JPH08504748A

JPH08504748A - Ｎ−保護アミノ酸チオヒダントインの形成方法

Info

Publication number: JPH08504748A
Application number: JP6504539A
Authority: JP
Inventors: ボイド，ビクトリア，エル; ボッチニ，メリリサ; グガ，ピオトル，ジェイ; ゾン，ゲロルド
Original assignee: アプライドバイオシステムズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-07-15
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 1996-05-21
Also published as: US5304497A; WO1994002468A1; EP0650478A1

Abstract

(57)【要約】Ｎ−保護アミノ酸（Ｉ）から式（II）のチオヒダントインを形成する方法が記載されている。この方法はアミノ酸の末端カルボキシル基を活性化するためにウロニウム（III）またはホスホニウム（IV）化合物、および活性化したアミノ酸をチオヒダントインに環化するためにチオシアネート試薬を用いる。Ｃ−末端ペプチド配列決定に使用するため、チオヒダントインをそのＮ−保護基から開裂することができる。特に好ましいウロニウム化合物は２−クロロウロニウムの塩を含む。好適なチオシアネート試薬はトリメチルシリルイソチオシアネートおよび、ＫＳＣＮの１８−クラウン−６付加物のようなメタロチオシアネートのクラウンエーテル付加物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】Ｎ−保護アミノ酸チオヒダントインの形成方法１．発明の技術分野本発明はアミノ酸チオヒダントインを合成する方法に関する。２．引用文献バンワースダブリュ、Tetrahedron Letters，32，1157-1160（1991）。ボイドら、米国特許第5,185,266号。ボイドら、米国特許第5,051,368号。ボイドヴィ、Tetrahedron Letters，31，3849-3852（1990）。ドウトゴルヴィ、Synthesis，572-574（1984）。フレロトイー、Tetrahedron Letters，47，259-270（1991）。ゴケルジイ、Synthesis，168-184（1976）。ホーク、米国特許第4,837,165号。ホークら、米国特許第5,049,507号。ホークディエイチら、Anal Biochem、166:298（1987）。イングリスエイエスら、プロテインシーケンス分析方法（ウィットマン −リーボルドビイ著）スプリンガーベルラグ、137-144（1988）。クノールアール、Tetrahedron Letters，30，1927-1930（1989）。メウスジェイら、Biochemistry，21:3750（1982）。ミラー、米国特許第4,935,494号。ミラーシイジイら、プロテインシーケンス分析方法（ウィットマン・リーボルドビイ著）スプリンガーベルラグ、145-151（1988）。ニューマン、エイエイ著、チオシアン酸とその誘導体の化学と生化学（アカデミックプレス、1975）中、８ページ。パーハムら、Biochem Biophys Res Comm，80（1）:1（1978）。リードエムら、Chemical 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6）］によって1926年に提案された。この初期の方法の多くの改良がそれ以来提案された（参照、例えば、スターク；ボイドら、米国特許第5,051,368号；ホーク、1987；ホーク、米国特許第4,837,165号；ホークら、米国特許第5,049,507号；イングリス；ミラー、1988；およびミラー、米国特許第4,935,494号）。２−チオヒダントインを生成するためのスタークの化学は多くの場合、収率が低く、誘導化された生成物となった（即ち、アセチル化と脱水）。またホークら（米国特許第5,049,507号）はアシルイソチオシアネート部分を使用してチオヒダントインを生成するペプチジル−ＴＨの形成方法を提案した。しかしながら、この方法は末端カルボキシ基のアセチル化（スターク）、例えばペプチドのアミノ酸側鎖の分解に一般に関連するものと同じ制限をもつ。チオヒダントインを基礎とした方法を改良するための最近の努力はＣ−末端活性化エステルを形成する効率を改善することに向けられている。例えば、ボイドら（米国特許第5,051,368号）はウッドワード試薬Ｋによって生じるようなＮ− 置換ケテンイミンを用いて活性化エステルを生成するＣ−末端チオヒダントインを形成する方法を提案した。４．発明の概要本発明の目的はＮ−保護アミノ酸を対応するアミノ酸チオヒダントインに変換する改良された方法を提供することにある。この方法はＮ−保護アミノ酸とハロウロニウム、偽ハロウロニウム、トリフレートウロニウム、またはスルホニルウロニウム化合物と、またはハロホスホニウム、偽ハロホスホニウム、トシルホスホニウム、トリフレートホスホニウム、またはスルホニルホスホニウム化合物と、およびアミノ酸チオヒダントインを形成するために有効な条件下にチオシアネート試薬と反応させることを含む。好適例では、アミノ酸とウロニウムまたはホスホニウム化合物の反応はチオシアネート試薬の存在で行われる。種々の好適例では、ウロニウム化合物は1,1,3, 3−テトラ置換２−ハロウロニウム塩、例えば、1,1,3,3−テトラメチル２−クロロウロニウムクロライド、4,5−ジヒドロ−1,3−ジメチル２−クロロイミダゾリウムクロライド、またはビスピロリジノクロロウロニウムテトラフルオロボレートであり、そしてホスホニウム化合物はＰ−ハロホスホニウム塩、例えば通常はトリス（ピロリジノ）−ブロモホスホニウムヘキサフルオロホスフェートのようなトリス（ジアルキルアミノ）ホスホニウム塩である。チオシアネート試薬は、シリルイソチオシアネート、例えばトリメチルシリルイソチオシアネート、ピリジニウムチオシアネート、またはマクロ環状エーテルまたはメタロチオシアネートの付加物、例えば一価のカチオンのチオシアネート塩の18−クラウン−６付加物であることができる。ひとつの局面では、本方法はＣ−末端アミノ酸配列決定のために使用される。本方法は、Ｃ−末端アミノ酸残基のＴＨ形成後、上記方法によれば、以下に述べるように、形成したアミノ酸ＴＨを、残りのペプチドから脱保護アミノ酸チオヒダントインを放出するために有効な開裂試薬と接触させる：そして脱保護アミノ酸チオヒダントインを単離して同定し、ポリペプチドの開裂したＣ末端残基を同定することを含む。本発明はさらに、Ｎ−保護アミノ酸残基からチオヒダントインを形成する方法において、カルボキシル活性化剤と、そしてチオシアネートと残基を反応する工程を含み、チオシアネートとして、メタロチオシアネートのクラウンエーテル付加物を用いて改良する。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は本発明の以下の詳細な説明を添付する図面と組み合わせて読むときにさらに完全に明らかになるだろう。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｃは、ここに画定されるような、Ｎ−保護アミノ酸（１Ａ）、脱保護アミノ酸チオヒダントイン（１Ｂ）、および脱保護アミノ酸チオヒダントイン（１Ｃ）の構造を示す；図２は本発明の反応式を示し、式中、ウロニウム化合物（IV）はＮ−保護アミノ酸（Ｉ）と反応し、提案された活性化エステル中間体を経てＮ−保護チオヒダントイン（II）を与える；図３は本発明の反応式を示し、式中ホスホニウム（VII）化合物がＮ−保護アミノ酸（Ｉ）、例えばポリペプチドと反応し、Ｎ−保護アミノ酸チオヒダントイン（II）を生成する；図４Ａ−４Ｃは例示的な18−クラウン−６エーテル（４Ａおよび４Ｂ）およびＫＳＣＮと18−クラウン−６エーテルの錯体を示す；そして図５Ａ−５Ｅは本発明の方法がＣ−末端ペプチド配列方法においてどのように用いることができるかを示す。発明の詳細な説明Ａ．定義ここで用いられるように、次の用語は指示された意味をもつ： “Ｎ−保護アミノ酸”は、ポリペプチドを含み、そのＮ−末端に結合した保護基を有するアミノ酸のことである。よく知られているように、代表的な保護基は Fmoc、Boc、アシル、ポリペプチジル基、および共有結合により結合した表面を含む。ここで言及されるように、Ｎ−保護アミノ酸は固相支持体に、Ｎ−末端アミノ基としてまたは側鎖によって、例えばリジン残基のε−アミノ基によって、任意に結合することができる。Ｎ−保護アミノ酸のための構造式は図１Ａに示され、丸で囲んだＰは保護基を示す。側鎖がＲによって示されるアミノ酸は、アミン、酸、スルフヒドリル、またはアミノ酸側鎖の水酸基にて追加の保護基をもつことができる。 “ペプチド”または“ポリペプチド”は天然または変性タンパク質を含むペプチドのことである。図１Ａでは、保護アミノ酸は、保護基（丸で囲んだＰ）がアミド結合によってＣ−末端残基に結合した１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むならばペプチドのＣ−末端残基である。 “アミノ酸チオヒダントイン”または“アミノ酸ＴＨ”は図１Ｂに示される構造式をもつ化合物のクラスの一員のことであり、式中のＲはアミノ酸の会合した側鎖であり、数字１〜５はチオヒダントインについての通常の番号を付した模式図を示す。ここで示されるように本発明によれば、チオヒダントインはＮ−保護アミノ酸から形成され、Ｎ−保護遊離アミノ酸またはペプチドのＣ−末端アミノ酸を含むことができる。ここで用いられるように、アミノ酸ＴＨは、図１においてIIで示されるように、Ｎ−保護基をもつことができ、または脱保護することができる、即ち、図１Ｃに示されるように、そのＮ−保護基から脱離することができる。 “アシルチオヒダントイン”は図１ＢにおいてIIで示される式をもつ化合物のクラスの一員のことであり、丸で囲んだＰにより示される基はアシル基である。一般に、Ｐ−Ｃ（Ｏ）−はポリペプチドを含むＮ−保護アミノ酸残基であり、側鎖またはＮ−末端アミノ基によって、固相支持体に任意に結合することができる。アシルチオヒダントインはここでは“Ｎ−保護チオヒダントイン”、“ペプチジルチオヒダントイン”、“Ｃ−末端ペプチジルチオヒダントイン”等と呼ばれることが多い。アシル基をチオヒダントイン環窒素（Ｎ¹）に連結するアミド結合はここでは“アシル−チオヒダントイン結合”または“ペプチジル−チオヒダントイン結合”等と呼ばれる。 “イソチオシアネート試薬”または“チオシアネート試薬”はチオシアネート［ＳＣＮ］^-アニオンを与える化学種のことである。 “固体支持体”または“固相支持体”は表面官能性を有し、または表面官能性を有するように誘導できる任意の固体支持体のことである。好ましくは、表面官能性はペプチドを支持体に結合するようにペプチドのアミノ基と相互に作用することができる。このような結合は共有結合、イオン性相互作用、および／または疎水性相互作用によることができる。例示的な固体支持体は、これらに制限されないが、セファローズ、シリカのアミノプロピル誘導体、アミノプロピル−ＣＰＧ（制御されたポアグラス）、アミノエチルセルローズ、トリスーアリール^R− ＮＨ、ガラスビーズ、ポリアクリルアミド粒子、１，４−フェニレン（ＤＩＴＣ）ジイソチオシアネートガラス、官能化ポリスチレン、ポリエチレン、官能化ＰＶＤＦのような膜支持体等を含む。 “クラウンエーテル”は、式−（Ｙ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）_nの環状化合物のことであり、式中のＹはＯ、ＳまたはＮのようなヘテロ原子であり、ｎは一般に４〜８である。この化合物はヘテロ原子がクラウンの“先端”を形成する冠状を形成する。図４Ａと４Ｂは代表的な18−クラウン−６エーテルを示し、これはリング構造が６個のヘテロ原子を含む全部で18個の原子をもつ事実によって名付けられた。 “クラウンエーテルのメタロチオシアネート錯体”はメタロチオシアネート例えばＫＳＣＮ，ＮａＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ等の錯体であり、金属イオンは、18−クラウン−６エーテルのＫＳＣＮの錯体について図４Ｃに示されるように、クラウンエーテルのヘテロ原子によって画定された“穴”の中に錯体を作っている。 “ウロニウム化合物”は図２においてIVで示される一般構造をもつ化合物のことである。本発明において有用なウロニウム化合物は、式中のＸがハロゲン、偽ハロゲン、例えばシアン化物、アジド、シアネートチオシアネート、セレノシアネート、およびテルロシアネート（ニューマン）、またはスルホネート基、例えばトシレート（ｐ−トルエンスルホネート）、トリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）、またはスルホネートそれ自身であるような化合物である。 “ホスホニウム化合物”は図３においてVIIで示される一般構造をもつ化合物のことである。本発明で有用なホスホニウム化合物は式中のＸがハロゲン、偽ハロゲン、またはスルホネート基、例えぽトシル、トリフレート、またはスルホネートそれ自身であるようなものである。Ｂ．アミノ酸チオヒダントインの形成本発明を実施する際に、Ｎ−保護アミノ酸はウロニウムまたはホスホニウム塩と、代表的には非水媒体中で反応させ、そしてさらにチオシアネート試薬と反応させて対応するアミノ酸ＴＨまたはペプチジルＴＨを形成する。反応において、ウロニウムまたはホスホニウム化合物は、アミノ酸の末端カルボキシル基の反応性ウロニウムエステルまたはホスホニウム混合無水物を意味する活性化誘導体を形成すると仮定され、これは次にチオシアネート試薬と反応してＴＨの形成に導く反応を完了する。本発明の文脈では、この誘導体は“活性化”していると言われるが、これはチオシアネート試薬と反応するが、アミノ酸の末端カルボキシル（非誘導化）基はチオシアネートアニオンと反応しないからである。図２ではウロニウム塩について反応を示す。この図に示されるように、Ｎ−保護アミノ酸（Ｉ）とウロニウム塩（IV）の反応は活性化エステル、例えば図２に示される中間体Ｖを、Ｘ基の置換と共に導く。本発明を支持して行われる研究はウロニウムまたはホスホニウム化合物の基Ｘが良好な脱離基であり、同時に、Ｘがそれ自身チオシアネートである場合を除いて（この場合にＴＨはウロニウムまたはホスホニウム化合物単独で形成される）、活性化エステル中のウロニウムまたはホスホニウム基を置換する能力を有しないことを示す。実施例１Ｂは、例えば、使用したウロニウム化合物がＨＢＴＵ（２−（１Ｈ− ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート即ち、式中のＸがベンゾトリアゾール基である反応を示す。この反応は、ＴＨ収率が少なく、種々のペプチドＣ末端残基をもつ、おそらくＨＯＢｔ脱離基とクロロウロニウムエステルの反応がチオヒダントインを形成する際にＳＣＮとの反応性が小さいＨＯＢｔエステルを生成するためであろう。２つの良好な脱離基であり活性化誘導体を妨害しないＸ基はハロゲン原子、例えば塩素、臭素、およびフッ素、ヨウ素、偽ハロゲン、およびスルホン酸、およびトルエンスルホネートおよびトリフレートを含むスルホン酸誘導体を含む。好ましいウロニウム化合物は２−ハロウロニウム化合物、例えば図２において IVで示される式をもつ化合物（式中のＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄は各々アルキル、アリール、またはアラルキル基であり、Ｘはハロゲンまたは他の適当な脱離基である）を含む。ウロニウム種は正に荷電しているので、負に荷電したカウンターイオン、例えばハロゲン化物、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート等が存在する。ひとつの好ましいウロニウム化合物は２−ハロウロニウム塩、そしてさらに好ましくは、２−クロロウロニウム塩である。またテトラアルキルウロニウム化合物、例えばN,N,N',N'−テトラメチルウロニウム種もまた好ましい。特に好ましいウロニウム塩は1,1,3,3−テトラメチル−２−クロロウロニウムクロリド（ＴＭＵＣｌ）であり、クノールら、Tetrahedron Letters，30（24）：1927（1989 ）の方法によって合成することができる。他の好ましいウロニウム化合物はN,N'−ジシクロ化合物、例えばビステトラヒドロピロロクロロウロニウム（ＴＰｙＣｌＵ）テトラフルオロボレートを含み、ＳＮＰＥ社（プリンストン、ＮＪ）から入手できる。また、クノールらの方法を用いて、1,3−ジメチル−２−イミダゾリジノンから形成された1,3−ジメチル− 1,3−エチレノクロロウロニウム塩のようなN,N'−モノシクロ化合物を用いることができる。引続き図２を参照すると、活性化ウロニウムエステル中間体はチオシアネート試薬によって誘導化されたカルボキシル基の炭素原子にて求核攻撃を受けると仮定する。活性化中間体を形成する活性化工程はカルボキシル炭素を一層電気陽性のカルボキシル炭素にする、従って一層求核攻撃を受けやすくする。図２はチオシアネート試薬との反応に対するひとつの可能な反応機構を示し、チオシアネート試薬の電気陰性の窒素原子はカルボキシル炭素にて攻撃し次いで標的アミノ酸のＮ原子によって環状になりＮ−保護チオヒダントインを形成する。この機構は図２のVIで提案されるような中間体によって進行する。図２のIIで示される最終反応生成物は、テトラアルキル尿素化合物の脱離を伴うＮ−保護アミノ酸ＴＨである。Ｎ−保護基がペプチジル残基であるとき、図２のIIのチオヒダントインは“ペプチジルチオヒダントイン”であると言える。Ｎ−保護アミノ酸と２−ハロウロニウム塩との反応は、ＴＨの収率を高めるため、チオシアネート試薬の存在で行われることが好ましい。しかし、アミノ酸からのＴＨの生成は所望により、段階的やり方で行うことができる。特にウロニウム試薬がアミノ酸から形成されたＴＨの性質に影響を与える証拠があるならば、いくつかの場合には段階的反応が望ましい。ウロニウム化合物によるＮ−保護アミノ酸の活性化は一般に無水溶媒の条件下に行われる。極性の非プロトン性溶媒、例えぽアセトニトリル、塩化メチレン、およびエーテルを含んだ溶媒が特に好ましい。また、塩基の使用は反応を促進し収率を改善するために必要である。好ましい塩基は第３アミン、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびピリジンとその誘導体、例えば2,6−ジメチルピリジンを含む。Ｎ−保護アミノ酸からのチオヒダントイン生成反応は一般に約１〜30分間約25 〜60℃にて生じる。例えば、大抵のアミノ酸の活性化は室温ないし55℃にて約５〜10分の過程でスムーズに行われる。対照的に、無水酢酸を用いる活性化によるＴＨ生成（スターク化学）は一般に約60〜80℃にて少なくとも30分間の反応を必要とする；そしてウッドワード試薬Ｋを用いた活性化は（ほぼ室温で行わなければならない）一般に数時間を必要とする。従って、本方法の重要な利点は、実質的に一層低い反応温度および／または反応時間によって測定されるように、活性化とＴＨ形成が非常に容易なことである。溶液中、使用されるアミノ酸に対するウロニウム化合物のモル比は好ましくは約１：１であり、アミノ酸に対するチオシアネート試薬の比は約１：１、またはそれ以上である。本発明に使用するための好ましいチオシアネート試薬は、シリルイソチオシアネート、ピリジニウムチオシアネート、およびメタロチオシアネートを含む。特に好ましいシリルイソチオシアネートはトリメチルシリルーイソチオシアネート（ＴＭＳ−ＩＴＣ）を含む。特に好ましいメタロチオシアネートは、ＬｉＳＣＮ、ＮａＳＣＮ、ＫＳＣＮ、ＲｂＳＣＮ、ＡｇＳＣＮ、およびＨｇ（ＳＣＮ）₂のような市販品として入手できるものを含み、そして特に一価金属の一価チオシアネート、例えばＮａＳＣＮおよびＫＳＣＮである。ここでひとつの発見によれば、メタロチオシアネートそれ自体は活性化アミノ酸を対応するＴＨに転換する際に非常に僅かに反応することが見いだされた。しかしながら、適当なクラウンエーテルを用いて錯体にする場合、メタロチオシアネートは本発明の反応方法でＴＨ化合物を有効に形成することができる。この効果は、一部は溶媒和効果および／またはイオン対効果に依ることができる（ゴケル）。図４Ａと４Ｂは２個の18−クラウン−６エーテルのための構造式を示し、これは特にＫＳＣＮとの錯体化のために好ましい。18−クラウンの名称はマクロサイクルがリング中に全部で18個の原子と６個の酸素原子を含むことを意味する。メタロチオシアネートの付加物を形成する際に使用するための好ましいクラウンエーテルは12−クラウン−４、15−クラウン５、18−クラウン−６、ジベンゾ− 18−クラウン−６、およびジベンゾ−24−クラウン−８を含み、アルドリッチケミカル（ミルウォーキィ、ＷＩ）から市販品として入手できる。クラウンエーテルと組み合わせて用いられる特別なメタロチオシアネート塩は、報告されているような（ゴケル）種々の既知のエーテルの既知の空洞寸法に基づいて選択することができる。例えば、18−クラウン−６エーテルの穴は概算が2.6〜3.2Åであり、Ｋ⁺のイオン直径は約2.66Åである。従って、18−クラウン−６エーテルは、ＫＳＣＮのようなカリウム塩と非常に安定な錯体を形成する。メタロチオシアネートの水の感度はシリルイソチオシアネートに閏して減少することも明らかであり、そしてこれらの化合物は腐食性が小さい。また試薬は便利で安全で、数日間にわたって安定である。ウロニウム化合物に対して述べたものに類似した反応は保護アミノ酸とホスホニウム化合物との反応によって行うことができる。図３に示すように、ホスホニウム化合物（VII）はＮ−保護アミノ酸（Ｉ）と反応し、図３においてVIIIで提案された構造のような活性化混合無水物を形成し、これはチオシアネート試薬のＳ＝Ｃ＝Ｎアニオンと反応してアミノ酸ＴＨ（II）を生成する。本発明を実施するために使用できる正に荷電したホスホニウム化合物は良好な脱離基（例えば、ハロゲン、偽ハロゲン、およびスルホン酸基、ｐ−トルエンスルホネートおよびトリフレート基を含む）を有するものであり、Ｎ−保護アミノ酸のカルボキシル基からホスホロ−カルボキシル混合無水物を生成することができる。このことについて好適なホスホニウム化合物はＰ−ハロホスホニウム塩を含む。例示的なホスホニウム化合物はトリス（ジアルキルアミノ）−およびトリス（ピロリジノ）−Ｐ−ハロホスホニウム塩を含む。このことについて特に好ましいものは、CalBiochem（ラジョラ、ＣＡ）から入手できるブロモトリス（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBroP、登録商標）である。また、ホスホニウム種の会合アニオンは、例えばテトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート等のような反応を著しく妨げない任意のアニオンであることができる。溶液中の遊離アミノ酸からＴＨを形成するための代表的な反応条件は実施例１に与えられる。以下に述べる実施例２〜５はまた本発明方法の例証とするが、固定化ペプチドのＣ−末端アミノ酸に応用される。溶液の例は、例えばアミノ酸ＴＨｓのＨＰＬＣ同定のためのＴＨ標準物として使用するため遊離アミノ酸ＴＨｓを形成するための方法の使用を示している。Ｃ．Ｃ−末端配列決定のための本方法の応用本発明の方法の他の応用はＣ−末端アミノ酸配列決定に使用するためのものである。この方法では、アミノ酸ＴＨへ変換されるＮ−保護アミノ酸はペプチドのＣ−末端アミノ酸残基である。配列決定の方法は以下に述べるように、自動化または半自動化操作のために採用することができる。Ｃ−末端配列決定方法は、本発明のひとつの局面に従って、図５Ａ−５Ｅに例示される。これらの図は、ε−アミノ基を介してＮ末端または内部のリジン側鎖にて、固体支持体12に結合するペプチド10を示す。固体支持体は、化学誘導化によって表面に置かれた官能基を含めて、ポリペプチドを結合できる任意の表面官能基を用いて調製することができる。例えば、ペプチドを固体支持体に結合するための任意の複数の方法を用いることができるが、固体支持体は、例えばジスクシンイミジルスベレートのような二官能性架橋試薬を用いて、結合部位として用いるように適当に誘導化される表面アミノ基を有する粒子ビーズであることができる。代表的な結合反応は実施例２Ａに記載される。本方法の第１工程では、固定化ペプチドは、セクションＢで記載したように、チオシアネート試薬の存在でウロニウムまたはホスホニウム化合物と反応し、Ｃ −末端アミノ酸残基をチオヒダントインに変換する、即ち、図５Ｂに示されるペプチジルチオヒダントインを形成する。代表的な反応条件は実施例２Ｂに示される。次にチオヒダントインを、例えば、末端アミド結合の加水分解開裂によって、酸性または塩基性条件下に、開裂する。あるいは、この開裂を、塩基性条件下に、チオヒダントインを最初にアルキル化して、図５Ｃに示されるようなアルキル化ＴＨ生成物を形成して、促進させることができる。好適なアルキル化試薬と条件は米国特許第5,185,266号の主題であり、その開示されたものはここに参考文献として組み込まれる。代表的な反応条件は実施例３に示される。アルキル化試薬を用いるとき、開裂反応は、図５Ｄに描写されるように、チオシアネートアニオンを用いて酸性無水条件下に直接行うことができる。ＴＭＳ− ＩＴＣのようなチオシアネート試薬の存在での開裂は好ましい、その理由は図５Ｅに例示されるように、ネックストーインのＣ−末端アミノ酸残基にて新しいＴＨを形成するために無水の酸性条件下にチオシアネート試薬を用いる反応が有効であるからである。この反応は図５Ｄに示される活性化ペプチジルＮＣＳ中間体によって実施することができる。あるいは、酸性条件下にメタロチオシアネートとクラウンエーテルの錯体を使用してアルキル化チオヒダントインを開裂し、同時にネックスト−インのペプチジルチオヒダントインを生成する。いくつかの場合には、酸性または塩基性の条件下に直接加水分解によってペプチドのＣ−末端からＴＨを開裂し、遊離カルボキシル基を有するＣ−末端残基を生成する。この残基を次にウロニウムまたはホスホニウム化合物、およびチオシアネート試薬との反応によって、上記のように、対応するＴＨに効率的に転化することができる。この後者のアプローチは、例えば、ペプチドの残余からアミド結合が最初に開裂されない場合に、プロリンのような第３アミンがＴＨを形成できないことに遭遇する際に好適である。他の残基、例えばセリン、スレニオン、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、またこれらの残基の側鎖の官能基によって不確定であることができる。しかし、合成ペプチドを迅速に活性化するためのウロニウム化合物の使用は、これらの残基がペプチド中に存在するときＣ−末端アミノ酸配列を決定するために改善されたルートを提供することが多かった。本発明を支持して行われた研究はウロニウム化合物を用いた活性化はセリン残基の脱水に導くことができることを示している。セリンとスレニオンは自動化配列決定方法においてこれらの残基の直前のアミノ酸で配列決定が停止するような問題を提供する。合成ペプチド“Ｋ11（Ｓ）Ｖ”は、例えば、ｃ−末端から３番目の残基にセリンを有する。このペプチドをウッドワードの試薬Ｋを用いて最初に活性化する場合、開裂したバリン誘導体に対するＨＰＬＣピークは最初の化学サイクルに対して観察される；しかしながら、アラニン（バリンの後でセリンの前のネックスト−インアミノ酸）および続くすべてのアミノ酸は観察されない。バリンのピークの大きさは期待される収量で矛盾しない。活性化試薬としてのクロロウリニウム化合物の使用はタンパク質またはペプチドのカルボキシル末端を修飾するだけでなく、セリン（そして多分スレニオン、アスパラギン酸およびグルタミン酸）の水酸基も修飾するように思われる。例えば、活性化試薬としてクロロウロニウム塩化物を用いてＫ11（Ｓ）Ｖを配列決定するとき、アラニンに対して小さいが重要なピークが第２サイクルにおいて期待されるように観察される。下検分と遅滞はあいまいでない配列の呼び出しを妨げるが、適当な残基のための信号は、何かの方法でクロロウロニウムがセリン残基を修飾していることを示している（メカニズムはまだ分からない）第４残基（サイクル）まで検出される場合が多い。 AspとGlu（カルボン酸側鎖）はまたカルボキシル活性化試薬によって誘導化される。ほんの少量が変更のないカルボン酸側鎖として検出される。誘導化された生成物が何であるかは知られていない。クロロウロニウム化合物は、室温またはそれ以上で10分間またはそれよりも短い反応時間で迅速に反応し、ペプチジルチオヒダントインを生成するために有用な活性化エステルを生成するので有利である。結果として、クロロウロニウム化合物は後生物のピークが少なくクロマトグラフィーがきれいになる。この方法は例えば、その後の工程の反応温度と一致して、例えば55℃で反応を有効に行うことができるけれども、室温で５分ないし10分でアプライドバイオシステムズシーケンサーモデル477Ａを、そのままタンパク質とペプチドを通常活性化するために用いることができる。１個だけの追加のボトル位置がこの応用のために必要とされる。クロロウロニウム化合物を用いたオンライン活性化は配列決定前に試料調製工程に消費する時間を最小にする、そしてこれはＡＢＩによって現在開発されているＣ−末端配列決定化学の向上に重要である。上述の配列決定技術はペプチドのＮ−末端残基の自動化配列決定に用いられる装置を使用して容易に自動化される。Ｃ−末端からペプチドを自動的に配列決定するための装置の１例は、反応容器に含まれる表面固定化ペプチドを用い、反応容器に新しい溶媒と試薬を添加し、そしてそこから反応混合物と洗浄溶媒を除去する。放出されたアミノ酸チオヒダントインは支持体から抽出し分析のためオンラインＨＰＬＣに移す。Ｄ．チオシアネート法本発明はまた、Ｎ−保護アミノ酸残基からチオヒダントインを形成する方法において、アミノ酸のカルボキシル基を活性化することによって、活性化したＮ− 保護アミノ酸をメタロチオシアネートのクラウンエーテル付加物と反応させる改良を含む。ひとつの好適例では、クラウンエーテルは18−クラウン−６エーテルであり、メタロチオシアネートは１価のカチオンのチオシアネート塩、例えばＫＳＣＮ、ＮａＳＣＮ、またはＣｓＳＣＮである。また好ましい反応方法では、上述のように、Ｎ−保護アミノ酸のカルボキシル基はウロニウムまたはホスホニウム化合物、特にハロウロニウム、トリフレートウロニウム、またはスルホネートウロニウム化合物、またはハロホスホニウム、トリフレートホスホニウム、またはスルホニルホスホニウム化合物と反応させて活性化される。次の実施例は本発明を更に詳細に説明するために示され、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではない。実施例これらの実施例では、次に示す略語は以下のように定義される（定義されない場合は、その略語は一般に受け入れられている意味をもつ）：ＡｃアシルまたはアセチルＤＩＥＡジイソプロピルエチルアミンＤＩＴＣ 1,4−フェニレンジイソチオシアネートＤＳＳジスクシンイミジルスベレートＦｍｏｃフルオレニルメトキシカルボニルＨＢＴＵ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートＨＰＬＣ高圧液体クロマトグラフィーＩＴＣイソチオシアネートＮＭＰＮ−メチルピロリドンＰＶＤＦポリビニルジフルオライドＰｙＢｒｏＰブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートＴＦＡトリフルオロ酢酸ＴＨチオヒダントインＴＬＣ薄層クロマトグラフィーＴＭＵＣｌテトラメチルクロロウロニウムクロライドＴＭＳ−ＩＴＣトリメチルシリル−イソチオシアネート−（CH₃）₃SiNCS ＴＰｙＣｌＵテトラヒドロピロロ−２−クロロウロニウムテトラフルオロボレートＷＲＫウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３−スルホネート）18−クラウン−６ 1,4,7,10,13,16− ヘキサオキサ−シクロオクタデカンこれらの実施例では、ＴＭＳ−ＩＴＣ、18−クラウン−６、ピリジン、およびＫＳＣＮをAldrich Chemical社（ミルウォーキイ、ＷＩ）から購入した。ＤＳＳはPierce Chemical（ロックフォード）から購入した。Ｎ−アシル化ペブチドをB achem Biosciences社（フィラデルフィア、ＰＡ）から購入した。ＰＶＤＦ−ＣＯＯＨ膜はPall Corporation（ロングアイランド、ＮＹ）から得られた。別に指示されなければ、他の試薬とペプチドはApplied Biosystems社（フォスターシティ、ＣＡ）にて標準方法を用いて調製された。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは300MHz Varian分光系で得られた。実施例１溶液中で遊離アミノ酸を用いてＴＨを形成Ａ．クロロウロニウム反応ＴＭＵＣｌの塩化物塩はクノールら〔Tetrahedron Letters，30（25）:1927（ 1989）〕によって記載さている方法に従って調製した。合成後、クロロウロニウムクロライド結晶を真空デシケーター中P₂O₅上で貯蔵した。調製されたＴＭＵＣｌ塩化物は溶液中でＦｍｏｃ−アラニンを容易に活性化した。この実験では、１ミリモルのＦｍｏｃ−アラニン−ＯＨを５mlの塩化メチレンに溶解した。ＤＩＥＡ（２当量）、ＴＭＵＣｌ塩化物（１当量）、およびＴＭＳ−ＩＴＣ（１当量）を保護されたアミノ酸に添加した。反応混合物は約30分間室温で攪拌し、その後、反応混合物を¹Ｈ−ＮＭＲによって試験してチオヒダントインの存在を決定した。この研究はクロロウロニウム塩化物試薬を用いて溶液中でアミノ酸ＴＨが迅速に合成されることを示している。Ｂ．ＨＢＴＵウロニウム化合物の使用約50mg（0.38ミリモル）のＡｃ−アラニン−ＯＨを１mlの無水アセトニトリルに溶解した。１当量のＨＢＴＵを添加した。試薬は２当量のＤＩＥＡを添加するまで完全には溶解しなかった。約２分後、１当量のＴＭＳ−ＩＴＣを反応混合物に添加した。反応は薄層クロマトグラフィーによってモニターした（溶媒系は塩化メチレン−メタノール、9.5：0.5、ｖ／ｖであった）。反応混合物を20分間55 ℃の熱ブロックでインキュベーションした。20分後、反応混合物の別の一部分をＴＬＣにかけた。Ａｃ−アラニン−ＴＨを、米国特許第5,185,266号に記載されているように別に合成し、ＴＬＣ用の参照標準として使用した。ＴＬＣプレートの展開後、２つの試料部分は標準と同じＲ_fの生成物を示した（生成物の存在はＵＶランプで見える）。反応混合物を高速真空（Savant Speed Vac）で終夜濃縮した。次に試料を最小量の塩化メチレン：メタノール（9.5：0.5、ｖ／ｖ）で再構成し、ＴＬＣ準備プレート（シリカゲル）を用いて精製した。展開後、適当なバンドをＴＬＣプレートから削り取り、メタノール／塩化メチレン１：１で抽出した。生成物を¹ＨＮＭＲスペクトロメーターで分析し、アセチル−アラニン−ＴＨであることを確認した。Ｃ．ペプチドを用いたＨＢＴＵ反応ＨＢＴＵを用いて反応性につき同様の試験を次の合成ポリペプチドに行った： Ac-Ala-Ala-OH（SEQ ID NO:1）， Ac-Ala-Ala-Ala-OH（SEQ ID NO:2）， Al4G：（Fmoc-Ala-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Leu-Phe-Tyr-Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly）（ SEQ ID NO:3），および G12Y：（Fmoc-Gly-Ala-Pro-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Tyr-Phe-Leu-Tyr-OH）（SEQ I D NO:4）．Ａ14ＧとＧ12Ｙは、以下の実施例２に記載するように、ポリスチレン支持体に最初共有結合させた。上記実験の結果はＨＢＴＵが試験した１のアミノ酸（Ac−Ala−OH）に対して多少のチオヒダントイン生成物を生成することができることを確かめた。しかしながら、ＨＢＴＵはポリペプチドからチオヒダントインを生成するとき効果が小さく、あるいは無効であった。これは、ウロニウム活性化エステルを用いた反応に対し、活性化（Ｈ０Ｂｔ）エステルの反応性および／またはＨＯＢｔとチオシアネートアニオンとの間の競合が小さいことに因るのかもしれない。実施例２ＴＭＵＣｌ塩化物を用いた固定化ペプチジルチオヒダントインの生成Ａ．ペプチドＡ14Ｇの合成と固定化ポリペプチドＡ14Ｇ（実施例１に定義した）を標準Fastmoc（登録商標）サイクルを用いてアプライドバイオシステムズインコーポレイテッドのモデル43 1Ａペプチド合成器で合成した。脱保護と開裂は標準方法によって行われ、ペプチドはＨＰＬＣおよびアミノ酸分析によって特性を表した。ペプチドＡ14Ｇは次のようにポリスチレンビーズに結合させた：100mgのアミノメチルポリスチレンビーズ（26μモルＮＨ₂/ｇ）（アプライドバイオシステムズインコーポレイテッド）を720μリットルのＮＭＰ中で15mgのＤＳＳリンカー、40μリットルのＤＩＥＡおよび40μリットルのピリジンを用いて活性化させた。ビーズと活性化溶液を１時間室温で振とうさせ、その後ビーズを３回ＮＭＰで洗浄した。合成ペプチドＡ14Ｇ（15mg）を360μリットルのＮＭＰ、40μリットルのピリジンおよび40μリットルのＤＩＥＡに溶解し、次いで活性化ビーズに添加した。ビーズとペプチド溶液を少なくとも12時間室温で振とうさせた。次にビーズを３回、それぞれＮＭＰとアセトニトリルで洗浄し、高速真空濃縮機で乾燥させた。ペプチドを樹脂およびガラスビーズに固定化する他の例は米国特許第5,185,26 6号に示されており、ここに参考文献として加えるが、これは本発明の実施のために適している。Ｂ．固定化ペプチドを用いたＴＭＵＣｌ塩化物の反応ＴＭＵＣｌ塩化物（0.5〜１ミリモル）を２ミリリットルのアセトニトリルと１〜２モル当量のＤＩＥＡに溶解した。約750μリットルのこの溶液を上記で調製した約20mgのＡ14Ｇ−ポリスチレンビーズと共にエッペンドルフチューブに入れた。約１〜２モル当量のＴＭＳ−ＩＴＣを添加し直ちにクロロウロニウム溶液を添加した。チューブを閉じて、数秒間渦巻運動させて、60℃のヒートブロックに30分間置いた。ポリスチレンビーズを連続して、アセトニトリルで２回、アセトニトリル：水（１：１、ｖ／ｖ）で２回、そして再びアセトニトリルで２回洗浄した。ビーズを高速真空で乾燥させた（15〜30分）。結合−Ａ14Ｇ−ＴＨを有する約１mgのポリスチレン樹脂をアプライドバイオシステムズインコーポレイテッドのモデル477Ａタンパク質／ペプチドシーケンサーを用いて６サイクルについてＣ−末端から配列決定を行った。Ｃ−末端配列決定法のための条件は米国特許第5,185,266号に記載されている。ペプチド中の最初のＴＨ形成の収率は50〜100％であった。実施例３クロロウロニウムクロライドの１回の使用でのタンパク質とペプチドのＣ−末端チオヒダントインの自動形成と配列決定固体支持体に結合したタンパク質とペプチド（上記）をＣ−末端チオヒダントインに誘導化して、次にアプライドバイオシステムズモデル477Ａタンパク質シーケンサーでＣ−末端から配列決定した。これらの実験では、ＴＭＵＣｌ塩化物の10％アセトニトリル溶液をモデル477ＡのＸ１位置に装填した。改変した “ビギン（Begin）”サイクルを実行してアセトニトリル中10％ＤＩＥＡの１部、10％ＴＭＵＣｌ塩化物溶液の１部、およびアセトニトリル中の10％ＴＭＳ−ＩＴＣの１部を供給した。これを５〜10分間隔で続け、その後に追加のＴＭＳ−ＩＴＣの１部を供給した。反応温度は55℃であった。このプロトコルを用いて、調べる各ペプチドとタンパク質に対してＣ−末端チオヒダントイン形成を20分以内で完了した。反応後の活性化試薬を反応カートリッジからアセトニトリルで洗浄し、配列決定を行った（米国特許第5,185,266号に記載されているように）。この方法では、Ｃ−末端チオヒダントインはアルキル化試薬と反応しチオヒダントインを一層良好な脱離基にする。次にＴＭＳ−ＩＴＣ（またはメタロチオシアネートクラウンエーテル錯体）およびＴＦＡ蒸気を使用して残りのペプチドからチオヒダントイン付加物を開裂し、ネックスト−インアミノ酸残基のチオヒダントインを形成する。代表的な方法では、固定化ペプチジルＴＨを塩基、例えば、ＤＩＥＡ、およびアルキル化剤、例えばブロモメチルナフタレンを用いて処理し、反応を20分間55 ℃にて行わせる。次にＴＭＳ−ＩＴＣおよびＴＦＡ蒸気を用いて残りの（残留）固定化ペプチドからアルキル化チオヒダントイン付加物を開裂し、同時にネックスト−インＣ−末端アミノ酸残基のＴＨを形成する。Ｃ−末端配列決定のためのこの方法（ネックストインチオヒダントインのアルキル化と開裂／再形成の繰り返されるサイクルで続く、“ビギン”サイクルのみのためのオンラインチオヒダントイン誘導化）を使用して、馬のアポミオグロビン（シグマケミカル；セントルイス、ＭＯ）のＣ−末端配列の５残基およびＤＩＴＣガラスビーズに共有結合したシトクロム−ｃ（シグマ）の３個までの残基を首尾よく決定した。また、官能化ＰＶＤＦ（ＰＶＤＦ−ＣＯＯＨ）に固定化したリゾチーム（シグマ）の４残基およびβ−ラクトグロブリンのＣ−末端残基はこの方法を用いて同定した。次の合成ペプチドの各々のＣ−末端配列はこの方法を用いて首尾よく配列決定された： A15G：Fmoc-Ala-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Leu-Tyr-Phe-Gly-Leu-Tyr-Gln-Phe-Gly （SEQ ID NO:5） K11V：Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Val-Gln-Ala-Ile-Val（SEQ ID NO:6） L20Y：Leu-Ile-Ala-Gln-Tyr-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gln-His-Tyr-Asn- Tyr-Phe-Leu-Tyr（SEQ ID NO:7） K10A：Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Tyr-Ala-Leu-Met-Ala（SEQ ID NO:8） K13Y：Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gln-His-Tyr-Asn-Tyr-Trp-Leu-Tyr（SEQ ID NO:9） K11（S）V：Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Val-Ala-Ser-Ala-Val（SEQ ID NO:10） K12S：Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Gln-Val-Ala-Asn-Val-Ser（SEQ ID NO:11） K13R：Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gln-His-Tyr-Asn-Tyr-Arg-Leu-Tyr（SEQ ID NO:12 ） K12V：Lys-Gly-Lys-Gly-His-Tyr-Met-Ile-Trp-Ala-Lys-Val（SEQ ID NO:13） A14L：Fmoc-Ala-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Phe-Tyr-Leu-Gly-Phe-Tyr-Leu（SEQ ID NO:14）単一の活性化工程においてＴＭＵＣｌ塩化物を用いてうまく行われるサイクル数は各ペプチドについて示される（括弧内）：Ａ15Ｇ（９）、Ｋ11Ｖ（６）、Ｌ20Ｙ（８）、Ｋ10Ａ（４）、Ｋ13Ｙ（４）、Ｋ 11（Ｓ）Ｖ（２＋）、Ｋ12Ｓ（６）、Ｋ13Ｒ（３＋）、Ｋ12Ｖ（４）、Ａ14Ｌ（７）。また第２のウロニウム塩を用いて複数の合成ペプチドを活性化した。ＳＮＰＥ社（プリンストン、ＮＪ）から市販品として入手できる塩、テトラヒドロピロロ −クロロウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＰｙＣｌＵ）はＴＭＵＣｌ塩化物に対して得られるものと似た結果を与えた。即ち、Ｃ−末端アミノ酸ＴＨの収率は50〜100％である。しかしながら、ＴＰｙＣｌＵテトラフルオロボレートは一般に塩化物塩よりも吸湿性が小さいため取り扱い性が更に良い。第１のＣ−末端残基のみを活性化するためＴＰｙＣｌＵを用いて首尾よく配列決定される合成ペプチドは、Ｋ11Ｖ（５）、Ｋ11（Ｓ）Ｖ（２）、およびＡ15Ｇ（６）であり、サイクル数は括弧内に示した。開裂したチオヒダントイン付加物を単離して、本発明の実施に適している米国特許第5,185,266号で示される方法によって同定した。実施例４クロロウロニウム塩化物を用いて繰り返される活性化によるペプチドのＣ−末端チオヒダントインの自動化形成と配列決定実施例３で上述した方法に代わって、ペプチドから各チオヒダントインが開裂する際に末端カルボキシル基を生成し、そしてウロニウム化合物を用いてそのたびにＣ−末端を再活性化することができる。この方法ではイソチオシアネート源なしで、酸、例えばＴＦＡを用いてアルキル化チオヒダントインをタンパク質またはペプチドから開裂することができる。ＴＭＳ−ＩＴＣを開裂反応から取り除くとき、アルキル化チオヒダントインを検出のために脱離する；しかしながら、先端を切ったタンパク質またはペプチドをクロロウロニウム塩化物を用いて活性化することができる部分に戻す。このプロトコルを用いる配列決定サイクルは好ましくは次の工程を含む：ａ）チオヒダントインを形成するようにクロロウロニウム塩化物、ＤＩＥＡ、およびＴＭＳ−ＩＴＣを用いたカルボキシル基の活性化；ｂ）ＤＩＥＡの存在でブロモメチルナフタレン試薬を用いたチオヒダントインのアルキル化；およびｃ）洗浄中に先端を切ったポリペプチドの遊離カルボキシル基に変換する部分に導くＴＦＡ蒸気を用いたアルキル化チオヒダントインの開裂。この配列決定法を使用して、反復の再活性化でＴＭＵＣｌ塩化物を使用するポリスチレンビーズに共役結合した合成ペプチド（Ｋ11Ｖ）の４サイクルを配列決定した。しかしながら一般に、各分解サイクルの始めのクロロウロニウム再活性化の次にＴＦＡ開裂が来るこの方法は、上記の米国特許第5,185,266号に記載されるような開裂とチオヒダントイン−再生を同時に行う場合よりも効率が低いことが見出されている。実施例５ホスホニウム化合物を用いるＣ−末端チオヒダントインの自動化形成 Calbiochem（ラジョラ、ＣＡ）から市販品として入手できるＰｙＢｒｏＰのヘキサフルオロホスフェート塩を使用して、オン−インストルメント（on-instrum ent）活性化の間に複数の合成ペプチドからＣ−末端チオヒダントインを生成した。これらの実験では、クロロウロニウム塩化物を用いた上記方法の唯一の変更はＸ１ボトル（10％ＴＭＵＣｌ塩化物のアセトニトリル溶液）を10％ＰｙＢｒｏＰのアセトニトリル溶液で置き換えたことである。次のペプチドは首尾よくそれらのＣ−末端チオヒダントインに変換され続いて括弧内のサイクル数に対して配列決定された：Ｋ11Ｖ（５）、Ｌ20Ｙ（８）、およびＡ15Ｇ（５）。括弧内の数は首尾よく実行されたサイクル数を示している。実施例６チオシアン酸カリウムの18−クラウン−６付加物の調製チオシアン酸カリウム（0.325g、0.003モル）および18−クラウン−６（0.79 4g、0.003モル）を12時間以上、真空デシケーター中で五酸化リンの上で乾燥させた。次に混合物を10mlの乾燥アセトニトリル（ＨＰＬＣ品質、アプライドバイオシステムズインコーポレイテッド）に溶解した。この溶液をアプライドバイオシステムズモデル477Ａタンパク質シーケンサーに装備した。チオシアン酸カリウムはアセトニトリル中で溶解し、“裸の（naked）”イソチオシアネートアニオンはカリウムイオンと18−クラウン−６の錯体化の際に求核性をかなり増加することが観察された。また、試薬はＴＭＳ−ＩＴＣよりもはるかに感湿性が小さいことが見いだされ、非腐食性であり、この試薬の調製と取り扱い性は手軽で安全であり、18−クラウン−６付加物は自動化シーケンサーに（琥珀色のボトル中、アルゴン下に）設置されるとき、少なくとも10日間安定である。実施例７開裂試薬としてＫＳＣＮ／18−クラウン−６を用いたペプチドのＣ−末端配列決定ペプチドＧ12Ｙをアプライドバイオシステムズモデル431Ａペプチド合成器で合成し、実施例２で上述した方法を用いてポリスチレン樹脂ビーズに結合させた。固定化ペプチドを、米国特許第5,051,368号および5,185,266号に記載されているように、ウッドワード試薬ＫおよびＴＭＳ−ＩＴＣを用いてチオヒダントイン誘導体に変換させ、そしてアプライドバイオシステムズモデル477Ａタンパク質シーケンサーで配列決定した。ＤＩＥＡの存在でペブチジルチオヒダントインを２−ブロモメチルナフタレンでアルキル化した後、試薬をアセトニトリルで洗浄した。次に開裂試薬（0.3モルＫＳＣＮ／18−クラウン−６アセトニトリル溶液）を樹脂が良く飽和されるまで（約３秒）供給した。10秒の間隔を置いた後、過剰溶液をアルゴン（５秒）で、次にＴＦＡ蒸気で、米国特許第5,185,266号に記載された方法に従って除去した。４回の逐次配列決定サイクルを行い、開裂されたアミノ酸Ｓ−アルキル化チオヒダントインの期待されたピークをＨＰＬＣクロマトグラムで観察した。第２のペプチド、Ｋ10ＡをＰＶＤＦ−ＣＯＯＨ膜に共有結合させた。0.5mgの割合の固定化ペプチド（３nmol）含有膜をアプライドバイオシステムズ 477 Ａタンパク質シーケンサーの反応室に置いて、実施例３で上述したように、ＴＭＵＣｌ塩化物で活性化させた。次に活性化ペプチドをＤＩＥＡの存在で0.3モルＫＳＣＮ／18−クラウン−６アセトニトリル溶液で処理した。ＫＳＣＮ／18−クラウン−６溶液を２回、１秒間供給し、各供給にはそれぞれ300秒と100秒の間隔を置いて、チオヒダントイン形成反応を行わせた。試料をアセトニトリルで洗浄し、実施例３に記載されているようにＴＨ誘導体のＣ−末端配列決定を行った。４凹の逐次サイクルを行ってＨＰＬＣクロマトグラムに解釈できるピークを与えた。本発明は、例証および実施例によって明瞭に理解できるように詳細に記述したが、多くの変更および改変を本発明の範囲から離れることなく行うことが可能である。配列リスト（１）一般情報（ｉ）出願人：アプライドバイオシステムズインコーポレイテッド（ii）発明の名称：Ｎ−保護アミノ酸チオヒダントインの形成方法（iii）配列の数：１４（iv）相当する住所：（Ａ）住所：ロウオフィシーズオブピーターデーリンガー（Ｂ）街路：350 ケンブリッジアベニュ，スイート 300 （Ｃ）市：パロアルト（Ｄ）州：ＣＡ（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号：94306 （ｖ）コンピューター読み取り型（Ａ）媒体タイプ：フロッピイディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release ♯1.0，バージョン ♯1.25 （vi）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）以前の出願データ：（Ａ）出願番号：US 07/914,280 （Ｂ）出願日：15-JUL-1992 （viii）代理人情報：（Ａ）名前：パワーズ，ヴィンセントエム（Ｂ）登録番号：36,246 （Ｃ）参照／ドケット番号：0550-0025.41 （ix）電話伝達情報：（Ａ）電話：（415）324-0880 （Ｂ）ファクシミリ：（415）324-0960 （２）SEQ ID NO：１のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド（xi）配列の記載：SEQ ID NO：１：（２）SEQ ID NO：２のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド（xi）配列の記載：SEQ ID NO：２：（２）SEQ ID NO：３のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：14アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド A14G （xi）配列の記載：SEQ ID NO：３：（２）SEQ ID NO：４のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：12アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド G12Y （xi）配列の記載：SEQ ID NO：４：（２）SEQ ID NO：５のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：15アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド A15G （xi）配列の記載：SEQ ID NO：５：（２）SEQ ID NO：６のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：11アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K11V （xi）配列の記載：SEQ ID NO：６：（２）SEQ ID NO：７のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド L20Y （xi）配列の記載：SEQ ID NO：７：（２）SEQ ID NO：８のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：10アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K10A （xi）配列の記載：SEQ ID NO：８：（２）SEQ ID NO：９のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：13アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K13Y （xi）配列の記載：SEQ ID NO：９：（２）SEQ ID NO：10のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：11アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K11（s）V （xi）配列の記載：SEQ ID NO：10：（２）SEQ ID NO：11のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：12アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K12S （xi）配列の記載：SEQ ID NO：11：（２）SEQ ID NO：12のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：13アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K13R （xi）配列の記載：SEQ ID NO：12：（２）SEQ ID NO：13のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：12アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド K12V （xi）配列の記載：SEQ ID NO：13：（２）SEQ ID NO：14のための情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：14アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：ペプチド（vi）起源：（Ｃ）各個の単離：合成ペプチド A14L （xi）配列の記載：SEQ ID NO：14：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ボッチニ，メリリサアメリカ合衆国カリフォルニア州 94401 サンマテオ，ステートストリート 112 (72)発明者グガ，ピオトル，ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州 94403 サンマテオ，カサドゥカムポ 3149 (72)発明者ゾン，ゲロルドアメリカ合衆国カリフォルニア州 94070 サンカルロス，フィルストリート 199

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｎ−保護アミノ酸を対応するアミノ酸チオヒダントインに変換する方法が、Ｎ−保護アミノ酸を、塩基の存在で、ハロウロニウム、偽ハロウロニウム、トシルウロニウム、トリフレートウロニウム、およびスルホニルウロニウムからなる群から選ばれるウロニウム化合物、およびハロホスホニウム、トシルホスホニウム、トリフレートホスホニウム、およびスルホニルホスホニウムからなる群から選ばれるホスホニウム化合物、の一種と、チオシアネート試薬を、アミノ酸チオヒダントインを形成するために有効な条件の下に反応させる工程から成る方法。２．前記Ｎ−保護アミノ酸とウロニウムまたはホスホニウム化合物と反応させる工程が、チオシアネート試薬の存在で行われる、請求項１記載の方法。３．ウロニウム化合物が２−ハロウロニウム塩である、請求項１記載の方法。４．ウロニウム化合物が1,1,3,3−テトラ置換ウロニウム塩である、請求項３記載の方法。５．ホスホニウム化合物がＰ−ハロホスホニウム塩である請求項１記載の方法。６．ホスホニウム化合物がトリス（ジアルキルアミノ）ホスホニウム塩である、請求項５記載の方法。７．チオシアネート試薬がシリルイソチオシアネート、ピリジニウムチオシアネート、およびメタロチオシアネートおよびクラウンエーテルの錯体、から成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。８．シリルイソチオシアネートがトリメチルシリルイソチオシアネートであり、錯体が１８−クラウン−６エーテルとチオシアン酸カリウムから成る、請求項７記載の方法。９．Ｎ−保護アミノ酸が固体支持体に固定化したポリペプチドのＣ−末端アミノ酸である、請求項１記載の方法。１０．ポリペプチドのＣ−末端アミノ酸残基を同定するのに使用するため、さらに、（ａ）形成したアミノ酸チオヒダントインを、脱保護アミノ酸チオヒダントインを残基ペプチドから脱離するために有効な条件下に、開裂剤と接触させ；そして（ｂ）脱保護アミノ酸チオヒダントインを単離し同定して、これによってポリペブチドのＣ−末端残基を同定する工程から成る、請求項９記載の方法。１１．前記接触が、チオヒダントインをアルキル化し、そしてアルキル化したチオヒダントインを、無水酸性の条件下に、残基ペプチドのＣ−末端にてチオヒダントインを形成する条件下に、チオシアネート試薬と接触させる工程を含む、請求項１０記載の方法。１２．Ｎ−保護アミノ酸残基からチオヒダントインを形成する方法において、該残基をカルボキシル活性化剤、およびチオシアネートと反応させる工程を含み、その改良がイソチオシアネートとして、メタロチオシアネートとクラウンエーテルの錯体を用いる工程から成る方法。１３．錯体が１８−クラウン−６エーテルとイソチオシアン酸カリウムから成る、請求項１２記載の方法。１４．カルボキシル活性化剤が、ハロウロニウム、偽ハロウロニウム、トリフレートウロニウム、およびスルホネートウロニウムからなる群から選ばれるウロニウム化合物、およびハロホスホニウム、偽ハロウロニウム、トリフレートホスホニウム、およびスルホネートホスホニウムからなる群から選ばれるホスホニウム化合物である、請求項１２記載の方法。