JPH08506019A - 足場および懸濁細胞の培養方法並びにその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 反応器１００で足場および非足場細胞を培養する方法並びに装置。反応器１００は、バスケット形充填ベッド１１３と内部再循環装置１２４とを含む。バスケット１１３は、培地をバスケット１１３を介して均一に流す頂部１１２と底部１１４とを含む。培地は、温和な流れを提供し、さらに細胞がキャリアーから除去されることを妨げるようにバスケット１１３を介してバスケット１１３の頂部から下方に流れる。好ましくは、キャリアー１６は繊維マトリックス製である。

Description

【発明の詳細な説明】 足場および懸濁細胞の培養方法並びにその装置 技術分野 １．発明の分野 本発明は、足場および非足場依存性細胞の培養方法並びにその装置に関する。 ２．関連技術 細胞培養は、ホルモン、酵素、抗体、ワクチンなどの産生のような種々の目的 に要望されている。ある細胞系は、その分野では公知であるように足場依存性で ある。このことは、細胞が、単層および多層がガラスまたはプラスチック基質に 固着するように、付着しかつ成長すべきであること意味する。 足場依存性細胞の培養は、かかる細胞を積み重ねられたペトリ皿に付着させま たは細胞を回転瓶中で成長させることによって、従来行われてきた。これらの方 法は、高体積細胞密度を得ることができずまたは細胞の成長に必要な循環が不十 分であるという欠点を有する。さらに、細胞は、高または低血清濃度、単層飽和 、撹拌によって生ずる粘性の向きの変更、または培地の潅流などの条件下におい て足場表面から脱離する傾向にある。 細胞増殖を増加させるための付着用表面積を増やすその 他の方法が示唆されている。微小なビーズが温和な攪拌のもとで培養液中で浮遊 するような特殊な重力のものから作られる微小キャリアー系が記載されている。 懸濁させると、細胞は微小キャリアー外表面に付着し、広がり、さらに成長する 。 特に、米国特許５，１１４，８５５には、微小球製の微小キャリアーを使用す ることが記載されている。その微小球はおよそ６０μｍよりも小さい直径である 。微小キャリアー系には、懸濁および混合が必要であって取扱い上の問題が生ず るという欠点がある。同様に、細胞は細胞破壊を生ずる物理的な応力を受ける。 また、ある種のタイプの細胞が懸濁中で成長できることは良く知られている。 懸濁細胞系は、従来、撹拌タンク反応器で成長していた。ある方法において、こ れらの懸濁細胞は都合よく固体マトリックスに架橋し、または物理的な応力から 細胞を保護するためにゲラチン、アルギネート、アガロースなどで包み込まれる 。 懸濁培養において細胞の収穫を促進するために従来の壁に塗りこむ方法が使用 された。壁に塗り込む方法には、中空糸（Hopkinson,J.″Hollow Fiber Cell Cu lture Systems For Economical Cell-Product Manufacturing″,Bio/Technology 3:225-230(1985)；膜反応器（Scheirer,W.,″High Density Growth of Animal Cells Within Cell Retention Fermentors Equipped with Membranes″,In：Spi er,R.R.a nd Griffiths,J.B.(Eds)Animal Cell Biotechnology,Vol.3,pp.263-281(1988)） が挙げられる。これらの技術には、これらの方法論のスケールアップが困難であ るという欠点がある。 さらに，マトリックス内に非足場依存性細胞をエントラップ（entrap）する捕 獲方法が使用できる。細胞の捕獲に使用されるマトリックスは、英国特許ＧＢ２ １７８４４７に記載されている。この特許には、個々の細胞容積の１〜２０倍の 細孔を有する高内部容積を提供する１０μｍ〜１００μｍの細孔直径を有する不 織布のマトリックスが記載されている。多孔質支持シートは、寸法安定性および 物理的強度を提供するようにマトリックスと結合させることができる。マトリッ クスシートはペトリ皿の底のライナーとして使用され、または螺旋状に織って培 地のコンテナーに浸される。同様に、マトリックスは足場依存性細胞の成長用に 使用できる。 足場依存性細胞の培養用のパックされた（packed）ベッド反応器は、長年の間 、使用されてきた。また、足場または非足場依存性細胞のいずれかの成長用にパ ックされたベッドのバイオリアクターは米国特許４，８３３，０８３に記載され ている。この特許では、容器はパックされたベッドの支持体またはマトリックス 物質を含んでいる。細胞または細胞成分は、付着し、またはパックされたベッド の固体支持物質またはマトリックス物質にエントラップされる。 固体支持物質は、けいそう土、シリカ、アルミナ、セラミックビーズ、活性炭、 重合体ビーズまたはガラスビーズから形成される。培地は、パックされたベッド を介して培地の半径方向に流れるようにパックされたベッドを横切って水平に内 側にポンプで流される。 一般的に関連するものは、細胞培養内で培地の流れを生じさせるインペラーに 関する米国特許５，０８１，０３６；４，８８８，２９４；５，１００，７９９ および５，０１９，５１２である。本発明に可能な一般的に関連するその他の特 許には、付着表面およびバイオレアクターに関する米国特許４，０８７，３２７ ；４，９０６，５７７；５，０７９，１６１および５，１２６，２６９；４，７ ２７，０４０と４，６３４，６７５が挙げられる。 物理的な応力に対して細胞が保護され、さらに細胞に最適レベルの栄養素と酸 素が提供される装置に関する要求がある。最も高い可能性のある細胞密度または 濃度は、興味のある細胞の経済的に大容量生産を達成するために必要である。 発明の開示 簡単に述べると本発明は、足場性および非足場性の細胞の両者の発酵および組 織培養用に改良された反応器を含んでいる。反応器は、内部再循環を提供する手 段を有するパックされたベッドとして設計されている。好ましくは、繊維マトリ ックスキャリアーが反応容器内のバスケットに置 かれている。バスケットの頂部と下部は、培地がバスケットを均一に流れるよう に通過する孔を有する。 再循環手段は、無視できる程度の全細胞集団が培地に懸濁すると仮定しながら 、栄養素の均一供給および廃棄物の除去を保証するように繊維マトリックスによ って占められる空間に培地を流す。また、バスケットと再循環手段との組み合わ せでは、酸素化された培地が繊維マトリックス中を、泡を発生することなく、自 由に流れる。 その他の培養系と比較すると、本発明では種々の重要な利益を提供できる。繊 維マトリックスキャリアーを用いると、細胞は撹拌および泡形成のような物理的 な応力から保護される。バスケットを通過する自由な培地の流れは、細胞に最適 に調整されたレベルのｐＨと栄養素を与える。生成物は、培地から連続的に除去 できる。収穫された生成物は、細胞を含まず、その後の精製ステップを容易にす る低たんぱく質を生成する。同様に、本発明の独特な設計では反応器のスケール アップが容易である。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の反応器における第１の実施態様を示す拡大正面図である。 図２は、本発明の反応器における第２の実施態様を示す拡大正面図である。 図３は、本発明の反応器における第３の実施態様を示す拡大正面図である。 図４Ａは、本発明のキャリアーを示す拡大正面図である。 図４Ｂは、図４に示されるキャリアーを示す拡大側面である。 図５は、三角形キャリアーの平面図である。 図６は、四角形キャリアーの平面図である。 図７は、六角形キャリアーの平面図である。 図８Ａは、複数の輪郭表面を有するキャリアーの平面図である。 図８Ｂは、図８Ａで示されるキャリアーの拡大側面図である。 図９は、本発明の反応器における酸素取り込みの結果を示すグラフである。 図１０は、Ｍａｂ生産および収穫されたＭａｂの結果を示すグラフである。 図１１は、本発明の反応器におけるインペラースピードと流速との関係を示す グラフである。 発明を実施するための最良の形態 本書において、同じ数字は、本発明を示す種々の図面に従って同じ要素を特定 するように使用される。 図１は、本発明における第１の実施態様の反応器１０を示す。反応器１０は、 容器１２と容器内に配置されたバスケット１４とを含んでいる。キャリアー物質 １６はバスケット１４内に置かれている。スクリーン１８、２０は、バスケット １４の頂部と下部を形成し、培地がバスケット１ ４内を流れることを許容する。スクリーン１８、２０は、ステンレススチール製 であることが好ましい。透過性シリコーンチューブ状物は、使用された培地５０ がバスケットから分取できるように、バスケット１４の側面２２を形成する。 カバー２４は、バスケット１４を通過した培地５０をインペラー２８に導くよ うにスクリーン２０の下面に取り付けられている。インペラー２８は、バスケッ ト１４を通過した培地５０を循環するように、シャフト４０で回転する。インペ ラー２８は、培地をバスケット１４から方向Ａ₁に押す、下方に向く刃２９を含 んでいる。培地５０は、容器１２とバスケット１４の横２２との間を上方に流れ る。その後、培地５０はスクリーン２０とバスケット１４とを通過して下方向Ａ₂ に流れる。オーリング２６は、バスケット１４を浸漬したハウジング４１にシ ールする。 さらに、インペラー２８は、反応系の必要性に依存するけれどもスピードを変 えて回転できる。特に、好ましい回転スピードはおよそ２０〜２２５ｒｐｍであ る。好ましい流速は、およそ０．２〜２．５ｃｍ／ｓｅｃである。反応器の作業 容積は１．０〜１０００リットルが使用できる。好ましい作業容積は、およそ２ ．５からおよそ５．０リットルである。 ヘッドプレート３６は、キャリアーと細胞とを容器１２内に導入する際に除去 できる。プラグ３８、３９は、ヘッ ドプレート３６表面から伸び、細胞培養の間、培地を受ける。頂部ガイドチュー ブ３０は、オーリング３４を用いてプラグ３８に固着し、培地をバスケット１４ 頂部に導く。底ガイドチューブは、オーリング３５を用いてプラグ３９に固着し 、培地をバスケット１４底に導く。 容器１２には、ヘッドプレート３６に付着した、溶存酸素測定用のプルーブ４ ２が与えられている。プルーブ３６の先端４３は、培地５０表面より下でバスケ ット１４の上まで伸びる。第２溶存酸素プルーブ４４は、バスケット１４の下に 位置する。ｐＨプルーブ４６はヘッドプレート３６に取り付けられている。その 他のセンサーおよび基準装置は、本発明において使用できる。 図２は、本発明の第２の実施態様である反応器１００を示す。容器１１０内に は、キャリアー物質１６の充填（packed）ベッド１１３がある。頂部スクリーン １１２と底スクリーン１１４は、充填ベッド１１３を囲む。充填ベッド１１３は 、中空軸１２６のいずれかの側面と容器１１０内壁１１５との間に広がる。ポー ト１３２は、吸引チューブ１３０を介してＰＢＳと培地を吸引する。使用した培 地はチューブ１３３によって容器１１０から除去する。吸引チューブ１３０は、 充填ベッド１１３を介して容器１１０の底に伸びる。 撹拌機１２４は、中空軸１２６端１２２に取り付けられている。撹拌機１２４ には、中空軸１２６から横に突出す る管１３４が含まれる。管１３４は中空であって、出口開口部１３６を特定する 第１端１３５と中空軸１２６の開口部１３８に連結した第２端１３７を含む。流 体は中空軸１２６を介して流れ、管１３４を介して出口開口部１３６から出る。 撹拌機１２４は、本明細書に引用例として挙げられている米国特許４，６３４， ６７５（´６７５特許）に記載されているように、吸引効果を生じさせるような 方法で作用する。撹拌機１２４は、流体の流れを出口開口部１３６から充填ベッ ド１１３を介して下方Ａ₃に導く。同様に、撹拌機１２４は、培地の流れを中空 軸１２６を介して上方の方向Ａ₄に培地の流れを導くように、中空軸１２６を介 して培地を吸う。上述の反応器は、キャリアーからの細胞の脱離を最小にしなが ら、バスケット内に位置するキャリアーに付着した細胞構造物の流れおよび暴気 を提供する。空気は、酸素化培地を提供し、上部流体表面における泡を離すよう に、底中空軸１２６におけるスパーガー（sparger）１３９から導入する。撹拌 機１２４は、充填ベッドバスケットに泡のない培地を提供する再循環手段を提供 する。バスケットは、高速撹拌速度において生ずる乱流から細胞を保護し、それ によって細胞成長を増加させるように顕著な酸素交換を提供できる。 この実施態様において、キャリアー１６は不織布物質からなる。しかし、ポリ エステル、ナイロン、無機物質などのその他の物質も使用できる。 その他の実施態様において、キャリアー物質は１６は、図４Ａに示されるよう に、複数の円盤から作ることができる。キャリアー１６は、図４Ｂに示されるよ うに、等高上表面を有する。上表面６０は、低表面６２上からおよそ０．００５ インチからおよそ０．０１５インチ高められている。キャリアー１６は、およそ ３／１６インチからおよそ３／８インチの直径を有する円盤状である。 キャリアー１６の低表面６２は、網目状繊維の不織布スクリーン物質から作ら れている。本発明を実施するために有用なスクリーン物質の例には、ポリエチレ ン、ポリプロピレンとテフロン（ＴＭ）が挙げられる。テフロン（ＴＭ）は、米 国デラウエアー州のデュポンの登録商標である。キャリアーとスクリーン用のそ の他の不織布は本発明の教示の範囲内で使用することが可能である。低表面６２ は、積み重ねまたは上表面６０にボルトで締めることが可能である。 図３は、本発明の第３の実施態様であるその他の反応器３００を示す。容器３ １０内には、キャリアー物質１６の充填ベッド３２０がある。頂部キャップ３１ ４は、ガスケット３１２を用いて容器３１０に取り付けられている。一対のサイ ドポート３１６は、容器３１０のいずれかのサイドに位置する。サイドポート３ １６は、サンプリングおよび培地の交換に使用できる。サイドキャップ３１８は 、メンブラン３１９を覆う。サイドキャプ３１８は、容器３１ ０の無菌シールを提供する。 オーリング３２２は、スクリーンカバー３２１を基部３１５に取り付ける。グ ルーブ３２３、３２５は、基部３１５に形成される。スクリーンカバー３２１は 、充填ベッド３２０の容積を変更するように、オーリング３２２を用いてグルー ブ３２３またはグルーブ３２５のいずれかに取り付けることができる。好ましく は、バスケット容積はスクリーン３２１がグルーブ３２３に取り付けられる場合 には１０ｇのキャリアー１６を保持するためにおよそ１００ｍｌであり、バスケ ット容積はスクリーン３２１がグルーブ３２５に取り付けられる場合には５ｇの キャリアーを保持するようにおよそ５０ｍｌである。好ましくは、容器３１０の 作業容積は全容積およそ１０００ｍｌに対しておよそ５００ｍｌである。 インペラー３２４は、流れを矢印Ａ₅、Ａ₆の方向、充填ベッド３２０からイン ペラー３２４の方向、を提供するようにマグネットによって作動する。 付着した代謝生成物は、反応系から濾過することなくキャリアー物質１６を用 いて容易に除去できる。 本発明の反応器は、分泌たんぱく質と残った生成物からの細胞の分離が、それ らが濯流中にキャリアー物質１６に捕獲されて止まるので、単純化されるという 利益がある。反応器は、細胞成長用容積比に対して高表面を提供し、さらに細胞 がガス液界面力にさらされること、インペラーか らの剪断力を妨げる。足場依存性細胞は、キャリアー物質１６表面に付着する。 懸濁液で成長した細胞は、キャリアー物質１６の充填ベッド内に保持される。 本発明の反応器は、分泌たんぱく質と残った生成物からの細胞の分離が、足場 依存性と懸濁細胞が培養法の間キャリアー物質１６に捕獲されて止まるので、単 純化されるという利益がある。 多くの足場依存性細胞系は、キャリアー物質１６に付着する。これらには、Ｃ ＨＯ、ｒＣＨＯ、Ｃ１２７、ＢＨＫとＶＥＲＯが含まれる。驚くべきことに、同 様に多くの懸濁系、例えばハイブリドーマ：ＤＡ ４．４；γ６９Ｂ，１２３Ａ と１２７Ａおよび昆虫系：ＴＮ−３６８およびＳｆ−９は，キャリアー物質１６ に付着している。当業者は、その他の細胞が本発明の反応器を用いて増殖させる ことができることを認めるであろう。 図５〜８は、その他の形のキャリアー１６を示す。キャリアー１６の上表面７ ０は、図５に示されるように三角形、または図６に示されるように四角形であっ てもよい。または、キャリアー１６の上表面６０は、図７に示されるように六角 形でもありえる。上記キャリアーにおいて、低表面６５は、上表面の形状に対応 する形状である。キャリアーとしてその他の形状も使用できる。 図８Ａと８Ｂは、キャリアー２００として示されるキャリアーのその他の実施 態様を示す。同心等高上表面２０２、 ２０４、２０６は、それぞれの低表面２０８、２１０上にある。この実施態様は 、グルーブ２１２、２１４において培地を運ぶという利益がある。 本発明の反応器の設計は、充填ベッドによって導管を減少でき、さらに反応器 において均一な流れを提供できるという利益がある。充填ベッドにおいてキャリ アーを使用すると、ハイブリドーマの増殖を支持し、反応器の単位当たりの高細 胞密度における細胞の成長を促進するという利益がある。ハイブリドーマは、低 レベルの血清または血清のない培地の潅流の基で生産状態においてキャリアー物 質の充填ベッド内に保持することができる。反応器は、バスケットを横切る圧力 低下が少ないために容易にスケールアップが可能である。 実施例１ 細胞成長または細胞培養用の本発明の反応器の使用を示すために、反応器には ポリエステル不織布円盤状キャリアーが充填される。１１０ｇのポリエステル円 盤は、反応バスケットに充填された。細胞は、マウス−マウス ハイブリドーマ 、ヒトＩｇＭに対してＩｇＧｌを産生するＤＡ４．４（ＡＴＣＣ ＨＢ−５７） である。ドゥルベッコウの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、反応器における細 胞成長に使用された。さらに、次のものが加えられた： ブリマトン アールエル（Primatone RL）（Sheffield） ２．５ｇ／Ｌ オキザロ酢酸（Oxalacetic Acid） １５０ｍｇ／Ｌ メルカプトエタノール ３．９２ｍｇ／Ｌ インシュリン ７５．５μｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム １１０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシン １００ｍｇ／Ｌ ペニシリン １００ユニット／Ｌ 子ウシ血清（Bovine Calf Serum）（Hyclone） ５容量％。 ＰＢＳ（Ｃａ⁺²、Ｍｇ⁺²のない）を培地として容器に加え、カバーを容器に取 り付ける。培地を加え、一夜インキュベートした。反応器に種を播いた。 培養条件は次ぎのようであった： 温度 ３７℃ 撹拌 ６０〜１４０ｒｐｍ 頂部溶存酸素（ＤＯ） ５０％ 底ＤＯ ＞２５％ ｐＨ ７．２ 培地流速 ４５〜１００ｍｌ／ｓｅｃ。 培養中、サンプリングし、オフラインで分析した。培地のグルコース（ブドウ 糖）、ラクテート（乳酸塩）、アンモニア濃度は、酵素検定法で決定した（Sigm a Chemical C o.）。モノクローナル抗体濃度は放射免疫拡散検定法で決定した。トリパンブル ー細胞計算と血球計によるクエン酸／結晶紫核計算を使用して培地中およびキャ リアーに付着した細胞数をそれぞれ決定した。 実施例２ 細胞付着 反応器中における細胞付着速度を決定した。接種後、細胞を、灌流することな く、バスケット内のキャリアー物質１６に付着させて培地中に保持した。次の表 は、反応器中でＤＡ４．４細胞付着を示す。 これらの結果では、ハイブリドーマ細胞は、例え連続撹拌が付着期間に行われ たとしても、円盤状キャリアーに容易に捕獲されたことが示される。 実施例３ 細胞培養は、ヒト ガンマ インターフェロンに対するＩｇＧ型抗体を産生す るハイブリドーマ１２３Ａ用に３６日間行なった。核の計測は、反応器が分解さ れてから行なった。計測値は物質１６の充填ベッドにおいて接種物濃度１．８× １０⁶細胞／ｃｍ³、さらに実験の終了時に９．４×１０⁷細胞／ｃｍ³であった。 加えて、反応器において０．１％未満の細胞を表す上澄で５×１０⁴細胞／ｍｌ であった。 実施例４ 細胞成長と生産性との比較 図９は、本発明の充填ベッド反応器を用いてハイブリドーマ１２３Ａ細胞培養 の間の酸素摂取率を示す。バスケットの上における溶存酸素濃度はガス流速によ って５０％に制御し、バスケットの底における溶存酸素濃度はインペラーによる 液体流れによって２５％以上であった。 次の表は、１２３Ａ細胞の培養における各種モードの産生に対するＭＡｂ生産 性を示す。 その結果から、撹拌タンク反応器と比較して本発明の充填ベッド反応器では１ ４倍増加する。 図１０は、充填ベッド反応器系においてハイブリドーマ１２３ＡからのＭＡｂ 産生を示す。産生されたＭＡｂは、生産相では１日当りおよそ０．５ｇであり、 全生産量はおよそ１１．５ｇであった。 実施例５ 足場依存性細胞培養 ｒＣＨＯ細胞系を２４日間反応器で培養した。１〜５％の牛血清を有するＤＭ ＥＭ／Ｆ１２培養培地を用いた。反応器の全容積は、６５ｇのキャリアー物質１ ６で充填して２．２リットルであった。培養条件は次のようであった：温度３７ ℃：ｐＨ７．２：溶存酸素濃度５０％：灌流速度は、７日以後１日当り３．０〜 ３．４リットルで維持した。連続的に実施すると、細胞密度は、２４日の終りに ベッド容積ｃｍ³当り１．２×１０⁸細胞に近付き、６０倍増加した。 実施例６ また、充填ベッドにおける細胞表面上の平均剪断応力（τａｖｇ）は、次式に よって評価される： ここで、△ｐはベッドにおける圧力損失；Ｌ_bはベッドの高さ；Ｓ／Ｖはベッ ド反応器の繊維表面と容積との比率を示す。液体の流速が１．０ｃｍ／ｓにおけ る計算されたτａｖｇは、０．６日／ｃｍ²であった。剪断応力は、細胞に剪断 損失を及ぼすために必要なものよりも極めて小さい。 ピトー管法を使用して図２に示される反応器の液体流速を測定した。また、ト レーサー（酸と塩基）法を使用して液体の流速を測定した。 図２に示されるような２．２リットルの反応器を用いた。充填ベッドの断面積 は１０００ｃｍ²であった。外見上の速度は、図１１に示されるように、インペ ラー速度８０〜２００ｒｐｍにおいて０．６５ｍ／ｓ〜１．７６ｍ／ｓであった 。これらの結果から、インペラーによって与えられる液体の流速は十分であって 、固定化細胞の酸素と栄養素の要求に合うことが分かる。 円盤のベッドの圧力損失（△ｐ）は、ガラス管マノメーターを用いて種々の流 速で測定し、次式によって計算された： △ｐ＝△ｈ（σ_L−σ_O）ｇ＝ＫμＬｕ ここで、△ｈはマノメーターの読み（ｃｍ）；σ_Lは液体の密度（ｇ／ｃｍ³） ；σ_Oは空気の密度（ｇ／ｃｍ³）；ｇは重力加速度（ｃｍ／ｓ²）；μは見掛上 の密度（ｐ ｏｉｓｅ）。円盤のベッドの抵抗係数（Ｋ）は、圧力損失値から計算して２×１ ０⁴ｃｍ²であった。 圧力損失が小さいと、反応器のスケールアップができる。反応器の容積１〜１ ０００Ｌは、細胞密度を維持しながら使用できる。 実施例７ 昆虫細胞が剪断に感受性を示し、ガス分散によって損傷を受けることは知られ ている。同様に、昆虫細胞が哺乳細胞と比較して高い酸素要求を有することも公 知である。 昆虫細胞系用の本発明の反応器の使用を示すために、ＴＮ−３６８細胞系用の 反応器は図２に示される。ＪＲＨバイオサイエンス（JRH Bioscience,Kansas） で製造された血清を含まない培地Ｅｘ−ｃｅ１１４００を反応器と共に用いた。 成長媒体を反応器に加え、反応器の内容物を一夜インキュベートした。次の表は 、反応器の容積を示す： 装置：２．２リットルバスケット反応器 作業容積 １．３リットル 全容積 ２．２リットル バスケット容積 ０．６５リットル キャリアー 物質１６ 重量 ６５ｇ。 接種条件は、ｐＨ６．２、温度２７℃、溶存酸素５０％ であった。接種１時間後、細胞の全てをバスケット内の充填ベッド中のキャリア ーに付着させた。グルコース濃度は、最初の２日の間に２．０ｇ／リットルから ０．８３ｇ／リットルにまで減少した。灌流は、３日に一日当り１．０５リット ルで開始した。９日から１３日まで、灌流速度を一日当たり１．５３リットルで 維持した。 トリパンブルー細胞計測は、１３日後に行なった。０．６５リットル充填ベッ ドにおける全細胞は５．６×１０¹⁰、細胞密度は８．６×１０⁷であった。細胞 密度に関するこの結果は、従来の懸濁バッチ培養と比較して２０倍も大きい。細 胞は、充填ベッドのキャリアー内に均一に分配された。 本発明は、キャリアー上に成長培地の穏やかな流れを提供しながら、キャリア ー上で細胞の成長を促進することができる利益を有する。足場および懸濁の両細 胞はキャリアー内に捕獲される。キャリアーは高細胞密度を生じる細胞成長用容 積比率に対する高表面を提供でき、等高表面を有するキャリアーはハイブリドー マ細胞の付着および連続成長を促進できるので、高Ｍａｂ生産率が得られる。反 応器は、キャリアーからの細胞の除去を減少させるキャリアーを含むバスケット を介して下方への穏やかな培地の流れを提供する。スケールアップはバスケット とカラムを横切る低圧力損失のために可能であり、酸素摂取速度は計算でき、灌 流を最適にするように使用することができる。反応器は、 種々の足場依存性細胞と懸濁細胞で使用できる。 本発明は好ましい実施態様を用いて説明されるけれども、当業者には本発明の 精神および範囲から逸脱することなく本発明の構造および形態を修正することが できることに留意すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１１月３日 【補正内容】 請求の範囲 １．上部、閉じられた底部と該閉じられた底部から伸びる側面壁を有する容器； 貫通孔を有し、頂部、底部、該頂部と底部との間に位置する側面部を備え、該 容器内に位置するバスケット手段； ガスの泡を該容器内に導く手段；および 該バスケット手段を通り抜けて流体を循環する手段，ここで該流体を循環する 手段は実質的に泡のない流体を該バスケット手段に提供できる、 ここで該実質的に泡のない流体は該バスケット手段を通り抜けて該容器の頂部 から該容器の底部に流れることを特徴とする細胞培養に使用される装置。 ２．該ガスの泡を導入する手段がスパーガーを含む請求項１に記載の装置。 ３．該バスケット手段が 該バスケット手段の該頂部と該底部とを形成する上部と底部スクリーン；およ び 複数のグルーブを含む基部、ここで該上部スクリーンは該グルーブのーつに収 容されている、を含み、 該グルーブ内の該上部スクリーンの位置を変更することによって該バスケット 内の容積を変える請求項２に記載の装置。 ４．さらに該バスケット手段内に位置するキャリアー、こ こで該キャリアーが不織布製のスクリーン物質からなる第１表面と不織布性物質 製の第２表面を有し、該キャリアーの第２表面が等高であって該第１表面上に高 く掲げられ、該細胞が該キャリアーに固定される請求項３に記載の装置。 ５．該流体を循環する手段が インペラー；および 該インペラーを駆動するマグネット手段を含む請求項４に記載の装置。 ６．該細胞がｒＣＨＯ；Ｃ１２７；ＢＨＫ；ＶＥＲＯ；ＤＡ４．４；γ６９Ｂ； １２３Ａ；１２７Ａ；ＴＮ−３６８とＳｆ−９からなる群より選ばれる請求項５ に記載の装置。 ７．閉じられた底部と該閉じられた底部から伸びる側面壁を備える容器； 底部開口端を備える該容器内に位置する中空チューブ； 貫通孔を有し、上部と底部を備え、該中空チューブを周って該容器の側面壁に 伸びるバスケット；および 該中空チューブに付着された流体の流れ用の撹拌機、ここで該攪拌手段は該中 空チューブと出口開口部に連結した入口開口部を有する流体の流れ用のチューブ 状物を含む、 流体は容器の底部から該中空チューブを通り抜けて該容器の頂部に流れ、さら に該バスケットを通り抜けて該容器の底部に戻ることを特徴とする細胞培養に使 用される装置。 ８．該バスケットが該バスケットの該頂部と該底部とを形成する上部と底部スク リーンを有する請求項７に記載の装 置。 ９．さらに該容器の頂部に取り付けられた移動可能なカバーと該カバーを介して 位置する反応培地入口を有する請求項８に記載の装置。 １０．さらに該中空チューブの底部開口端に位置するスパーガーを有する請求項 ９に記載の装置。 １１．さらに該バスケット内に位置するキャリアー、ここで該キャリアーが不織 布製のスクリーン物質からなる第１表面を行し、該第２表面が等高であって該第 １表面上に高く掲げられ、該細胞が該キャリアーに固定される請求項１０に記載 の装置 １２．該細胞がｒＣＨＯ；Ｃ１２７；ＢＨＫ；ＶＥＲＯ；ＤＡ４．４；γ６９Ｂ ；１２３Ａ；１２７Ａ；ＴＮ−３６８とＳｆ−９からなる群より選ばれる請求項 １１に記載の装置。 １３．バスケット内にキャリアーを置き、ここで該バスケットは容器内に位置す る； 細胞を該容器に加え、ここで該細胞は該キャリアーに固定されている；さらに 培地をバスケットを通り抜けて循環させ、ここで該培地は該バスケットを通り 抜けて該容器の底部に流れることを特徴とする細胞の培養方法。 １４．さらに該培地を該容器に加える提供手段ステップを有する請求項１３に記 載の方法。 １５．該バスケットを通り抜けて培地を循環させるステップは攪拌手段を用いて 行い、該バスケットは中空チューブを含み、該攪拌手段はチューブ状手段を含み 、該チューブ状手段は該中空チューブに取り付けられた入口と出口を有し、ここ で流体は該容器の底部から該中空チューブを通り抜けて該入口へ、該チューブ状 手段の出口を通り抜けて該容器の頂部へ、さらに該バスケットを通り抜けて該容 器の底部に戻る請求項１４に記載の方法。 １６．該バスケットを通り抜けて培地の循環ステップが上記該バスケット上に位 置する攪拌手段で行い、該バスケットが中空チューブを含み、該攪拌手段がチュ ーブ状手段を含み、該チューブ状手段が該中空チューブに取り付けられた入口と 出口を有し、ここで流体は該容器の底部から該中空チューブを通り抜けて該入口 へ、該チューブ状手段の出口を通り抜けて該容器の頂部へ、さらに該バスケット を通り抜けて該容器の底部に戻る請求項１４に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ワング、ゴーズヘング アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08904 ハイランド パーク、テンス ア ベニュー、デー サウス 273 (72)発明者 カドウリ、アビノアム イラン国 ペタッチ―チガ 49491、シャ ピロ ストリート 12

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．閉じた底部と該閉じた底部から伸びる側面壁を有する容器； 貫通孔を有し、頂部と底部との間に位置する側面部を備え、該容器内に位置し 、該頂部と該底部を含むバスケット手段；および 該バスケットの下に位置し、流体の循環用のインペラーを含み、 ここで、流体が該容器の底部から該容器の該側面壁と該バスケットの側面との 間を通って該容器の該頂部に流れ、該バスケットを通り抜けて該容器の底部に戻 ることを特徴とする細胞培養に使用される装置。 ２．該バスケットが該バスケットの該頂部と底部を形成する上部および底部スク リーンを含む請求項１に記載の装置。 ３．さらに該容器の頂部に取り付けられた移動可能なカバーを含む請求項２に記 載の装置。 ４．さらに該カバーを介して位置する反応培地入口を含む請求項３に記載の装置 。 ５．該バスケットの該側面がシリコーンチューブで形成されてなる請求項４に記 載の装置。 ６．該インペラーが該培地を該バスケットから離すように下方に向く刃を首する 請求項５に記載の装置。 ７．さらに該バスケット内に位置し、不織布スクリーン物 質で形成された第１表面および不織布物質で形成され、等高で、細胞が該キャリ アーに固定されている該第１表面上にある第２表面を有するキャリアーを備える 請求項６に記載の装置。 ８．さらに該インペラーを回転するマグネット駆動手段を含む請求項７に記載の 装置。 ９．基部が該バスケット内に伸び、該基部は該上スクリーンがグルーブに付着す る少なくとも１つのグルーブを含む請求項８に記載の装置。 １０．該細胞がｒＣＨＯ；Ｃ１２７；ＢＨＫ；ＶＥＲＯ；ＤＡ４．４；γ６９Ｂ ；１２３Ａ；１２７Ａ；ＴＮ−３６８とＳｆ−９からなる群より選ばれる請求項 ９に記載の装置。 １１．閉じられた底部および該閉じられた底部から伸びる側面壁を有する容器； 底部開口部を有する容器内に移し変えられるように位置する中空チューブ； 貫通孔を伴って頂部と底部とを有し、該中空チューブを囲んで該容器の側面壁 に伸びるバスケット；および 該中空チューブに付着され、該中空チューブに連結した入口開口部と出口開口 部を有する管状手段を含む撹拌機を含み、 ここで、流体が該容器の底部から該中空チューブを通り抜けて該容器の頂部に 流れ、該バスケットを通り抜けて該 容器の底部に戻ることを特徴とする細胞培養に使用する装置。 １２．該バスケットが該バスケットの該頂部と底部を形成する上部および底部ス クリーンを含む請求項１１に記載の装置。 １３．さらに該カバーを介して位置する反応培地入口を含む請求項１２に記載の 装置。 １４．さらに該中空チューブの底に位置するスパーガー（sparger）を含む請求 項１３に記載の装置。 １５．さらに該バスケット内に位置し、不織布スクリーン物質で形成された第１ 表面および不織布物質で形成され、等高で、細胞が該キャリアーに固定されてい る該第１表面上である第２表面を有するキャリアーを備える請求項１４に記載の 装置。 １６．該培養細胞がｒＣＨＯ；Ｃ１２７；ＢＨＫ；ＶＥＲＯ；ＤＡ４．４；γ６ ９Ｂ；１２３Ａ；１２７Ａ；ＴＮ−３６８とＳｆ−９からなる群より選ばれる請 求項１５に記載の装置。 １７．キャリアーを容器内に位置するバスケット内に置き； 細胞を該キャリアーに固定するように該バスケットに加え；さらに 該培地が該バスケットを通り抜けて該容器の底部に流れるように、バスケット によって培地を循環することを特徴とする細胞を培養する方法。 １８．さらに該培地を該容器に加える手段を提供するステップを含む請求項１７ に記載の方法。 １９．該バスケットを通り抜けて培地を循環するステップは該バスケットの下に インペラーを位置させることによって行う請求項１８に記載の方法。 ２０．該バスケットを通り抜けて培地を循環するステップが該バスケット上に位 置する撹拌手段で行い、ここで該バスケットが中空チューブを含み、該撹拌手段 がチューブ状手段を含み、該チューブ状手段が該中空チューブに付着した入口と 出口を含み、 ここで、流体が該容器の底部から該中空チューブを通り抜けて該容器の頂部に 流れ、該バスケットを通り抜けて該容器の底部に戻る請求項１９に記載の方法。