JPH08505530A - 複数部位走化性試験装置及び方法 - Google Patents

複数部位走化性試験装置及び方法

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Abstract

(57)【要約】 表面張力、毛細管作用、及び疎水性作用を使用して細胞懸濁物、走化性因子、及びコントロール流体を膜フィルター及び走化性プレートの両方の上の所定の位置に保持する簡単な走化性装置及び方法。１つの態様においては、走化性因子及びコントロールは下部プレート（97）上の上部表面の予め選択された領域におかれ、膜フィルター（101）は上部にある細胞懸濁物とともに下部プレート（97）の上に置かれ、走化性因子及びコントロールの液滴が、細胞懸濁物の位置の直下でフィルター膜（101）に接触するようにされる。他の態様においては、下部プレート（97）上の予め選択された位置は縁付きウェル（98）であり、これらは走化性因子（105-1）及びコントロール（105-2）により充填される。疎水性コーティング（109）を使用してフィルター膜（101）及び下部プレート（97）上の流体を動きを制限する。好ましい態様においては、閉塞物質あるいは細胞の単層を使用して重力による流体の流れをさらに制限する。

Description

【発明の詳細な説明】 複数部位走化性試験装置及び方法 本出願は1991年３月20日に出願された出願番号07/672,561（親出願）の一部継 続出願であり、前記出願は引用により本出願に含めることを明記する。背景 発明の分野 本発明は、走化性チャンバー（chemotaxis chamber）、即ち、移動する化学物 質の濃度勾配の生物学的細胞の指向的反応に対する作用を測定するチャンバーに 係わる。より具体的には、本発明は、１以上の膜フィルターによって隔てられた 上部及び下部領域を含む走化性試験部位に係わる。 発明の背景 走化性は、移動する化学物質の濃度勾配に対する生物学的細胞あるいは生物の 指向的反応である。これまでの走化性チャンバーはフィルターで隔てられた２つ の区画を有しており、その１つあるいは両方が空気に開放したものである。懸濁 物中の細胞を上部区画に置き、走化性因子あるいはコントロールを下部領域に置 く。走化性因子を種々の希釈率で使用して、用量に対する応答の曲線を得ること ができる。コントロールは一般に２種類であり、フィルターの上と下とで同じ媒 体を細胞を懸濁するのに使用する場合の陰性のものと、走化性因子を媒体中に同 じ濃度で、細胞とともに、そしてフィルターの逆の側に置く場合の化学運動性（ chemokinetic）のものである。化学運動性コントロールにより、ユーザは走化性 因子との接触により高められた細胞の任意の活性を、その走化性因子の濃度勾配 中の指向的反応から区別できる。 走化性活性は、最初に走化性チャンバー中に安定な濃度勾配を形成することに より測定される。チャンバーを所定の時間インキュベートし、その後フィルター を装置から取り除く。次にフィルターを通して（あるいはフィルター中に一定の 深さで）移動した細胞を計数する。次に試験されている走化性因子の濃度勾配中 での細胞の活性と、濃度勾配のない場合における細胞の活性とを比較する。 このような装置を使用して、異なる起源の細胞（例えば疾患を有する患者から の免疫細胞）の、既知の走化性活性を有する走化性因子に対する反応を測定する こともできる。この場合、問題となる細胞は、陰性コントロール及び走化性因子 の両方と比較され、特異な反応が抑制されるか正常であるか観察される。 マイクロ走化性（microchemotaxis）チャンバー及びそのいくつかの用途は、F alk，et al.，“A 48 Well Micro Chemotaxis Assembly for Rapid and Accurat e Measurement of Leukocyte Migration，”Journa1 of Immunological Methods ，33，239-247（1980）；Harvath，et al.，“Rapid Quantification of Neutro phil Chemotaxis： Use of a Po1yviny1pyrro1idone-free Polycarbonate Membr ane in a Multiwell Assembly，”Journal of Immunological Methods，37，39- 45（1980）；Richards，et al.，“A Modified Microchamber Method for Chemo taxis and Chemokinesis，”Immunological Communications，13（1），49-62（ 1984）；Falk，et al.，“Only the Chemotactic Subpopulation of Human Bloo d Monocytes Expresses Receptors for the Chemotactic Peptide N-Formylmeth ionyl-Leucyl-Phenylalanine，”Infection and Immunity，36，450-454（1982 ）；及びHarvath，et al．“Two Neutrophil Populations in Human Blood with Different Chemotactic Activities：Separation and Chemoattractant Bindin g，”Infection and Immunity，36（2），443-449（1982）に記載されており、 これらは全て引用により本明細書の一部とすることを明記する。発明の要旨 本発明は、その上部及び下部に表面張力により流体を保持する領域を有する膜 フィルターを含む、複数部位走化性試験装置である。 本発明のいくつかの態様においては、膜フィルターが毛細管孔膜（capillary ｐore membrane）である。毛細管孔膜フィルターの孔は、アッセイに使用される 細胞の種類及びアッセイの性質に応じて、0.1〜14ミクロンの直径を有する。例 えば、0.1あるいは0.2ミクロンの孔サイズを使用することにより、ある種の細胞 （例えば癌細胞）の仮足（pseudopods）を走化性因子に応答して膜を通過させ、 しかし細胞体が膜を通過することは阻止することができる。次いで刺激していな い「ウェル」に対して刺激されたものにおいてどれだけの仮足が侵入したかを測 定 することにより、特異な反応が測定される。しかし、非常に大きな細胞を使用し 、移動した細胞を計数することによりアッセイ結果を読み取る場合は、孔はこれ らの細胞が孔を通って移動するのに十分に大きくなければならない。 当初は、フィルターの上部の流体は媒体中に懸濁された細胞を含み（即ち、バ ランスのとれた塩及び栄養物溶液中の細胞）、フィルターの下部の流体は媒体の み（陰性コントロール）または走化性因子の溶液及び媒体のみを含む。しかし、 化学運動性コントロールは、フィルターの上部と下部とに同濃度の走化性因子を 含む（即ち、化学運動性コントロールは、走化性因子の濃度における勾配がない ことにより走化性試験部位とは異なる）。その最も単純な形態において、試験装 置は、剛性のフレームに接合された典型的には６〜30ミクロン厚の膜フィルター のシートからなる。膜中の孔は通常２から14ミクロンの間で選択される。しかし 、細胞体が移動するのを防止しなければならない場合はより小さい孔サイズを使 用する。走化性因子の液滴（drop）及びコントロール溶液の液滴を、整然とした パターン、例えば12×８列の９mm離れた96のスポットとしてフィルターの一方の 側に置く。次いでフィルターとフレームをひっくり返し、細胞懸濁物の液滴を、 走化性因子及びコントロール溶液の最初の位置に対応するスポット上でもう一方 の側にピペットで置く。液滴の容量は２〜75μｌの範囲とすることができる。流 体の液滴はその場所に表面張力により保持される。フィルターの両側に流体を置 いた後、下部の液滴の表面張力が上部の液滴の重力と表面張力と等しくなるまで 、重力により上部から下部への流れが生じる。次いで装置を37±１℃で15分〜72 時間の間インキュベートする。 インキュベーターからフレーム付きのフィルターを取り出した後は、１あるい は２のフィルターを使用したかにより、そしてどのような種類のフィルターを使 用したかにより、いくつかの異なる手順を行うことができる。単一の毛細管孔膜 フィルターを含む装置に適当な１つの手順は、フィルターの移動していない側か ら細胞を除去し、固定し、染色し、フィルターを通って移動した細胞を計数する ことである。もう１つの手順は、全ての細胞を固定し、移動したものを計数する ことである。いずれの方法においても、移動した細胞はそれぞれの露出されたフ ィルター領域の下面で計数され、走化性因子に露出された細胞の活性とコントロ ールに露出された細胞の活性とを比較する。セルロースニトレートフィルターの ような非毛細管孔膜を使用した場合は、細胞がフィルターマトリックス中に移動 した距離、即ち、移動した細胞のフィルターマトリックス中の先頭とフィルター 表面上のその出発点との距離を測定する。２つのフィルターを使用した場合は、 上部フィルターを捨て、下部フィルター上の細胞を計数する。細胞をCr51のよう な放射性同位体により標識し、そして上部フィルターを捨てた後、下部フィルタ ーのそれぞれの部位において放射活性の量を測定することもできる。 種々の染色及び染色方法を使用することができ、例えば蛍光染色を使用するこ とができる。 本明細書において記載するさらに別の本発明の態様は、走化性因子またはコン トロール及び細胞懸濁物がフィルターに置かれた部位において、それらの部位に おけるフィルターを通る流体の重力による流れをブロックあるいは阻害すること により、濃度勾配を安定化するための特徴を付け加えたものである。 本発明の第１の目的は、複数の標本の走化性活性の測定のための簡単な装置及 び方法を提供することである。 本発明の別の目的は、安価で及び／または使い捨てできる複数部位走化性試験 装置を提供することである。 本発明の別の目的は、走化性因子活性の正確な測定のためにごく僅かの容量の 細胞懸濁物しか必要としない、複数部位走化性試験装置を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、高感度の複数部位走化性試験装置を提供すること である。 本発明のまた別の目的は、自動マイクロタイタープレートリーダーを用いて分 析することができる走化性試験装置を提供することである。図面の簡単な説明 図１は、本発明の走化性装置の第１の態様の概略図である。 図2a〜2dは、本発明の走化性装置の一部分の拡大図であり、手順の異なる段階 における、単一の走化性試験部位を示すものである。 図3a〜3dは、本発明の第２の態様の概略図であり、フィルターの下部に位置す るグリッドの使用を示すものである。 図4a〜4dは、本発明の第３の態様の概略図であり、フィルターの上部に位置す るグリッドの使用を示すものである。 図5a〜5dは、本発明の第４の態様の概略図であり、フィルターの下部及び上部 の両方に位置するグリッドの使用を示すものである。 図６は、本発明の第５の態様の概略図であり、離すことができるシールにより 互いに接着された２つのフィルターから形成された装置を示すものである。 図７は、本発明の第６の態様の概略図であり、グリッドにおける特別な形の穴 を使用して重力による流れを制御するものである。 図8a〜8bは、本発明の第７の態様の概略図であり、重力による流れを制御する ためにグリッドにおける特別な形の穴を有するものである。 図9a〜9bは、本発明の第９の態様の概略図であり、感圧接着裏打ちシートを有 するものである。 図10a〜10bは、本発明の第10の態様の概略図であり、流体の流れをブロックす るが、走化性因子の拡散と細胞の移動とを可能とする材料を含むものである。 図11a〜11cは、本発明の第12の態様の概略図であり、スペーサーにより隔てら れ、クランプ装置により一緒に保持されている、上部フィルター部品及び下部プ レート部品を含む装置を示すものである。 図12a〜12cは、本発明の第13の態様の概略図であり、多数のウェルを有する上 部フィルター部品及び下部プレート部品を含む装置を示すものである。発明の詳細な説明 図１に示す、その最も単純な態様においては、本発明の複数部位走化性試験装 置10は、図１に示すように、剛性のフレーム12に結合された膜フィルター11（例 えば、Poretics（Livermore，CA）またはCostar Nuclepore（Pleasanton，CA） により製造された、５μmの穴を有する10μm厚のポリカーボネート毛細管孔膜フ ィルター）を含む。本明細書でいう「試験部位（test sitｅ）」あるいは「部位 （site）」の用語は、走化性因子の溶液または単なる媒体が位置し、そのフィル ターの逆側に並列して細胞の懸濁物が位置するフィルター上の輪郭を有するスポ ット をいうものであり、これらの流体は、従来の走化性チャンバーのように区画によ り所定の位置に保持されるか、あるいは表面張力により所定の位置に保持される ものである。走化性試験部位の位置は、例えばフィルター11上のパターン13によ り規定される。走化性試験部位の位置を特定するパターンは、フィルター上にイ ンクにより印刷して形成することができ、あるいはパターンを付したプラスチッ クあるいはシリコンのフィルムであってもよく、あるいはフィルターに捺染され ているか塗布されている疎水性のコーティングのパターンにより規定されてもよ い。この本発明の第１の好ましい態様においては、走化性流体は表面張力により 所定の位置に保持される。フレームはプラスチック、ステンレススチール、アル ミニウム、あるいはその他の適当な材料とすることができる。フレームはフィル ター及びそれに結合されるグリッドを平坦に保つのに十分な剛性を有するもので なければならない。膜フィルターは任意の適切な固定手段でフレームに取り付け ることができ、例えば接着剤、ヒートシール、超音波シールあるいは機械的手段 により取り付けることができる。 図2a〜2dは、走化性装置の一部分の拡大図であり、手順の連続した段階におけ る、単一の走化性試験部位を示すものである。図2a〜2dに示した態様においては 、フィルター11上のパターンはフィルター11の上部側の疎水性コーティング14a 及び下部側の14bにより形成されている。この疎水性コーティングは、走化性試 験部位を規定する位置を除いてフィルター全体を覆っている。この場合、フィル ターを通しての流体移動はこれらの位置においてのみ可能である。図2aは、流体 を添加する前の走化性試験部位を示す。図2bは、走化性因子またはコントロール 15を添加した後の走化性試験部位を示す。図2cは、走化性装置を逆にし、第１の 面上の走化性因子またはコントロール15の逆に位置するフィルター11のもう一方 の面に細胞懸濁物16を加えた後、その流体が安定する前の走化性試験部位を示す 。図2dは、表面張力により重力と表面張力が等しくなって流体が安定化された後 の走化性試験部位を示す。図2dにおいて、フィルター11の下面上の流体17はここ ではフィルターの逆の面上の細胞懸濁物からフィルターのこの面に流れた媒体を 含んでいる。 この装置は以下の手順により使用する。種々のコントロール溶液の液滴、及び 走化性因子の液滴（場合によっては種々の濃度のもの）を、膜の表面に印刷する か塗布することによって、あるいは膜上にコーティングを捺染するか析出させる ことによって、輪郭を決められた明確なパターン中で膜フィルターの一方の面の 上に置く。このコーティングは単に走化性試験部位の位置を規定するのみでもよ く、あるいは走化性流体を空間的に限定する疎水性障壁としても機能してもよい 。次いで装置をひっくり返し、逆の面の対応する試験部位上に細胞懸濁物をピペ ットで置く。いくつかの態様においては、重力及び表面張力により、それらの力 が平衡に達するまで膜の細胞懸濁物側から逆の側へ流れが生じる。他の態様にお いては、表面張力及び毛細管作用力が重力による流れを防止する。 次いで、細胞の性質、使用した膜フィルター、試験される走化性因子等に応じ て装置を所定時間、典型的には15分〜72時間インキュベートする（通常37℃で） 。インキュベートの後、フィルターの細胞懸濁物側から移動していない細胞は通 常、スクイジー（squeegees）、ワイパーブレード（wiper blades）及び綿スワ ブ（cotton swabs）を使用する方法を含むいくつかの方法の１つにより除去する 。この手順は、ワイピングの間にフィルターをリン酸塩緩衝生理食塩水に浸した 後に繰り返す。二重フィルターバリヤーを使用する場合には、移動していない細 胞を有するフィルターは通常捨てる。しかし場合によっては、移動していない細 胞を除去せず、これらを移動した細胞と同様に調べ、計数する。例えば、10ミク ロン厚のポリカーボネート毛細管孔膜フィルターの一方の面上にある細胞を、共 焦顕微鏡を使用して、膜の逆の面にある細胞により視覚的に妨害されることなく 調べ、計数することができる。 次いでフィルター中またはフィルター上の細胞を固定し（例えばメタノール中 で約２分間）、乾燥させる（場合によりフィルターをガラススライドに載置し、 乾燥する）。次に必要な場合、載置されたフィルター上の細胞を染色する（例え 部位において、フィルターを通して、あるいはフィルター中に移動した細胞の数 を計数する。細胞は、顕微鏡を使用して（例えば、対物25×により）個々に計数 でき、あるいは細胞の数は、光学密度測定器（例えばMolecular Devices，Menlo Park，CAにより製造されるUVmax Model光学密度測定器、あるいはOptomax，I nc.，Hollis，NHにより製造されるOptomax Image Analyzerにより）のような特 別な装置を使用して見積もることができる。細胞が放射性同位体により標識され ている場合は、試験部位をそれぞれから分離し、シンチレーションカウンター（ 例えば、Packard Instrument Co.，Downers Grove，IL）を使用して細胞を計数 する。 この本発明の装置の第１の態様を使用する場合、膜フィルター上の液滴の最適 な位置は、手持ちピペット、自動可変容量ピペット、あるいは自動ピペッティン グ器具により得られる。図１に示したように、走化性流体の液滴の間隔と位置、 即ち、個々の走化性試験部位の位置はパターン13により示される。96の走化性試 験部位の位置と間隔は、標準的な間隔、例えば96ウェルマイクロタイタープレー トの標準的な間隔とすることが好ましく、フレームの外側の寸法は標準的なマイ クロタイタープレートの寸法と同じ寸法とするのが好ましく、これにより例えば UVmax光学密度測定器のような自動装置を細胞の計数に使用できる。 図3a〜3dに概略的に示したように、本発明の第２の好ましい態様においては、 装置は穴22の配列を含有するグリッド21をさらに含む。図3aは、フィルター11上 の任意のパターン化された疎水性コーティング23も示している。図3bは、走化性 因子またはコントロール15を添加した後の装置を示している。図3c及び3dは、ひ っくり返して細胞懸濁物16を添加した後の装置を示している。図3cは最初に置か れた細胞懸濁物16の形を示し、図3dは、フィルターの上側からの表面張力と重力 がフィルターの下側からの表面張力と等しくなった場合の、安定化した後の細胞 懸濁物16の形を示している。 グリッド21は、生物学的に活性でなく水溶性でない、任意の剛性あるいは柔軟 性の材料から製造することができ、例えば、アクリル、ポリスチレン、ポリカー ボネート、ポリエチレン、またはポリプロピレンのようなプラスチック；シリコ ン；あるいは、被覆されたアルミニウム、スチール、またはスレンレススチール のような金属等の材料から製造することができる。この態様においては、例えば 穴は縦12列、横８列の中心から中心までの距離が９mmのパターン、即ち標準的な マイクロタイター配置とすることができる。しかし、これらはより小さい、ある いはより大きいフレーム上の、より多い、あるいはより少ない数の試験部位を有 する任意の便利なパターンとすることができる。例えば、最終的な計数を顕微鏡 を使用して行う場合には、試験部位をより小さいフレーム上に設けることができ 、例えば２”×３”のフレーム上に標準的なマイクロタイタープレートの中心か ら中心まで９mmのパターンよりも近いパターンで設けることができる。この好ま しい態様においては、穴の直径は0.5mm〜７mmで変化させることができる。グリ ッドの最適な厚さは穴の直径、及びグリッドの材料に依存する。グリッド材料が 親水性の場合（あるいは可能性としてグリッド材料が親水性でも疎水性でもない 場合）で、穴の直径が１mmである場合には、グリッドの厚さは0.5mmとし得る。 その場合、図3dに示したように、毛細管作用によりフィルター上に流体の大部分 を保持することができる。グリッド材料が疎水性である場合には、図2dに示した ように、全ての流体がフィルターを通されてしまい得る。ウェルの直径が６mmで グリッド材料が親水性または中性である場合は、フィルター上に十分な流体を保 持し、走化性因子の濃度勾配が形成され得るように、グリッド材料はより厚くな ければならない。 本発明の第３の好ましい態様においては、図4a〜4dに示したように、フィルタ ー11はグリッド21の下部に取り付けられている。図4aには、フィルター11上の任 意のパターン化された疎水性コーティング23が示されている。図4a〜4dには、走 化性流体15（図4b、4c及び4d）と、細胞懸濁物16（図4c及び4d）の置かれたとこ ろが示されている。図4cは、細胞懸濁物が添加された直後の流体の置かれた様子 であり、図4dは安定化後の流体の様子である。 本発明の第４の好ましい態様においては、図5a〜5dに示されるように２つのグ リッドが使用されている。１つのグリッド21がフィルター11の上部に取り付けら れており、１つのグリッド21がフィルター11の下部に取り付けられている。図5b に示したように、走化性因子またはコントロール15はフィルター11の一方の面に 添加され、細胞懸濁物16は図5cに示したようにフィルター11の別の面に添加され る。図5cは、最初に細胞懸濁物が置かれた様子を示す。図5dは、安定化後の流体 の様子を示す。 本発明の第５の好ましい態様は図６に示したように２つの毛細管孔膜フィルタ ー31及び32を使用するか、１つの毛細管孔膜及び１つの非毛細管孔膜、あるいは ２つの非毛細管孔膜を使用する。フィルター31及び32はそれぞれグリッド33及び 外側フレーム34に離れないように接着されている。フィルター31及び32は互いに 対向しており、互いに直接接触している。図６に示されているフィルター31及び 32の間のギャップは、図６を判りやすいものとするためだけのものである。フィ ルターは、例えば薄い感圧接着シール35により一時的に互いに接着されている。 フィルターは、細胞懸濁物36、及びコントロール及び走化性因子37が位置する各 走化性試験部位の周りで密閉されている。 そして以下の手順により走化性因子の走化性活性が測定される。先ず走化性装 置を逆にし、走化性因子及びコントロール37を、フィルター32上、グリッド33の 開口の逆の側に置く。２番目に、装置をその本来の面を上にして置き、細胞懸濁 物36をグリッド33の開口内でフィルター31上に置く。毛細管作用により流体の殆 どが上部区画に保持され、その時点でこれらの走化性因子を含む試験部位中で走 化性因子の濃度勾配が形成される。３番目に、装置をインキュベーター中に入れ る。４番目に、約37℃で一定期間（30分〜72時間）インキュベートした後、装置 をインキュベーターから取り出す。次いで細胞を固定し、上部グリッド及びフィ ルターを下部フレーム及びフィルターから分離する。５番目に下部フィルターを 染色する。最後に、下部フィルター上の細胞数を計数する。 下部フィルターに使用したフィルターの種類、及び使用した計数法（光学的、 密度測定等）の両方に応じて、上部フィルターから分離した後の下部フィルター を取り扱うのに異なる方法を使用する。例えば、毛細管孔ポリカーボネートフィ ルターを下部フィルターとして使用する場合は、固定する前またはその後にフィ ルターを分離し、下部フィルターの上面の細胞及び／または細胞断片を除去する ことができ、あるいはしなくてもよい。下部フィルターに付着した細胞を計数す るのに標準的な光学的方法を使用した場合は、下部フィルターの上部表面から細 胞及び細胞断片を除去することが望ましい場合がある。 本発明の第６の好ましい態様は、図７に示したように、第５の態様と同じ構造 、即ち２つの膜フィルター41を使用し、第１のものはグリッド42に載置され、第 ２のものはフレーム34に載置されている。グリッド42及びフレーム34は、互いに 接合され、２つのフィルター41が互いに直接接触するようになっている。しかし こ の態様においては、グリッドの穴は特別な形をしており、流体の安定化の後に各 走化性試験部位の上部部分において毛細管作用により保持される流体の量を増加 させるようになっている。例えば、図７に示したように、グリッド42中の各穴の 開口は比較的狭く、フィルター41に向かうに従って穴の直径が増加するようにな っている。 第７の好ましい態様を図8a及び8bに示す。この態様は第６の態様と同様なもの であるが、ただし上部グリッド54が比較的大きな穴52を含有し、下部グリッド55 は上部グリッド54中のより大きい各穴52に対応する多くのより小さい穴56を含有 している。図8aは、この装置を側面からみた断面を示す。図8bは、下部グリッド 55の下部から見た１つの試験部位の図であり、小さい直径の穴56の下部グリッド 55における配置を示している。小さい直径の穴はより大きな毛細管作用を与え、 上部の流体に対する重力及び表面張力の作用を打ち消す。この態様の別な形態は 、小さい穴を有する１つのグリッドを含み、これがフィルターの走化性因子側（ 通常下部側）への重力による流れを排除し、そして細胞懸濁物側（通常上部側） 上の疎水性コーティング（ただし深いグリッドはない）を含むものである。この 配置により、細胞懸濁物の液滴が平坦なフィルターの上部上に止まり、まったく （あるいはごく少量しか）その中を流れず、濃度勾配が直ちに形成される。細胞 とともに多量の流体が存在するので、濃度勾配は急速には消失しない。また、上 部表面は移動しなかった細胞を容易に拭い清浄にすることができる。 本発明の第８の好ましい態様は、第５の態様と同じ構造、即ち、互いに直接接 触するように接合された、グリッド上に載置された２つの毛細管孔膜フィルター を使用する。この態様においては、グリッドの区画全体をあるいは部分的に満た した後に柔軟性の感圧シートを使用してグリッドの片面を密閉する。このシート は、流体がフィルターの他方の面に加えられたときに重力による流れを制限し、 これにより安定な濃度勾配を生成する。 本発明の第９の好ましい態様は第８の態様と同様なものであるが、図9a〜9bに 示したように、単一のフィルターを使用する。この態様は、グリッド62中の穴61 により形成された試験部位を細胞懸濁物63で充填することにより使用する。感圧 接着剤65により裏打ちされたシート64をフィルター66の逆の側でグリッド62の面 に適用する。過剰な細胞懸濁物は押し出されて試験部位の間の凹部67にトラップ され、そして装置をひっくり返す。次に走化性因子68をフィルター66の逆の面上 で各ウェルの上にピペットで取る。次いで装置をもう１度ひっくり返し、インキ ュベートする。試験部位の上部ウェルは密閉されているので、細胞が懸濁された 媒体はフィルターを通して流れて濃度勾配を乱すことはない。この装置を使用す るもう１つの方法は、走化性因子及びコントロールを密閉された側に入れ、その 後逆の側に細胞懸濁物をピペットで置くことである。 本発明の第10の好ましい態様は２つのフィルター（第８の好ましい態様のよう に）または単一のフィルター（第９の好ましい態様のように）を使用することが でき、図10a〜10bに示す（２つのフィルターのもの）。図10aは、個々の走化性 試験部位の側面断面図である。図10bはいくつかの走化性試験部位の側面断面図 である。図10aには、一緒に接近して互いに対向して置かれ、小さい空間（5〜20 μm）により隔てられた上部フィルター71及び下部フィルター72が示されている 。フィルターの孔、及びフィルターの間の空間（２つのフィルターを使用した n Collaborative Biomedical Products，Bedford，MAから入手できる）により充 填され、これにより走化性因子74の拡散及び細胞の細胞懸濁物75中での移動が可 能となり、これは媒体中に溶解しない（あるいはアッセイを完了できるように十 分にゆっくりと溶解する）。２つのフィルターは、各試験部位を囲む取り外し可 能な感圧接着剤76により、一緒に接近した状態に保持されている。図10bに示し たように、このアセンブリーは外側フレーム77により支持されている。この装置 は、第８の好ましい態様（２つのフィルターを使用した場合）あるいは第９の好 ましい態様（単一のフィルターを使用した場合）の装置に類似する。寒天（ある いは同等の閉塞物質）が流体の垂直方向の流れを防止するので、流体は重力に影 響されない。２つのフィルターを使用した場合は、溶解した寒天が２つのフィル ターの間を毛細管作用により空隙を残さず流れるので、毛細管孔フィルターが好 ましい。水平方向の流れは、各試験部位を囲む比較的疎水性のコーティング78に より防止される。 本発明の第11の好ましい態様においては、第５の態様に開示した２−フィルタ ー構造を使用するが、感圧接着剤は、エタノールのようなフィルターを溶解しな い溶媒中に可溶なものである。従って、装置を例えばエタノール固定液に浸漬し た後に２つのフィルターは容易に分離することができる。あるいは、上部フィル ターは溶媒（例えばメタノール）中に溶解する材料（例えばセルロースニトレー ト）から形成されていてもよく、下部フィルターはそのような溶媒中に溶解しな い材料（例えばポリカーボネート）から形成されていてもよい。これにより、上 部フィルターは細胞を固定した後、あるいは固定工程の間に溶媒中に溶解される 。いずれの形態においても、下部フィルターを上部フィルターから分離した後に 、下部フィルターを染色し、下部フィルター上または下部フィルター中の細胞の 数を上記した方法のいずれかを使用して測定する。 本発明の第12の好ましい態様を図11a〜11cに示す。この態様においては、図11 aに示すように、装置はスペーサー79及び下部プレート80を含む。スペーサー79 はフィルター84のフィルターフレーム81と同じ形であり、0.02〜0.2インチの厚 さとすることができる。下部プレート80は、生物学的に活性でなく、又水溶性で はない任意の透明な剛性材料、例えばガラス、サファイア、アクリル、ポリスチ レン、ポリカーボネート等から製造することができる。下部プレート80は、多数 の非コート部位83を除いてその上部表面91に塗布された疎水性コーティング82を 有する。これらの非コート部位83は円形であり、直径は0.04〜0.5インチの間で 変化させることができる。部位の典型的なパターンは、本発明の第１の態様につ いて記載したマイクロタイタープレート配置である。 この態様の上部部品は、フィルターフレーム81に囲まれたフィルター84を含み 、フィルター84の上部表面96及びフィルター84の下部表面94は、本発明の第１の 好ましい態様において記載し図１に示したように、パターン化された疎水性コー ティング82により被覆されている。疎水性コーティング82は、下部プレート80上 の非コート部位83に対応する多数の非コートフィルター部位92を形成するように パターン化されている。図11aは、位置決めピン86を有する支持プレート85、ボ ルト87、及びつまみナット89を有するクランププレート88を含むクランプ装置93 も示している。 下部プレート80、スペーサー79、及びフィルターフレーム81はすべて位置決め ピン86により整列されており、ボルト87上のつまみナット89の作用により支持プ レート85及びクランププレート88の間に挟持されている。図11a〜11cは、下部プ レート80の非コート部位83とフィルター84の非コートフィルター部位92の間にト ラップされた走化性因子90-1（またはコントロール溶液90-2）を示している。図 11bに示すように、下部プレート80上の疎水性コーティング82及びフィルターの 下部表面94上の疎水性コーティング82は、走化性因子90-1（またはコントロール 溶液90-2）が広がり、そばの部位の流体と接触するのを防いでいる。細胞懸濁物 95をフィルター84の上部表面96の非コートフィルター部位92上に置く。非コート フィルター部位92を取り囲むフィルター84の上部表面96上の疎水性コーティング 82は、細胞懸濁物の液滴95が膜をわたって移動し、互いに接触するのを防いでい る。 図11cは、この態様の走化性試験部位の拡大図である。走化性因子90-1（また はコントロール溶液90-2）の液滴の表面張力が、細胞懸濁物95の液滴上の表面張 力と重力の合計と等しくなったとき、２つの液滴は平衡状態になり、フィルター 84を通る流れは起こらない。これらの液滴の容量、各非コートフィルター部位92 の表面積、及び下部プレート80上の各非コート部位83の表面積、及び流体の表面 張力の性質により、細胞懸濁物95がこれらの非コートフィルター部位92上にピペ ットで置かれたときに、フィルター84の非コートフィルター部位92を通した流れ が起こるかどうかが決まる。 実際においては、細胞懸濁物95の各液滴の容量の約10％の、各非コートフィル ター部位92を通した下方への当初の流れがあることが必要である。これにより、 表面張力と重力が平衡に達したときに走化性因子90-1（またはコントロール溶液 90-2）の最適な濃度勾配が形成されることが確保される。しかし、流れが上向き であると、平衡が達成される前に走化性因子90-1（またはコントロール溶液90-2 ）が細胞懸濁物95中に流れ入り、細胞懸濁物95は走化性因子90-1（またはコント ロール溶液90-2）により汚染されてしまう。このような場合、走化性因子90-1（ またはコントロール溶液90-2）は細胞にランダムな（非指向的な）かたちで結合 して細胞が走化性反応を示すのを抑制するか、あるいは上向きの流れが小さいと きは走化性反応が弱められてしまう。 第12の態様においては、フィルター84がクランブ装置93中に置かれる前あるい はその後に、細胞懸濁物95を非コートフィルター部位92上に置くことができる。 非コートフィルター部位92はまた、態様10におけるように閉塞物質で被覆して もよく、あるいは部位はその上で培養された、フィルターの孔を閉塞する細胞の 単層を有していてもよい。これらの２つの場合のいずれにおいても、フィルター が下部プレート80の上に置かれ、走化性因子90-1（またはコントロール溶液90-2 ）の液滴がフィルター部位92の下面に接触した後に、フィルター84の上部表面96 及び下部表面94の間に流れは起こらない。 本発明の第13の好ましい態様を図12a〜12cに示す。この態様においては、装置 は96のウェル98を有する下部プレート97、下部プレート97の周囲を取り巻くリム 99、４つの基準ピン100、及びフィルターフレーム110により囲まれる上側フィル ター101を含む。図12bは、線A-Aにおけるこの態様の断面図であり、感圧接着剤1 02の層により下部プレート97の上部に固定されたフィルターフレーム110及びフ ィルター101を有する。図12cは、図12bの一部分の拡大であり、２つの走化性試 験部位を示している。 図12aにおいては、取り付けられたフィルター101を有するフィルターフレーム 110が下部プレート97上に位置しており、下部プレート97のリム99はフィルター1 01のフィルターフレーム110の下にあるようになっている。下部プレート97は、 生物学的に活性でなく、又水溶性でない透明な剛性の任意の材料、例えば、ガラ ス、サファイア、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネート等から製造するこ とができる。下部プレート97は、0.04〜0.5インチの直径の多数のウェル98（こ の場合96個）を有している。部位の典型的なパターンは、本発明の第１の態様に おいて記載したようにマイクロタイタープレート配置である。 図12b及び12cに示したように、この態様の上側部品は、取り付けられたフィル ターフレーム110により囲まれたフィルター101を含み、フィルター101の上部表 面103及び下部表面104はパターン化された疎水性コーティング109により部分的 に被覆されている。疎水性コーティング109は、下部プレート97中のウェル98の 位置に対応する多数の非コートフィルター試験部位106を形成するパターンを有 している。図12aにはまた、下部プレート97及びフレームを付きフィルタ ー101が位置決めピン100によりどのように配列されるかが示されている。 図12b及び12cは、非コートフィルター試験部位106の下部表面により下部プレ ート97のウェル98中にトラップされた走化性因子105-1（またはコントロール溶 液105-2）、及びフレーム付きフィルター101の下部表面104上の疎水性コーティ ング109を示している。フレーム付きフィルター101の下部表面104上の疎水性コ ーティング109は下部プレート97のウェルリム108に接触しているかあるいは殆ど 接触している（0.01インチ未満）。フィルター101の下部表面104上の非コートフ ィルター試験部位106を囲み、ウェルリム108に接触しているかあるいは近接して いる疎水性コーティング109は、走化性因子105-1（またはコントロール溶液105- 2）が（毛細管作用により）ウェルリム108及びフレーム付きフィルター101の間 に運ばれるのを防止する。細胞懸濁物107の液滴がフレーム付きフィルター101の 上部表面103上に非コートフィルター部位106においてピペットで置かれた場合、 細胞懸濁物107中の流体がフィルターを通りウェル98中に流れるのが防止され、 これはその中に充填されていない容量がないことによるものである（即ち、ウェ ル98は走化性因子105-1（またはコントロール溶液105-2）により完全に充填され ており、その流体はウェル98の壁によりトラップされており、疎水性コーティン グ109は非コートフィルター試験部位106を囲んでいる）。同様に、非コートフィ ルター試験部位106を取り囲むフィルター101の上部表面103上の疎水性コーティ ング109は、細胞懸濁物107の液滴が試験部位の周辺の外側に移動し、互いに接触 するのを防いでいる。 この第13の態様によれば、細胞懸濁物107中の流体は、非コートフィルター部 位106を通る最初の流れを示さない（第12の態様とは異なる）。細胞懸濁物107中 の流体の下方への流れは不可能であり、これは非コートフィルター試験部位106 の下の容量がウェル98中の走化性因子105-1（またはコントロール溶液105-2）に より完全に充填されているからである。一方、過剰の走化性因子105-1（または コントロール溶液105-2）が下部プレート97のウェル98にピペットで入れられる と、これは、フレーム付きフィルター101が下部プレート97上に置かれ、感圧接 着剤102により接着されたときに押し出され、完全に充填されたウェル98を残す 。 非コートフィルター試験部位106はまた、第10及び第12の態様で示したように 、 al Products，Bedford，MA）で被覆されてもよく、あるいは部位はその上で培養 され、フィルターの孔を閉塞する細胞の単層を有していてもよい。これらの条件 により、他の細胞層を通した、あるいは他の物質を通した細胞の移動を調べるこ とができる。これらの場合、あるいはフィルターの孔に閉塞物質がない場合のい ずれにおいても、フィルター101が下部プレート97上に置かれ、ウェル98中の走 化性因子105-1（またはコントロール溶液105-2）の液滴がフィルター101の下部 表面104と接触した後に、フィルター101を通る細胞懸濁液107の流れはない。前 者の２つの場合においては、細胞懸濁物107はフィルター中の孔の閉塞のために 下方へは流れず、後者の場合においては、単にフィルター試験部位106の下に細 胞懸濁物107が流れることができる容量がないことにより流れがない。さらに、 ウェル98が完全に充填されている限り、各ウェル98にピペットで入れられる走化 性因子105-1（またはコントロール溶液105-2）の正確な量は、実験条件の均一性 について重要ではなく、これは第12の態様において同様である。 インキュベート期間の後、非コートフィルター部位106の上部表面上の細胞は その懸濁媒体とともに除去することができ、これによりフィルターの下部、ある いはフィルターの孔の中、あるいは下部プレート97のウェル98中に移動した細胞 を残すことができる。このとき、組み立てられた走化性装置を遠心分離器中で回 転させることができ、またあるいはフィルター101上の細胞を種々の溶液（当業 者に周知のもの）で前処理して、遠心分離中の脱着を容易にすることができる。 次いで移動した細胞は、当業者に周知の種々の方法により調製され、自動細胞計 数器で計数される。細胞は、フレーム付きフィルター101を下部プレート97から は顕微鏡下でフィルター101上で直接計数することもできる。下部プレート97は 、フレーム付きフィルターを除去した後に遠心分離することなくそれ自体を読み 取り、フィルターから脱落した全ての細胞を計数することもできる。 本発明の態様のこれまでの開示は、例示と説明のために示されたものである。 本発明がこれに尽くされ、あるいは本発明を開示したそのものの形態に限定する ことを意図するものではない。上記の記載により、本明細書中に記載した態様の 多くの変形及び改変が当業者には明らかであろう。本発明の範囲は、本明細書に 添付する請求の範囲、及びその均等物によってのみ規定されるものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．（a）周辺部を有する上面及び下面を有する少なくとも１の下部プレートを 用意し、 （b）予め選択された位置の第１のセットにおいて前記少なくとも１の下部プ レートの上面上に走化性因子の液滴を置き、 （c）予め選択された位置の第２のセットにおいて前記少なくとも１の下部プ レートの上面上にコントロールの液滴を置き、 （d）前記少なくとも１の下部プレートの上面の上に上面と下面を有する少な くとも１のフレーム付き膜フィルターを置き、前記走化性因子の液滴及びコント ロールの液滴が前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの下面に接触する ようにし、 （e）細胞懸濁物の液滴を、前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め 選択された位置の第１及び第２のセットの直上の予め選択されたフィルター位置 において前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面に置き、 （f）表面張力が重力と平衡に達し、それにより走化性因子濃度勾配が形成さ れるのに少なくとも十分な時間、前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルター をインキュベートし、 （g）走化性因子濃度勾配及びコントロールに対する細胞懸濁物の反応を測定 すること、 を含む走化性試験を行う方法。 ２．前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選択された位置の第１及び 第２のセットが、その予め選択された位置の第１及び第２のセットの配置を規定 するパターンを含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記少なくとも１の下部プレートの上面上に疎水性コーティングを塗布する ことによりパターンが形成されている、請求項２に記載の方法。 ４．さらに、前記少なくとも１の下部プレートの上面の周辺部上に上面及び下面 を有する所定の高さのスペーサーを置き、該スペーサーが前記少なくとも１の下 部プレートの上面の周辺部と前記フレーム付き膜フィルターのフレームの下 面の間に挟まれ、前記フレーム付き膜フィルターの下面と前記下部プレートの上 面との間に前記スペーサーの高さに等しい間隔を残し、その間に走化性因子及び コントロールの液滴をトラップすることを含む、請求項２に記載の方法。 ５．前記少なくとも１の下部プレート、前記スペーサー、及び前記少なくとも１ のフレーム付き膜フィルターがクランプ装置により所定の位置に保持されている 、請求項４に記載の方法。 ６．前記クランプ装置が、少なくとも１の位置決めピンにより前記少なくとも１ の下部プレート、前記スペーサー、及び前記少なくとも１のフレーム付き膜フィ ルターを整列させている、請求項５に記載の方法。 ７．細胞懸濁物の液滴が、前記クランプ装置が取り付けられる前に前記少なくと も１のフレーム付き膜フィルターの上面に置かれる、請求項５に記載の方法。 ８．細胞懸濁物の液滴が、前記クランプ装置が取り付けられた後に前記少なくと も１のフレーム付き膜フィルターの上面に置かれる、請求項５に記載の方法。 ９．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面及び下面が、予め選択 されたフィルター位置の配置を規定するパターンを含む、請求項２に記載の方法 。 10．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面及び下面上に疎水性コ ーティングを塗布することによりパターンが形成されている、請求項９に記載の 方法。 11．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置がさらに閉塞物質のコーティングを含む、請求項２に記載の方法。 12．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置がさらに培養細胞の単層を含む、請求項２に記載の方法。 13．前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選択された位置の第１及び 第２のセットが、縁付きのウェルの予め決められた第１及び第２のセットを含む 、請求項１に記載の方法。 14．さらに、 （a）縁付きのウェルの予め決められた第１のセットの中に走化性因子の液滴 を置き、流体が前記縁付きウェルの縁に達するかそれを越えるようにし、 （b）縁付きのウェルの予め決められた第２のセットの中にコントロールの液 滴を置き、流体が前記縁付きウェルの縁に達するかそれを越えるようにし、 （c）前記少なくとも１の下部プレートの縁付きウェルの上に前記少なくとも １のフレーム付き膜フィルターを置き、前記縁付きウェルの縁の位置が前記少な くとも１のフレーム付き膜フィルターの下面に接近するようにし、 （d）前記少なくとも１の下部プレートの縁付きウェルの直上の予め選択され たフィルター位置において、前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上 面上に細胞懸濁物の液滴を置くこと、 を含む請求項13に記載の方法。 15．前記少なくとも１の下部プレートが少なくとも１の上方に突き出す基準ピン を有し、前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターが少なくとも１の対応す る基準穴を有し、膜フィルターが下部プレート上に置かれ上方に突き出す基準ピ ンが対応する基準穴に係合したときに、前記少なくとも１の下部プレートの縁付 きウェルが前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの前記予め選択された フィルター位置の直下に位置するようにする、請求項14に記載の方法。 16．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターのフレームの下面が、前記少 なくとも１つの下部プレートの上面の周辺部に感圧接着剤により接着されている 、請求項14に記載の方法。 17．前記少なくとも１の下部プレートの縁付きウェルが、マイクロタイタープレ ート配置にある、請求項14に記載の方法。 18．前記少なくとも１の下部プレートが96の縁付きウェルを含む、請求項14に記 載の方法。 19．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面及び下面が、予め選択 されたフィルター位置の配置を規定するパターンを含む、請求項14に記載の方法 。 20．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面及び下面上に疎水性コ ーティングを塗布することによりパターンが形成されている、請求項19に記載の 方法。 21．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置が閉塞物質のコーティングをさらに含む、請求項14に記載の方法。 22．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置が培養細胞の単層をさらに含む、請求項14に記載の方法。 23．（a）周辺部を有する上面及び第１及び第２の予め選択された位置のセット を有する少なくとも１の下部プレート、 （b）前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選択された位置の第１ のセットに位置する走化性因子の液滴、 （c）前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選択された位置の第２ のセットに位置するコントロールの液滴、 （d）上面と下面を有し、前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選 択された位置の第１及び第２のセットの直上の予め選択されたフィルター位置の セットの配置を規定するパターンを膜フィルターの上面及び下面上に有する少な くとも１のフレーム付き膜フィルターであって、前記少なくとも１の下部プレー トの上面の上に配置され、前記走化性因子の液滴及びコントロールの液滴が前記 少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの下面に接触するようにされている前 記少なくとも１のフレーム付き膜フィルター、及び （e）前記予め選択された位置のセットにおいて前記少なくとも１のフレーム 付き膜フィルターの上面上に位置する細胞懸濁物の液滴、 を含む、走化性装置。 24．前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選択された位置の第１及び 第２のセットが、その予め選択された位置の第１及び第２のセットの配置を規定 するパターンを含む、請求項23に記載の走化性装置。 25．前記少なくとも１の下部プレートの上面上のパターンが塗布された疎水性コ ーティングを含む、請求項24に記載の走化性装置。 26．さらにスペーサーを含み、該スペーサーは前記少なくとも１の下部プレート の上面の周辺部と前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターのフレームの下 面に挟まれ、前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの下面と前記下 部プレートの上面との間に前記スペーサーの高さに等しい間隔を残し、その間に 走化性因子及びコントロールの液滴をトラップするものである、請求項24に記載 の走化性装置。 27．さらにクランプ装置を含み、それにより前記少なくとも１の下部プレート、 前記スペーサー、及び前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターが所定の位 置に保持されている、請求項26に記載の走化性装置。 28．前記クランプ装置がさらに、 （a）支持プレート、 （b）クランププレート、 （c）前記支持プレート及び前記クランププレートを通して上向きに設置され 、前記少なくとも１の下部プレートの下部表面に固定された少なくとも１のねじ 山を有するボルト、 （d）対応するネジ山を有する少なくとも１のつまみナットであって、これに よりクランプ装置が前記スペーサー、及び前記少なくとも１のフレーム付き膜フ ィルターを前記少なくとも１の下部プレートに固定することができるものである 前記つまみナット、及び （e）前記支持プレートの上部表面から上方に突き出た、少なくとも１の位置 決めピン、 を有する、請求項27に記載の走化性装置。 29．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面及び下面上のパターン が塗布された疎水性コーティングを含む、請求項24に記載の走化性装置。 30．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置が閉塞物質のコーティングをさらに含む、請求項24に記載の走化性装置。 31．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置が培養細胞の単層をさらに含む、請求項24に記載の走化性装置。 32．前記少なくとも１の下部プレートの上面上の予め選択された位置の第１及び 第２のセットが、縁付きのウェルの予め決められた第１及び第２のセットを含む 、請求項23に記載の走化性装置。 33．（a）前記縁付きウェルの予め選択された第１のセット中に位置する走化性 因 子の液滴であって、該走化性因子の流体は前記縁付きウェルの縁に達するか越え るものである液滴、 （b）前記縁付きウェルの予め選択された第２のセット中に位置するコントロ ールの液滴であって、該コントロールの流体は前記縁付きウェルの縁に達するか 越えるものである液滴、及び （c）前記少なくとも１の下部プレートの縁付きウェル上に位置する、パター ン化されたフレーム付き膜フィルターであって、前記縁付きウェルの縁が前記少 なくとも１のフレーム付き膜フィルターの下面に接近している、膜フィルター、 をさらに含む、請求項32に記載の走化性装置。 34．（a）前記少なくとも１の下部プレートの周辺部から上方に突き出す少なく とも１の基準ピン、及び （b）前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターのフレーム中の少なくと も１の対応する基準穴であって、これにより前記少なくとも１のフレーム付き膜 フィルターは前記少なくとも１の下部プレートの頂上の所定の位置に保持され、 前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルター上の予め選択されたフィルター位 置は前記少なくとも１の下部プレートの縁付きウェルと垂直に整列させられる、 前記基準穴、 をさらに含む、請求項33に記載の走化性装置。 35．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの下面と前記少なくとも１の 下部プレートの上面との間に置かれた感圧接着剤の層をさらに含む、請求項33に 記載の走化性装置。 36．前記下部プレートが96の縁付きウェルを含む、請求項33に記載の走化性装置 。 37．前記下部プレートがマイクロタイタープレート配置を含む、請求項33に記載 の走化性装置。 38．パターンが、前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの上面及び下面 上に塗布された疎水性コーティングを含む、請求項33に記載の走化性装置。 39．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置がさらに閉塞物質のコーティングを含む、請求項33に記載の走化性装置。 40．前記少なくとも１のフレーム付き膜フィルターの予め選択されたフィルター 位置がさらに培養細胞の単層を含む、請求項33に記載の走化性装置。
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