m lのモノクローナル抗体90F2Dの50μｌを各ウェルに添加し、プレートを、室温に て１時間インキュベートし、そして３回洗浄した。CMF-PBSTに1/1000に希釈した エキストラアビジン（シグマ社）50μｌを引き続き各ウェルに添加し、現像前に 、室温にて１時間インキュベートした。 PAF-AH活性と酵素レベルとの間の直接的な相関が観察された。患者の血清中の 活性の欠如は、検出可能な酵素の欠如として反映されていた。同様に、正常な活 性の半分の活性を有する血漿試料は、正常レベルのPAF-AH活性の半分の活性を有 していた。これらの観察結果より、PAF-AH活性の欠損が、酵素合成の不能または モノクローナル抗体を認識しない不活性酵素によるものであることが示唆された 。 さらなる実験により、この欠損がヒト血漿PAF-AH遺伝子における遺伝的損傷に よるものであることが明らかとなった。PAF-AH欠損の個体からのゲノムDNAを単 離し、PAF-AH遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCR反応の鋳型として使用し た。コード配列エキソンのそれぞれをまず増幅し、１つずつ配列決定した。エキ ソン９での一つのヌクレオチドの変更（配列番号：７の996位のＧからＴへ）が 観察された。このヌクレオチドの変更の結果、PAF-AH配列の279位のフェニルア ラニンからバリ ンへのアミノ酸置換（V279F）がもたらされた。同じ点突然変異を有することが 見出されたさらに11人のPAF-AH欠損患者個体からのゲノムDNAより、エキソン９ を増幅した。 この突然変異が酵素を失活させるか否かを試験するために、この突然変異を含 む大腸菌発現構築物を、実施例１０に記載したと同様の方法により作製した。大 腸菌内に導入すると、発現構築物はPAF-AH活性を示さなかったが、この突然変異 を伴わない対照発現構築物では活性が十分に認められた。このアミノ酸置換はお そらく、観察された活性の欠損を引き起こし、本発明のPAF-AH抗体との免疫反応 性を欠如せしめる、構造的な修飾をもたらすものであると思われる。 よって、本発明のPAF-AH特異抗体は、血清中のPAF-AHの異常なレベル（正常レ ベルは、約１〜５単位/mlである）を検出し、PAF-AHを用いた病理学的状態の治 療の改善のための診断法において使用することができる。さらに、PAF-AH遺伝子 の遺伝的損傷の同定は、日本人患者に認められるPAF-AH欠損の遺伝子スクリーニ ングを可能とする。この突然変異により、制限エンドヌクレアーゼ部位（MaeII ）が獲得されるので、活性体対立遺伝子と変異体対立遺伝子とを識別する、制限 断片長多型性（RFLP）分析の簡単な方法を可能なものとする。レウィン（Lewin ）、Genes V、オックスフォードユニバーシティープレス（Oxford University P ress）ニューヨーク、ニューヨーク州（1994）の第136〜141頁を参照されたい。 12人のPAF-AH欠損患者のゲノムDNAのスクリーニングをMaeIIによるDNAの消化 、サザンブロッティング、及びエキソン９プローブ（配列番号：17のヌクレオチ ド1〜396）を用いたハイブリダイゼーションによって行った。すべての患者にお いて、突然変異対立遺伝子と一致するRFLPが認められた。 本発明は特定の実施態様に関して説明してきたが、当業者であれば様々な修正 や変更を施せるものと考えられる。よって、添付の請求の範囲に明記された限定 のみが、本発明に付加されるべきである。 配列表 （1） 一般情報 （i）出願人：イコス コーポレーション （ii）発明の名称：血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ （iii）配列の数：26 （iv）連絡先住所： （A）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー アンド ボーラン （B）番地：6300シアーズ タワー、233サウス ワッカー ドライブ （C）都市名：シカゴ （D）州名：イリノイ （E）国名：米国 （F）郵便番号：60606 （v）コンピューター読取形式： （A）媒体：フロッピーディスク （B）コンピューター：IBM PC互換機 （C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：パテント イン リリース#1.0、バージョン#1.25 （vi）現出願データ： （A）出願番号： （B）出願日： （C）分類： （vii）先行出願データ： （A）出願番号：US 08/133,803 （B）出願日：6-10月-1993 （viii）弁護士／弁理士情報： （A）氏名：ノーランド、グレタ イー （B）登録番号：35,302 （C）参照／事件番号：32205 （ix）通信情報： （A）電話：（312）474-6300 （B）ファックス：（312）474-0448 （C）テレックス：25-3658 （2） 配列番号：１の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：17アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号：１ （2） 配列番号：２の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：16アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号：２ （2） 配列番号：３の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：11アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号：３ （2） 配列番号：４の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：32塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ix）配列の特徴： （A）配列を表す記号：Modified-site （B）存在位置：グループ（13、21、27） （C）他の情報：これら各部位でのヌクレオチドは、イソシンである。 （xi）配列：配列番号：４ （2） 配列番号：５の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：30塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （xi）配列：配列番号：５ （2） 配列番号：６の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：32塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （xi）配列：配列番号：６ （2） 配列番号：７の情報 （i）配列特徴： （A）配列の長さ：1520塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：cDNA （ix）配列の特徴： （A）配列を表す記号：CDS （B）存在位置：162..1484 （xi）配列：配列番号：７ （2） 配列番号：８の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：441アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号：８ （2） 配列番号：９の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：504塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （A）配列を表す記号：exon （B）存在位置：185..311 （xi）配列：配列番号：９ （2） 配列番号：10の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：417塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （A）配列を表す記号：exon （B）存在位置：145..287 （xi）配列：配列番号：10 （2） 配列番号：11の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：498塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （A）配列を表す記号：exon （B）存在位置：251..372 （xi）配列：配列番号：11 （2） 配列番号：12の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：433塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （A）配列を表す記号：exon （B）存在位置：130..274 （xi）配列：配列番号：12 （2） 配列番号：13の情報 （i） 配列特徴： （A）配列の長さ：486塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/06 9/18 8827−4Ｂ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/573 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ ＡＣＤ //(Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 グレイ， パトリック アメリカ合衆国 98112 ワシントン シ アトル 38ス プレイス イースト 2244 (72)発明者 レ トロン， ハイ アメリカ合衆国 98107 ワシントン シ アトル エヌ．ダブリュ． ５ス アベニ ュー 6241 (72)発明者 トエルカー， ラリー， ダブリュ. アメリカ合衆国 98021 ワシントン ボ ウゼル エス．ダブリュ． 216ス スト リート 404 (72)発明者 ワイルダー， シェリル， エル. アメリカ合衆国 98004 ワシントン ブ レビュー エヌ．イー． 98ス アベニュ ー 2526

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血漿PAF-AHをコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド。 ２．請求の範囲第１項記載のDNA。 ３．ｃDNAまたはその生物学的複製物である、請求の範囲第２項記載のDNA。 ４．配列番号：７に示される配列を有し、ヒト血漿PAF-AHをコードする、請求 の範囲第２項記載のDNA。 ５．配列番号：８に示されるヒトPAF-AHアミノ酸配列をコードする、請求の範 囲第２項記載のDNA。 ６．配列番号：８の42〜441のアミノ酸をコードする、請求の範囲第２項記載 のDNA。 ７．ゲノムDNAまたはその生物学的複製物である、請求の範囲第２項記載のDNA 。 ８．請求の範囲第７項記載のゲノムDNAのRNA転写物。 ９．全体的にまたは部分的に、化学的に合成されたDNAまたはその生物学的複 製物である、請求の範囲第２項記載のDNA。 １０．（a）配列番号：７に示される配列を有するDNA、 （b）（a）のDNAの非コード鎖に厳密な条件下でハイブリダイズするDNA、 及び （c）余分な遺伝コードを伴わなければ、（a）または（b）のDNA配列の非 コード鎖に厳密な条件下でハイブリダイズすると考えられるDNA からなる群より選択される、PAF-AHをコードする全長のDNA。 １１．配列番号：２１に示される配列を有し、ネズミ血漿PAF-AHをコードする、 請求の範囲第２項記載のDNA。 １２．配列番号：２２に示される配列を有し、ウサギ血漿PAF-AHをコードする、 請求の範囲第２項記載のDNA。 １３．請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスポリヌ クレオチド。 １４．内在性発現制御DNA配列をさらに含んでなる、請求の範囲第７項記載のDNA 。 １５．請求の範囲第２項記載のDNAを含んでなる、DNAベクター。 １６．前記DNAが、発現制御DNA配列に作動可能に連結される、請求の範囲第１５ 項記載のベクター。 １７．請求の範囲第２項記載のDNAで安定に形質転換またはトランスフェクトさ れた宿主細胞であって、PAF-AHまたはPAF-AHに特異的な酵素活性もしくは免疫学 的特性を有するPAF-AHの変異体を該宿主細胞内で発現することを許容する方法で 形質転換ま たはトランスフェクトされた宿主細胞。 １８．PAF-AHの製造法であって、該方法が、請求の範囲第１７項記載の宿主細胞 を好適な栄養培地中で生育し、さらに該細胞またはその生育培地からPAF-AHまた はその変異体を単離することを含んでなる方法。 １９．本質的に、配列番号：８に示されるヒト血漿PAF-AHのアミノ酸配列からな る、精製され単離されたPAF-AHポリペプチド。 ２０．本質的に、配列番号：８のアミノ酸42〜441からなる、精製され単離され たPAF-AHポリペプチド。 ２１．PAF-AHに特異的なモノクローナル抗体。 ２２．ハイブリドーマ90G11D（ATCC HB 11724）により生産されるモノクローナ ル抗体。 ２３．．ハイブリドーマ90F2D（ATCC HB 11725）により生産されるモノクローナ ル抗体。 ２４．請求の範囲第２１項記載のモノクローナル抗体を生産する、ハイブリドー マ細胞系。 ２５．ハイブリドーマ細胞系90G11D（ATCC HB 11724）。 ２６．ハイブリドーマ細胞系90F2D（ATCC HB 11725）。 ２７．請求の範囲第２１項記載のヒト化抗体物質。 ２８．血漿からPAF-AH酵素を精製する方法であって、該方法が、 （a）低密度リポタンパク質粒子を単離する、 （b）該低密度タンパク質粒子を10mM CHAPSを含む緩衝液中にて可溶化し、第 １のPAF-AH酵素溶液を作製する、 （c）該第１のPAF-AH酵素溶液をDEAE陰イオン交換カラムに付す、 （d）１mM CHAPSを含むおよそpH7.5の緩衝液を用いて、該DEAE陰イオン交換カ ラムを洗浄する、 （e）0〜0.5M NaClの濃度勾配を含んでなるおよそpH7.5の緩衝液を用いて、該 DEAE陰イオン交換カラムからPAF-AH酵素を画分に溶出する、 （f）該DEAE陰イオン交換カラムから溶出した、PAF-AH酵素活性を有する画分 をプールする、 （g）該DEAE陰イオン交換カラムからの、該プールした活性画分を、10mM CHAP Sに調整して、第２のPAF-AH酵素溶液を作製する、 （h）ブルーダイリガンドアフィニティーカラムに、該第２のPAF-AH酵素溶液 を付す、 （i）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムから、10mM CHAPS及びカオ トロピック塩を含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素を溶出する、 （j）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムからの溶出液を、Cuリガン ドアフィニティーカラムに付す、 （k）該Cuリガンドアフィニティーカラムから、10mM CHAPS及びイミダゾール を含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素を溶出する、 （l）該Cuリガンドアフィニティーカラムからの溶出液をSDS-PAGEに供する、 及び、 （m）SDS-ポリアクリルアミドゲルから、およそ44kDaのPAF- AH酵素を単離する 工程を含んでなる方法。 ２９．工程（b）の緩衝液が25mMトリス-塩酸、10mM CHAPS、pH7.5であり、工 程（d）の緩衝液が25mMトリス-塩酸、１mMCHAPSであり、工程（h）のカラムがブ ルーセファロースファストフローカラムであり、工程（i）の緩衝液が25mMトリ ス-塩酸、10mM CHAPS、0.5M KSCN、pH7.5であり、工程（j）のカラムがCuキレー ティングセファロースカラムであり、そして工程（k）の緩衝液が25mMトリス-塩 酸、10mM CHAPS、0.5M NaCl、50mMイミダゾール、pH8.0である、請求の範囲第２ ８項記載の方法。 ３０．大腸菌により生産される活性なPAF-AH酵素を精製する方法であって、該 方法が、 （a）PAF-AH酵素を生産する分解した大腸菌から遠心上清を調製する、 （b）ブルーダイリガンドアフィニティーカラムに、該遠心上清を付す、 （c）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムから、10mMCHAPS及びカオト ロピック塩を含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素を溶出する、 （d）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムからの該溶出液を、Cuリガ ンドアフィニティーカラムに付す、及び、 （e）該Cuリガンドアフィニティーカラムから、10mM CHAPS及びイミダゾール を含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素を溶出する、工程を含んでなる方法。 ３１．工程（b）のカラムがブルーセファロースファストフローカ ラムであり、工程（c）の緩衝液が25mMトリス-塩酸、10mM CHAPS、0.5M KSCN、p H7.5であり、工程（d）のカラムがCuキレーティングセファロースカラムであり 、そして工程（e）の緩衝液が25mMトリス-塩酸、10mM CHAPS、0.5M NaCl、100mM イミダゾール、pH7.5である、請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２．大腸菌により生産される活性なPAF-AH酵素を精製する方法であって、該 方法が、 （a）PAF-AH酵素を生産する分解した大腸菌から遠心上清を調製する、 （b）該遠心上清を、10mM CHAPSを含む低pH緩衝液中で希釈する、 （c）該希釈された遠心上清を、約pH7.5にて平衡化した陽イオン交換カラムに 付す、 （d）１Mの塩を用いて、該陽イオン交換カラムからPAF-AH酵素を溶出する、 （e）該陽イオン交換カラムカラムからの該溶出液のpHを上げ、そして該溶出 液の塩濃度を約0.5Mの塩に調整する、 （f）ブルーダイリガンドアフィニティーカラムに、該陽イオン交換カラムか らの該調整された溶出液を付す、 （g）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムから、約２M〜約３Mの塩を 含む緩衝液を用いてPAF-AH酵素を溶出する、及び、 （h）該ブルーダイリガンドアフィニティーカラムからの該溶出液を、約0.1％ ツイーンを含む緩衝液を用いて透析する 工程を含んでなる方法。 ３３．工程（b）の緩衝液が25mM MES、10mM CHAPS、１mM EDTA、pH4.9であり 、工程（c）のカラムが、25mM MES、10mM CHAPS、 １mM EDTA、50mM NaCl、pH5.5で平衡化したＳセファロースカラムであり、工程 （d）において１mM NaClを用いてPAF-AHが溶出され、工程（e）における溶出液 のpHが２Mトリスベースを用いてpH7.5に調整され、工程（f）におけるカラムが セファロースカラムであり、工程（g）における緩衝液が25mMトリス、10mM CHAP S、３M NaCl、１mM EDTA、pH7.5であり、また、工程（h）における緩衝液が25mM トリス、0.5M NaCl、0.1％ツイーン80、pH7.5である、請求の範囲第３１項記載 の方法。 ３４．血清中のPAF-AH酵素の検出法であって、血清をPAF-AHに特異的な、１ま たは複数のモノクローナル抗体に接触せしめる工程及び、該１または複数の抗体 により結合されたPAF-AH酵素の量を定量する工程を含んでなる方法。 ３５．PAF-AHが媒介する病理学的状態が疑われるかまたは罹患している哺乳動 物の治療法であって、該哺乳動物中で内在性PAF-AH活性を補足し、病因となる量 のPAFを不活性化せしめるに足る量のPAF-AHを、該哺乳動物に投与することを含 んでなる方法。 ３６．胸膜炎が疑われるかまたは罹患している哺乳動物の治療法であって、該 哺乳動物の内在性PAF-AH活性を補足し、病因となる量のPAFを不活性化せしめる に足る量のPAF-AHを、該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。 ３７．喘息が疑われるかまたは罹患している哺乳動物の治療法であって、該哺 乳動物の内在性PAF-AH活性を補足し、病因となる量のPAFを不活性化せしめるに 足る量のPAF-AHを、該哺乳動物 に投与することを含んでなる方法。 ３８．鼻炎が疑われるかまたは罹患している哺乳動物の治療法であって、該哺 乳動物中で内在性PAF-AH活性を補足し、病因となる量のPAFを不活性化せしめる に足る量のPAF-AHを、該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。 ３９．湿疹が疑われるかまたは罹患している哺乳動物の治療法であって、該哺 乳動物中で内在性PAF-AH活性を補足し、病因となる量のPAFを不活性化せしめる に足る量のPAF-AHを、該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。 ４０．ヒト血漿PAF-AH酵素のアミノ酸279におけるフェニルアラニン残基のバ リン残基への置換に起因する、ヒトPAF-AH遺伝子における遺伝的傷害の検出法で あって、野生型と変異型対立遺伝子を区別するために、制限断片長多型性分析を 用いることを含んでなる方法。