JPH08505131A

JPH08505131A - 肝炎ｃ型ウイルス（ｈｃｖ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法

Info

Publication number: JPH08505131A
Application number: JP6513756A
Authority: JP
Inventors: ハベツツ，ウイナンド・ヨハネス・アントニウス; ボーンデル，ピーテル・ヤコブ
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 1996-06-04
Also published as: FI952778L; FI952778A0; AU6653394A; WO1994013699A1; FI952778A7; EP0672065A1; ZA939169B; CA2151128A1; KR950704353A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＨＣＶに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチドに係る。本発明の好適ペプチドはＮＳ−３タンパク質のＨＣＶ特異的エピトープを含む。本発明は更に、ＨＣＶのＮＳ−３タンパクと特異的に反応する抗体にも係る。ＨＣＶ又はＨＣＶ抗体の検出方法、ＮＳ−３抗原に対して特異的に反応性の抗体の検出方法も本発明に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称：肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びＨＣＶの検出方法本発明は肝炎Ｃ型ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド、及び該ペプチドをコードする核酸配列に係る。本発明はＨＣＶに対する抗体にも係る。本発明は更に、試験流体中のＨＣＶ又は抗ＨＣＶの検出方法と、該検出方法を実施するための免疫化学試薬及びテストキットにも係る。肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）は、ＮＡＮＢ肝炎（非Ａ非Ｂ）の原因物質の１種として認められている９．４ｋｂの１本鎖ポリアデニル化ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶは急性及び慢性肝疾患を誘発し、肝細胞癌に関与する。肝細胞癌は、公知肝炎ウイルス、即ち肝炎Ａ型ウイルス（ＨＡＶ）、肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）及び肝炎δ型ウイルス（ＨＤＶ）に起因するものや、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）に起因する肝炎を含む他の形態のウイルス関連肝疾患から区別される。疎水性プロット及び配列相同に基づく実証によると、ＨＣＶはフラビウイルス科と遠縁にあると思われる（ＨｏｕｇｈｔｏｎＭ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４：３８１，１９９１）。非Ａ非Ｂ肝炎は輸血を受けた個体で最初に同定された。ヒトからチンパンジーへの伝播及びチンパンジーにおける連続継代の結果、非Ａ非Ｂ肝炎は伝播性感染物質に起因することが立証された。疫学的実証によると、非Ａ非Ｂ肝炎は水伝染性疫学型、血液又は注射針に関連する型、及び散発発生（集団獲得）型の３種が存在すると考えられる。ＨＣＶのウイルスゲノムは、広範な翻訳後プロセッシングを受ける約３０１０アミノ酸のポリプロテインをコードする。ウイルス構造領域は非構造領域の上流に位置し、高度に保存された１９ｋＤａヌクレオキャプシドタンパク質と、２つの広範にグリコシル化されたエンベロープポリペプチドｇｐ３３（Ｅ１）及びｇｐ７２（Ｅ２／ＮＳ１）を含むと推定される。最近の研究によると、Ｅ２／ＮＳ１のＮ末端領域ではほぼ全部のＨＣＶ単離株間に実質的な配列不均一性が存在することが示されており、ＨＣＶエンベロープのこの領域は強い免疫選択下にあると考えられる。膜結合２３ｋＤのタンパク質であるＮＳ２と、ウイルスヘリカーゼに対応し、ＮＳタンパク質のプロセッシングに関与すると現在考えられているＮ末端セリンプロテアーゼドメインを含み得る約６０ｋＤａの可溶性タンパク質であるＮＳ３を含む種々の推定非構造タンパク質がＨＣＶポリプロテインの残余からプロセッシングされる。ＮＳ４タンパク質の機能は現時点では解明されていないが、該タンパク質は免疫優性抗体結合部位を含む５−１−１フラグメントを含み（ＫｕｏＧ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：３６２，１９９１；ＣｅｒｉｎｏＡ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：２６９２）、ＮＳ５はウイルスレプリカーゼを含む。臨床研究によると、ＨＣＶに暴露後、ＮＳ３のＣ末端とＮＳ４タンパク質の一部を含む組換えタンパク質である抗ｃ１００−３への血清変換から数週間前にウイルス核タンパク質及びＮＳ３の保存領域に対する抗体が出現し得ることが報告されている。従って、高度に保存されたＨＣＶヌクレオキャプシドタンパク質及びＮＳ３を組み込んだ血清アッセイは、急性ＨＣＶ感染の有用な診断マーカーになると期待される。ＨＣＶ感染の種々の段階で確実な診断を可能にする特異的且つ高感度の方法を開発するためには、この型の免疫優性ウイルスエピトープを同定することが極めて重要である。本発明の目的は、ＨＣＶ感染の診断及びモニターに有用な小さいペプチドを提供することである。推定ＨＣＶＮＳ３抗原の少なくとも一部をコードする長い組換え抗原はＨＣＶに対する抗体に対して反応性であるが、上記に要約したような実質的な欠点を有する。小さい合成ペプチドはこれらの欠点を解決できるが、十分に免疫反応性ではない。本発明の目的は、小さい合成ペプチドの利点を有するように十分小さく且つＨＣＶに対する抗体に対して免疫反応性であるように十分大きい長さを有するペプチドを提供することである。推定ＨＣＶＮＳ３遺伝子によりコードされる領域からの小さいペプチド（１２量体）はＨＣＶに対する抗体を検出するためには特に有用でないことが判明した。大きいポリペプチドは融合タンパク質として容易に発現できず、内因性タンパク分解を受け易く、偽陽性反応の可能性が高いので非実用的である。大きいポリペプチドは更に合成しにくく、精製しにくく、感染性であり得る。本発明では、長さと免疫反応性を考慮した最適合成を形成するＨＣＶＮＳ３ −ゲノムの領域が同定される。本発明の別の目的は、ＨＣＶ特異的ＮＳ−３抗原配列を含むペプチドを提供することである。本発明は、配列番号６、７、８、９及び１０に示す配列群とその組み合わせ、又はＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記配列群のフラグメントもしくは前記配列群の類似体から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。推定ＨＣＶＮＳ３遺伝子の全部ではないとしてもほとんどをカバーする抗原をコードする組換えクローンからのＤＮＡフラグメントから構成されるライブラリーを構築することができる。これらのフラグメントは約５０〜３００ヌクレオチドの寸法であり、適当な読み取り枠内で発現されると、約１７〜１００アミノ酸のＨＣＶポリペプチドをコードした。こうして、１７〜１００アミノ酸の任意の可能なフラグメントを少なくとも１回含むために十分相違する組換え体を含むライブラリーを構築することができる。プローブとしての適当な抗体及び格別反応性のペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用して、格別反応性の抗原を発現する組換え体を選択することができる。本発明のペプチドは、ＨＣＶゲノムの推定ＮＳ３領域に位置する。本発明のペプチドは、ＨＣＶ抗体に対して格別免疫化学的に反応性であることが判明した。この反応性の利点は、本発明のペプチドの１種以上を使用すると、大きい組換えフラグメントを使用した場合に比較して免疫アッセイの特異性が高いという点である。別の利点は、前記ペプチドの１種以上を使用すると、免疫アッセイの感度が増加するという点である。本発明は更に、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記ペプチドのフラグメントを含む。本明細書中で使用する「フラグメント」なる用語は、本発明のペプチドのサブ配列を含むアミノ酸配列を意味する。該フラグメントは、ＨＣＶＮＳ３抗原の１個以上の免疫原決定基を有するペプチドである。フラグメントは特に、ＤＮＡには制限エンドヌクレアーゼ、ポリペプチドにはプロテアーゼを使用して前駆物質分子の酵素切断により生成することができる。他の方法としては、フラグメントの化学的合成又はＤＮＡフラグメントによるポリペプチドフラグメントの発現も利用できる。配列番号６〜１０のペプチドの類似体又は誘導体も本発明に含まれる。「類似体」なる用語は例えば、ペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を意味する。請求の範囲には明記しないが、該当ペプチドの免疫化学活性に影響しない限り、ＨＣＶの種々の単離株の株間変異の結果として、本発明のペプチド中の数個のアミノ酸が欠失していてもよいし、他のアミノ酸又はアミノ酸類似体もしくは誘導体を挿入してもよいし、これらのアミノ酸等で置換してもよいことは自明である。更に、これらのペプチドの類似体は、ペプチドの酸付加塩、ペプチドのアミド（特にＣ末端アミド）、エステル（特にＣ末端エステル）、Ｎ−アシル誘導体（特にＮ末端アシル誘導体、特にＮ−アセチル誘導体）も意味する。本発明のペプチドの製造は、公知有機化学ペプチド合成法の１種を応用するか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して実施することができる。後者方法によると、該当ペプチドの１種以上をコードするポリヌクレオチド配列を含む適切なベクターを用いて組換えポリペプチドを発現させ、ベクターを適切な宿主に導入することにより所望のペプチドを製造する。有機化学ペプチド合成法は、均一相内又は所謂固相を使用して縮合反応により必要なアミノ酸のカップリングを行うとみなされる。縮合反応は次のように実施することができる。ａ）縮合剤の存在下で、遊離カルボキシル基又は他の保護された反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び他の保護された反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合；ｂ）活性化カルボキシル基及び遊離又は他の保護された反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び遊離又は他の保護された反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合。カルボキシル基の活性化は特に、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾリド又は活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェニルエステル）に変換することにより実施することができる。上記縮合反応のための最も一般的な方法は、ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１−３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１９８０，１９８１（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているようなカルボジイミド法、アジド法、混合酸無水物法及び活性化エステル類を使用する方法である。あるいは、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。例えば、ペプチドを反復配列に（縦列に）組み込んでもよいし、（著しく大きい）タンパク質又はポリペプチドの成分として製造してもよい。この目的では、本発明のペプチドをコードする特定核酸配列を有するポリヌクレオチドを組換えＤＮＡの成分として使用することができる。本発明のペプチドをコードするこの型のポリヌクレオチド、及びこのポリヌクレオチドを同様に組み込んだ組換えＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。本発明は更に、上記ペプチドの少なくとも１種を含む免疫化学試薬にも関する。本発明の「免疫化学試薬」は、本発明の１種以上のペプチドと適切な支持体又は標識物質を含み得る。使用可能な支持体は例えば、微量試験ウェルもしくはキュベット、管もしくは毛管、膜、フィルター、試験ストリップの内壁又は、粒子（例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒子としての金属化合物、ＢＳＡもしくはＫＬＨ等のキャリヤータンパク質）の表面である。使用可能な標識物質は特に、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物である。本発明は更に、本発明のペプチドをコードする核酸配列、好ましくは配列番号１、２、３、４、５に示すＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む核酸配列を包含する。本明細書中に使用する「核酸配列」なる用語は、リボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両者を含めた任意長のヌクレチオドのポリマー形態を意味する。原則として、この用語は分子の一次構造を意味する。即ち、この用語は２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ、２本鎖及び１本鎖ＲＮＡ、並びにその改変形を含む。本発明の核酸配列は、天然ではこのような配列が会合又は結合しない種々の複製実施ＤＮＡ配列と連結することができ、適切な宿主の形質転換に使用可能な所謂組換えベクター分子を構成する。有用な組換えベクター分子は好ましくは例えばプラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はウイルスに由来する。本発明の核酸配列をクローニングするために使用可能な特定のベクター又はクローニングベクターは当業者に公知であり、特にプラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２、、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド）、バクテリオファージ（例えばｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８及びＭ１３に由来するファージ）、又はウイルスベクター（例えばＳＶ４０、アデノウイルス又はポリオーマウイルス）を挙げることができる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｕｒｖｅｙｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１−２４，１９９０も参照されたい）。本発明の組換えベクター分子の構築に使用する方法は当業者に公知であり、特にＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている。例えば、両方の遺伝子及び所望のクローニングベクターが相補ＤＮＡ末端を生成するのと同一の制限酵素で切断されていると、本発明の核酸配列をクローニングベクターに容易に挿入することができる。本発明の組換えベクター分子は更に、所望の形質転換細胞を選択するために使用可能な１種以上のマーカー活性（例えばｐＵＣ８におけるアンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドと同様の、例えばｐＢＲ３２２におけるアンピシリン及びテトラサイクリン耐性）を含み得る。本発明は更に、対応する核酸配列の発現により本発明のペプチドを産生することが可能な、上記核酸配列又は組換え発現ベクター分子で形質転換された宿主細胞も含む。適切な宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列又はこのような核酸配列を含む組換えベクター分子により形質転換させることができ且つ、所望により前記核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現させるために使用可能な微生物又は細胞である。宿主細胞は例えば細菌（例えば大腸菌、枯草菌及びプソイドモナス種）等の原核起源でもよいし、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は高等真核細胞（例えば昆虫、植物又は、ＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）等の真核起源でもよい。昆虫細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細胞系を含む（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６，４７−５５，１９８８）。真核クローニング系における本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情報は、Ｅｓｓｅｒ，Ｋ．ら（ＰｌａｓｍｉｄｓｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８６）に記載されている。一般に、本発明で有用な組換えベクター分子を構築するためには原核細胞が好適である。例えば、ＤＨ５α又はＭＣ１０６１ｋ等の大腸菌Ｋ１２株が特に有用である。発現のためには、本発明の核酸配列を発現ベクターに導入する。即ち前記配列を発現調節配列に作動的に連結する。このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、インデューサー、リボソーム結合部位等を含み得る。従って、本発明は発現調節配列に作動的に連結した上記ペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクター分子を提供するものであり、該ベクター分子は、形質転換宿主細胞において該ベクター分子に含まれるＤＮＡ配列を発現させることが可能である。当然のことながら、クローニングベクターの選択された部位に挿入されたヌクレオチド配列は、形質転換宿主が少なくとも１個の免疫原決定基を有するポリペプチドを産生する限り、本発明のペプチドをコードする完全核酸配列のフラグメントしか含まないと理解されたい。宿主が細菌であるとき、有用な発現調節配列の例としては、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２７５，６１５，１９７８）；外層膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯＪ．１，７７１− ７７５，１９８２）；バクフリオファージｋプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配列並びに、選択された宿主細胞に適合可能な他の発現強化及び調節配列が挙げられる。宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現調節配列としては例えばα 交配因子が挙げられる。昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロモーターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物起源である場合には、有用な発現調節配列としては例えばＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９６，３９−４２，１９８２）又は熱衝撃プロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，４９４９−５３，１９８５）が挙げられる。あるいは、ＨＣＶ中に存在する発現調節配列も利用できる。発現を最大にするためには、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８，４７３，１９７９）も参照されたい。本発明の別の目的は、ＨＣＶウイルスのＮＳ３タンパク質と特異的に反応し、臨床試料中のＨＣＶの有無を検出するための免疫診断試験で特に有用な新規モノクローナル抗体を提供することである。モノクローナル抗体を産生する細胞系の製造は、例えばエプスタイン−バールウイルスによる形質転換、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎは、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成する方法を考案した（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９））、腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換法、ヒトもしくはマウス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系である融合パートナーとヒトＢリンパ球との直接融合、又はＥＢＶ形質転換細胞系と前記骨髄腫細胞系との直接融合により実施することができる。エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）はヒトＢリンパ球を形質転換及び不滅化することが可能である。エプスタイン−バールウイルスを使用すると、骨髄腫パートナー細胞の必要なしに不滅化したヒトＢリンパ球を得ることができる。エプスタイン−バールウイルスは種々の起源から得られる。最も一般に使用されるＥＢＶ源はＢ９５−８マーモセット細胞系である。Ｂ９５−８細胞系はエプスタイン−バールウイルスを培地中に自然放出する。種々の細胞型が、ＥＢＶ形質転換細胞のクローニングのための良好な支持細胞層を提供すると示唆されている。最も一般に使用されているのは末梢単核血球（ＰＢＭＣ）及び繊維芽細胞である。ＰＢＭＣは単球、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（５〜１０％）から構成される。すべてのＢリンパ球が適正な特異性の抗体を提供する訳ではないので、ＰＢＭＣを適当な細胞について増菌すると有利である。ＥＢＶ形質転換細胞に対して細胞毒性Ｔ細胞が生成されないようにするためには、洗浄したヒツジ赤血球で細胞を処理することにより、（例えばＥＢＶ産生Ｂ９５−８細胞系からの上清による）ＥＢＶ感染前にＴリンパ球を除去する（“ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＶｏｌ．Ｉ，ａｐｒａｃｔｉｃｌｅａｐｐｒｏａｃｈ”, ＣａｔｔｙＤ編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国，１９８８，第４章）。不滅化Ｂ細胞系により産生される抗体は、以下の要件：１）抗体分泌の経時的安定性（＞６カ月）、２）ただ１つのＩｇＧ（Ｈ及びＬ）機能細胞の分泌、３）少なくとも２回の順次サブクローニング手順後の抗体分泌の特異性及び安定性（親系と同一の特異性及び遺伝子表現型でＩｇＧを分泌するコロニーの増殖１００％) を満足する場合にモノクローナル抗体であるとみなすことができる。本発明は更に、試験流体（被験液）中のＨＣＶに対する抗体の検出方法に係り、該方法によると、本発明のペプチドを試験流体と接触させ、ペプチドと試験流体中の抗体との間で形成された免疫複合体を検出する。ペプチドと試験流体中の抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出し、この検出により試験流体中のＨＣＶに対する抗体の存在を確認し、これを判定することができる。使用する免疫化学試薬の種類及び他の特性に依存して、実施される免疫化学反応は所謂サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応であり得る。試験流体中のＨＣＶの検出に特に適切な方法は、標識物貫を備える本発明のペプチドと（試験流体中に存在する）ＨＣＶ抗原との間の競合反応を利用し、ペプチド及び抗原を固相に結合したＨＣＶに対する抗体と競合させる。支持体に被覆した抗体は例えば本発明のモノクローナル抗体であり得る。本発明は更に、サンプル中の肝炎Ｃ型ウイルスの検出方法に係り、該方法は、サンプルを本発明のモノクローナル抗体と接触させる段階と、モノクローナル抗体と肝炎Ｃ型抗原との間で形成された免疫複合体を検出する段階とを含む。試験サンプル中のＨＣＶの検出のために例えばサンドイッチ反応を実施する際には、使用するテストキットは、例えば微量試験ウェルの内壁である固体支持体に被覆した本発明のモノクローナル抗体と、結合体としての標識モノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む。ＨＣＶの検出に使用可能なイムノアッセイの別の例は、標識化試薬としてヒトモノクローナル抗体を使用する阻害アッセイである。固相上の抗原とこの試薬との結合を、テストサンプル中の抗体により競合させることができる。上述のように、本発明のモノクローナル抗体は診断に非常に適しており、中和性のこの抗体は受動免疫療法に非常に有用である。本発明は更に、イムノアッセイを実施するためのテストキットに係り、該テストキットは少なくとも１種の本発明の免疫化学試薬を含む。本発明のテストキットは、上記免疫化学試薬を必須成分として含む。この免疫化学試薬は、本発明の抗体又はペプチドを含み得る。本発明の種々の免疫化学試薬の組み合わせ、例えば固体支持体に被覆したペプチドとラベル（標識）を備える抗体の組み合わせを含むテストキットは当然本発明の範囲に含まれる。ＨＣＶ抗体を検出するためにサンドイッチ反応を実施する際には、テストキットは例えば固体支持体（例えば微量試験ウェルの内壁）に被覆した本発明のペプチドと、本発明の標識ペプチド又は標識抗抗体を含み得る。別のサンドイッチ反応試験形式はＨＣＶ抗原の検出であり、本発明のモノクローナル抗体を固体支持体に被覆し、モノクローナル抗体を結合体として使用する。例えばサンドイッチ反応は、酵素イムノアッセイに関する本出願人の米国特許即ちＲＥ３１．００６及びＲＥ３２．６９６（Ｓｃｈｕｕｒｓら）に記載されている。競合反応を実施するためには、テストキットは固体支持体に被覆した本発明のペプチドと、ＨＣＶに対する標識化抗体、好ましくは前記ペプチドに対するモノクローナル抗体を含み得る。凝集反応では、テストキットは粒子又はゾルに被覆した本発明のペブチドを含み得る免疫化学試薬を含む。テストキットの別の態様は例えば、固体支持体に被覆したＨＣＶに対する抗体上の結合部位を被検出ＨＣＶ抗原と競合させる競合反応における免疫化学試薬としての本発明の標識化ペプチドの使用である。ＮＡＮＢ肝炎病害の予防及び／又は治療における適切な医薬剤形で使用可能な本発明のペプチド又はそのフラグメントも本発明に含まれる。こうしてこのようなペプチド又はそのフラグメントを活性成分として使用して得られるワクチンの製造は、当業者により実施することができる。実施例実施例１：λｇｔ−１１ライブラリーの構築及びスクリーニング特定プライマーを使用するＰＣＲにより、ＨＣＶのＮＳ−３遺伝子の一部をコードする配列（ヌクレオチド３５７３〜４８９０）を増幅した。出発材料は、原型ＨＣＶ株を感染させたチンパンジー血清からｒｔ−ＰＣＲにより構築したクローンから得た。ＰＣＲ産物を電気溶離によりＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル（８％ＰＡＧＥ）から単離した。このＰＣＲ材料の一部（８０μｌのうちの２０μｌ）を制御条件下で（１ｍＭＭｎＣｌ₂、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及びＤＮＡｓｅ−１（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ２６３５単位／ｍｇ、最終濃度：０．６単位）を含有する最終容量２５μｌ中、２５℃で１０〜６０分間）消化した。フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール中で消化を停止し、抽出した。ＤＮＡｓｅ消化はニックトランスレーションにより制御した。適当な５０〜２００ｂｐの長さを有するフラグメントを拡散により８％ＰＡＧＥ後に単離した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）。配列番号６のペプチドをコードするポリヌクレオチドに販売業者（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の推奨に従ってオリゴ−ｄＧでテーリングした。末端ＥｃｏＲ１部位を結合したポリＣをプライマーとして使用してテーリング産物でＰＣＲを実施した。ＥｃｏＲ１消化及びフェノール抽出後、産物をλｇｔ− １１アームにクローニングし、販売業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により詳述されているように大腸菌にトランスフェクトした。λｇｔ１１−プライマーを使用してライブラリーでＰＣＲを行った結果、挿入フラグメントの長さに一致する長さを有するスミアが明らかになった。ヒトモノクローナル抗体（１：５０）を用いる標準手順を使用してデュプロフィルター（ｄｕｐｌｏｆｉｌｔｅｒ）上でライブラリーをスクリーニングし、抗体の反応をアルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧでの反応を検出した。陽性ファージを再スクリーニングしてその内容が陽性であることを確認した後、インサートをベクターｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に移入した。市販キット（ＰｈａｒｍａｃｉａＴ７−配列決定キット）を販売業者の推奨に従って使用してこのベクターにおけるインサートを配列決定した。抗βガラクトシダーゼアフィニティーカラムを使用する標準手順により、上述のように得られた組換え体によりコードされるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を精製した。これらの精製抗原をＥＬＩＳＡプレートに被覆し、非Ａ非Ｂ肝炎患者からの血清と反応させた。このＥＬＩＳＡを使用して、本発明者らはこれらの患者血清と正常ヒト血清対照とを区別することができた（表１）。この手順を以下に詳述する。配列番号６の本発明のペプチドを１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）中に濃度７．５μｇ／ｍｌで溶解し、前記ペプチド溶液１３５μｌをＮＵＮＣマイクロタイタープレートの各ウェルに入れた。ペプチドとマイクロタイタープレートとの結合は、４℃で一晩行った。次いでプレートを０．２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）／０．２ＭＮａＣｌ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）の溶液で５分間室温でブロックした。次にプレートを０．２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）／０．２ＭＮａＣｌで１回、０．０４ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）で２回、２５０μｌ／ウェルの割合で洗浄し、乾燥した。非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスに特異的な抗体を判定するために、ウェルにピペット分配（１００μｌ／ウェル）したサンプル希釈剤（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／２０％正常ヤギ血清／１％Ｔｒｉｔｏｎ×１００）で血清サンプルを希釈し、１時間３７℃でインキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で洗浄後、サンプル希釈剤で希釈したペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル、３７℃で１時間）で標識したヤギ抗ヒト免疫グロブリンで結合ヒト抗体を検出した。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で４回洗浄した。ＴＭＢをペルオキシダーゼ酵素の基質として加え（１００μｌ／ウェル）、室温で３０分間反応させた。２ＭＨ₂ＳＯ₄ １００μｌを各ウェルに加えることにより、反応を停止した。ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａマイクロエリザリーダーで４５０ｎｍで黄色を読み取った。非Ａ非Ｂ肝炎患者からの血清では陽性結果が得られ、２０人の正常ヒト血清の結果は陰性であった（表１）。対照として２種の非関連ペプチドで手順を繰り返すことができる。いずれの場合も、正常ヒト血清及びＮＡＮＢＨ患者からの血清サンプルで得られる特異的認識に有意差は観察できない。上記結果から、本発明の前記ポリペプチドがＨＣＶ抗体と免疫化学的に高反応性であり、診断テストキットで単独又は組み合わせて使用できるという結論は正しいと思われる。上記組換えＤＮＡ法を使用して、配列番号７、８、９及び１０の配列による本発明のペプチドを製造した。上記と同一の構成を使用してイムノアッセイで前記ペプチドを試験した。非Ａ非Ｂ肝炎患者からの血清では特異的認識は陽性であり、２０人の正常ヒト血清の結果は陰性であった（表１）。配列表配列番号：１配列の長さ：１４８配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：大腸菌株名：ＪＭ１０１配列配列番号：２配列の長さ：１５８配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：大腸菌株名：ＪＭ１０１配列配列番号：３配列の長さ：１６４配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：大腸菌株名：ＪＭ１０１配列配列番号：４配列の長さ：１４８配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：大腸菌株名：ＪＭ１０１配列配列番号：５配列の長さ：６８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）起源生物名：大腸菌株名：ＪＭ１０１配列配列番号：６配列の長さ：４９配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント配列配列番号：７配列の長さ：５２配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル配列：ＮＯ配列配列番号：８配列の長さ：５４配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル配列：ＮＯ配列配列番号：９配列の長さ：４８配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル配列：ＮＯ配列配列番号：１０配列の長さ：２２配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/70 9453−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 9284−4ＣＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．肝炎Ｃ型ウイルスのＮＳ−３抗原のＨＣＶ特異的エピトープを含むペプチド。２．配列番号６、７、８、９及び１０に示す配列群とその組み合わせ又は、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記配列群のフラグメントもしくは前記配列群の類似体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のペプチド。３．請求項１又は２に記載のペプチドを含む免疫化学試薬。４．請求項１又は２に記載のペプチドをコードする核酸配列。５．配列番号１、２、３、４及び５に示すＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む請求項４に記載の核酸配列。６．請求項４又は５に記載の核酸配列を含む組換えベクター分子。７．請求項６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。８．請求項１又は２に記載のペプチドに対するモノクローナル抗体。９．請求項８に記載のモノクローナル抗体を含む免疫診断試薬。１０．被験液中のＨＣＶに対する抗体の検出方法であって、請求項１又は２に記載のペプチドを被験液と接触させ、ペプチドと被験液中の抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出する方法。１１．サンプル中の肝炎Ｃ型ウイルスの検出方法であって、サンプルを請求項８に記載のモノクローナル抗体と接触させる段階と、モノクローナル抗体と肝炎Ｃ型抗原との間で形成された免疫複合体を検出する段階とを含む前記方法。１２．被験液中の肝炎Ｃ型ウイルスのＮＳ−３タンパク質のＨＣＶ特異的エピトープに対する抗体の検出方法であって、請求項１又は２に記載のペプチドを被験液と接触させ、ペプチドと被験液中の抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出する方法。