JPH08505121A

JPH08505121A - 分子プローブとしての４，７−ジクロロフルオレセイン染料

Info

Publication number: JPH08505121A
Application number: JP6507415A
Authority: JP
Inventors: メンシェン，ステベン，エム; リー，リンダ，ジー; コンネル，チャールス，アール; ハーシー，エヌ，デービス; チャケリアン，バージン; ウー，サム，エル; ステベンフング
Original assignee: アプライドバイオシステムズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1993-09-01
Publication date: 1996-06-04
Also published as: JP2009000119A; JP2004225049A; EP0658167B1; JP4554224B2; EP0658167A1; DE69324494T2; JP2011162548A; WO1994005688A1; DE69324494D1

Abstract

(57)【要約】長波長の狭い発光バンド幅のフルオレセイン染料が、空間的に重なっている標的物質を検出するために提供される。この染料は４，７−ジクロロフルオレセイン、および特に２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインから成る。この染料をＤＮＡ分析に使用するための方法およびキットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】分子プローブとしての４，７−ジクロロフルオレセイン染料発明の技術分野本発明は一般に蛍光標識技術に関し、そしてさらに特に、同じ試料中の多数の標的物質を検出ずるための４，７−ジクロロフルオレセインの使用に関するものである。背景多くの診断上および分析上の技術は同じ試料中の多数の標的物質を区別できる蛍光タグで標識を付けることを必要としている、例えばラニールら、ジャーナル・イムノロジイ、第132巻、第151〜156頁（1984）（フローサイトメトリー）；グレイら、クロモソマ、第73巻、第９〜27頁（1979）（フローシステム核型）；フングら、米国特許4,855,225号（ＤＮＡ配列決定）；およびマリイランドら、アプライド・アンド・セオリティカル・エレクトロフォレシス、第３巻、第１〜 11頁（1992）（電気泳動により分離したポリメラーゼ鎖反応（PCR）生成物の分析）。この要請は、最も自動化された配列決定アプローチにおいて少なくとも４種のスペクト・ルにより分解できる色素が必要であるＤＮＡ配列決定分析で満足させることは特に難しい。現在、ＤＮＡ配列決定には２つの基本的なアプローチがある：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えばサンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、第5463〜5467頁（ 1977）；および化学分解方法、例えばマキサムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、第560〜564頁（ 1977）。チェイン・ターミネーター法は幾つかの方法で改良され、あらゆる一般に入手できる自動化ＤＮＡ配列決定機器のための基礎として役に立っている、例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第143巻、第161〜178頁（1980）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第129巻、第169〜172 頁（1979）；スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13巻、第2399〜 2412頁（1985）；スミスら、ネイチャー、第321巻、第674〜679真（1987）；プロパーら、サイエンス、第238巻、第336〜341頁（1987）、セクションII、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第155巻、第51〜334頁（1987）；チャーチら、サイエンス、第240巻、第185〜188真（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、第５巻、第342〜348頁（1987）。鎖末端および化学分解方法は共に１またはそれ以上のセットの標識を付したＤＮΛフラグメントの世代を必要とし、各々は共通の起源をもち各々は既知の塩基を末端とする。次にフラグメントの単数または複数のセットは大きさによって分離され配列情報が得られる。両者の方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によって分離される。最も自動化されたＤＮＡ配列決定機器では、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、例えばスミスら（1987、上記）、あるいは末端ジデオキシヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロパーら（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメントが分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメントによって放出される蛍光信号を分析することによって塩基配列は決定される。異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入手することはこのようなＤＮＡ配列決定システムでは主要な難点である。第１に、有機蛍光染料に対する代表的な発光バンド半幅は約40〜80ナノメートル（ｎｍ）であり可視スペクトルは約350〜400nmに過ぎないので、有意に重なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バンドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞれの蛍光効率が低すぎる場合ＤＮＡ配列決定のために未だ不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、ＤＮＡ・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、15〜21頁（1988）には、増大したゲル荷重が低い蛍光効率を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つかの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンドが広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当する波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用する場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うように強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラグメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーションは接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるようにあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響してはならない。最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作するために用いられる化学物質と相溶性がなければならない。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を妨げてはならない。これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけが、自動化ＤＮＡ配列決定にまた診断および分析の技術に使用できることが見出された、例えばスミスら（1985、上記）；プロパーら（上記）；フードら、ヨーロッパ特許出願8500960 号；およびコンネルら（上記）。上記の観点では、ＤＮＡ配列決定のような、多くの分析および診断の技術は、（１）容易に入手できる染料に物理化学的に類似のもの、（２）ゲル上の密に配置されたＤＮＡバンドのような空間的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）自動化ＤＮＡ配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、および（４）広範囲の予備および手先のテクニックを用いての使用において影響を受けやすいもの、である新しい蛍光染料の入手容易性によって有意に促進されるであろう。発明の概要本発明は４，７−ジクロロフルオレセイン染料を使用して空間的に重なる標的物質を同時に検出する方法、そして特に、４，７−ジクロロフルオレセイン染料を用いるＤＮＡ配列決定の方法にある。本発明はまた式１によって定義される２ ’，７’−ジクロロ−５（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインを含む。式中、Ａ’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはアミノであり；好ましくはＡ’は連結官能体または連結官能体に変換できる基であり；Ｘ’は水素、フルオロまたはクロロであり、Ａ’が６個の炭素原子の置換基であるときは必ずＸ’は５個の炭素原子の置換基であり、そしてＡ’が５個の炭素原子の置換基であるときは必ずＸ’は６個の炭素原子の置換基であり；好ましくはＸ’は水素であり；Ｚ₃水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり；好ましくはＺ₃は水素またはクロロであり；Ｚ₄は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり；好ましくはＺ₄は水素またはクロロであり；Ｂ’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基；好ましくはＢ’はカルボキシルまたはスルホニル、および最も好ましくはＢ’はカルボキシルであり；そしてＡ’、Ｚ₃、およびＺ₄の少なくとも１個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である。好ましくはＡ’、Ｚ₃、およびＺ₄の１個のみは連結官能体または連結官能体に変換できる基である。本発明はまた本発明の方法を実施するためのキットを含む。一般に、キットはＤＮＡフラグメントの電気泳動により分離された複数のクラスを検出するために提供される。特に、キットはプライマー伸長生成物の少なくとも１つのクラスに４，７−ジクロロフルオレセイン染料で蛍光による標識を付けるＤＮＡ配列決定を行うためのものを含む。このようなＤＮＡ配列決定キットは染料で標識を付けたプライマーをもつキットを含み、より好ましいものとしては染料で標識を付けたターミネーターをもつキットを含む。全体にわたり、カラー・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、1971）炭素ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９’−フェニルの炭素を指す。本発明は、４，７−クロロ−５（および６−）カルボキシフルオレセインおよび関連する染料の蛍光性が分子プローブとしての使用に非常に有利であることを発見したことに一部は基づいている。これらの発光バンド幅は４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に 20〜30パーセント狭く、これらの発光および吸収の最大値は４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に約10〜30nm高く、そしてこれらの蛍光効率は高く、いくつかの場合には４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体のそれのほぼ３倍である。発明の詳細な説明上述のように、本発明は通常長い波長、狭い発光バンド幅および他の有利な蛍光性にて最大の吸収および発光を示すある種のフルオレセイン染料の発見に一部は基づくものである。さらに、本発明はこの種の染料の種類として式Ｉによって定義される新規のフルオレセイン類似体を含む。これらの染料はスペクトルにより分解できる、自動化ＤＮＡ配列決定分析に特に利用できる物理化学的に類似の染料の新規なセットのアセンブリを可能にする。ここで使用される染料のセットに関係する語「スペクトルにより分解できる」は、染料の蛍光発光バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシステムによって各染料によって発生した蛍光信号に基づいて区別することができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,558号、4,811,218 号等、またはホイーレスら、フロー・シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・データ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨーク、1985）の21〜76頁に記載されたようなシステムが挙げられる。ここで直接にまたはエーテルと関連して使用される「低級アルキル」の語は、１〜６個の炭素原子を含む直鎖および／または分技鎖アルキル基を示し、例えばこの語はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert−ブチル、イソブチル等を含む。さらに好ましくは、この「低級アルキル」の語は、１〜３個の炭素原子をもつアルキルを示す。ここで使用される「ハロ」はハロゲン原子、弗素、塩素、臭素、および沃素を示し；さらに好ましくは、この語は弗素または塩素を示し；そして最も好ましくは、この語は塩素を示す。好ましくは、本発明の４，７−ジクロロ−５（および６−）カルボキシフルオレセイン染料は式IIによって定義されるものを含む。式中、Ａ’、Ｂ’およびＸ’は上記と同じであり；Ｚ₁は水素または、Ｚ₂と共にとるときは、ベンゾであり；Ｚ₂は、単独でとるときは、、水素、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、または活性連結官能体に変換できる基、例えば、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり、またはＺ₁と共にとるときは、Ｚ₂は活性連結官能体に変換できるメチルアミノであり、またはＺ₅と共にとるときは、Ｚ₆はベンゾであり、好ましくは、単独でとるときは、Ｚ₆は水素、メチル、エチル、フルオロ、クロロ、メトキシ、またはエトキシであり；そしてＡ、Ｚ₂、Ｚ₃、Ｚ₄、およびＺ₅の少なくとも１個は連結官能体に変換できる基である。好ましくは、Ａ、Ｚ₂、Ｚ₃、Ｚ₄、およびＺ₅の１個のみが活性連結官能体に変換できる基である。本発明に使用するための多くの染料は市販品として入手できるかまたはこの分野で知られている技術によって合成できる、例えば、ガタクら、ジャーナル・オブ・ザ・インディアン・ケミカル・ソサイアティ、第６巻、第465-471真（1929 ）；およびカンナら、米国特許4,439,356号。あるいは、フルオレセイン類似体、即ち、Ａ＝Ｂ＝カルボキシルは、実施例に示されるように、置換したレゾルシノールを置換したベンゾフェノンと、または置換したトリメリット酸と、プロピオン酸の存在下に反応させて合成することができる。スルホニルフルオレセイン、即ちＡまたはＢがスルホニルは、リーら、サイトメトリー、第10巻、第151-16 4頁（1989）によって開示された方法に従って合成され、適当な反応体を置換することにより改変して５−または６−カルボキシル−またはスルホニルフルオレセイン生成物を与える。好ましくは、ＤＮＡ配列決定においてポリヌクレオチドに標識を付けるとき、一般に異性体の混合物を使用する場合バンドの幅が広がるようになる僅かに異なる電気泳動移動性をもつので、染料の５−または６−異性体を別々に使用する。染料の５−または６−異性体は逆相ＨＰＬＣによって容易に分離される、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロジー、第21巻、第561頁（1984）。一般に、最初の溶出ピークは６−異性体および第二の溶出ピークは５ −異性体であると信じられている。本発明の染料はこの分野で良く知られている種々の手段によって標的物質に結合することができる。例えば、ハウグランド、ハンドブック・オブ・フルオレセント・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルス（モレキュラー・プローブス，インコーポレイテッド、ユージーン、1989）は標的物質に染料を結合するための手段のガイドと例を提供する。置換体Ａは、連結基を形成するように標的物質上で相補的官能体と反応できる連結官能体に変換される。次表はＡがカルボキシル、スルホニルまたはアミンであるときは必ず形成できる例示の連結官能体、適当な相補的官能体、および本発明に使用するために適している得られた連結基を列挙している。好ましくは連結官能体は、相補的官能体がアミンであるときは必ずイソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、またはスクシンイミジルカルボキシレートである。そして好ましくは連結官能体は相補的官能体がスルフヒドリルであるときは必ずマレイミド、またはヨードアセトアミドである。例えばカンナら、米国特許4,318,846号の実施例６および８、およびカサイら、アナリチカル・ケミストリー、第47巻、第34〜37頁（1975）に示されているように、スクシンイミジルカルボキシレートは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して上記染料の５−および／または６−カルボキシルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合して形成することができる。従って、これらの文献は参考にここに組み込まれる。染料ホスホルアミダイトはスタインら、ジーン、72巻、333〜341頁（1988）；フングら、米国特許4,757,141号；1989年９月13日に出願されたヨーロッパ特許出願89116946.8号；および1988年８月26日に出願されたヨーロッパ特許出願88307934.5号によって教示されているように生成される。例えばビューケージら、テトラヘドロン、第48 巻、第2223〜2311頁（1992）；カルーサースら、ナラング著、ＤＮＡとＲＮＡの合成と応用（アカデミック・プレス、ニューヨーク、1987）第47〜94頁等によって教示されるように、置換基Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃は種々の形態をとることができる。好ましくは、Ｒ₁およびＲ₂は、別々にとるときは、メチル、エチル、またはイソプロピルであり、そしてＲ₁およびＲ₂は、それらが結合している窒素と共にとるときは、４ないし８個の炭素原子、および窒素、酸素、および硫黄からなる群から選ばれる１ないし２個のヘテロ原子を有する複素環である。さらに好ましくは、Ｒ₁およびＲ₂は、それらが結合している窒素と共にとるときはモルホリノである。好ましくは、Ｒ₃はメチル、クロロフェニル、β−シアノエチル、メチルスルホニルエチル、およびニトロフェニルエチルからなる群から選ばれる。好ましくは、例えばビューケージら（上記)；ステクら、ＰＣＴ出願PCT/US91/01 010；ビューケージら、米国特許5,003,097号等によって教示されているように、ホスホルアミダイト−誘導連結基は酸化されてリン（Ｖ）連鎮を形成する。本発明の染料はＤＮＡ配列決定のためのジデオキシヌクレオチドに標識を付けるために使用されるとき、好ましくはこれらはピリミジン塩基の５番目の炭素および７−デアザプリン塩基の７番目の炭素に連結される。例えば、いくつかの適当な塩基標識化方法が本発明と共に使用できることが報告された、例えば、ギブソンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、第6455〜6467頁（9187）；ゲベイエフら、ヌクレイソク・アシッズ・リサーチ、第15巻、第4513〜4535頁（1987）；ハララムビジスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、第 4856〜4876頁（1987）等。好ましくは、染料と塩基の間の連結基はジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ−誘導化塩基と本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させて形成される。好ましくは連結基は３−カルボキシアミノ−１−プロピニルである。このようなアルキニルアミノ− 誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願番号87305844.0号および米国特許5,047,519号によって教示されている。簡単に述べると、アルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（ホッブスら（上記）によって教示されているように通常は５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７− デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにＡｒを吹き込み、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（O）を添加して生成される。反応混合物は数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオソドの消費を示すまで攪拌することできる。保護されていないアルキニルアミンを使用するときは、アルギニルアミノ−ヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイドロハライドを中和するよにう水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲルのクロマトグラフィーにかけることによって単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用するときは、メタノール／塩化メチレンを反応混合物に続いて強塩基性アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成させることができる。次にスラリーを約45時間攬拌し、濾過し、そして樹脂を追加のメタノール／塩化メチレンを用いて洗うことできる。一緒に合わせた濾液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラディエントを用いてシリカゲルのフラッシュ− クロマトグラフィーで精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られる。本発明の標的物質は本発明の染料が結合できるものであれば事実上何でもよい。好ましくは染料は標的物質に共有結合される。標的物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せおよび集合体、例えば染色体、細胞核、生細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺乳類細胞、組織等を含む。ここに使用されるように「ポリヌクレオチド」の語は、長さが数塩基から数千塩基の大きさの範囲、例えば６から数十ないし数百または数千までの塩基の長さ（一重鎖の場合）、または長さが数塩基対ないし数千塩基対の大きさの範囲、例えば６から数十ないし数百までまたは数千までの塩基対の長さ（二重鎖の場合）でのＤＮＡまたはＲＮＡの一重鎖または二重鎮を意味する。多数の相補的官能体を合成オリゴヌクレオチドおよびボリヌクレオチドの５’ または３’末端に、例えばアミノ基、フングら、米国特許4,757,141号およびミヨシら、米国特許4,605,735号；またはスルフヒドリル基、コノリイ、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13巻、第4485〜4502頁（1985）、およびスボートら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、4837〜4848頁（1987）、を結合することができる。本発明の染料は、類似の物理化学的な性質、例えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有する標的物質の一連のバンドまたはスポットが線状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のような、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチドの種類を同定するために特に良く適している。ここで使用されるように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物理化学的性質に基づいた標的物質の空間的配置または凝集を含む。通常のバンドは電気泳動、特にゲル電気泳動によって染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じる。ポリヌクレオチドの種類は種々の関係において生じることができる。例えば、それらは制限酵素消化の生成物として、またはポリメラーゼまたはリガーゼ反応の伸長生成物として生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定される種類は、対応が４種の可能な末端塩基と１組のスペクトルにより分析できる染料の部分との間に確立されるように末端ヌクレオチドの語において定義される。このような組は、市版品として入手できる分光光度計を用いて発光と吸収のバンド幅を測定して、本発明の染料から容易に集められる。さらに好ましくは、それらの種類はＤＮＡ配列の化学的またはチェイン・ターミネーター法の関係において生じ、最も好ましくはチェイン・ターミネーター法の関係において生じる。何れかの方法において染料−ポリヌクレオチドの共役体は標準のゲル電気泳動方法によって分離される、例えばゴールドおよびマシューズ、上述；リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実際のアプローチ（ＩＲＬプレス・リミテッド、ロンドン、1981）；またはオスターマン、プロテインと核酸の研究方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、1984）。好ましくはゲルのタイプは約２〜20パーセントの間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはストランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第65巻、第299〜305頁（1980）の「98％ホルムアミドまたは７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲルにおける低分子量ＤＮＡおよびＲＮＡの分別」；マニアチスら、バイオケミストリー、第14巻、第3787〜3794頁（1975）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による小さい二重鎖および一重鎖ＤＮΛ分子の鎖長決定」；およびマニアチスら、モレキュラー・クローニング：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ、ニューヨーク、1982）17 9〜185頁によって与えられる。従ってこれらの参照文献は参考のため挙げられる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知れない。例として、約20〜300塩基の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する：19部対１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作られ、48 パーセント（重量／容量）尿素を用いて、ｐＨ8.3（25℃で測定した）にてトリス−ボレートＥＤＴＡ緩衝液に形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは約50℃にて実施された。ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共役体は標準手段、例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー・等によって発光される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチドはアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー光、特に、アルゴンイオンレーザーの488および514nmの発光ラインによって発光される。これらのラインで同時にレーザー光を発する幾つかのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手できる、例えばシオニクス社（サニイベール、ＣＡ）モデル2001等。チェイン・ターミネーター法において、本発明の染料はプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合することができる。染料は、例えばここに参考文献として組み込まれるフングらの米国特許 4,757,141号の教示に従って、プライマーの５’末端の；例えばワードらの米国特許第4,711,955号の教示に従って、プライマーの塩基の相補的官能基に；ホスホルアミダイト結合官能基を介して５’−ヒドロキシルに直接；またはジデオキシヌクレオチドの塩基に、例えばここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願87305844.0号によって開示されているアルキルアミノ結合基を介して、結合することができる。本発明のキットは種々の形をとることができるが、通常大きさにより分離される多重ＤＮＡの蛍光性の検出のための手段を提供する。キットは、ＤＮＡ配列決定のために、（例えば電気泳動によって）大きさにより分離される増幅核酸を検出するため等に用いられる。一般に、キットは、４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けたオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ配列決定キットの具体例において少なくとも１個の染料−ターミネーターに４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた染料−ターミネーター混合物のいずれかを含む。通常、染料−ターミネーターは、上記のように、蛍光染料で標識を付けたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。増幅核酸を検出するためのキットは、４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた少なくとも１個のオリゴヌクレオチド、核酸ポリメラーゼおよび核酸リガーゼからなる群から選ばれる酵素、および反応緩衝液から成る。キットがＤＮＡポリメラーゼを含む場合は必ず、さらにヌクレオシドトリホスフェート混合物、例えば特定の応用、例えば増幅、配列決定等のために適当な濃度のヌクレオシドトリホスフェートを含有するＥＤＴＡの50mM水溶液を含む。キットがＤＮＡ配列決定のためにヌクレオシドトリホスフェート混合物を提供する場合、このようなトリホスフェートは、例えばリーらのヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第20巻、第2471〜2483頁（1992）によって教示されているようなヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）のような類似体を含むと解される。核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素等を含む。好ましくは、キットがＰＣＲ増幅用である場合、核酸ポリメラーゼは、例えばゲルファンドらの米国特許4,889,818号によって開示されているようなTaqポリメラーゼである。特定の具体例のためのＰＣＲ反応緩衝液およびヌクレオシドトリホスフェート混合物を選択するための手引はインニスら著、ＰＣＲプロトコル：ア・ガイド・トゥ・メソッズ・アンド・アプリケイションズ（アカデミック・プレス・ニューヨーク、19 90）に見ることができる。代表的な10X PCR 反応緩衝液は15mMのMgCl₂、500mMの KCl、およひTris-HCl、pH8.3から成る。好ましくは、キットが、例えばランデグレンらの米国特許4,938,617号等によって開示されているようなリガーゼに基づく増幅反応を可能にする場合は必ず、核酸リガーゼは、バラニイのプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第88巻、第189〜193頁（1991）によって開示されているような熱安定性リガーゼである。リガーゼに基づく反応緩衝液を選択するための手引はランデグレンら（上記）、ウら、ゲノミクス、第４巻、第560〜5 69頁（1989）；バラニイ（上記）、およびニッカーソンら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第87巻、第8923 〜8927頁（1990）に見出すことができる。代表的な連結反応緩衝液は20mMのTris -HCl、pH7.6；5OmMのKCl；10mMのMgCl₂；１mMのEDTA； 10mMのNAD⁺、および10mMのジチオトレイトールから成る。キットの染色−標識オリゴヌクレオチドは広範囲の長さをもつことができるが、好ましくはそれらの長さは６ないし60個のヌクレオチドの範囲である。さらに好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは６ないし30個のヌクレオチドの長さの範囲であり、最も好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは16 ないし25個のヌクレオチドの長さの範囲である。オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列は勿論、増幅されるように探索される標的配列によって指図される。ＰＣＲ増幅のための具体例において、ＰＣＲプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドの選択は当該分野では、例えばインニスら（上記）、ヒリアーおよびグリーン、ＰＣＲメソッズ・アンド・アプリケーションズ、第１巻、第124〜128頁（1991）等によって良く知られている。好ましくは、染色−ターミネーターを提供するＤＮＡ配列決定用キットでは、各ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２ ’，７’−ジメトキシ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５ −および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’ ，８’−ジベンゾ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−および６ −カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５− および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインから成る組から選ばれる染料を用いて別々に標識を付けられる。さらに好ましくは、ジデオキシチミジントリホスフェートは６−カルボキシフルオレセイン（“６−ＦＡＭ”）を用いて標識を付けられ、ジデオキシシチジントリホスフェートは２’，４’，５’．７−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＺＯＥ ”を用いて標識を付けられ、ジデオキシアデノシントリホスフェートは２’，４ ’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＨＥＸ”）を用いて標識を付けられ、そしてジデオキシグアノシントリホスフェートは１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−５ −カルボキシフルオレセイン（“５−ＮＡＮ”）を用いて標識を付けられる。ジデオキシアデノシンは２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシンを含み、そしてジデオキシグアノシンは２’，３’−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２’，３’−ジデオキシ−７−デアザイノシンを含み、そしてジデオキシチミジンは２’，３’−ジデオキシウリジンを含むと解される。通常、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは連結基によって標識を付けられる。好ましくは、連結基は２’，３’−ジデオキシシチジンまたは２’，３’−ジデオキシウリジンの５番目の炭素を染料の５または６番目の炭素に連結し、そして連結基は２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシンまたは２’，３’−ジデオキシ −７−グアノシン−または２’，３’−ジデオキシ−７−デアザイノシンの７番目の炭素を染料の５または６番目の炭素に結合する。好ましくは、連結基はカルボキシアミノアルキニルであり、そして最も好ましくは、、連結基は３−カルボキシアミノ−１−プロビニルである。好ましくは、染料−ターミネーターを提供するＤＮＡ配列決定用キットにおいて、核酸ポリメラーゼはSequenase（登録商標）である。実施例１４．７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセイン（“ＡＬＦ”） 0.58ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸、0.72ｇのレゾルシノール、0.5 ml の儂硫酸、および３mlのプロピオン酸をアルゴン下に12時間還流した。反応混合物を150mlの水に注入し、沈澱物を乾燥し、３mlのビリジンに入れ、２mlの無水酢酸塩で１時間アセチル化した。アセチル化混合物は100mlの酢酸エチルに入れ、１Ｎの塩酸、水で洗浄し、蒸発乾固した。残渣を15ｇのシリカゲルに置き、50 mlの酢酸エチルで、次いで４：１の酢酸エチル：メタノールで溶出した。約0.2 のRf（４：１の酢酸エチル：メタノール／シリカゲル）でＵＶ活性物質を含有する画分を蒸発乾燥させた。この残渣を10mlのメタノールに溶解し、次いで１mlの４Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反応混合物を200mlに水で希釈し、次いで0.5mlの濃塩酸を添加した。全混合物を200mlの酢酸エチルで抽出し、その後酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥させ蒸発乾固させて102mgの黄緑色の固体を得た。実施例２４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル実施例１からの13.7mgのフルオレセイン、3.3mgのＮＨＳ、6.4mgのＤＣＣ、および１mlの酢酸エチルを0.5時間攬拌した。固体を濾過し、そして上澄液を３回１：１のブライン：水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させて15mg のＮＨＳエステルを得た。実施例３４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドの結合実施例２からの５mgのＮＨＳエステルを20ulのＤＭＳＯに溶解した；３ulのこの溶液を20ulの1.0mnの５’−アミノヘキシルホスフェートオリゴヌクレオチド（18量体）水溶液および10ulの１Ｍ重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液、 pH9.0から成る溶液に添加した。暗所で１時間後、溶液を10mlのSephadex G-25（ medium）カラムに0.1Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、pH7.0を用いて通過させた。排除容量で溶出する着色物質のバンドを収集した。逆相ＨＰＬＣは、ＤＮＡに結合した染料の５−および６−異性体に対応する２本の主要な蛍光ピークを示した。このビークを集め、pH8.0での50％尿素における蛍光スペクトルは5 28nmでの発光最大値と34nmのハーフマックスでの全幅を示した。実施例４２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシ４，７ージクロロフルオレセイン（“ＢＵＢ”）次の物質および分量に変えた以外は実施例１の方法に従った：1.47ｇの４−メトギシレゾルシノール、0.60ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸、0.2mlの濃硫酸、および４mlのプロピオン酸。この方法は0.180gの４，７−ジクロロ−２’ ，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインを生成した。実施例５２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシ４，７ −ジクロロフルオレセインＮＨＳエステル 18mgのこの染料ＮＨＳエステルは実施例４からの18mgの染料、 3.5mgのＮＨＳ、6.4mgのＤＣＣ、および２mlの酢酸エチルを用いて実施例２と同様に調製した。実施例６４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合実施例５の染料ＮＨＳエステルを用いて実施例３の方法に従った。逆相ＨＰＬＣの間に集められた２本のピークの蛍光スペクトルはpH8.2での50％尿素において544nmでの発光最大値と37nmのハーフマックスでの全幅を示した。実施例７２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“Ｌ０Ｕ”）この染料は実施例４の染料および水性水酸化ナトリウムの次亜塩素酸ナトリウム溶液から調製された。実施例８４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインＮＨＳエステル 1.1mgのこの染料ＮＨＳエステルを実施例７からの0.7mgの染料、0.45mgのＮＨＳ，0.7mgのＤＣＣ、および0.2mlの酢酸エチルから実施例２のように調製した。実施例９４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合この実施例の染料オリゴヌクレオチド結合体を実施例８からの染料ＮＨＳエステルを用いて実施例３と同様に調製した。逆相ＨＰＬＣの間に集められた２本のピークの蛍光スペクトルはpH8.2での50％尿素において558nmでの発光最大値と38 nmのハーフマックスでの全幅を示した。実施例１０１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＮＡＮ”）まず、３，６−ジクロロトリメトリット酸トリクロリドを調製した：0.5gの３，６−ジクロロトリメリット酸と1.3gの五塩化リンの混合物を130℃で40分間加熱した。混合物を室温まで冷却し氷に注いだ。次いで混合物を40mlのエーテルで抽出し、有機画分を２回15mlの水で洗浄し、MgSO₄で乾燥し、透明油（0.7g）まで濃縮した。酸トリクロリドをさらに精製しないで使用した。ＮＡＮを次のように調製した：2.7gの１，３−ジヒドロキシナフタレン、2.84gの３，６−ジクロロトリメリット酸トリクロリド、および８mlのプロピオン酸の混合物を２時間還流した。水（50ml）および酢酸エチル（50ml）を添加した。相を分離して、有機相を３回50mlの１ＭのNaHCO₃で抽出した。水溶液を沸点まで加熱して濃HClで酸性にした。得られた赤色固体（0.2g）を濾過し乾燥した。実施例１１１’，２’，７’，８−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５ −（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＤＥＢ”） 20mgのＮＡＮ、水酸化ナトリウム（15％溶液34ul）、水（１ml）、および次亜塩素酸ナトリウム（５％溶液170ul）を一緒にした。逆相ＨＰＬＣは92％の反応を示した。溶液をHClで酸性にして、20mlの酢酸エチルで抽出し、乾燥（Na₂SO₄）し、20mgまで濃縮した。固体をシリカゲルカラム（径１“×高さ２”）のクロマトグラフィーによって600：60：16の塩化メチレン：メタノール：酢酸で溶出して精製した。染料溶液を濃縮し、希HClおよび酢酸エチルを添加した。有機相を乾燥（MgSO₄）し、20mgのＤＥＢまで濃縮した。実施例１２１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセ・インＮＨＳエステルの生成ＮＡＮ（10mg）を２mlの酢酸エチルに溶解し、ＮＨＳ（10mg）とＤＣＣ（５mg ）を添加した。20分後、溶液は暗赤色になり、結晶固体が現れた。600：60：16 の塩化メチレン：メタノール：酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマトグラフィーはＮＨＳエステルに完全に転換したことを示した。酢酸エチル溶液を希HClで洗浄し、乾燥（NaS0₄）して赤色固体（15mg）まで濃縮した。実施例１３ＤＮＡ配列分析において染料標識プライマーとしてＡＬＦ−、ＢＵＢ−、ＬＯＵ−、およびＮＡＮ−オリゴヌクレオチド結合体を使用染料の全フルオレセインセットを使用してアプライド・バイオシステムズ（フォスター・シテイ、ＣＡ）モデル370A自動化ＤＮＡシーケンサーを用いてチェイン・ターミネーター法でＤＮＡフラグメントに標識を付けた。製造業者のプロトコル（参考文献として組み込まれるユーザー・ブレタン・ＤＮＡシーケンサーモデル370、発行第２号、1987年８月２日）に従って、Ｍ13中の未知のＤＮＡの増幅してゲル電気泳動分離のための別々に標識を付けたＤＮＡフラグメントを調製した。染料標識プライマーは上記実施例に記載されたように調製した。即ち、各染料のＮＨＳエステルを調製し、５’−アミノヘキシル誘導化Ｍ13 ユニバーサルプライマー（5’-TCCCAGTCACGACGTTGT-3’）と反応させ４つに分かれるジデオキシ反応混合物に対する染色標識プライマーを生成した。次の変更は標準プロトコルでなされた：ジデオキシシチジン反応においてプライマーに標識を付けた５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシアデノシン反応においてプライマーに標識を付けた２’，７’−ジメトキシ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６ −カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマーに標識を付けた１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、各反応からの標識を付けたＤＮＡフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした：１：４：２ｄｄＣ反応：ｄｄＡ反応：ｄｄＧ反応：ｄｄＴ反応、そして検出は535、550、565、および580nmに中心がある10−nmバンドパスフィルターを用い改良フィルターホイールで行った。実施例１４ＤＮＡ配列分析において染料−標識プライマーとしてＡＬＦ−、ＢＵＢ−、ＤＥＢ−、およびＮＡＮ−オリゴヌクレオチド結合を使用次のことを除いて、実施例１３に記載したと同様の方法に従った：（ｉ）ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、（ii）各反応からの標識を付けたＤＮＡフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした：１：１：２：15 ｄｄＣ反応：ｄｄＡ反応：ｄｄＧ反応：ｄｄＴ反応、そして（iii）５nm バンドパスフィルターは540、560、580、および610nmに中心があった。実施例１５２’，７’−ジクロロ−５−（および６）−カルボキシ−４，７ −ジクロロフルオレセイン（“５−（および６−）ＴＥＴ”）４−クロロレゾルシノール（10g）、４，７−ジクロロトリメリット酸（10g）、およびメタンスルホン酸（30ml）の混合物を一緒にして２時間140〜150℃まで加熱した。赤色混合物を水（100ml）に注ぎ酢酸エチル（100ml）で抽出した。有機相を２回希塩酸で洗浄し、金褐色固体（19g）に濃縮した。ピリジン（4Oml）と無水酢酸（10ml）を固体に添加し混合物を0.5時間還流した。溶液を１時間４ ℃で冷却させた。結晶を濾過して分離し、白色固体（5.4g）を生成した。少部分の加水分解（0. 02mlの0.1N NaClおよび0.02mlのエタノールを２mgの固体に添加）続いて逆相ＨＰＬＣの分析で固体は92：８の比の異性体（６−カルボキシＴＥＴ：５−カルボキシＴＥＴ）を含有することを示した。２回目の再結晶はジアセテート（99：１比）としてほぼ純粋な異性体染料を与えた。５−ＴＥＴは濾液からの５−ＴＥＴのジアセテートの加水分解、次にアセトニトリルからの再結晶によって回収された。水酸化ナトリウム（３ｇ）と水（10ml）を６−ＴＥＴジアセテート（8.6g）（ＨＰＬＣカラムから２本のピークの最初のものとして得られた）に添加した。追加の水（50ml）を溶液が均質になるまで添加した。暗赤色溶液に濃HCl（15ml）を添加した。黄色の沈澱が形成された。混合物を酢酸エチル（100ml）で抽出した。有機相を淡黄色のほぼ無色の固体（7.4gの６−ＴＥＴ）に濃縮した。実施例１６２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“５−および６−ＨＥＸ”）磁気攬拌棒を備えた１リットルのエルレンマイヤーフラスコに５−または６− ＴＥＴ（6.3g）および１Ｍの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液pH9.4（60ml）を添加した。家庭用漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム、50ml）を20分かけて滴加した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣでモニターした。全部で67mlの漂白剤を添加した。濃HCl（1 5ml）で溶液を酸性にして酢酸エチル（100ml）で抽出した。有機相を明黄色固体（7.3g）まで儂縮した。¹H ＮＭＲ（DMSO−ｄ₆）δ8.1（1H）；7.4（2H）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 21/78 Ｃ 7363−2Ｊ 27/447 33/58 Ａ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (72)発明者コンネル，チャールス，アールアメリカ合衆国カリフォルニア州 94062 レッドウッドシティ，キングストリート 167 (72)発明者ハーシー，エヌ，デービスアメリカ合衆国カリフォルニア州 94071 サンカルロス，エルムストリート 800，208号 (72)発明者チャケリアン，バージンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94403 サンマテオ，アイビイストリート 1940，アパートＢ (72)発明者ウー，サム，エルアメリカ合衆国カリフォルニア州 94061 レッドウッドシティ，カルロスアベニュ 450 (72)発明者フングステベンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94306 パロアルト，アドベプレイス 420

Claims

【特許請求の範囲】１．次式を有する化合物。式中、Ａ’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり；Ｂ’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基であり；Ｘ’は水素、フルオロまたはクロロであり；Ｚ₃およびＺ₄は別々に水素、ハロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり；そしてＡ’、Ｚ₃、およびＺ₄の少なくとも１個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である。２．Ａ’はカルボキシル、スルホニル、イソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、ホスホルアミダイト、またはアミノであり；Ｂ’はカルボキシルまたはスルホニルであり；Ｘ’は水素であり；Ｚ₃およびＺ₄別々に水素、ハロ、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノである請求項１記載の化合物。３．Ａ’、Ｚ₃、およびＺ₄の１個のみがカルボキシル、スルホニル、メチルアミノ、またはアミノである請求項１記載の化合物。４．Ａ’およびＢ’がカルボキシルであり、Ｚ₃が水素またはクロロであり、そしてＺ₄が水素またはクロロである請求項１記載の化合物。