JPH08505369A

JPH08505369A - 精製されたｔｓｈ製剤、その製法、及び、ｔｓｈ受容体検定用ｔｓｈトレーサー製造での及びｔｓｈ受容体検定でのその用途

Info

Publication number: JPH08505369A
Application number: JP6510683A
Authority: JP
Inventors: ベルグマン，アンドレアス; ストラック，ジョアキム
Original assignee: ベー．アール．アー．ハー．エム．エスディアグノスティカゲーエムベーハー
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1993-10-27
Publication date: 1996-06-11
Anticipated expiration: 2013-12-14
Also published as: FI952140A7; JP2835781B2; DE69316911T2; EP0668775A1; CA2148690A1; WO1994009814A1; DE4237430C1; ATE162948T1; AU5338794A; AU669953B2; FI952140A0; EP0668775B1; DE69316911D1; FI952140L

Abstract

(57)【要約】粗製のウシＴＳＨ（チロトロピン）から精製によって得られ、直接の放射性ヨウ素化によって、ＴＳＨ受容体検定用の放射性ヨウ素化されたＴＳＨトレーサーに転化でき、40 IU TSH/蛋白質mgを越える生物活性を有し、かつ、始めに抗ＴＳＨ抗体カラム上でのアフィニティ・クロマトグラフィにより、次に末端カルボキシル基をもちポリアミド被覆されたシリカゲルに基づく弱酸性陽イオン交換装置でのイオン交換クロマトグラフィにより、市販の粗製牛ＴＳＨの精製により得ることができるＴＳＨ製剤；その対応する製法；及びＴＳＨトレーサー製造への、とりわけＴＳＨ受容体自己抗体検定用のＴＳＨトレーサー製造へのその用途。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称精製されたＴＳＨ製剤、その製法、及び、ＴＳＨ受容体検定用ＴＳＨトレーサー製造での及びＴＳＨ受容体検定でのその用途本発明は、粗製のウシＴＳＨ（チロトロピン）から精製によって得られ、直接の放射性ヨウ素化によって、ＴＳＨ受容体検定用の放射性ヨウ素化ざれたＴＳＨトレーサーに転化でき、かつ生物学的活性（特異的受容体結合活性）を高めたＴＳＨ製剤；この製剤の製法：及びトレーサー製造へのその使用と、本発明によるＴＳＨ製剤からつくられるトレーサーを含有するＴＳＨ受容体検定の製作へのその使用に関する。ＴＳＨは、甲状腺機能の調節に中心的な任務を行なう下垂体ホルモンである。その放出は、視床下部で形成されるホルモシであるＴＲＨによって刺激され、最も重要な甲状腺ホルモンのチロキシン（T4）の生成と放出を制御する。フィードバックにより、血清中のチロキシン含有量はＴＳＨの放出を制御する。甲状腺細胞によるチロキシンの形成がＴＳＨによって刺激されるのは、下垂体によって放出されるＴＳＨが甲状腺細胞膜のＴＳＨ受容体に結合するためである。しかし、そのＴＳＨ受容体に対して、種々異なる病理学的条件において、種々のタイプの自己抗体が形成され得る。自己抗体のタイプにもよるが、チロキシンの形成と放出は、ＴＳＨ受容体におけるＴＳＨ分子の遮蔽（shielding）によって抑制され得るか、または、この甲状腺ホルモンは、ＴＳＨ受容体の自己抗体がＴＳＨと同様に、甲状腺ホルモン類の合成と放出を刺激するため抑制されることなく放出される。後者の場合に生ずる過剰な甲状腺ホルモンは、とりわけバセドウ病のような甲状腺機能亢進症として現われる。このため、ＴＳＨ受容体自己抗体の検出は実際の臨床に非常に重要であり、生物体液中のこのような自己抗体を測定できるような幾つかの放射性受容体検定法がすでに知られている。ＴＳＨ受容体が古典的なラジオイムノアッセイでの抗体の代わりに、この検定法で特異的結合剤として使用されることを除けば、このようなＴＳＨ受容体検定は、競争的なラジオイムノアッセイと同様に機能する。既知のＴＳＨ受容体自己抗体検定法では、これらの受容体は動物の甲状腺組織に由来しており、特にブタＴＳＨ受容体製剤が使用される。これらは溶液型で入手でき、化学量論量より少ない量で使用される。検定を行なう時に、患者の血清からのＴＳＨ受容体自己抗体と、トレーサーとして使用される、通常は¹²⁵Iで標識したウシＴＳＨである、標識ＴＳＨとが、この受容体試薬の限られた数の結合位置に対して競争する。血清試料中にある自己抗体の数が少ないほど、より多く標識ＴＳＨトレーサー分子が受容体によって結合される。ヒト血清中のＴＳＨ受容体自己抗体測定の基本原理とその詳細は、多数の刊行物に記載がある。中でも、検定法に関連した種々のメーカーの製品情報（本出願人のTRAK^(R)、Byk Sangtec、Biocode、及びChronusなどの会社の検定法）のほか、以下について特に言及できる。エル・シー・ハリソン（L．C．Harrison）及びピー・ジェイ・リードマン（P．J．Leedman）によるClin．Biochem．23巻43-48 頁（1990年）の記事；バーナード・リース・スミス（Bernard Rees Smith）ら、 Endocrine Reviews 9巻1号106-121頁（1989年）；及びバーナード・リース・スミス及びレジナルド・ホール（Reginald Hall）、Methods in Enzymology 74巻4 05-420頁（1981年）。ＴＳＨ受容体検定法に必要なＴＳＨ受容体は、通常、ふつうはブタからの、甲状腺膜の消化と洗剤抽出によって、比較的単純な方法で得られ、使用できるものとなるが、トレーサーとして使用されるＴＳＨは非常に高い品質要件を満たさなければならない。このため、ＴＳＨ受容体自己抗体検定法向けに臨床上の期待を満たすためには、放射性ＴＳＨはＴＳＨ受容体に対する特異的結合についてのある最少値（約30-50％の特異的結合）と、非特異的結合に対する対応的に低い値（使用の放射性マーカーの全活性の5％まで）をもたなければならない。この目的はこれまで、相当な複雑さを伴うことでしか達成されなかった。これはバーナード・リース・スミスを著者とする上の刊行物で詳細に説明されている。十分な品質の放射性ヨウ素化されたＴＳＨトレーサーを得るためには、以下の操作が必要である。１．ウシ下垂体からのウシＴＳＨを複雑な方法で精製しなければならない。文献によれば、原則として、最も好ましい場合にタンパク質mg当たり約30IUの特異的活性が得られる。市販の最もよいウシＴＳＨは、メーカー（UCB社）のデータによると、タンパク質mg当たり20IUの特異的活性をもっている。しかし、他のウシＴＳＨ製剤も市販されており、いずれもより低い特異的活性をもっている。２．放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーを得るためには、この人手できるウシＴＳＨを¹²⁵Iで標識しなければならない。複雑であるが穏和とみられるヨウ素産生法が、この目的に好ましく使用される。［バーナード・リース・スミス、Method s in Enzymology74巻408-412頁を参照。］タンパク質製剤への25-70％のヨウ素¹ ²⁵ 取り入れ率が得られる。その後のゲル濾過による遊離ヨウ素の精製又は分離により、5-10×10⁸dpmの全収量が得られる。1mCi（2.22×10⁹dpm）の放射能使用量に基づいて、これはこの既知トレーサー産生法において22-45％の放射能収率に相当する。しかし、放射性受容体試験で直接使用する時は、このトレーサーはわずか約11％（Bo−UB）の特異的結合しか生じない（B₀＝結合放射能の全量；UB＝非特異的結合）。換言すれば、放射能の主要部分は、受容体結合能力をもたないＴＳＨ誘導体や断片に結合される。このような特異的結合は、実施上満足できるようなＴＳＨ受容体自己抗体検定法を提供するには、とても十分とは言ない。３．これまで、専門家の議論の余地のない決った意見として、¹²⁵I-ＴＳＨの受容体結合分画を増加するために、ウシＴＳＨの放射性ヨウ素化によって得られるトレーサーを、更にアフィニティ精製にかけることが、この段階で絶対的に必要である。すでに放射性ヨウ素化されたＴＳＨについてこの段階で実施される精製段階は、以下の工程段階からなる。 a）ブタから精製された甲状腺膜を調製する（バーナード・リース・スミス、Methods in Enzymologyを参照）。 b）上で得られるトレーサーを膜ホモジネートと一緒に培養する。十分な受容体結合能力をもったトレーサーが膜ホモジネートに結合される。 c）膜に結合されたトレーサーを含有するペレットを得るために、37℃で15 分培養し、続いて17,000gで15分の遠心分離にかける。 d）上澄み液を除去後、2M濃度で塩化ナトリウムを含有する緩衝液中に於てこのペレットを再ホモジナイズし、それによって精製に使用された受容体へのＴＳＨトレーサーの結合を排除する。 e） 100,000gで２時間の遠心分離にかけると、精製された放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーが上澄み液中に見出される。最終段階は脱食塩カラムに通してトレーサー溶液から塩化ナトリウムを除去することである。この極端に不都合な方法の収率は5％であり、これは、1.1〜2.2％の範囲の全放射能収率となる。ＴＳＨ受容体自己抗体検定法に使用されるとき、この方法で精製されたトレーサーは全使用活性の約45％の特異的結合値を与え、これは自己抗体検定に十分である。しかし、放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの調製に使用される方法の複雑さは、相当な材料損失と低い放射能収率をもたらし、これはコストを高めるだけでなく、労力と環境上の理由からも不利であり、検定法に使用できるトレーサー量と、測定精度や測定時間に関しても経済的な限界を設けることになる。 Endocrinology 116巻4号1379及び1382頁（1985年）とそこに引用されている文献は、粗製ウシＴＳＨの精製法を記載している。極めて高い生物活性をもった非常に純粋なＴＳＨが、この文献に記載された逆相HPLC（RPLC）クロマトグラフィ法によって得られることが報告されている。しかし、上記の文献中に記載されている精製法を繰り返すと、上記の文献に従って、クロマトグラフィの溶離に応じて非常に純粋なタンパク質分画が得られるけれども、下記の検定法によれば、これらの分画は少なくともＴＳＨ受容体検定法に記載されたブタＴＳＨ受容体に関しては、その受容体結合能力を失っていること、従って高い生物学的活性をもったＴＳＨトレーサーの調製に使用できないこともわかった。従って、本発明に至る研究を始めたとき、解決すべき問題は、今日まで専門家の間で必須とみなされている放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの複雑な調製に代わるものを見つけることであり、この代替法で材料損失をより少なくし、放射能収率を高め、より簡単で、もっと信頼できる形でトレーサーの調製を可能にすることであった。驚いたことに、下記の検定法において特異的受容体結合活性として測定されるその生物活性が改良されており、トレーサーとして直接使用できる直接の放射性ヨウ素化による放射性ヨウ素化された高活性のＴＳＨトレーサーを生ずる点で今日までに知られたＴＳＨ製剤とは区別される新しいＴＳＨ製剤が提供されるならば、この問題がすぐに解決できることがわかった。本発明の第一の面によれば、粗製ウシＴＳＨの精製によって得られる本発明が提供しているＴＳＨ製剤は、市販の最良のＴＳＨ製剤に比べて２倍よりもっと改良された生物活性をもち、またその組成、例えば実際の生物学活性ＴＳＨの伴っている物質に関しては、既知方法による直接の放射性ヨウ素化が活性の有害な損失なしに可能である純度をもっている。本発明の更に一つの面によれば、このようなＴＳＨ製剤の製造を初めて可能とするような製法が提供される。本発明のもう一つの面は、本発明によるＴＳＨ製剤の標識化により、ＴＳＨトレーサーの製造用に、大きく改良された生物活性をもった本発明によるＴＳＨ製剤の用途に関している。それ以上精製せずにＴＳＨ受容体自己抗体試験に使用できるような放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーが、特に上記製剤の直接の放射性ヨウ素化において得られる。更に本発明の一つの面に従って、この新規な高品質放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーは、それ自体は知られている原理に従ってＴＳＨ受容体自己抗体検定法に使用される時に、高められたトレーサー放射能のために、検定時間の相当な減少が可能である検定法の提供を可能としている。先行技術の問題を解決する本発明のこれらの種々の面は、新規なＴＳＨ製剤に関する物質請求項１−３項、その製法に関する方法請求項４〜９項、特に直接の放射性ヨウ素化によって得られるそれから新規な標識ＴＳＨトレーサーの製造への新規なＴＳＨ製剤の用途に関する用途請求項９〜１２項、及びＴＳＨ受容体自己抗体を測定するためのＴＳＨ受容体検定法において、ＴＳＨ製剤又は直接の放射性ヨウ素化によってそれから得られるＴＳＨトレーサーの用途に関する請求項１３項と１４項によって包含されている。本出願において特許請求され説明されている本発明のの更に有利な態様と主題は、下に述べる説明と態様から当業者に明らかである。本発明は、慣用法で得られる粗製（天然）ＴＳＨ製剤をなおも精製にかけると、先行技術とは異なって、受容体結合能力として現われるＴＳＨ製剤の生物活性の相当な増加をもたらしうるという驚くべき発見に基づいている。この増加は、市販の最良の製剤と比べて２倍を越えるものであり、低生物活性をもった市販製剤と比べると非常に高い係数の増加である。また、その後の標識化反応に干渉する物質の生成を伴っていない。トレーサーを得るために、標識と結合させることによる更なる加工の前、特に放射性ヨウ素化の前に、ＴＳＨ製剤を精製し、その活性を高めることにより、これまで文献中で必要と記載された、アフィニティ・クロマトグラフィによる標識つきＴＳＨ製剤の複雑な精製を必要とせずに、ＴＳＨ受容体への高い特異的結合を示すとともに、高い放射能収率をもった製剤を得ることが、直接の標識化によって可能である。本発明によって得られる結合放射能の値は、良好な受容体結合能力との組み合わせにより、統計的に関連性のある結果にとって必要な測定値が既知のすべての商業的方法よりもはるかに短い時間で得られるやりかたで、ＴＳＨ自己抗体測定用の既知ＴＳＨ受容体検定法を変更することを、原理的に可能とした。本発明は、先行技術に比べて約40倍高い放射能収率をもったトレーサーとして適しており、標識化反応中に取り入れられなかった放射性ヨウ素の分離後、ＴＳＨ放射性受容体試験にトレーサーとして直接に使用でき、また複雑な手順で精製された既知の放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーに比肩するか又はそれより優れてさえいる受容体結合能力をもっている、放射性ヨウ素化されたウシＴＳΠを得ることを可能とした。粗製ウシＴＳＨの精製によって得られる本発明によるＴＳＨ製剤は、タンパク質mg当たり約40 IU TSHを越える生物活性を特徴とするが、典型的にはタンパク質mg当たり約55 IU TSHの生物活性を特徴とする。本発明によるＴＳＨ製剤の生物活性は、下の方法によって測定され、また生物活性について記載の値は既知の商業的生成物の対応する値と直接比べることが可能である。というのは、下に定義された、国際単位（IU）の設定に有効な基準が、標準物質として使用されているからである。ウシＴＳＨの特異的受容体結合活性（生物活性）の測定本説明と特許請求の範囲では、生物活性は下記の測定で得られた値で記載されている。生物活性は、ヘニング・ベルリン社から市販されているTRAK-Assay^Rによって測定される。この試験で、¹²⁵ヨウ素で標識されたウシＴＳＨはブタＴＳＨ受容体に結合する。生物活性を測定しようとする対象のＴＳＨ製剤は、この検定法で試料として使用され、試験で使用されるＴＳＨ受容体の結合位置に対して、トレーサーとして使用される¹²⁵I-標識つきウシＴＳＨと競争する。各場合に検査されるＴＳＨ製剤のタンパク質濃度を考慮して、高い特異的受容体結合活性をもったＴＳＨ製剤は、標識つきＴＳＨトレーサーの結合量又は結合放射能が低すぎる結果になる。国際基準を使用するか、又はタンパク質mg当たりのIU TSHでの生物活性が知られているＴＳＨ製剤を使用して、未知のＴＳＨ製剤の生物活性をこの方法で決定できる。本発明による製剤は、タンパク質mg当たり40 IU TSH以上、及び典型的にはタンパク質mg当たり約55 IU TSHの生物活性によって区別される。生物活性の測定に使用される市販のTRAK-Assay^Rは、成分として¹²⁵I-標識つきウシＴＳＨとブタＴＳＨ受容体をもち、両成分の調製は、最初に述べた、そしてバーナード・リース・スミス及びホール（Meth．Enzym．74巻405-420頁、1981年）によって前掲文献中に記載されている先行技術に従って実施される。既知検定法の試験原理は以下のように要約される。ウシＴＳＨをウシ下垂体から既知の方法で抽出し、クロマトグラフィ法で濃縮し、¹²⁵ヨウ素で標識し、最後にブタＴＳＨ受容体でのアフィニティ精製にかけると、トレーサーが得られる。ブタＴＳＨ受容体の調製には、ウシ甲状腺を洗剤なしの緩衝液中てホモジナイズする。達心分離を行ない、水溶性タンパク質を伴った上澄み液を捨て、生ずるペレットを洗剤含有緩衝液（膜タンパク質は可溶化される）で再ホモジナイズし、この後２度めの遠心分離を行ない、生ずる上澄み液が試験に使用されるＴＳＨ受容体製剤である。 TRAK-Assay^Rは、メーカーのヘニング・ベルリン社によって試験とともに提供された作業指針のとおりに、以下の段階に従って実施される。１．50μlの試料又は標準（それぞれ測定しようとするＴＳＨ製剤又は既知の生物活性及び濃度をもったＴＳＨ製剤）をピペットで取る。２．50μlの受容体をピぺットで取る。３．室温で15分培養する。４．トレーサー（測定当たり約12,500dpm）として、¹²⁵Ｉで標識されたウシＴＳＨ100μlをピペットで取る。５．室温で２時間培養する。６．氷冷PEG溶液（ポリエチレングリコール6000、18％）2mlをピペットで取る。７．2000g、20分の遠心分離にかける。８．生ずる上澄み液を傾斜させる。９．残った堆積物中の放射能を測定する。試験しようとするＴＳＨ製剤の受容体結合活性を測定するには、製剤は異なる希釈度で測定される。試験しようとする製剤のタンパク質濃度の測定は、既知方法でピアース社からのＢＣＡ法によって実施される。較正は、標準材料「チロトロピン国際標準、ウシ、コード53/1、国立生物標準・対照研究所、英国」による上の測定系の標準化によって行なった。種々のＴＳＨ製剤について、以下の値が測定された。本発明に従って、相当に改良された生物活性をもったＴＳＨ製剤は、このように得られる。生物活性の尺度としての役目をもつ受容体結合能力が、極めて敏感な生成物性状であり、これをクロマトグラフィ生成物単位と混同してはならないこと、及びこれが同時に、例えば抗体結合能力より、はるかに敏感な尺度を表わしていることを、ここで指摘すべきである。本発明によるＴＳＨ製剤は、慣用法で得られる任意のＴＳＨ製剤又は任意の市販の粗製ウシＴＳＨ製剤を、始めに抗ＴＳＨ抗体カラム上でのアフィニティ・クロマトグラフィによる穏和な精製にかけ、次に弱酸性陽イオン交換装置でのイオン交換クロマトグラフィにかけることによって得られ、全操作は室温より低温で行なわれ、操作中の不要な待ち時間を回避できる。請求項４〜８項に一般的に請求されている本発明によるＴＳＨ製剤の製法は、具体例を参照して下に詳細に記載されている。粗製ウシＴＳＨから得られ、改良された生物活性をもったＴＳＨ製剤の調製１．アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシＴＳＨ精製用の抗ＴＳＨアフィニティ・カラムの製造。製造は、ピアース社（イリノイ州ロックフォード）からの「カーボリンク^R」マニュアル中の指示に従って実施し、そのタンパク質結合ゲルを使用した。（a）酸化された抗ＴＳＨ抗体をつくるために、モノクローナル抗ＴＳＨ抗体5 405（ロット番号SP005、オイ・メディックス・バイオケミカ社、フィンランド国カウニアイネンから入手）25 mgと0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）25mlに、室温で過ヨウ素酸ナトリウム100mgを加え、溶液が完全に透明になるまで混合を続けた。次に、室温で30分の培養を行なった。抗ＴＳＨ抗体5405はhＴＳＨ（又はｈＴＳＨのβサブユニット）に対して特異的であり、ｈＴＳＨのモル当たり5×10⁹1のアフィニティ定数をもっている。これは生体外で調製され、0.1％のNaN₃含有量をもったNaClｇ当たり0.15molのアフィニティ精製されたIg分画（タンパク質濃度1.02mg/ml）として販売されている。ウシＴＳＨの精製へのその使用は、メーカーにより記載された可能な用途には入っていない。上記の抗体の代わりに、他の抗ＴＳＨ抗体を使用することも可能であり、その妥当性は、ここに述べたアフィニティ精製によって粗製ウシＴＳＨを精製する能力に基づいて比較的簡単に測定できる。（b）段階a）で得られる酸化ずみ抗体を、脱塩カラム［フアーマシア社（スエーデン国ウプサラ）からのNAPー25］によって、低分子量成分から分離する。使用の脱塩緩衝液は0.1Mリン酸ナトリウム（pH 7.5）である。（c）脱塩後、抗体（40ml）を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.0）中で前もって洗ったカーボリンクゲルと混合し、穏やかに振とうしながら、4℃で20時間培養する。（d）次に、カラム材料をカラス製カラム（バイオラド社、1×20cm）に移し、0.1MグリシンHCl緩衝液（pH2.8）100mlで洗い、0.1Mリン酸緩衝液（ｐH7.0）中で平衡化させる。２．アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシＴＳＨの精製粗製ウシＴＳＨ（シクマ社、アーマー社、カルバイオケム社、及びフルカ社から入手）の種々の試料［20mNリン酸ナトリウム（pH7.0）5ml中50IU］を、上のように調製された抗ＴＳＨアフィニティ・カラム中に4℃て滲出させ、30分培養する。次に、20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）（琉量1.5ml/分、全量180mL）でカラムを洗い、このあと50mMグリシンHCl緩衝液（pH2.8）による結合ペプチドの溶離を1.5ml/分、4℃で実施する。カラム流出液は、280nmでの光学密度を測定するために、継続的に流量測定し、溶離タンパク質を回収する（最終容量6ml）。所望のタンパク質を含有する溶液を直ちに水で1：2に希釈し、続いてイオン交換クロマトグラフィに使用する。上記のアフィニティ・クロマトグラフィ精製中に行なった検査は、上記の条件下に（pH7.0）、ウシＴＳＨがカラム材料に完全に結合されることを示した。未結合物質がないようにカラムを洗浄後、酸性緩衝液での溶離によって約80％の収率でこれを脱着する。本発明による結果は、非常に異なる特異的活性をもった種々の粗製ＴＳＨ製剤（シグマ社の粗製ＴＳＨ、特異的活性1.8IU/mg；カルバイオケム社、アーマー社、及びフルカ社からの同様な製剤；及び新しく直接調製されたウシ下垂体抽出物）を使用して得られた。従って、任意の汚染された製剤を、ウシＴＳＨの迅速効果的な精製に使用できる。３．弱酸性陽イオン交換樹脂でのイオン交換クロマトグラフィアフィニティ・クロマトグラフィでの精製で得られ２倍の容量に希釈したＴＳＨ製剤を、4℃、毎分0.8mlの流量で直接にカラムに適用する。カラムは10mM酢酸アンモニウム（pH4.5）で平衡化され、弱酸性陽イオン交換樹脂（ユーラミッドW CEX、末端カルボキシル基をもち、ポリアミド被覆されたシリカゲル基盤のもの）を含有している。適用後、10mM酢酸アンモニウム（pH4.5）から1M酢酸アンモニウム（pH4.5）への直線勾配で、毎分0.8mlで30分間にペプチドを溶離する。28 0nmでのUV吸光度のために、カラム流量を継続的に測定する。ウシＴＳＨは約19 分後に溶離し、固体二酸化炭素で冷却されたガラス容器にこれを直接集める。ＴＳＨの凍結乾燥後、物質を20mMリン酸塩（ｐH7.0）でもどすと、使用できるものとなり、¹²⁵ヨウ素で標識を付けることができる。イオン交換クロマトグラフィでは、無傷のＴＳＨはそのサブユニットに分解されたＴＳＨから分離される。これは本発明による条件下に迅速、効果的に、高収率で実施できる。本発明による精製ＴＳＨは、溶液で、又は凍結乾燥後、乾燥型で直接に得られ、その生物活性（特異的受容体結合能力）はタンパク質mg当たり約55 IU TSHである。４．本発明によるＴＳＨ製剤の放射性ヨウ素化 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）100μl中の上で得られた本発明によるＴＳＨ製剤24μｇを、¹²⁵ヨウ素（アマーシャム）2.5mCi（25μl）と混合し、クロラミンＴ3μｇ（水20μl中）を加えて反応を開始させる。30秒培養後、反応混合物はウォータース（米国、ミリポア・コーポレーシヨン）からのタンパク質Pak-125カラム［移動相：300mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.1％ラブロール（シグマ社）、流量0.5ml/分］上で直接に分離される。放射能用にカラム流出量を継続的に測定する。放射性ヨウ素化ウシＴＳＨは、17.5分の溶離時間で溶離される。放射性ヨウ素化の収率は極めて高い。放射性ヨウ素化に使用される¹²⁵ヨウ素2 .5 mCiのうち、1.0〜1.25mCiが生成物中に存在し、これをいつでも使えるトレーサーとして直接に使用できる。このように、使用放射能の約50％が単離されたトレーサーに含まれている。上記のクロラミンＴ法による放射性ヨウ素化の代わりに、他の既知の方法、例えばヨウ素発生法（iodogenicmethod）を用いても、放射性ヨウ素化を行なうことができる。しかし、実験的に簡単なクロラミンＴ法によって、有害な活性損失なしに放射性ヨウ素化を行なえることは、相当な実際的な利点をなしており、本発明によるＴＳＨ製剤の純度を反映している。５．ＴＳＨ受容体自己抗体検定法での放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの使用単離された放射性ヨウ素化ウシＴＳＨを、10mMトリス-ＨＣｌ緩衝液（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、及び0.1％ウシ血清アルブミン中で、所望の全最終合計活性まで希釈し、ＴＳＨ受容体検定法にトレーサーとして直接使用する。冒頭に引用された刊行物中での今日までの一致した意見とは反対に、本発明によって得られるトレーサーが、アフィニティ・クロマトグラフィによるその後の精製なしにでも、必要な受容体結合能力をもち、複雑な慣用法で調製されてからアフィニティ・クロマトグラフィで精製されたトレーサーより優れてはいないとしても、定性的に比肩しうるものであることが、驚異的に発見された（表１を参照）。本発明方法の高収率のため、プロセス技術による重大な欠陥及び今日まで使用されたトレーサーの調製とその製法に関する重大な欠陥を相殺することができる。すなわち、慣用の放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの劣った収率と高価格のため、ＴＳＨ受容体自己抗体検定法の知られた全製造業者（本発明の出願人や、By k Sangtec社、バイオコード社、及ひクロナス社を除く）は、低い全放射能（10, 000-15,000dpm）で操作せざるをえない。これためユーザーは、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体の測定において、好ましくないほどの長い計測時間をかけることになる（全製造業者は試料当たり５分の程度の計測時間を特定している）。本発明の第一段階で得られるＴＳＨ製剤の高い生物活性（受容体結合能力）と純度のため、特異的受容体結合能力の不利な低下なしに、また十分な生物活性をもった生成物を得るために、アフィニティ・クロマトグラフィによって更に精製する必要なしに、この製剤を直接に放射性ヨウ素化できる。本発明方法では、放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーを多量でも問題なく調製でき、ＴＳＨ受容体自己抗体検定法で実質的に多量の放射能の使用が可能となり、従ってユーザーにとって、もっと短い計数時間が得られる。表２は種々の面で本発明と先行技術との間の相違をまとめたものである。これまで知られた粗製ウシＴＳＨ製剤を比較的簡単な方法で精製して、市販の全ＴＳＨ製剤に比べて相当に改良された生物活性（受容体結合能力）をもったＴＳＨ製剤を回収できることは、先行技術では知られておらず、また更に任意のＴＳＨ製剤の直接的放射性ヨウ素化によって、ＴＳＨ放射性受容体検定法での使用に必要な高い特異的結合性を、高い放射能収率とともにもつ放射性ヨウ素化ＴＳＨが得られることも、先行技術から知られていないため、本発明は相当に驚異的な技術の進歩をなすものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月６日【補正内容】 −原文明細書１頁− 明細書発明の名称放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの製造方法及びＴＳＨ受容体検定でのトレーサーとしてのその用途本発明は、粗製のウシＴＳＨ（チロトロビン）から精製によって得られるＴＳＨ製剤をもとにした、放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの製造方法、及びＴＳＨ受容体自己抗体の測定の為のＴＳＨ放射性受容体検定に於ける、その放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの用途に関する。ＴＳＨは、甲状腺機能の調節に中心的な任務を行なう下垂体ホルモンである。その放出は、視床下部で形成されるホルモンであるＴＲＨによって刺激され、最も重要な甲状腺ホルモンのチロキシン（T4）の生成と放出を制御する。 −原文明細書７〜９頁− いる。しかし、上記の文献中に記載されている精製法を繰り返すと、上記の文献に従って、クロマトグラフィの溶離に応じて非常に純粋なタンパク質分画が得られるけれども、下記の検定法によれば、これらの分画は少なくともＴＳＨ受容体検定法に記載されたブタＴＳＨ受容体に関しては、その受容体結合能力を失っていること、従って高い生物学的活性をもったＴＳＨトレーサーの調製に使用できないこともわかった。更に、Endocrinology 1988、Vo1．122, No．1、319〜324頁は、単一段階で、粗製ウシＴＳＨを、抗ＴＳＨセファロース上のアフィニティ−クロマトグラフィーによって均質近くに精製する方法を記載している。アフィニティ−精製された生成物の純度を示す為に、競争的ＲＩＡによるＴＳＨ抗原に対する異なる分画を検定することを含む、ＨＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィ、及び放射性ヨウ素化された生成物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動が実施された。生物活性は、ＦＲＴＬ５細胞（クローン化ラット甲状腺細胞系）のの［Ｈ³］チミジン取込みを測定することによって決定した。しかし、発明者等は、アフィニティ −精製ＴＳＨ調製物の放射性ヨウ素化は、ブタＴＳＨ受容体へのたった約9.7％の特異的結合を有する生成物を導き、従って先行技術の記載に従う放射性ヨウ素化生成物を精製する段階は、上記の通り必要であるようである。 −原文明細書７〜９頁− 従って、本発明に至る研究を始めたとき、解決すべき問題は、今日まで専門家の間で必須とみなされている放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの複雑な調製に代わるものを見つけることであり、この代替法で材料損失をより少なくし、放射能収率を高め、より簡単で、もっと信頼できる形でトレーサーの調製を可能にすることであった。驚いたことに、下記の検定法において特異的受容体結合活性として測定されるその生物活性が改良されており、トレーサーとして直接使用できる直接の放射性ヨウ素化による放射性ヨウ素化された高活性のＴＳＨトレーサーを生ずる点で今日までに知られたＴＳＨ製剤とは区別される新しいＴＳＨ製剤が提供されるならば、この問題がすぐに解決できることがわかった。本発明の第一の面によれは、粗製ウシＴＳＨの精製によって得られる本発明が提供しているＴＳＨ製剤は、市販の最良のＴＳＨ製剤に比べて２倍よりもっと改良された生物活性をもち、またその組成、例えば実際の生物学活性ＴＳＨの伴っている物質に関しては、既知方法による直接の放射性ヨウ素化が活性の有害な損失なしに可能である純度をもっている。本発明のもう一つの面は、それ以上精製せずにＴＳＨ放射性受容体目己抗体検定に上記放射性ヨウ素化されたＴＳＨトレーサーを使用することに関する。更に本発明の一つの面に従って、この新規な高品質放 −原文明細書７〜９頁− 射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーは、それ自体は知られている原理に従ってＴＳＨ受容体自己抗体検定法に使用される時に、高められたトレーサー放射能のために、検定時間の相当な減少が可能である検定法の提供を可能としている。先行技術の問題を解決する本発明のこれらの種々の面は、放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの新規製法に関する、法請求項１〜９項、及びＴＳＨ受容体自己抗体の測定用のＴＳＨ放射性受容体検定のＴＳＨトレーサーの用途に関する、用途請求項１０〜１１項によりカバーされる。本出願において特許請求され説明されている本発明のの更に有利な態様と主題は、下に述べる説明と態様から当業者に明らかである。本発明は、慣用法で得られる粗製（天然）ＴＳＨ製剤をなおも精製にかけると、先行技術とは異なって、受容体結合能力として現われるＴＳＨ製剤の生物活性の相当な増加をもたらしうるという驚くべき発見に基づいている。この増加は、市販の最良の製剤と比べて２倍を越えるものてあり、低生物活性をもった市販製剤と比べると非常に高い係数の増加である。また、その後の標識化反応に干渉する物質の生成を伴っていない。トレーサーを得るために、標識と結合させることによる更なる加工の前、特に放射性ヨウ素化の前に、ＴＳＨ −原文明細書７〜９頁− 製剤を精製し、その活性を高めることにより、これまで文献中で必要と記載された、アフィニティ・クロマトグラフィによる標識つきＴＳＨ製剤の複雑な精製を必要とせずに、ＴＳＨ受容体への高い特異的結合を示すとともに、高い放射能収率をもった製剤を得ることが、直接の標識化によって可能である。本発明によって得られる結合放射能の値は、良好な受容体結合能力との組み合わせにより、統計的に関連性の −原文明細書１４〜１５頁− 本発明に従って、相当に改良された生物活性をもったＴＳＨ製剤は、このように得られる。生物活性の尺度としての役目をもつ受容体結合能力は、極めて敏感な生成物の性質であって、その性質を生成物のクロマトグラフィ的な均質性と混同してはならないこと、及び同時にその性質は、例えば抗体結合能力よりはるかに敏感な尺度を表わしていることをここで指摘すべきである。本発明によるＴＳＨ製剤は、慣用法で得られる任意のＴＳＨ製剤又は任意の市販の粗製ウシＴＳＨ製剤を、始めに抗ＴＳＨ抗体カラム上でのアフィニティ・クロマトグラフィによる穏和な精製にかけ、次に弱酸性陽イオン交換装置でのイオン交換クロマトグラフィにかけることによって得られ、全操作は室温より低温で行なわれ、操作中の不要な待ち時間を回避できる。本発明による放射性ヨウ素化ＴＳＨレーサーの製法は、具体例を参照して下に詳細に記載されている。 −原文明細書１４〜１５頁−粗製ウシＴＳＨから得られ、改良された生物活性をもったＴＳＨ製剤の調製１．アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシＴＳＨ精製用の抗ＴＳＨアフィニティ・カラムの製造。製造は、ピアース社（イリノイ州ロックフォード）からの「カーボリンク^R」マニュアル中の指示に従って実施し、そのタンパク質結合ゲルを使用した。（a）酸化された抗ＴＳＨ抗体をつくるために、モノクローナル抗ＴＳＨ抗体5 405（ロット番号SP005、オイ・メディックス・バイオケミカ社、フィンランド国カウニアイネンから入手）25mgと0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）25mlに、室温で過ヨウ素酸ナトリウム100mgを加え、溶液が完全に透明になるまで混合を続けた。次に、室温で30分の培養を行なった。抗ＴＳＨ抗体5405はhＴＳＨ（又はhＴＳＨのβサブユニット）に対して特異的てあり、hＴＳＨのモル当たり5×10⁹1のアフィニティ定数をもっている。これは生体外て調製され、0.1％のNaN₃含有量をもったNaClｇ当たり0.15molのアフィニティ精製されたIg分画（タンパク質濃度1.02 mg/ml）として販売されている。ウシＴＳＨの精製へのその使用は、メーカーにより記載された可能な用途に入っていない。上記の抗体の代わりに、他の抗ＴＳＨ抗体を使用することも可能であり、その妥当性は、ここに述べたアフィ −原文請求の範囲１〜３頁− 請求の範囲１．後でアフィニティ−クロマトグラフィーで直接放射性ヨウ素化ＴＳＨ調製物を更に精製することなく、（i）抗ＴＳＨ抗体アフィニティゲル上て粗製のウシＴＳＨを処理し、中間精製ＴＳＨ調製物の溶出液を回収し；（ii）段階（i）からの該中間精製されたＴＳＨ調製物を、弱酸性陽イオン交換樹脂上のイオン交換クロマトグラフィによって処理し；（iii）段階（ii）の溶出液のうち、280nmで吸光する分画を回収し；そして（iv）段階（iii）から得られる溶出液分画を凍結乾燥する段階を含む方法によって、得ることが出来る、タンパク質mg当たり約40 IU TSHを越える生物活性をもったＴＳＨ調製物を直接放射性ヨウ素化することからなる、放射性ヨウ素化されたＴＳＨトレーサーの製造方法。２．段階（i）のアフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシＴＳＨの精製が、抗ＴＳＨ抗体アフィニティケルを含有しているカラムの助けによって行なわれることを特徴とし、該カラムが（a）過ヨウ素酸ナトリウムによりモノクローナル抗ＴＳＨ抗体を酸化し；（b）脱塩カラムにより低分子量成分から該酸化抗体を分離し； −原文請求の範囲１〜３頁− （c）タンパク質結合ゲルで該脱塩された酸化抗体を培養し；そして（d）該結合した抗ＴＳＨ抗体を有するゲルを慣用のカラムへ移すこと；によって得られ、全段階を通じて慣用の緩衝液と洗浄液が使用される、請求項１に記載の方法。３．段階（ii）のイオン交換クロマトグラフィが、末端カルボキシル基をもちポリアミド被覆されたシリカゲルに基づく弱酸性陽イオン交換樹脂を使用して実施される、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。４．モノクローナル抗体5405（メディックス社、フィンランド国カウニアイネン）と同一の、又は類似した結合性を有する抗ＴＳＨ抗体が、精製段階（i）用の抗ＴＳＨ抗体アフィニティケルの製造用抗体として使用される、請求項１〜３のいずれかに一に記載の方法。５．段階（i）から得られる溶出液が希釈されて、段階（ii）に直接に使用され、また段階（iii）から得られる溶出液が固体二酸化炭素の温度に直ちに冷却される、請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。６．クロラミンＴを使用する放射性ヨウ素化法により該放射性ヨウ素化が行なわれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７． 30％を越える特異的結合をもった放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーが製造されることを特徴とする、請 −原文請求の範囲１〜３頁− 求項１〜６のいずれか一に記載の方法。８．放射性ヨウ素化の合計放射能収率が45〜50％であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一に記載の方法。９．放射性ヨウ素化されるべき該ＴＳＨ調製物の生物活性が、55 IU TSH／蛋白質mg である請求項１〜８のいずれか一に記載の方法。１０．ＴＳＨ受容体としてブタＴＳＨ受容体製剤が使用される、ＴＳＨ受容体自己抗体の測定用ＴＳＨ放射性受容体検定に於けるトレーサーとしての、請求項１〜９のいずれかに記載の方法により得られた放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーの用途。１１．生物体液中のＴＳＨ受容体自己抗体の測定に要し、かつB₀＞12,500dpm の値に適用可能な計数時間が１分の領域内にある量で、該トレーサーがＴＳＨ放射性受容体検定に使用される、請求項１０に記載の用途。

Claims

【特許請求の範囲】１．粗製ウシＴＳＨ（チロトロビン）の精製によって得られ、直接の放射性ヨウ素化によってＴＳＨ受容体検定法用の放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーに変換可能で、タンパク質mg当たり40 IU TSHを越える生物活性をもち、かつ抗ＴＳＨ抗体カラムでのアフィニティ・クロマトグラフィと、それに続く末端カルボキシル基を持ち、ポリアミド被覆されたシリカゲルに基づく弱酸性陽イオン交換装置でのイオン交換クロマトグラフィによる市販粗製ウシＴＳＨの精製によって得られる、ＴＳＨ製剤。２．タンパク質mg当たり約55 IU TSHの生物活性をもった、請求項１に記載のＴＳＨ製剤。３．以下の請求項４〜７のいずれか一に記載の方法によって得られる、請求項１項又は第２項のいずれかに記載のＴＳＨ製剤。４．（１）抗ＴＳＨ抗体アフィニティゲル上で粗製のウシＴＳＨを処理し、精製ＴＳＨ調製物の溶離液を回収し；（２）アフィニティ・クロマトグラフィによって精製された、段階（１）から得られた該ＴＳＨ溶離液を、弱酸性陽イオン交換樹脂上のイオン交換クロマトグラフィによって処理し；（３）段階（２）の溶離液のうち、280nmで吸光する分画を回収し；そして（４）段階（２）｛段階（３）｝から得られる溶離液分画を凍結乾燥する；以上の段階を含む、タンパク質mg当たり約40 IU TSHを越える生物活性をもった、請求項１〜３項の何れか一に記載のＴＳＨ製剤の製法。５．アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシＴＳＨの精製が、抗ＴＳＨ抗体アフィニティカラムの助けによって行なわれることを特徴とし、該カラムが（ａ）過ヨウ素酸ナトリウムによりモノクローナル抗ＴＳＨ抗体を酸化し；（ｂ）脱塩カラムにより低分子量成分から該酸化抗体を分離し；（ｃ）タンパク質カップリングゲルで該脱塩された酸化抗体を培養し；そして（ｄ）該結合した抗ＴＳＨ抗体を有するゲルを慣用のカラムへ移すこと；によって得られ、全段階を通じて慣用の緩衝液と洗浄液が使用される、請求項４に記載の方法。６．段階（２）のイオン交換クロマトグラフィが、末端カルボキシル基をもちポリアミド被覆されたシリカゲルに基づく弱酸性陽イオン交換樹脂を使用して実施される、請求項４項又は第５のいずれかに記載の方法。７．モノクローナル抗体5405（メディックス社、フィンランド国カウニアイネン）と同一の、又は類似した結合性状をもった抗ＴＳＨ抗体が、精製段階（１）の抗ＴＳＨ抗体アフィニティカラムの製造用抗体として使用される、請求項４〜６項のいずれかに一に記載の方法。８．段階（１）から得られる溶離液が希釈されて、段階（２）に直接に使用され、また段階（２）から得られる溶離液が固体二酸化炭素の温度に直ちに冷却される、請求項４〜７のいずれか一に記載の方法。９．これまで知られた任意の標識分子での標識化によって、ＴＳＨ受容体検定法用のトレーサーを製造のための、請求項１〜３項ののいずれかに記載のＴＳＨ製剤又は請求項４〜８のいずれかに記載の方法からの生成物の用途。１０．放射性ヨウ素化によって得られるトレーサー製剤をアフィニティ・クロマトグラフィにより後で更に精製することなしに、上記ＴＳＨ製剤のそれ自体知られた直接的放射性ヨウ素化によって、ＴＳＨ受容体検定用の放射性ヨウ素化されたＴＳＨトレーサーをつくるための、請求項９に記載のＴＳＨ製剤の用途。１１．30％以上の特異的結合をもった放射性ヨウ素化ＴＳＨトレーサーをつくるための、請求項１０に記載のＴＳＨ製剤の用途。１２．放射性ヨウ素化の全放射能収率が45〜50％である、請求項１０又は１１に記載のＴＳＨ製剤の用途。１３．ＴＳＨ受容体自己抗体を測定するためのＴＳＨ受容体検定法でのトレーサーとしての、このＴＳＨ製剤のその後の直接的放射性ヨウ素化によって得られる放射性ヨウ素化されたＴＳＨ製剤の形の、請求項１〜４項ののいずれか一に記載のＴＳＨ製剤又は請求項５〜８のいずれかに記載の方法の生成物の用途。１４．生物体液中のＴＳＨ受容体自己抗体の測定に要し、かつＢ₀＞12,500 dp mの値に適用可能な計数時間が１分の領域内にある量で、該トレーサーがＴＳＨ放射性受容体検定に使用される、請求項１３に記載の用途。