JPH08506000A - Ｃ−ｒａｆ−１遺伝子検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は（１）発癌リスクの高い個体を識別する方法、（２）癌患者の予後を判定する方法、そして（３）癌患者の適性治療法を決定するための方法に関し、ｃ−ｒａｆ−１遺伝子の領域を増幅することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ−ＲＡＦ−１遺伝子検出方法 発明の分野 本発明は（１）発癌リスクが高い個体を同定する方法、（２）癌患者の予後を 判定する方法、（３）癌患者にとって適切な治療法を決定する方法に関する。 発明の背景 米国では新生物の中でも肺癌による死亡率が最も高く（R.S．Finley，Am．Pha rm． NS29，39（1989））、中でも肺の腺癌の予後が最も悪い（T.P．Miller，Sem in．Oncol ．17，11（1990））。米国における肺の腺癌（ＡＣＬ）の発生率は急 速に高くなっている（I．Linnoila，HeEatol．Oncol．North.Am．4,1027（1990 ）；J.B．Sorensen，H.H．Hansen，Cancer Surviv．8，671（1989））。この複 雑かつ致命的な疾患をより正確に把握するために、研究モデルが開発されている 。こうしたモデルから臨床的に意味をもつデータを得るには、幾つかの基準、す なわち、発生させた腫瘍は組織学的にヒトの腫瘍と同等でなければならない、腫 瘍誘発の方法は信頼性、再現性のあるものでなければならない、そして統計学的 に有意な数の腫瘍を誘発しなければならない、などの基準を満たさねばならない 。これらの条件を満たすために、２種の近交系マウス（ＮＦＳ／ｓおよびＡＫＲ ）を用いて発癌物質Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソユリア（ＥＮＵ）を胎盤を介して 暴露させ、抗酸化剤ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）で促進するシステム が開発されている。その結果発生した腫瘍を、肺癌発生にかかわる遺伝子であるｒａｓ 、ｍｙｃ、ｒａｆなどのオンコジーン変性発現あるいは構造性突然変異に ついて調べた（C.D．Little et al.，Nature306，194（1983）；P.E．Kiefer et al.，Cancer Res.，47，6236（1987）；E．Santos et al.，Science 223，661 （1984）；S．Rodenhuis，N．Engl．J．Med． 317，929（1987）；M．Barbacid，Eur．J．Clin．Invest．20，225（1990）；U. R．Rapp et al.，J．Int.Assoc．for the Study of Lung Cancer 4，162（1988 ）；M.J Birrer et al.，Ann．Rev．Med．40，305（1989）：G．Sithananda et al.，Oncogene 4，451（1989））。 ｒａｆプロトオンコジーンは細胞質セリン/トレオニン特異性キナーゼをコー ド化する進化過程の中でも最も保存の高い遺伝子であり、ミトゲンシグナル形質 導入で機能する（U.R．Rapp et al.，The Oncogenen Handbook，T．Curran et a l.，Eds．（Elsevier Science Publishers，The Netherlands，1988），pp．115 -154；U.R.Rapp，0ncogenen 6，495（1991）において検討）。ｒａｆ系統群のう ち既知の３つの活性メンバーは類似の大きさのリン蛋白をコード化する（Ｒａｆ −１は７２／７４ｋＤ；Ａ-Ｒａｆ−１は６８ｋＤ；Ｂ−Ｒａfは７４ｋＤ（U.R ．Rapp et al.，Retroviruses and Human Pathology，R．Gallo et al.，Eds． （Humana Press，Clifton，New Jersey 1985），pp．449-472：T.W．Beck et al .，Nucliec AcidsRes．15，595（1987）；G．Sithanandam et al.，Oncogene 5 ，1775（1990）））。Ｒａｆ−１は最初、３６１１ＭＳＶの形質転換遺伝子であ るｖ−ｒａｆ（H.W．Jansen et al.，Nature 307，218（1984））の細胞相同体 として同定された（U.R．Rapp et al.，J．Virol．45，914（1983）；U.R．Rapp et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80，4218（1983））。ｒａｆ系統群遺伝 子のアミノ酸比較は３つの保存領域［ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３］を示している（ T.W．Beck et al.，Nucleic Acids Res．15，595（1987））。ＣＲ１はＣｙｓフ ィンガー共通配列を取り巻く制御領域であり、ＣＲ２は高セリン／トレオニン領 域であり、ＣＲ３はキナーゼドメインを表す。Ｒａｆ−１はヒトの染色体３ｐ２ ５にマップされており（S.J．0'Brien et al.，Science 223，71（1984））、こ の領域は肺の小細胞癌（ＳＣＬＣ）（J．Whang-Penget al.，Cancer Genet. Cyt ogenet. 6，119（1982）；J.M. Ibson et al.，J．Cell．Biochem. 33，267（19 87））、家族性の腎細胞癌（A.J．Cohen et al.，N．Eng．J．Med. 301，592（1979）；G．Kovacs et al.，Int．J．Cancer 40，1 71（1987））、混合型耳下腺腫瘍（Ｊ．Mark et al.，Hereditas 96，141（1982 ））、並びに卵巣癌（K．Tanaka et al.，Cancer Genet．Cytogenet．43，1（19 89））においてしばしば変性を示すことが知られている。 Ｒａｆ遺伝子は各種組織中で分化発現する（S．M．Storm et al,，Oncogene 5 ，345（1991））。ｃ−ｒａｆ−１は絶対レベルが組織によって異なるものの、 遍在的に発現することが知られている。Ａ−ｒａｆ−１は尿生殖組織に顕著に存 在するが、Ｂ−Ｒａｆは大脳および精巣に最も多く見られる。遍在性ｃ−Ｒａｆ −１キナーゼは活性化増殖因子レセプターキナーゼから生じるチロシンとセリン のリン酸化によって調節される（D.K．Morrison et al.，Cell 58，648（1989） ；D.K．Morrisonet al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，8855（1989）；K.S ．Kovacina et al.，J．Biol．Chem. 265，12115（1990）；P.J．Blackshear et al.，J．Biol．Chem．265，12131（1990）；M.P．Carroll et al.，J.Biol．Ch em. 265，1981 （1990）；J.N. Siegel et al.，J．Biol．Chem. 265，18472（1 990）；B.C.Turner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，1227（1991）；M ．Baccarini et al.，EMBO J．9，3649（1990）；H．App et al.，Mol．Cell．B iol ．11, 913（1991））。Ｒａｆ−１は、抗体のマイクロインジェクションを用 いた実験から、ミトゲンシグナル形質導入におけるＲａｓの下流で作用すると判 断され（M.R．Smith et al.，Nature 320，540（1986））、ｃ−ｒａｆ−１非転 写発現（K．Kolch et al.，Nature 349，426（1991））は負の優性変異（W．Kol ch et al.，Nature 349，426（1991））とＲａｆ復帰変異細胞を構成する。ＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞と脳組織を用いた研究では、ミトゲン処理によってＲａｆ−１キナ ーゼの活性が誘発され、活性酵素が細胞質から核と核周囲域に一過性のリロケー ションを生じさせることが実証された（Z.Olah et al.，Exp. Brain．Res.（印 刷中）；U.R．Rapp et al.，Cold Spring Harbor Symposiaon Quantitative Bio logy ，Vol．LIII，Eds．（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．1988）pp．173-184）。 Ｒａｆ−１結合を十数個のレセプター系について調べたが、強大なミトゲンは すべてＲａｆ-１キナーゼ活性を剌激し（U.R．Rapp，Oncogene 6，495（1991） ；D.K．Morrison et al.，Cell 58，648（1989）；D.K.Morrison et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci ．USA 85，8855（1989）；K.S．Kovacina et al.，J．Biol． Chem ．265，12115（1990）；P.J．Blackshear et al.，J.Biol.Chem．265，1213 1（1990）；M.P．Carroll et al.，J．Biol．Chem．265，19812（1990）；J.N． Siegel et al.，J．Biol．Chem．265，18472（1990）；B.C．Turner et al.，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 88，1227（1991）；M．Baccarini et al.，EMBO J． 9，3649（1990）；H．App et al.，Mol．Cell．Biol．11，913（1991））、この 剌激は見かけ分子量の変化につながるＲａｆ−１のリン酸化増大と相関があった 。 発明の要旨 本発明の目的は、発癌リスクの高い患者を識別するための方法を提供すること にある。 本発明の他の目的は、癌患者の予後を判定する方法を提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、癌患者の適切な治療法を決定する方法を提供する ことにある。 本発明のさらに他の目的および利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。 一実施例によれば、発癌リスクの高い患者を識別する本発明方法は、 ｃ−ｒａｆ−１遺伝子領域を増幅し、 増幅による生成物から突然変異の痕跡を解析し、 該領域に１つ又はそれ以上の突然変異を有する個体を発癌リスクが高いとして 分類することからなる。 他の実施例によれば、癌患者の予後を判定するための本発明方法は、 ｃ−ｒａｆ−１遺伝子領域を増幅し、 増幅による生成物から突然変異の痕跡を解析し、 該領域に突然変異がない患者は、該領域の突然変異が１つ又はそれ以上の患者 に比べ再発の危険が少ないあるいは生存の可能性が高いとして分類する、 ことからなる。 さらに他の実施例によれば、癌患者の適切な治療法を決定するための本発明方 法は、 ｃ−ｒａｆ−１遺伝子領域を増幅し、 増幅による生成物から突然変異の痕跡を解析し、 該領域に突然変異が少なくとも１つある場合は、生存率が低いまたは再発まで の時間が短い患者に適した治療が必要であるとして識別し、 該領域に突然変異がない場合は、生存率が高いまたは再発の危険が少ない患者 に適した治療が必要であるとして識別する、 ことからなる。 図面の簡単な説明 図１。ＮＦＳ／ｎｘＡＫＲマウスにおけるＥＮＵ腫瘍形成に対するＢＨＴプロ モーター作用。Ｘ軸に各グループ内での腫瘍による死亡率（％）を示し、Ｙ軸に 週齢を示す。マウスはすべて妊娠１６日目（膣栓の存在を妊娠第１日として計算 ）の母体重Ｋｇあたり０.５ｍＧのＥＮＵを胎盤を通して暴露させた。週齢２で マウスを離乳させて雌雄２つのグループに分けた。両グループとも同じ形のケー ジに収容し、飼料（Ｐｕｒｉｎａ Ｌａｂ Ｃｈｏｗ）と水を自由に摂取させた 。週齢３からグループ２Ａ（〇）にはコーン油（０.１ｍｌ）を毎週腹腔内（ｉ ．ｐ．）注射で投与し、グループ２Ｂ（◇）にはコーン油に溶解したＢＨＴ（２ ０ｍｇ／体重）を毎週ｉ．ｐ．注射した。ＢＨＴ投与により平均死亡齢が約２０ 週から１３週に低下し、最初の死亡齢も下がる。コックス両側検定によりこれら の曲線には有意差（ｐ≦0.001）が認められた。両グループにおいて、雌雄の腫 瘍形成率は同じであった。 図２。ＥＮＵ誘発マウスにおけるプロトオンコジーン発現レベルのノーザンブ ロッティング解析。 図３。ＥＮＵ誘発腫瘍からのＰＣＲ増幅Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の診断のための分 断。ＲＮＡ調製中に塩化セシウム勾配からゲノムＤＮＡを単離した。各ケースと も、Ｔａｇ１ポリメラーゼ２単位を用いてＰＣＲにより（９５°Ｃ、５分に続い て９５°Ｃ、１分を３５サイクル→５５°Ｃ、１分→７２°Ｃ、１分）１０ｎg 増幅させた。用いたプライマー（Ｋ１；５'-ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧ ＡＣＣＴ−３’→（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびＫ２；＜＝３'-ＧＴＣＴＴＡ ＧＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴ−５’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は７９ｂ.ｐ． 生成物を生じる。プライマーＫ１はコドン１２で終わり、正常マウスからの不適 合な組合せを含む（Ｋｉ−ｒａｓは１８番目のヌクレオチド（Ｇ→Ｃ）に配列し 、正常コドン１２（ＧＧＴ）との結合によりＢｓｔＮＩサイトを創製する）。Ｂ ｓｔＮＩを用いた正常対立遺伝子からの増幅生成物の分断により、２つの生成物 である１９と６０ｂ.ｐ．が生じるが、コドン１２の最初の２つの位置の１つに 突然変異があるとＢｓｔＮＩサイトが排除される。２つの正常対立遺伝子が存在 すると生成物はすべて分裂し、突然変異体が１つと正常対立遺伝子が１つの場合 は生成物の切断は半分に過ぎない。３つのパネルにおいて各サンプルをＢｓｔＮ Ｉで切断したもの、切断しなかったものの２通りで操作した。Ｆ１は未処理ＮＦ Ｓ／ｎ ｘ ＡＫＲ Ｆ１マウスのＤＮＡであり、ＭＣＡ５は突然変異体Ｋ−ｒａ ｓ コドン１２対立遺伝子を宿していることが分かっている齧歯目の細胞系である 。リンパ腫（２４Ｌｙ）１種と細胞系１種（１１７；肺の腺癌由来）は、突然変 異Ｋｉ−ｒａｓコドン１２対立遺伝子を示す。しかし２４Ｌｙは継代接種した腫 瘍であり、もとの腫瘍は２つの正常対立遺伝子を示しているため、この突然変異 は継代接種中に生じたものであることを示している。 図４。ＥＮＵ誘発腫瘍のｃ−ｒａｆ−１ ＲＮＡｓｅ保護解析。用いたプロー ブは、マウスｃ−ｒａｆ−１ ｃＤＮＡの３’非コード化領域から３’ｍｏｓｔ ＳｔｕＩ 部位への３２ｐ標識した非転写トランスクリプトである。このプローブと正常Ｒ ＮＡとのハイブリッド形成により、Ｒａｆ−１キナーゼドメインをコード化する 領域をカバーする１.２ｋｂの保護断片が得られる。各腫瘍のポリ（Ａ）+ ＲＮ Ａを１μｇとＦ１ ＲＮＡを５μｇ（同等シグナルを得るために）、³²ｐ標識し たマウスｃ−ｒａｆ非転写トランスクリプトを２００,０００ｃｐｍ用いて５２ °Ｃで１２時間ハイブリッド化した。次いでハイブリッドを３０分間、２５μｇ のＲＮＡｓｅ Ａと３３単位のＲＮＡｓｅ Ｔ１を用いて室温で分断させた。分断 させたハイブリッドを５０μｇのプロテナーゼ Ｋで培養し、フェノール／クロ ロフォルムで抽出し、エタノールで析出させ、８０％ホルムアミドを含有する負 荷染料中に再懸濁させた。サンプルを次いで６％ポリアクリルアミド変性シーク エンシングゲル上で６５ワットで操作した。ゲルを摂氏８０度で真空乾燥させ、 Ｘ線フィルムに暴露させた。プローブは未分断プローブのみであり、ｔＲＮＡは 非特異ＲＮＡにプローブでハイブリッド化され、ｖ−ｒａｆはｖ−ｒａｆ変換細 胞系からのＲＮＡにプローブでハイブリッド化されて、検出帯域はマウスｃ−ｒ ａｆ とｖ−ｒａｆとの間の単一の不適合塩基の組合せを表している。ＮＦＳ／Ａ ＫＲ Ｆ１は正常未処理マウスのＲＮＡとプローブハイブリッド化しており、２ ４Ｌｙはリンパ腫からのＲＮＡとプローブでハイブリッド化している。残るレー ンは肺腫瘍から単離したＲＮＡとプローブでハイブリッド化している。 図５。ＥＮＵ誘発突然変異の部位を示すＲａｆ−１蛋白の概略図。ＣＲ１、Ｃ Ｒ２、ＣＲ３は保存領域１、２、３を表す。ｃＤＮＡはＭｏＭｕＬｖリバースト ランスクリプターゼを用いてポリ（Ａ）+ ＲＮＡ由来の腫瘍から調製した。次い で４３５塩基対領域ｃ−ｒａｆを網羅するプライマー（ＭＲ１配列とＭＲ２配列 ）を用いてＰＣＲによりこの領域を増幅した。増幅混合を１.７％アガロースゲ ル上で行い、４３５ｂｐ生成物を単離した。こうして単離した断片をＴ４ポリメ ラーゼで処理し、Ｍ１３ｍｐ１８のＨｉｎｃＩＩの部位中シークエンシングのた めにクローニングさ せた。端部にＥｃｏＲＩ部位を含むプライマー（ＥＭＲ１配列とＥＭＲ２配列） をもう１組設計し、これを用いて６０９塩基対領域（原発の４３５塩基対領域を 網羅する）を増幅させた。これらの反応から単離させた生成物をＥｃｏＲＩで分 断させ、ＫＳのＥｃｏＲＩ部位中にクローニングさせた。１本鎖、２本鎖シーク エンシング用のプロトコールに従ってシクエナーゼキット（ＵＳＢ）を用いたシ ークエンシング反応を実施した。シークエンシング反応は、６％ポリアクリルア ミド変性ゲル上で６５ワットで行った。ゲルを摂氏８０度で真空乾燥させ、Ｘ線 フィルムに暴露させた。それぞれのケースで、正常対立遺伝子が突然変異をした 対立遺伝子に並んで配列されていた。 図６。ｃ−ｒａｆ−１突然変異の識別を示す概略図。プライマー１、２はそれ ぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示す。 発明の詳細な説明 本発明はｃ−ｒａｆ−１遺伝子の領域（マウスｃ−ｒａｆ−１遺伝子の配列を ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に、ヒトｃ−ｒａｆ−１遺伝子のヌクレオチドと対応ア ミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２にそれぞれ示す ）を増幅させるステップを用いる方法に関する。 本発明の一実施例は、個体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のｃ−ｒａｆ−１遺伝 子の領域（好ましい実施例の１つでは、この領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のア ミノ酸５１４から５３５をコード化する）を（好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反 応法（ＰＣＲ）またはクローニング手法を用いて）増幅し、増幅生成物を解析し て突然変異の痕跡を調べ（好ましくは、該領域のＤＮＡ配列によって）、該領域 に突然変異を１つ又はそれ以上有する個体を発癌率が高いとして分類することか らなる、個体の発癌リスク増大（好ましくは肺癌、Ｔ細胞リンパ腫、腎細胞癌、 卵巣癌、混合型耳下腺腫瘍）を識別するための方法に関する。好ましい実施例の １つでは、該領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５００から５５０、また はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸４５０から６３０をコード化している。他の好ましい実施 例では、ＰＣＲ法にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列からなるプライマーと、SE Q IDN0:8に示す配列からなるプライマーを用いる。他の好ましい実施例では、図 ６に示すステップからなる方法を用いる。 他の実施例による本発明は、癌患者（好ましくは、上に列記した癌の患者）の 予後を判定する方法に関する。該方法は、前述の要領でｃ−ｒａｆ−１遺伝子領 域を増幅させ、増幅生成物を前述の要領で解析して突然変異の痕跡を調べ、該領 域に突然変異のない患者は、該領域に１つ又はそれ以上の突然変異を有する患者 に比べて、疾患再発の危険が少ないあるいは生存率が高いとして分類することか らなる。 他の実施例による本発明は、癌患者（好ましくは、上に列記した癌患者）のた めの適正な治療法を決定する方法に関するもので、前述の要領でｃ−ｒａｆ−１ 遺伝子領域（前述）を増幅させ、増幅生成物を前述の要領で解析して突然変異の 痕跡を調べ、該領域に突然変異を少なくとも１つ有する患者は、生存率が低いあ るいは再発までの時間が短い患者のための治療を必要とする患者として識別し、 該領域に突然変異のない患者は、生存率が高いまたは再発の危険が少ない患者に 適した治療を必要とする患者として識別することからなる。 突然変異体Ｒａｆ−１蛋白は認識するが正常Ｒａｆ−１は認識しないようにし た治療剤（細胞毒性または細胞増殖抑制性を有する）を投与することにより、腫 瘍細胞を特異的に標的にして死滅または成長抑制させることができる。かかる薬 剤としては細胞毒性Ｔ細胞、抗体および／または特定の化学化合物がある。 以下の例では、化学物質によって誘発された腫瘍についてのマウスのモデルに おいてキナーゼドメインの小さい領域内部で、ｃ−ｒａｆ−１プロトオンコジー ンの一貫した点突然変異が見られることを実証している。これは生体内で点突然 変異を示したｒａｆ遺伝子の最初の実証例であり、またプロトオンコジーンのキ ナーゼドメインにおける活性化する生体内点突然変異の初の単離例である。調べ た腫瘍は、 別の系統群に属する遺伝子である動物およびヒトの腫瘍における点突然変異によ って活性化されることが多いｒａｓプロトオンコジーンが関与していないため、 Ｒａｆ−１突然変異に選択的特異性を示す（S．Rodenhuis et al.，Am．Rev．Re spir．Dis ．142，S27-30；T.R．Devereux et al.，Carcinogenesis 12，299（19 91））。 本発明を以下の実施例に沿ってさらに詳しく述べるが、本発明はこれらによっ て限定されるものではない。 実施例 以下の実施例では下記のプロトコールと実験の詳細を参照している。ＲＮＡの単離 腫瘍を摘出し、少量をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で細片 にしてヌードマウスに継代接種し、直ちにドライアイス／エタノール浴中で凍結 させた後、ＲＮＡ抽出まで−７０°Ｃで保存した。凍結組織をチオシアン酸グア ニジン緩衝液（４Ｍチオシアン酸グアニジン １０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％Ｎ−ラウ リルサルコシン、２％ベータ・メルカプトエタノール、１０ｍＭ トリス（ｐＨ ＝７．６））中の氷上で細断し、ダウンス・ホモジナイザーで粉砕し、フェノー ル：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：２４：２）で３回抽出した 。上澄液をＳＷ４１試験管に移して塩化セシウム１ｍｌあたり１００μｇを添加 した後、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝７.０；屈折率 １．３９９５−１．４００ ０）中の１／２飽和塩化セシウムを底に敷き、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＷ−４１ＴＩ ローター中でベックマンＬ５−５０型超遠心分離機を用いて２５,０００ｒｐｍ で２０時間遠心分離を行った。上澄液を取り出し、ＲＮＡペレットを４ｍｌ再懸 濁緩衝液（１０ｍＭトリス-ＨＣＩ ｐＨ＝７.６、５％ベータ−メルカプトエタ ノール、０.５％Ｎ−ラウリルサルコシン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、フェ ノール：クロロフォルム：イソアミルアルコールで１回抽出し、０.１２Ｍに酢 酸ナトリウムを添加してＲＮＡを２容量エタノールを用いて−２０°Ｃで一晩析 出させた。析出物をＳｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４中で９,０００ｒｐｍ、３０分遠 心分離にかけ、ペレットをＲＮＡサンプル緩衝液中 （１０ｍＭ トリス ｐＨ＝７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０.０５％ドデシル硫酸ナ トリウム）に再度溶解させ、吸光度２６０ｎｍで濃度を調べた。ポリ（Ａ）+ Ｒ ＮＡは、高濃度塩溶液中でオリゴｄＴセルロース・カラム（１０ｍＭ トリス ｐ Ｈ＝７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％ＳＤＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）に結合 させ、４０℃に加熱したＲＮＡサンプル緩衝液で溶出させることにより単離した 。ノザン・ブロッティング １レーンあたり５μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡをエタノ ール析出、乾燥後、負荷緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ＝６.８、５ｍＭ酢酸 ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％ホルムアミド、６％ホルムアルデヒド） に再度懸濁させ、６５℃で５分間加熱し、氷上で１０分急冷して、２.２Ｍフォ ルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ［ｐＨ＝６.８］、５ｍＭ酢酸ナトリウムお よび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０.７％アガロースゲル電気泳動を行った。ゲル はニトロセルロース・フィルター上に２０Ｘ ＳＳＣで一晩毛細管現象により転 写（ブロット）させ、フィルターを３Ｘ ＳＳＣを用いて１０分洗浄した後８０ ℃で２時間焼付た。ハイブリダイゼーション フィルターを５Ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、２ ０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ＝６.８、ＰＶＰ−４０を２００μｇ／ｍｌ、フィ コール４００を２００μｇ／ｍｌ、ウシ血清アルブミンを２００μｇ／ｍｌ、超 音波処理した後かきだしたサケの精子ＤＮＡを２００μｇ／ｍｌ用いてあらかじ めハイブリッドさせた。次いで、ブロットをランダムに感作させ、32ｐ標識した プローブを５００,０００ｃｐｍ／ｍｌ用いて、５％デキストランスルフェート のハイブリダイゼーション前処理液中で、４２℃で一晩ハイブリッドさせた。ブ ロットを攪拌しながら２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳを用いて、室温で１回２０ 分づつ６回洗浄した後、０.１Ｘ ＳＳＣを用いて、４５℃で１５分間１回洗浄し た。フィルターをＸ−ＡＲ５フィルムに−７０℃で暴露させた。 実施例１ 腫瘍の誘発 ＮＦＳマウスの雌をＡＫＲマウスの雄と交配させ、膣栓の見られた日を妊娠第 １日として起算して妊娠１６日目に妊娠した雌に１−エチル−１−ニトロソユリ ア（ＥＮＵ）を母体重１ｋｇあたり０．５ｍＭ経胎盤注射した。ＥＮＵはｉｎ ｖｉｖｏで塩基を修飾することができ、直接作用する強力な発癌物質であること から、腫瘍誘発に用いられることになった（Singer，B．et al.，1983．Molecul ar Biologyof Mutagens and Carcinogens ，Plenum Press，New York）。ＥＮＵ はすべての組織をほぼ同じ効率でアルキレート化し（E．Scherer et al.，Cance r Lett ．46，21（1989））、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期は極めて短いため（E．M ．Faustman et al.，Tetratology 40，199（１989））、特定の時間に有糸分裂 的に活性の高い組織を特異的に変異誘発させることできる。ＮＦＳとＡＫＲを親 株に選んだのは、ＥＮＵに暴露させると特に肺腫瘍が発生しやすいことが先の研 究で知られているからである（B.A．Diwan et al.，Cancer Res．34，764（1974 ）；S．L．Kauffman，JNCI 57，821（1976））。この手法により、ほぼ１００％ の仔マウスに肺の腺癌が生じ、ほぼ７０％にはさらにＴ細胞リンパ腫が見られ、 平均潜伏期間は約２０週間であった。腫瘍形成をより促進するために、腫瘍プロ モーターである抗酸化剤ＢＨＴ（体重１ｋｇ当たり２０ｍｇをコーン油に溶解） を毎週離乳期のマウスに注射した。ＢＨＴを用いたのはマウスに注射した場合肺 の病変や過形成をきたすことが実証されているからである（A. A. Marino et al .，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．140, 122（1972）；H．Witschi et al.，Proc ．Soc．Exp．Biol．Med. ，147，690（1974）；N．Ito etal.，CRC Crit．Rev．T oxicol． 15，109（1984））。本システムでは腫瘍発生率はほぼ２倍になる。図 １は、ＥＮＵのみを投与したマウスと、ＥＮＵに加えてＢＨＴで腫瘍発生を促進 させたマウスの腫瘍による死亡率を週齢で比較したものである。図の曲線からＢ ＨＴ投与群では、腫瘍による平均死亡週齢が約２０週から１２週程度 に低下し、初期潜伏期も短縮することがわかる。これらの曲線は有意差があり、 コックスの両側検定を用いた信頼限界は９９.９９％以上である。さらに、ＢＨ Ｔは腫瘍形成の速度を速めるが腫瘍スペクトルには影響を与えない。 実施例２ オンコジーン発現 ノーザン・ブロット解析では調べた腫瘍すべてにおいてｃ−ｒａｆ−１のレベ ルが正常組織より高く、ウエスタン・ブロット解析では蛋白レベルがメッセージ レベルと相関性をもつことが明らかになった（U.R．Rapp et al.，Oncogenes an dCancer ，S．A．Aaronson et al.，Eds．（Tokyo/VNU Scientific Press，Tokyo ，1987）pp．55-74）。さらに、原発腫瘍由来の細胞系ではＲａｆ−１蛋白キナ ーゼ活性が構成的であることが免疫複合体キナーゼアッセイによって示された。 さらに他のオンコジーンを解析したところ、ｒａｓ、ｍｙｃ系統群の遺伝子以外 は発現パターンに一貫性が見られなかった。ｍｙｃ系統群の場合、メンバーの１ つ（ｃ−、Ｎ−、またはＬ−ｍｙｃ）に過剰発現が見られたが、それも１つ以上 であることはなかった。ｒａｓ遺伝子については、メンバーの少なくとも１つ（ ｋｉ−、ｈａ−、またはＮ−ｒａｓ）、また多くの場合１つ以上が、正常組織よ り高レベルで発現した。またノーザン解析で調べたオンコジーンすべてが全長に わたる正常な大きさの転写産物を示した。 Ｋｉ−ｒａｓの発癌形態が肺腫瘍において認められており、ＥＮＵは点変異体 である（Singer，B．et al.，1983．Molecular Biology of Mutagens andCarcin ogens，Plenum Press，New York）ことから、ｒａｓ遺伝子が突然変異活性を生 じる可能性が高いと考えられた（S．Rodenhuis et al.，Am．Rev．Respir．Dis ． 142，S27-30；T.R．Devereux et al.，Carcinogenesis 12，299（1991））。 したがって腫瘍形成活性化に関与することが知られる各種ｒａｓコドンの系統的 解 析を行った。Ｈａ−、Ｋｉ−およびＮ−ｒａｓの突然変異の可能性をコドン１２ 、１３、６１において、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（R.M．Myers et al.，Science 230、1242（1985）；E．Winter et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82，757 5（1985））、ＰＣＲ増幅に続くシークエンシング（F．Sanger et al.，J．Mol ．Biol． 13，373（1975））、およびＰＣＲ増幅に続く診断のための制限分断（W ．Jiang et al.，0ncogene 4，923（1989））を用いて調べた。診断酵素部位を 創製するＰＣＲ増幅は既知の部位における突然変異の対立遺伝子を調べるには極 めて効率のよい方法であり、３’端部が対象コドンの隣にありかつ対象コドンを 網羅する新規制限部位を生じるＰＣＲプライマーを設計することから成る。増幅 の後、正常対立遺伝子からのＰＣＲ生成物は新しい制限部位を含むが、変異体対 立遺伝子はこれを含まない。生成物を２つの正常対立遺伝子をもつ組織から分断 することにより生成物はすべて切断されてしまう。しかし、対立遺伝子の１つが 突然変異を含んでいれば、生成物は半分分断されるに過ぎない。図３に、数種類 の腫瘍と細胞系のＫｉ−ｒａｓコドン１２に増幅と診断のための分断を応用した 結果を示す。最初のパネルは１組のリンパ腫から得たものである。Ｆ１は未処理 の正常マウスからのＤＮＡで、両方の対立遺伝子はＢｓｔＮｌで切断されており 、２つの正常対立遺伝子が存在することを示している。ＭＣＡ５はＫｉ−ｒａｓ コドン１２突然変異を含むことが知られるマウスの細胞系であり（L.F．Parada et al.，Mol．Cell Biol．3，2298（1983））、増幅正常対立遺伝子のみ分裂し ている。２番目のパネルに示した５種の腫瘍のうち、１つが突然変異Ｋｉ−ｒａ ｓ 対立遺伝子を示している。３番目のパネルに試験した肺の腫瘍のいくつかを示 すが、いずれも変異体対立遺伝子を示さない。最後のパネルに腫瘍由来の細胞系 を示す。最初の３つはリンパ腫由来、そして残る３つは肺の腺癌由来のものであ る。肺腫瘍細胞系の１つ（＃１１７）は、原発腫瘍には存在しなかったが移植に よって生じたＫｉ−ｒａｓ１２突然変異を持つ。この解析はコドン１２と６１に おいてＫｉ、Ｈａ、Ｎ−ｒａｓ遺伝子を用いて行った。この方法でコドン １２と６２における３つのｒａｓ遺伝子の突然変異について調べたすべての腫瘍 、細胞系のうち、検出できたのはここに示す２つのみであった。コドン１３を取 巻くゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した後、ＫＳ＋（ストラ−タジーン）にクローン し、二本鎖シークエンシングを行ってコドン１３を調べた。表Ｉにｒａｓ突然変 異データを示す。この表で最も注目すべき点はこれらの腫瘍にはｒａｓ突然変異 が明らかに存在しないことである。事実、ｒａｓ突然変異の数は自然発生性腫瘍 からサンプルを採った場合に予測される数に比べてかなり少ない（S．Rodenhuis et al.，Am．Rev．Respir．Dis．42，S27-30；T.T．Devereux et al.，Carcino genesis 12，299（1991）；J.L．Bos，Cancer Res．49，4682（1989））。これ らＥＮＵ誘発腫瘍の発生においてｒａｓ遺伝子が主要な役割をもつものとして排 除した後、ｃ−ｒａｆ−１を小さな突然変異あるいは点突然変異について調べた 。 実施例３ Ｒａｆ−１における突然変異 ｒａｓ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ突然変異については文献があるが（E．Santos e tal.，Science 223，661（1984）；S．Rodenhuis，N．Engl．J．Med．317，929 （1987）；M．Brabacid，Eur．J．Clin．Invest．20，225（1990）；F．Sanger etal.，J．Mol．Biol．13，373（1975））、ｒａｆ遺伝子については記述がなか ったため、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて点突然変異のスクリーニングを行っ た（R.M．Myers et al.，Science 230，1242（1985）；E．Winter et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 82，7575（1985））。図４にｃ−ｒａｆ−１プローブ を用いた代表的な保護アッセイを示す。この実験では、使用したプローブは３’ ｍｏｓｔ Ｓｔｕｌ部位からのｒａｆ−１の３’端部からコード化配列の端部ま でをカバーしていた。第１レーンはマーカー（ＨａｅＩＩＩでｐＢＲ３２２分断 ）、第２レーンはプローブのみが分断されていないもの、第３レーンはプローブ が無関係のＲＮＡ、この場合はｔＲＮＡにハイブリッドされたもの、第４レーン はｖ−ｒａｆ形質転換細胞とのハイブリダイゼーション、下部バンドはマウスｃ −ｒａｆ−１遺伝子がｖ−ｒａｆと異なる点での切断を表す。第５レーンは未処 理のＦ１マウスの正常肺から単離したＲＮＡとのハイブリダイゼーションを、続 くレーンは幾つかの腫瘍から単離したＲＮＡを示す。正常ＲＮＡの場合は、完全 に保護されたバンドが１つ検出されたに過ぎないが、腫瘍の場合は分断の後に、 大きなバンドが２つ見られる。この方法で解析した２０例の腫瘍のうち２０例に この特別のバンドが見られた。これらのデータから次の重要な点が明らかになる ：１）ＲＮＡｓｅＡまたはＴ１で認識できる非相同領域を生じる腫瘍特異性変性 がｃ−ｒａｆ−１にあること；２）腫瘍レーンには大きさが等しい２つのバンド が存在するため変性は１つの対立遺伝子の同一領域に限られていること；および ３）２つのバンドの強度がほぼ同じであるため、対立遺伝子は両方とも同等レベ ルで発現していること。図示のアッセイでは、正常組 織から５μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡをハイブリッドし、腫瘍からは１μｇを用い た。このことは腫瘍にｃ−ｒａｆ−１の過剰発現があるため、同一ゲル上で比較 できるシグナルを得るために必要であった。各種マーカーを用いてこれらのアッ セイを実施することにより、変性部位がエキソン１４／エキソン１５結合の近辺 であることが予測できた。正確な遺伝子変性を定義するために、この領域を網羅 する６００ｂｐ断片を産するようなＰＣＲプライマーを設計した。次いで腫瘍由 来ＲＮＡからのｃＤＮＡを増幅し２本鎖シークエンシング用にＫＳ＋（ストラー タジーン）にクローンした。いくつかの腫瘍からのシークエンシングの結果を図 ５に示す。図５の上部に、マウスＲａｆ−１蛋白の略図を示す。３つの保存領域 ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３があり、ＣＲ３はキナーゼドメインを表す。ＲＮＡｓｅ 保護アッセイで用いたプローブは表示した部分をカバーし、ＰＣＲプライマーは 括弧でくくった領域を増幅させた。この部分をシークエンシングした結果、ＡＰ Ｅ部位の少し下流にさまざまな突然変異が見られた。これらの突然変異体を図５ の下の部分に拡大して示す（正常マウスのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および変異体配 列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３、４、および５ 参照）。これらの変異体は４つ の別個の腫瘍から単離したもので、それぞれについて正常対立遺伝子も配列させ た。ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅、クローニングおよびシークエンシングを繰り返 すことにより同一の配列が得られ、正常組織は突然変異を示さないため、これら の変性が人為的ではないことを実証している。増幅領域をカバーする配列を調べ たが、興味深いのはこれらの変化はすべてｒａｆ蛋白のごく小さい領域で生じて いる点である。事実、これらの突然変異が生じる領域は、ｒａｆに対して生じた モノクローナル抗体によって共有されるエピトープとオーバーラップしており（ W．Kolch et al.，Oncogene 5，713（1990））、蛋白のコンピューターモデルに よればこの領域は親水性ドメインであって、その構造はこれらの突然変異によっ て変化すると予測される。このことは分子にとって生物学的に重要な領域を示し ており、レトロウイルス発現ベクター（Ｅｌ−ｎｅｏ，（G． Heidecker et al.，Mol．Cell．Biol. 10，2503（1990）））へのクロニーング 後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞アッセイでテストしたこれら突然変異の最初のものはモロ ーニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）のＬＴＲでドライブさせると弱い形質転換を示すこと が判った。形質転換効率は先に特性化したヒトｃ−ｒａｆ−１ ｃＤＮＡの突然 変異であるＥＣ２（G．Heidecker et al.，Mol．Cell．Biol. 10，2503（1990） ；C．Wasylyk etal.，Mol．Cell．Biol. 9，2247（1989））と同等であり、ｖ−ｒａｆ オンコジーンの２０分の１以下であった。 ＊＊＊ 以上本書で言及した文献はその言及により全文がここに含まれる。 理解を容易にするために本発明をある程度詳細に説明したが、当該技術の熟練 者であれば、本説明を読むことにより本発明並びに付属のクレームの範囲を逸脱 することなく形態、詳細についてさまざまな変更が可能であることがわかるであ ろう。 配列のリスト （１）一般情報 （ｉ）出願人 ：ウルフ・Ｒ・ラップ スティーヴン・Ｍ・ストーム （ｉｉ）発明の名称：Ｃ−ＲＡＦ−１遺伝子検出方法 （ｉｉｉ）配列の数 ：１２ （ｉｖ）連絡先 （Ａ）名宛人：ニードル・アンド・ローゼンバーグ事務所 （Ｂ）町村 ：Ｎ．Ｗ．カーネギーウェイ１３３番地４００号室 （Ｃ）市 ：アトランタ市 （Ｄ）州 ：ジョージア州 （Ｅ）国 ：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：３０３０３−１０３１ （ｖ）コンピュータ読取り形式 （Ａ）媒体 ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：Patentln Release ♯l.0，＃1.25バージョン （ｖｉ）最新出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日 ： （Ｃ）分類 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人についての情報 （Ａ）氏名 ：ディビッド・Ｇ・ペリーマン （Ｂ）登録番号：３３,４３８ （Ｃ）事件番号：１４１４.０４２１ （ｉｘ）電話番号 （Ａ）電話 ：（４０４）６８８−０７７０ （Ｂ）ファクス：（４０４）６８８−９８８０ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：アミノ酸６４８個 （Ｂ）タイプ ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：アミノ酸６４８個 （Ｂ）タイプ ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：アミノ酸６４８個 （Ｂ）タイプ ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｉｘ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：アミノ酸６４８個 （Ｂ）タイプ ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｉｘ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：アミノ酸６４８個 （Ｂ）タイプ ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｉｘ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：塩基対２０個 （Ｂ）タイプ ：核酸 （Ｃ）鎖 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴ ＧＧＴＴＧＧＡＣＣＴ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：塩基対２０個 （Ｂ）タイプ ：核酸 （Ｃ）鎖 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ ＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：塩基対２０個 （Ｂ）タイプ ：核酸 （Ｃ）鎖 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡ ＧＴＴＴＣＡＧＡＴＧ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：塩基対２０個 （Ｂ）タイプ ：核酸 （Ｃ）鎖 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣ ＡＴＴＧＡＴＡＴＣＣ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：塩基対１９４７個 （Ｂ）タイプ ：核酸 （Ｃ）鎖 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：塩基対１９４７個 （Ｂ）タイプ ：核酸 （Ｃ）鎖 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｉＸ）特徴： （Ａ）ネーム／キー：ＣＤＳ （Ｂ）ロケーション：１．．．１９４４ 配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２についての情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ ：アミノ酸６４８個 （Ｂ）タイプ ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直列 （ｉｉ）分子タイプ：タンパク質 配列の説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．個体のｃ−ｒａｆ−１遺伝子領域を増幅し、 該増幅による生成物を解析して突然変異の痕跡を調べ、 該領域に１つまたはそれ以上の変異を有する個体を発癌リスクが高いとして 分類することからなる発癌リスクの高い個体を識別するための方法 ２．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５１４から５３５ま でをコード化する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５００から５５０ま でをコード化する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸４５０から６３０ま でをコード化する特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．該生成物をＤＮＡシークエンシングによって解析する特許請求の範囲第１項 に記載の方法。 ６．該増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う特許請求の範囲第１ 項に記載の方法。 ７．該ＰＣＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなるプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：８からなるプライマーを用いる。特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．個体のｃ−ｒａｆ−１遺伝子領域を増幅し、 増幅生成物を解析して突然変異の痕跡を調べ、 該領域に突然変異のない患者は、該領域に１つまたはそれ以上の変異を有す る患者よりも再発の危険が少ないあるいは生存率が高いとして分類する ことからなる癌患者の予後を判定する方法。 ９．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５１４から５３５ま でをコード化する特許請求の範囲第８項に記載の方法。 10．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５００から５５０ま でを コード化する特許請求の範囲第９項に記載の方法。 11．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸４５０から６３０ま でをコード化する特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 12．該生成物をＤＮＡシークエンシングによって解析する特許請求の範囲９に記 載の方法。13．該増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う特許請求 の範囲第９項に記載の方法。 14．該ＰＣＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなるプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：８からなるプライマーを用いる特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 15．個体のｃ−ｒａｆ−１遺伝子領域を増幅し、 増幅生成物を解析して突然変異の痕跡を調べ、 該領域に少なくとも１つ突然変異を有する患者を生存率の低いまたは再発ま での時間が短い患者に適した治療が必要な患者として識別し、 該領域に突然変異のない患者を生存率の高い患者または再発の危険が少ない 患者に適した治療が必要な患者として識別する ことからなる癌患者の適性治療法を決定するための方法。 16．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５１４から５３５ま でをコード化する特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 17．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸５００から５５０ま でをコード化する特許請求の範囲第１６項に記載の方法。 18．該領域が少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸４５０から６３０ま でをコード化する特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 19．該生成物をＤＮＡシークエンシングによって解析する特許請求の範囲第１６ 項に記載の方法。 20．該増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う特許請求の範囲第１ ６項に記載の方法。 21．該ＰＣＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなるプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：８からなるプライマーを用いる特許請求の範囲第２０項に記載の方法。