JPH08505040A - ゴキブリに対し活性の新規なバシルスチューリンゲンシス単離体及びゴキブリ活性毒素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はゴキブリに活性の新規な毒素蛋白質をコードした新規な微生物及び遺伝子に関する。ゴキブリは一般的な家屋内の害虫てあり、病院、食品産業、及び農業において問題を生じる。新規な本発明のバシルスチューリンゲンシス微生物はB．ｔ．PS185L8とよばれる。本発明はまたゴキブリを抑制する為のPS201T6の用途にも関する。これらの微生物又はその変異体の胞子又は結晶は種々の環境中のゴキブリを抑制するのに有用である。本発明の遺伝子は新規な毒素蛋白質が発現される種々の宿主を形質転換するのに使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ゴキブリに対し活性の新規なバシルスチューリンゲンシス単離体及 びゴキブリ活性毒素をコードする遺伝子 関連出願に対するクロスリファレンス 本発明は1991年11月6日に出願された係属する米国出願番号07/788,654の一部 継続出願である。 発明の背景 バシルスチューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（B．t．）はδ‐エ ンドトキシンと命名される昆虫毒素を生じる。これはB．t．胞子形成細胞によっ て合成される。この毒素は結晶形で感受性昆虫により摂取されると、昆虫の腸の 消化液ブロテアーセによって生物活性部分に変換される。主要標的は腸の上皮の 昆虫細胞であり、これらが急速に破壊される。 報告されたB．t．の活性スペクトラムは鱗翅目内の昆虫種をカバーしており、 これらの多くは農業及び林業における主要な害虫である。活性スペクトラムはま た双翅目の昆虫も含み、これらには蚊及びブヨ（ブラックフライ）が含まれる。 コウチ，T．L.，（1980）「バシルスチューリンゲンシスvar．イスラエレンシス の蚊への病源性」Developments in lndustrial Microbiology（ディベロップメ ンツ イン インダストリアル マイクロバイオロジー）、22：61-76；ビーグ ル、C．C.，（1978）「農業生態系に於け る虫生細菌の用途」Developments in lndustrial Microbiology（ディベロップ メンツ イン インダストリアル マイクロバイオロジー）、20：97‐104を参 照。クリーグ等Z．ang．Ent．（1983）96：500-508はバシルスチューリンゲンシ ス var．テネブリオニス（tenebrionis）と命名されるB．t．単離体を記載し、 これは報告されるところでは鞘翅目中の２つの甲虫に対し活性である。これらは コロラドポテトビートル（コロラドじゃがいもはむし）のレピノタルサ デセム リネアタ（Leptinotarsa decemlineata）及びアゲラスティカ アルニ（Agelast ica alni）である。ヨーロッパ特許出願第0 202 739には鞘翅類に対し活性の新 規なB．t．単離体が記載されている。これはB．t．チューリンゲンシス var． サンジエゴ（B．t．S．d．）として知られる。米国特許4,966,765は鞘翅類に活 性なバシルスチューリンゲンシス単雌体B．t．PS86B1を開示している。 ジャーマンコックローチ（Balatella germanica）、オリエンタルコックロー チ（Blatta orientalis）、アメリカンコックローチ（Periplanet americana） 、及びブラウンコックローチ（Periplaneta americana）等のゴキブリは家屋や 商業的構造物中の昆虫害虫のなかでも、最も重要なものの幾つかである。これら の害虫は食物、皮革及び布の破壊を生じる雑食習慣を有している。ゴキブリはま たサルモネラ菌及びトキソプラズマの伝染に関与するとされている。ゴキブリは アレルギー源を含有し ている。およそ人口の7.5%はこれらのアレルギー源に対し感受性である。 ゴキブリは餌で防除されることが多い。これらの餌は家屋やレストランで使用 されるのでゴキブリ用殺虫剤は人に安全でなければならない。合成殺虫剤の使用 が多いと抵抗性のゴキブリ群が選択されることとなる。これらの抵抗性のゴキブ リを防除する為に、新しい高度に安全な殺虫剤が必要である。 本発明の簡単な説明 本発明は新規なバシルスチューリンゲンシス（B．t．）単離体、及びその単離 体からの、新規なゴキブリに活性の蛋白質をコードしている遺伝子に関する。本 明細書中でバシルスチューリンゲンシス ＰＳ１８５Ｌ８（B．t．ＰＳ１８５Ｌ ８）として知ることが出来る新規なB．t．単離体はゴキブリ類に対し活性である ことが示されている。 本発明はまた例示ざれる単離体と実質的に同じ殺虫性を有している上記単離体 の変異体を含む。変異体には突然変異体が含まれる。突然変異体を造る手順は微 生物技術でよく知られている。紫外線及びニトロソグアニジンはこの目的によく 使用される。 本発明は更にゴキプリ類を抑制するために、B．t．単離体ＰＳ２０１Ｔ６及び その変異体を使用することに関する。ＰＳ２０１Ｔ６単離体自体又はＰＳ２０１ Ｔ６の変異体、その単離体から得られる毒素、又は遺伝子が別の 宿主に移されているその単離体の遺伝子によって造られる毒素を使用して、ゴキ ブリは抑制され得る。 更に本発明はまた、実質的に無傷の細胞（細胞壁が破壊されていない細胞）が 標的害虫の環境に適用された時に殺虫活性を長期化させるために、本発明の遺伝 子を含有している実質的に無傷のB．t．細胞及び組替え細胞を処理することを含 んでいる。そのような処理はこの技術が殺虫剤の性質に悪影響をせず、また殺虫 剤を保護しでいる細胞の能力を減少させない限り化学的又は物理的手段、又は化 学的及び物理的手段の組合せであり得る。処理された細胞は殺虫毒素の為の保護 コートとして作用する。毒素は標的昆虫によって摂取されるとそのまま作用する ために利用できるようになる。 図面の簡単な記載 図１−蛋白質標準と比較したB．t．ＰＳ１８５Ｌ８の標準ＳＤＳポリアクリルア ミドゲルの写真である。 発明の詳細な記載 本発明の新規なバシルスチューリンゲンシス単離体は生物学的に純粋な形態で 次の特性を有している。 B．t．PS185L8の特徴 コロニー形態---大きなコロニー、くすんだ表面、B．t．に典型的なもの。 成長細胞形態---典型的なB．t．のもの。 培養方法---B．t．に典型的なもの。 B．t．PS185L、B．t．PS201T6及び既知のB．チューリンゲンシス var．クル スタキ（HD-1）の特徴の比較が表１に示される。 本出願に開示された培養基はアメリカ合衆国61604イリノイ州 ペオリア ノ ースユニバーシティー ストリート1815、ノーザン リージョナル リサーチ センター（北部研究所）、農業研究サービス特許培養基コレクション（NRRL）（ Agricu1tural Research Service Patent Culture Collection（NRRL），Northen Regional Research Center，1315 North University Street，Peoria Illinois 61604，U．S．A．）に寄託された。 これらの培養基は37 CFRの1.14及ひ35 U．S．C 122のも とで特許商標庁長官に権限ありと決定されたものは、その特許の継続中に培養基 を入手できることが保証されるという条件下で寄託されている。これらの寄託物 は本出願又はその子孫の出願の対応が出願されている国々の外国法令で要求され るならば入手できる。しかし寄託物の入手可能性は行政行為によって付与された 特許権を侵害して発明を実施する権利を構成するものではないことが理解される べきである。 さらにこれらの培養基は微生物寄託に対するブタペスト条約の規定に従って、 一般に入手可能とされる。即ちこれらは寄託物の寄託試料の提供の最も最近の要 求後少なくとも５年間の期間、そしていかなる場合にも寄託日後少なくとも30年 の期間、又は培養基を開示して発行され得るあらゆる特許の権利行使可能な期間 、寄託物を生きたまま、そして汚染されないように保つために全ての必要な注意 をもって保存される。寄託者は、寄託物の状態の為に要求された時に、寄託所が 試料を提供することが出来ないならば、寄託物を置き換える義務を有することを 認める。この培養基寄託物の一般への入手可能性についての全ての制限は、開示 する特許の付与によって永久に取除かれる。 本発明のB．t．細胞は標準の技術の培地及び発酵技術を使用して培養できる。 発酵サイクルが完了すると細菌はまずB．t．胞子及び結晶を、この分野で良く知 られた手段 によって発酵ブロスから分離することによって収穫できる。回収されたB．t．胞 子及び結晶は特定の標的害虫に対し取扱いと適用を容易にするために表面活性剤 、分散剤、不活性担体及びその池の成分を添加することにより水和粉末、液体濃 縮物、顆粒、又は池の処方に処方できる。これらの処方剤及び適用手順は全てこ の分野でよく知られている。 処方された生成物はゴキブリを防除するために餌として適用されるか又はスプ レーできる。 本発明のB．t．細胞は、標的害虫の環境に細胞が適用されるときに殺虫活性を 長引かせるために処方前に処理できる。そのような処理は、技術が毒素の性質に 悪影響をしない限り、また毒素を保護する細胞の能力を減少させない限り化学的 又は物理的手段、又は化学的及び／又は物理的手段の組合せによるものであり得 る。化学剤の例はハロゲン化剤、特に原子番号17〜80のハロゲンによるものであ る。より詳しくは温和な条件下でヨウ素が使用でき、そして所望の結果を達成す るために十分な時間行なわれる。他の適当な技術にはアルデヒド、例えばホルム アルデヒド及びグルタルアルデヒドでの処理、抗感染剤例えばゼフィランクロラ イド、アルコール類例えばイソプロピルアルコール及びエターノール；種々の組 織学的固定剤例えばボウイン（Bouin）固定剤及びヘリー（Helly）固定剤（ヒュ ーマソン，グレッチェン L.、アニマル組織 技術、（W．H．フリーマン アンド カンバニー 1967参照）での処理、又は細 胞が宿主動物に投与された時に細胞中に造られる毒素の活性を保存し、長引かせ る物理（熱）及び化学剤の組合せが含まれる。物理的手段の例はガンマー線照射 、Ｘ線照射などの短波長照射、凍結、紫外線照射、凍結乾燥等である。 本発明の新規な単離体が宿す毒素遺伝子は広範囲な微生物宿主中に導入できる 。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に、殺虫剤の細胞内生産及び維持を生じる 。適当な宿主、例えばシュードモナスでは微生物はゴキブリが増殖し、そしてそ の昆虫によって摂取ざれる、ゴキブリのいる場所に適用できる。その結果望まれ ない昆虫が抑制される。別の方法として、毒素遺伝子を宿している微生物は細胞 内で造られる毒素の活性を長引かせる条件下で処理できる。処理された細胞は次 に標的害虫の環境に適用できる。生じる生成物はB．t．毒素の毒性を維持する。 B．t．毒素遺伝子が適当なベクターを経由して微生物宿主に導入され、そして その宿主が生きている状態で環境に適用される場合には、ある種の宿主微生物が 使用されることが必須である。微生物宿主は生息地を占めることが知られている ものが選択される。微生物宿主はまたゴキブリの特定の種と共生的に生きるもの であり得る。これらの微生物は野性型の微生物と特定の環境（昆虫の生息地）中 で巧く競争できるように選ばれ、ポリペプチド 殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持と発現を提供し、そして望ましくは環境中 に於ける分解及び不活性化から殺虫剤の保護の改良を提供する。 数多くの微生物がそういう生息地に生息することが知られている。これらの微 生物には細菌、藻類、菌類が含まれる。これらのうち特に奥味あるのは微生物、 例えば細菌、例えば次属のもの：シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニ ア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クリブシエラ（Klebsiella）、キサン トモナス（Xanthomnas）、ストレプトマイセス（streptomces）、リゾビウム（R hizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Me yhylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Ace tobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobac ter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、 及び アルカリゲネス（Alcaligenes）；菌類、例えば次属のもの：サッカロミ セス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイベロマイ セス（Kluyveromyces）・スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ （Rhodotorula）、及びオーレオバシジウム（Aureobasidium）である。特に興味 が持たれるのは次の様な細菌種である。シュードモナス シリンガエ（Pseudomo nas syringae）シュードモナス フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens ）、セラチ アマルケスセンス（Serratia marcescens）、アセトバクタークシリニウム（Ace tobacter xylinum）、アグロバクテリウムツメファシエシス（Agrobacterium tu mefaciens）、ロドシュードモナススフェロイデス（Rhodopseudomonasspheroide s）、キサントモナスカムペストリス（Xantho-monnas campestis）、リゾビウム ノリオチ（Rhizobiummelioti）、アルカリゲネス エントロバス（Alcaligenes entrophus）及び アゾトバクタービンランディイ（Azotobacter vinlandii）； 及び次の様な酵母種、例えばロドトルラ ルブラ（Rhodotorula rubra）、ロド トルラ グルティニス（R．glutinis）、ロドトルラ マリナ（R．marina）、ロ ドトルラアウランティアカ（R．aurantiaca）、クリプトコッカスアルピダス（C ryptococcus albidus）、クリプトコッカスディフルエンス（C．diffluens）、 クリプトコッカスラウレンティイ（C．laurentii）、サッカロミセスロゼイ（Sa ccharomyces rosei）、サッカロミセスプレトリエンシフ（S．pretoriensis）、 サッカロミセスセレビシアエ（S．cerevisiae）、スポロボロマイセスロセウス （Sporobomyces yoseus）、スポロボロマイセスオドラス（S．odorus）、クルイ ベロマイセス ベロナエ（Kluyveromyces veronae）、及びアウレオバシジウム ポルランス（Aureobasidium pollulans）。特に興味があるのは色素微生物であ る。 遺伝子の安定な維持と発現を可能とする条件下で、微 生物宿主中に毒素を発現するB．t．遺伝子を導入するために種々の方法が利用で きる。毒素遺伝子を発現するための転写及び翻訳調節シグナル、それらの調節制 御下の毒素遺伝子、及び組込みを生じる、宿主生物の配列と相同のDNA配列、及 び／又は組込み又は安定な維持を生じる、宿主中で機能する複製系を含むDNA構 築物を提供することができる。 転写開始シグナルはブロモーターと転写開始出発位置を含む。ある場合には環 境に放出した後にのみしか毒素の発現が生じないような毒素の調節的な発現を提 供することが望まれるかもしれない。これはオペレーターで、又は微生物の物理 的又は化学的な環境の変化で誘発できるアクチベーター又はエンハンサーに対す る領域結合で達成できる。例えば温度感応性の調節領域を使用でき、この場合は この生物は毒素の発現なしに実験室で成育できるが、環境に放出すると発現が開 始する。他の技術では毒素の発現を阻害する実験室内の特定の栄養培地を用いる ことができ、この場合環境中の栄養培地は毒素の発現を可能とする。翻訳開始の ためにはリボソーム結合位置及び開始コドンが存在するであろう。 メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作を用いることが出来、特に 活性プロモーターを使用することにより、並びにメッセンジャーRNAの安定性を 強化する配列を用いることによって行なうことができる。開始 領域及び翻訳停止領域はストップコドン、ターミネーター領域、及び任意付加的 に存在できるボリアデニル化シグナルを含む。 転写の方向、即ちコード化配列又はセンス配列の５’から３’への方向に於い て、構築物はもしあるならば転写調節領域及びプロモーター（ここで調節領域は プロモーターの５’又は３’の何れかであり得る）、リボソーム結合位置、開始 コドン、開始コドンと相が一致するオープンリーディングフレームを有している 構造遺伝子、ストップコドン（単数又は複数）、もしある場合にはポリアデニル 化シグナル配列、及びターミネーター領域を含むであろう。二本鎖としての二の 配列は微生物宿主の形質転換のためにはそれ自体で使用されうるが、通常はマー カーを件うDNA配列が含められており、その場合には第二のDNA配列はDNAを宿主 中へ導入する間に毒素発現構築物と結合され得る。 マーカーとは変更又は形質転換されている宿主の選択を提供するための構造遺 伝子を意図している。マーカーは通常は選択的な利点、例えば殺生物剤抵抗性、 例えば抗生物質抵抗性又は重金属抵抗性、独立栄養宿主に対し原栄養性を提供す るための相補性などを通常与える。好ましくは変更された宿主が選択されるのみ ならず、フィールド中で競争的でありうる様に相補性が用いられる。構築物の開 発に於いて、並びに宿主を変更するのに、１ 又はそれ以上のマーカーが用いられ得る。生物はさらにフィールド中の他の野性 型の微生物に対する競争的利点を提供することによってさらに変更され得る。例 えば金属キレート化剤、例えばシデロフォア（siderohores）を発現する遺伝子 は、毒素を発現する構造遺伝子と共に宿主中に導入できる。この方法でジテロフ ォアの強化された発現が毒素生産宿主に対する競争的な利点を提供し、従ってこ れは野性型の微生物と効率的に競争し環境に於ける生態的地位を安定に占めるこ とができる。 機能しうる複製系が存在しない場合には、構築物は少なくとも50塩基対（bp） 、好ましくは少なくとも約100bp、そしで通常は約1000bpを越えない宿主の配列 と相同の配列を含むであろう。この方法で正当な組替えの確率が強化されるので 遺伝子は宿主中に組込まれ、そして安定に宿主によって維持される。望ましくは 毒素遺伝子は相補性を提供する遺伝子並びに競争的な利点を提供する遺伝子の近 くにある。そうすれば毒素遺伝子が失われた場合には、生じる生物は相補性の遺 伝子及び／又は競争的利点を提供する遺伝子も失い、従ってそのままの構造を維 持する遺伝子と環境中で競争することができない。 細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、菌類等の種々の広い範 囲の微生物宿主から数多くの転写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域は 、trp遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモー ター、tacプロモーター、宿主中で機能する場合の、毒素遺伝子と関連する天然 のプロモーター、関連領域を含む。例えば米国特許4,332,898、4,342,832及び4, 356,270を参照。その停止領域は２つの領域が適合性で宿主中で機能できる限り に於て、その転写開始領域と又はある異なる転写開始領域と通常関連する停止領 域であり得る。 安定なエピゾーム維持又は組込みが望まれる場合には、プラスミドは宿主中で 機能し得る複製系を有するものが用いられる。複製系は染色体、宿主又は異なる 宿主中に通常存在するエピゾームエレメント、又は宿主中で安定なウイルスから の複製系に由来できる。数多くのプラスミドが利用でき、例えばpBR322、pACYC1 84、RSF1010、pR01614及びその也が利用できる。例えばオルソン等、（1982）、 J．Bacteriol．150：6069及びバブダサリアン等、（1981）（Cene 16：237及び 米国特許第4.356,270、4,362,817、4,371,625を参照。 B．t．遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように転写及び翻訳開始領域と、 転写及び翻訳停止領域の間に導入できる。この構築物はプラスミド中に導入され 、プラスミドは少なくとも１つの複製系を含むが、１つの複製系がプラスミドの 開発の間のクローニングのために使用され、第２の複製系が究極の宿主中で機能 するために必要であるときは、１以上の複製系を含むことができる。さらに前に 記載した１又はそれ以上のマーカーが存在でき る。染色体への組み込みが望まれる場合にはプラスミドは望ましくは宿主ゲノム と相同の配列を含むであろう。 形質転換体は、存在する場合に変更されていない生物又は移し変え用生物から 、望まれる生物を選択することを可能とする選択技術を通常用いて、慣用の方法 に従って単離できる。形質転換体は次に殺虫活性について試験できる。 適当な殺虫剤含有細胞が細胞中の毒素の活性を長期化させるために処理され、 処理された細胞が標的害虫に適用される場合には、適当な宿主細胞は、哺乳類等 の高等生物に対し毒性である物質を造り出さない細胞に通常限定されるが、原核 細胞、真核細胞のいずれかを含み得る。しかし高等生物に対し毒性の物質を造る 生物も、哺乳類宿主に対する毒性の可能性をさけ得るほど毒素が不安定であるか 十分低い適用水準であるならば使用できる。特に興味ある宿主は原核細胞及び低 級真核細胞、例えば菌類である。グラム陰性及び陽性の両方を含む原核生物の例 には、エセリキア、エルウィニア、シジェラ、サルモネラ、及びプロテウスなど のエンテロバクテリアセアエ（Enterobacteriaceae）；バシラセアエ（Bacillac eae）；リゾビウムなどのリゾビセアエ（Rizobiceae）；フォトバクテリウム、 ジモモナス（Zymomonas）、セラチア、アエロモナス、ビブリオ、デサルフォビ ブリオ、スピリリウムなどのスピリラセアエ（Spirillaceae）；ラクトバシラ セアエ（Lactobacillacea）；シュードモナス及びアセトバクターなどのシュー ドモナダセアエ（Pseudomonabaceae）；アゾトバクテラセアエ（Azotobacterace ae）；及びニトロバクテラセアエ（Nitorobacteraceae）が含まれる。真核生物 のなかでは、真菌類、例えば、藻状菌（Phycomycetes）、サッカロミセスやシゾ サッカロミセスなどの酵母を含む、子嚢菌（Ascomycetes）、及び担子菌酵母、 例えばロドトルラ、オウレオバシディウム、スポロボロマイセス等がある。 製造の目的の宿主細胞を選択するのに特に興味ある特徴は、宿主へのB．t．遺 伝子の導入の容易さ、発現系の入手可能性、発現の効率、宿主中の殺虫剤の安定 性、及び補助的な遺伝子的能力の存在が含まれる。殺虫剤ミクロカプセルとして 使用するために興味ある特微には、殺虫剤の保護性質、例えば厚い細胞壁、色素 形成、細胞内のパッケージレグ又は封入体の形成；葉の親和性；哺乳類への毒性 がないこと；害虫が摂取するのに魅力的かどうか；毒素の損傷なしに殺すことと 固定できることの容易さ等である。他の考慮点には処方、取扱の容易さ、経済性 、貯蔵安定性等である。 特に興味のある宿主生物は、酵母、例えばロドトルラの種、オーレオバシディ ウムの種、サッカロミセスの種、スポロボロマイセスの種、シュードモナスの種 、エルウィニアの種、及びフラボバクテリウムの種、又は他の生 物例えば、エセリキア、ラクトバシルスの種、バシルスの種、ストレプトマイセ スの種などが含まれる。特定の生物には、シュードモナス アエルギノサ、シュ ードモナス フルオレスセンス、サッカロミセス セレビシアエ（S．cerevisia e）、バシルス チューリンゲンシス、エセリキア コリ、バシルス ズブティ リス、ストレプトマイセス リビダンスなどが含まれる。 細胞は通常は無傷であり、胞子形であるよりも処理された時に実質的に増殖型 であるが、ある場合には胞子も使用できる。 組替え微生物菌体の処理は、後に記載する様に行ない得る。処理菌体は、一般 に、環境条件への抵抗性を強める、強化された構造的安定性を有する。殺虫剤が プロ型のときは、不活性化方法は、標的害虫病原体によって殺虫剤のプロ型から 完成型への処理がなされるのを妨げないように選択されるべきてある。例えばホ ルムアルデヒドは蛋白質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤のプロ型を処理すること を妨げ得る。不活性化又は殺菌方法は毒素の生物利用性又は生物活性の実質的な 部分を少なくとも保持する。 DNA構造物が選択的な利点を提供する場合、B．t．殺虫遺伝子を含有している 細胞宿主は、任意の都合のよい栄養培地中で成育することができ、細胞の実質的 な全て又は全てがB．t．遺伝子を保持するように選択培地を提供す る。これらの細胞は次に慣用方法に従って収穫される。別の方法として細胞は収 穫前に処理することができる。 B．t．菌体は種々の方法で処方できる。これらは種々の不活性材料、例えば無 機鉱物（フィロシリケート類、炭酸塩類、硫酸塩類、燐酸塩類等）又は植物材料 （粉末化とうもろこしの穂軸、米の籾殻、胡桃の殻など）と混合することによっ て水和粉末、餌、顆粒、又は散布剤として用いることができる。処方剤はスプレ ッダー-スティッカー（spreader-sticker）助剤、安定化剤、他の殺虫添加剤又 は表面活性剤を含み得る。液体配合物は水性基盤又は非水性であり得、フォーム 、ゲル、懸濁液、乳化可能な濃縮物などとして用いることができる。成分はレオ ロジー剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤、又は重合体を含み得る。 殺虫濃度は特定の処方の性質、特にこれが濃縮物か直接使用されるに依存して 広く変り得る。殺虫剤は少なくとも１重量％で存在し、そして100重量％であり 得る。乾燥配合剤は殺虫剤の約１〜95重量％を有するが、一方液夜体配合剤は一 般に液相中の約１〜60重量％の固体である。配合剤は一般にmg当り約10²〜10⁴細 胞を有する。これらの配合剤はヘクタール当り約50mg（液体又は乾燥）〜１kg又 はそれ以上投与される。 処方剤はゴキブリの環境、例えば植物、土壌、又は水に対しスプレー、噴霧、 散布（スプリンクル）、餌など によって適用できる。 以下は最良の態様を含めた本発明を実施する手順を説明する実施例である。こ れらの実施例は制限するものと解釈されるべきではない。別途記載されない限り 全ての％は重量により、全ての溶媒混合物割合は容量による。 実施例１ B．t．単離体の培養 B．t．単離体のサブカルチャーは次の培地、ペブトングルコース塩培地に接種 するために使用できる。 塩溶液及びCaCl₂溶液を瀘過滅菌し、接種の時にオートクレーブされた調理さ れたブロスに加えた。フラスコ を30℃でローターリーシェーカー上で200rpmで64時間培養した。 上の手順はこの分野で良く知られた手順によって大規模醗酵に容易にスケール アップできる。 上記醗酵で得られたB．t．の胞子及び結晶はこの分野で良く知られた手順で単 離できる。よく使用される手順は収穫した醗酵ブロスを分離枝術、例えば遠心分 離にかけることである。実施例２ B．t．単離体の試験 B．t．PS185L8の胞子-結晶ペレットを、0.5%の２-メルカプトエタノールを有 する0.1MのＮａ₂ＣＯ₃、pH 11.5中に懸濁し、２時間室温で培養した。懸濁液を0 .1MのＮａＨＣＯ₃、pH 9.5に対し４℃で18時間透析し、試料容量の15倍を３回交 換した。この水性懸濁液をジャーマンコックローチ、Blatella germanicaに自由 に食べさせた。毎日の間隔で致死率を評価した。処理10〜12日でB．t．PS185L8 は80%を越える致死率を生じ、一方対照の致死率は３%以下であった。実施例２ B．t．単雑体201T6の試験 B．ｔ．菌株201T6の胞子-結晶ペレットを、0.5%のβ-メルカプトエタノールを 含有する0.1MのＮａ₂ＣＯ₃、pH 11中に懸濁した。懸濁液を室温で一時間放置し 、続いて15容量の0.1MのＮａ₂ＣＯ₃、pH 9.5に対し室温で３時間透析した。この 水性懸濁液を、ジャーマンコックローチ、 Blatella germanicaに自由に食べさせた。処理21日でB．t．菌株PS201T6は78%の 致死率を生じ、一方対照の致死率は３%以下であった。 ルール6.4が適用される場合は、そのような日は国際寄託機関の地位を得た日で ある。国際寄託機関の地位を得た後にブタペスト条約外でなされた寄託がブタペ スト条約下の寄託に変換された時は、そのような日は国際寄託機関によって微生 物が受取られた日である。 ルール6.4が適用される場合は、そのような日は国際寄託機関の地位を獲得した 日である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/20 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:065） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＳ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＰＬ，ＲＵ (72)発明者 ランドール，ジョン，ビー, アメリカ合衆国 53406 ウイスコンシン 州 レイシン センテニール レーン1729 (72)発明者 ブロワー，デビット，オーリン アメリカ合衆国 53405 ウイスコンシン 州 レイシン ウエストブルバード529

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ゴキブリを、NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性を有しているB ．t．単離体PS185L8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t ．単離体PS201T6、及び上記単離体の変異体、からなる群から選択されるバシル スチューリシゲンシスのゴキブリ抑制量と接触させることからなる、ゴキブリの 抑制方法。 ２． 該ゴキブリがジャーマンコックローチ（Blatella germanica）である請求 項１に記載の方法。 ３． 実質的に無傷のB．t．細胞が標的害虫の環境に適用されたときに殺虫活性 を長期化させるように処理されている請求項１に記載の方法。 ４． （1）NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性を有しているB．t．PS1 85L8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t．PS201T6、及 び上記単離体の変異体、からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス 単離体；又はその単離体又は変異体の胞子、結晶又は毒素、を含む餌を調製し、 そして （2）該餌をゴキブリが訪れる区域に置くこと、 からなるゴキブリの抑制方法。 ５． PS185L8、PS201T6からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス 単離体及びそれらの単離体の変異体；又はそれらの単離体からの胞子、結晶又は 毒素、を殺虫剤担体と組合せた組成物。 ６． NRRL B-18915のゴキブリに対する活性の同定特性を有するバシルスチュー リンケンシスPS185L8又はその変異体の生物学的に純粋な培養基。 ７． NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t．単離体PS185L 8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t．単離体PS201TG、 及びそれらの単離体の変異体からなる群から選択されるバシルスチューリンゲン シスによって造られるゴキブリに対し活性の毒素。 ８． NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性を有しているB．t．単離体PS 185L8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t．単離体PS201 T6、及び上記単離体の変異体、からなる群から選択されるバシルスチューリンゲ ンシフから得ることが出来るＤＮＡであって、ゴキブリに対し活性のバシルスチ ューリンゲンシス毒素をコードしたＤＮＡ。 ９． NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性を有しているB．ｔ．単離体P S185L8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t．単離体PS20 1T6、及び上記単離体の変異体、からなる群から選択されるバシルスチューリン ゲンシスから得ることが出来るＤＮＡであって、ゴキブリに対し活性のバシルス チューリンゲンシス毒素をコードするＤＮＡを含んでいる組替えＤＮＡ運搬ベク ター。 10． 原核又は真核宿主中に移され、複製される請求項９に記載のＤＮＡ運搬ベ クター。 11． NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性を有しているB．t．単離体PS 185L8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有するB．t．単離体PS201 T6、及び上記単離体の変異体、からなる群から選択されるバシルスチューリンゲ ンシスによって製造可能な毒素であってゴキブリに対し活性なハシルスチューリ ンゲンシス毒素を発現する為に形質転換された細菌宿主。 12． シュードモナス、アゾトバクター、エルウィニア、セラチア、クレブシエ ラ、リゾビウム、バシラス、ストレブトマイセス、ロドシュートモナス、メチロ フィラス、アグロバクチリウム、アセトバクター、又はアルカリゲネスの種であ る請求項11に記載の微生物。 13． 請求項12に記載の微生物をゴキブリ又はゴキブリの環境に投与することを 含む、ゴキブリの抑制方法。 14． 標的害虫の環境に適用されたときに長期化された殺虫活性を有する実質的 に無傷の処理細胞を含有する殺虫剤を含んでいる殺虫組成物であって、該殺虫剤 は、ゴキブリに対するポリペプチド毒素であり、細胞内にあって、ゴキブリに対 し活性なバンルスチューリンゲンシス毒素の発現が出来る形質転換された微生物 の発現の結果つくられ、該毒素は、NRRL B-18915の特性のゴキブリに対する活性 を有しているB．t．単離体PS185L8、NRRL B-18 750の特性のゴキブリに対する活性を有するPS201T6、及び上記単離体の変異体、 からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシスによって造られるもので ある殺虫剤組成物。 15． 該処理細胞が環境中で殺虫剤活性を長期化させるために化学的又は物理的 手段によって処理されている請求項１４に記載の殺虫組成物。 16． 該細胞が原核又は低級真核生物である請求項１５に記載の殺虫剤組成物。 17． 該原核細胞がエンテロバクテリアセアエ（Enterobacteriaceae）、バシラ セアエ（Bacillaceae）、リゾビアセアエ（Rhizobiaceae）、スビリラセアエ（S pirilacae）、ラクトバシラセアエ（Lactobacillaceae）、シュードモナダセア エ（PSeudomonadaceae）、アゾトバクテラセアエ（Azotodacteraceae）、及びニ トロバクテラセアエ（Nitrobacteraceae）からなる群から選択ざれる請求項１６ に記載の殺虫剤組成物。 18． 該低級真核細胞が藻状菌、子嚢菌、及び担子菌からなる群から選択される 請求項１６に記載の殺虫組成物。 19． 細胞内毒素を含有している処理された実質的に無傷の単一徽生物細胞であ って、該毒素はゴキブリに対し活性のポリペプチド毒素に対しコードするバシル スチューリンゲンシス毒素遺伝子の発現の結果であり、該毒素がNRRL B-18915の 特性のゴキブリに対する活性を有して いるB．ｔ．単離体PSl85L8、NRRL B-18750の特性のゴキブリに対する活性を有す るB．t．単離体PS201T6、及び上記単離体の変異体、からなる群から選択される バシルスチューリンゲンシスによって製造出来、該細胞は標的昆虫の環境に細胞 が適用されたときに殺虫活性を長期化させる条件下で処理されたものである微生 物細胞。 20． 該細胞が環境中で殺虫活性を長期化させる為に化学的又は物理的手段によ って処理された請求項１９に記載の細胞。