JPH08506325A

JPH08506325A - サイトメガロウイルスに対するヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH08506325A
Application number: JP6517375A
Authority: JP
Inventors: オストバーグ、ラース、ジー．; ナドラー、ポール
Original assignee: サンドファーマスーティカルコーポレーション
Priority date: 1993-01-28
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1996-07-09
Also published as: AU6167794A; EP0683675A4; EP0683675A1; WO1994016730A1; AU695584B2; CA2153790A1

Abstract

(57)【要約】ヒトサイトメガロウイルス感染、例えばＣＭＶ網膜炎を治療するために有用なヒトモノクローナル抗サイトメガロウイルス抗体、及び該抗体を用いたＣＭＶ網膜炎の治療方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】サイトメガロウイルスに対するヒトモノクローナル抗体技術分野本発明は、一般に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、例えばＣＭＶ網膜炎等の治療及び予防のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、ヒトサイトメガロウイルスに結合しそして中和するヒトモノクローナル抗体を用いることを含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の予防及び治療に関する。背景サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヒト集団中に広く拡がったヘルペスウイルスであり、乳児集団の０．２〜２．２％は子宮内で感染し、そしてその他の８〜６０％は生後６カ月の間に感染する（レイノルズら、１９７３年、ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８９：１）。ＣＭＶ感染は、大半が通常不顕性であるけれども、ＣＭＶで誘発された知覚神経系の聴覚障害及び致死的なサイトメガロウイルス感染（「サイトメガルス性封入体疾患」）は、重大な公衆の健康問題である。更に、ＣＭＶは、ＡＩＤＳにより併発されるより一般の日和見感染の一つであり、そしてしばしば、ＨＩＶ陽性の人に起こる繰り返しの感染による疾患、典型的には、網膜炎又は結腸及び食道の角質化しない病変を形成する疾患を生じ、及び場合により、重篤な予後を伴う腸の広範囲にわたる壊死を生じる（レーンら、（１９８８）、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３３：７４１；メイスルマンら（１９８５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：８８：１７１）。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染は、精神遅滞及び先天性聴覚障害の主要な感染原因である。ＣＭＶはまた、免疫抑制された人のなかでたくさんの疾患の原因であり、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者、医原性的に免疫が抑制された器官移植患者、及び骨髄移植患者において、一般的な及びしばしば厳しい全身性の効果を生じる。サイトメガロウイルス感染が重大な人の健康問題であるということは明らかである。それ故、サイトメガロウイルス感染を予防し及び／又は、持続的な潜伏感染からの繰り返しの感染の発生を阻止する、特にヒト患者のＣＭＶ網膜炎の治療のために、治療薬の開発が望まれている。サイトメガロウイルスによる感染は、新生児及び免疫が抑制された患者、特に器官移植、癌及びＡＩＤＳを有する患者の罹病率及び死亡率に重要な役割を果たす。接種又は感染の特定の治療によるこれらの感染の予防は、従来は不可能であった。ヘルペスウイルス感染の治療のために用いられている一つのアプローチは、ＣＭＶウイルスのＤＮＡ複製の阻害である。例えば、ウイルスＤＮＡ複製は、しばしば、ウイルスによってエンコードされたＤＮＡポリメラーゼを阻害する薬剤によって阻害されうる。ウイルスＤＮＡポリメラーゼのこのような阻害剤の最も顕著な例は、アサイクロバー、ガンシクロバー、シトルシン−Ｉ及び非環式グアノシンホスホネート（Ｒ，Ｓ）−ＨＰＭＰＣである（テリーら（１９８８）ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ．１０：２３５；ヤマモトら（１９８９）ＡｎｔｉvｉｒａｌＲｅｓ．１２：２１）。しかしながら、これらの化合物は、ウイルスのチミジレートシンセターゼ又はＤＮＡポリメラーゼに完全に選択性でなく、それ故、不都合にも、高い投与量では宿主のＤＮＡ複製の阻害を引き起こしうる。更に、これらの化合物の阻害効果に耐性である変異株ウイルスの発生が報告されており、そしてそれはウイルスＤＮＡポリメラーゼの変異の結果から生じているようである（コーエンら（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：９０９；コーエンら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：２２６５；ラーダーら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：１６９）。従って、ＣＭＶ感染、例えばＣＭＶ網膜炎を最初にホスカネット及びガンシクロバーで処理することができる一方、ある期間の後、ＣＭＶ複製及び病理学的なウイルス感染の進行が再発する。ウイルス病理学のこのような再発及び進行は、ホスカネット及びガンシクロバーを用いた更なる治療に対して抗治療性であり得る。そしてこれは、「ブレークスルー」現象と呼ばれる。更に、ＣＭＶ感染（例えば、網膜炎）のホスカネット及びガンシクロバー治療は、かなり短い期間の抗ウイルス効果を結果し、ある研究では、抗ウイルス治療から疾患進行までの平均の期間（即ち、ブレークスルー）は、ガンシクロバー治療についてはたったの５６日であり、そしてホスカネット治療についてはたったの５９日であった（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：２１３（１９９２））。抗体（例えば、免疫グロブリン）を用いた受動免疫を、ガンシクロバーと組み合わせて、ヒトにおける治療効果についてテストした。このような抗体の調製物は、より初期の感染の結果としてウイルスに対する高い抗体価を有する供与体の血清から得られる。このような慣用の抗体調製物の一つの欠点は、適した供与体の数が限られていること及び、種々の調製物の乏しい再現性又は品質（これは、病原体及び病原性ウイルスの潜在的な汚染を含む）である。不運にも、ガンシクロバーと組み合わせての静脈内の免疫グロブリンの使用は、明白に、ガンシクロバー治療単独に比べて著しく改善された効果を生じない（ジェイコブソンら（１９９０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７６）。ハイブリドーマの開発及び同様の技術は、今日、インビトロにおいて所望の特異性を有する抗体を、大量にかつ一定の品質にて製造することを可能とした。このような抗体は、典型的には、ミエローマ細胞を所望の特異性の抗体を分泌するリンパ球と融合することにより得られるハイブリドーマ細胞から製造される。他の発現系もまた、モノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖をエンコードするポリヌクレオチドの導入に引き続いてモノクローナル抗体を発現するために用いられ得る。モノクローナル抗体は、本技術分野の熟練者に良く知られた種々の技術により得られうる。簡潔には、動物、好ましくはヒト（ヒトの治療のために減少した抗原性を有するヒトモノクローナル抗体を製造するため）を、所望の抗原で免疫するか又はＣＭＶで感染させ、そして脾臓細胞を取り出して、通常はミエローマ細胞と融合することにより不死とする（コーラーとミリステイン（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１、及び。オストベルグＬとパーシュＥ（１９８３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ２：３６１参照）。不死化の代替の方法は、エプスタイン・バールウイルス、オンコジーン又はレトロウイルスを用いた形質転換、又は本技術分野にて公知の他の方法を含む。単一の不死化細胞から作り上げたクローンを、所望の特異性及び抗原に対する親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングする。このような細胞によって産生されたモノクローナル抗体の収量は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹水腔への注入を含む）により増幅されうる。ハイブリドーマセルライン及びそれらの製造方法、並びに抗体産生のためのそれらの使用は、米国特許第４，６３４，６６４号明細書に記載されている。これらのハイブリドーマセルラインは、異種ハイブリドーマ細胞を、遺伝子的に相容性の物質を産生する細胞と融合することによって作られる。モノクローナル抗体を記載している他の文献は、米国特許第４，５７４，１１６号、第４，６２４，９２１号、第４，４９１，６３２号、第４，６１８，５７７号、第４，６０８，３７７号、第４，６３４，６６６号、及び５，０４３，２８１号明細書；英国特許出願公開第２，０８６，９３７号公報；ヨーロッパ特許出願第０，３８９，９８３号公報、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９１／１４７０３号公報；メーダーら（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ５：３３；イチモリら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＲｅｓＣｏｍｍ．１２９：２６；ヴァンミールら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８０：２６７；ガファーら（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ５：９３；パルマーら（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ５：２４９及びカン−ミッチェルら（１９８７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ６：１６１を含む。この技術の適用を成功させるためには３つの決定的な要因がある。（１）得られるハイブリドーマを不死化し、そして同時にこの細胞において所望の抗体を連続的に産生することを可能とする適当なミエローマ細胞の使用。（２）融合パートナーとしてのリンパ球、該リンパ球は、所望の抗体を製造するためにインビボ及び／又はインビトロで適当な方法により刺激されている。及び（３）適当なスクリーニング及び選択方法の使用、該方法を用いて、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が選択されうる。サイトメガロウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体の調製は、これらの３つの要因の正しい組み合わせに基づいている。ニューカークら（１９８８）ＪＣｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１５１１は、ヒトＣＭＶと反応する中和性モノクローナル抗体、及び該抗体の可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を記載している。抗サイトメガロウイルスモノクローナル抗体の安全性及び薬物動態プロフィールはアウリツキーら（１９９１）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３：１３４４及びドロビスキーら（１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５１：１１９０において議論されている。しかしながら、報告されたヒト抗ＣＭＶモノクローナル抗体はいずれも、ヒトのＣＭＶ感染（例えば、網膜炎）の治療において、著しい治療効果を有していないと示されている。従って、本技術分野においては、ヒトサイトメガロウイルスの複製阻害、ＣＭＶビリオンの中和、及びサイトメガロウイルス感染特にヒトＣＭＶ網膜炎、及び特に免疫が抑制された患者例えばＡＩＤＳ患者におけるＣＭＶ感染を予防・治療するための効果的な方法及び組成物が必要とされている。ＣＭＶウイルスが誘発した病状を妨げる薬剤は一般に重大な治療上の欠点及び限定を有しているので、このような方法及び組成物は、他の治療態様、例えばＣＭＶ感染を直接に治療するためのホスカネット及びガンシクロバー治療、及び潜伏性のＨＩＶ病状及びＡＩＤＳ病状に付随する免疫抑制の治療のためのジデオキシイノシン及びＡＺＴとの有利な組み合わせに適していることが更に望ましい。発明の概要本発明は、サイトメガロウイルス感染に対して有効なヒトモノクローナル抗体に関する。本発明は、サイトメガロウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体の製造において、ミエローマ細胞ＳＰＡＺ−４を、既にサイトメガロウイルスに対して免疫応答を有しかつインビトロにてＣＭＶ抗原で二次刺激を受けているヒト脾臓からのリンパ球、又はサイトメガロウイルスに対する抗体が増加しているヒトからの末梢血リンパ球のいずれかと融合することを特徴とする製造に関する。所望のハイブリッドが選択され、このようにして作られたハイブリドーマセルライン（これは、ナショナルコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（ＮＡＣＣ）に１９８５年１０月９日に、番号８５１００８０３にて寄託された）がインビトロ培地で培養され、そして、モノクローナル抗体ＳＤＳＭＳＬ１０９がこの培地より単離される。モノクローナル抗体は、免疫抑制された患者、例えば新生児又は器官移植を受けた或いは癌、ＡＩＤＳ等を有する患者の治療に有用である。本発明の目的は、サイトメガロウイルス感染に対して抗ウイルス活性を有する、特にヒトサイトメガロウイルス（例えば、ｈＣＭＶ）での感染により生じた網膜炎の治療のための組成物及び化合物（モノクローナル抗体を包含する）を提供することである。本発明の他の目的は、特にヒトにおいて、ＣＭＶ感染、そして特には、免疫抑制された患者、例えばＡＩＳＤ患者、新生児、抗腫瘍化学療法を受けている患者、移植片拒絶反応を防ぐために免疫抑制剤を処置された患者等におけるＣＭＶ網膜炎を治療又は予防するための方法を提供することである。一つの観点において、本発明は、ヒト患者においてＣＭＶ感染力及び／又はＣＭＶ関連病状を阻害する治療効果を有するヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を提供する。本発明の一つの実施態様において、ＣＭＶを中和しかつヒトＣＭＶ感染の治療に効果を有するＳＤＺＭＳＬ１０９と命名されたヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体が提供される。本発明はまた、ＣＭＶｇＨ表面糖蛋白質に結合しかつ（例えば、ウイルスを中和することにより）ＣＭＶ感染力を阻害するモノクローナル抗体、例えばＭＳＬ１０９を提供する。ＳＤＺＭＳＬ１０９抗体を分泌するハイブリドーマセルラインが提供され、そしてそれはＥＶ２−７と命名されている。本発明の一つの観点において、ヒト患者においてＣＭＶ感染を治療及び予防するための治療方法が提供される。一つの実施態様において、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体、例えばＣＭＶｇＨ糖蛋白質外部ドメインに結合する抗体の有効投与量が、ＣＭＶに感染したヒト患者に、単独で或いは少なくとも一つの他の抗ウイルス剤、例えばホスカネット及び／又はガンシクロバーと組み合わせて投与される。好都合に、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体は、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体に対する著しい抗体応答を引き起こさない。一つの観点において、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するヒトモノクローナル抗体の製造のための方法並びにこれらの抗体それ自身、及びこれらの方法で用いられる安定なハイブリドーマラインＥＶ２−７並びにその製造に関する。本発明は更に、ヒトにおいてｈＣＭＶ感染を治療するための、治療用のヒト抗ＣＭＶモノクローナル抗体の無菌組成物であって、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体の単位投与量、又は治療抗体及びウイルス阻害剤の混合物を含み、ヘルペスウイルス例えばＣＭＶの増殖を阻害する生物活性を有する組成物を提供することである。特に、ヒトＣＭＶ感染の治療に有用な組成物が提供される。いくつかの変更において、治療組成物は、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体及び非免疫グロブリン性抗ウイルス剤、好ましくはホスカネット、ガンシクロバー又はホスカネット及びガンシクロバーの両者を含む。本発明はまた、適当な培養条件下で培養されて培養上清中にＭＳＬ１０９モノクローナル抗体を発現しうる、ＥＶ２−７と命名されたハイブリドーマ（トリオーマ）を提供する。本明細書中で議論した文献は引用することにより本明細書の一部となり、そしてそれらは本出願の出願日前の開示のためのみに提供される。本明細書中のいずれの記載も、発明者が従来の発明によってこのような開示よりも先発明である権利を有しないということを是認したと解釈されるべきではない。明細書の以下の部分及び図を参照することにより、本発明の性質及び利点の理解が更に明白となるであろう。図面の簡単な説明図１は、ホスカネット又はガンシクロバーのいずれかと共にＳＤＺＭＳＬ１０９で処置された患者集団のカプラン−メイアープロットを示す。検出可能な進行が再び始まる前の日数に対して、ＣＭＶ網膜炎の発達が進行しない患者のパーセンテージがプロットされている。進行の再開（網膜炎のブレークスルー）の平均期間は２０２日であった。定義特に断りの無い限り、本明細書中で用いた全ての技術的及び化学的用語は、この発明が属する技術分野の熟練者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載した方法及び物質と類似の或いは同等のいずれの方法及び物質も、本発明を実施し又はテストするために用いられ得るけれども、好ましいのは記載された方法及び物質である。目的物に対して用いられる本明細書中の言葉「自然発生する」とは、目的物が天然に見いだされうる事実を意味する。例えば、天然の起源から単離されうる、かつ研究室で人為的に改変されていない微生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然発生するである。本明細書で用いた「実質的に純粋な」は、目的の物質種が優勢に存在する種である（即ち、モル基準で、それが、組成物中のいずれの他の個々の物質種よりも豊富である）ことを意味し、そして好ましくは、実質的に精製された画分とは、目的の物質種が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を構成する組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約８０〜９０パーセント超を構成する。最も好ましくは、目的種は、本質的に均質（汚染種が、慣用の検出手段では組成物中に検出されない）まで精製され、そこでは組成物は本質的に単一の巨大分子よりなる。本明細書で用いた言葉「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にエンコードされる１以上のポリペプチドからなる蛋白質を意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びにミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、抗体のみならず種々の形態で存在しうる。例えば、それらは、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）₂並びに一本鎖を含む（例ば、ヒューストンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９−５８８３（１９８８）及びバードら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６（１９８８）、これらは引用することにより明細書の一部となる）。（一般には、フードら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ベンジャミン、Ｎ．Ｙ．、第２版（１９８４）及びハンカピラーとフード、Ｎａｔｕｒｅ、３２３：１５−１６（１９８６）参照、これらは引用することにより明細書の一部となる）。本明細書で用いた言葉「抗体」とは、少なくとも２つの軽ポリペプチド鎖及び２つの重ポリペプチド鎖を含む免疫グロブリンを意味する。重ポリペプチド鎖及び軽ポリペプチド鎖のそれぞれは、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域（一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。また、重ポリペプチド鎖及び軽ポリペプチド鎖はそれぞれ、免疫系の種々の細胞を含む宿主組織又は因子、いくつかの食細胞及び古典的補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を仲介しうるポリペプチド鎖の定常領域（一般に、カルボキシル末端部分）を含む。典型的には、軽ポリペプチド鎖及び重ポリペプチド鎖は、可変領域及び完全な定常領域からそれぞれが本質的になる完全鎖である。本発明の抗ＣＭＶ抗体の可変領域は、他のイソタイプの定常領域にグラフトされうる。例えば、γ１イソタイプのヒト抗ＣＭＶ重鎖の可変領域をエンコードするポリヌクレオチドは、他の重鎖クラス（又はサブクラス）、例えば、μ、γ２、γ３、γ ４、δ、ε、α１、α２及びα_sec（γ定常領域を、κ定常領域の代わりに用いうる）の定常領域をエンコードするポリヌクレオチドにグラフトされうる。更に、一般に、１〜数個のアミノ酸置換、特には同類アミノ酸置換が、抗原結合を実質上に妨げることなしに、そしていくつかの実施態様においてはヒト患者に投与されたときに抗体の抗原性を実質上増加することなしに本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖配列のアミノ酸配列に対して成されうる。１〜数個のアミノ酸の変更、欠失または付加が行われうる。典型的には、アミノ酸の置換、付加又は欠失は、定常領域又は可変領域フレームワーク配列に対してなされ、相補性決定（ＣＤＲ）配列に対しては典型的には殆ど成されない。同類アミノ酸置換は、類似の性質を有する代替アミノ酸によるアミノ酸置換である（例えば、酸性であるものとしては、Ａｓｐ及びＧｌｕ）。同類（又は同義の）アミノ酸置換は、親配列の構造的特性を実質上変えるべきではない（例えば、代替アミノ酸が、親配列中にあるヘリックスを壊したり、又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を崩壊したりすべきではない）。従来認識されたポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、（１９８４）クレイトン（編）、Ｗ．Ｈ．フリーマンアンドカンパニー、ニューヨーク；ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、（１９９１）、Ｃ．ブランデンとＪ．トーズ、ガーランドパブリッシング、ニューヨーク、ＮＹ；及びトールントンら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５に記載されている。例えば、単一の又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、同類アミノ酸置換）は、自然発生する配列中で（好ましくは、抗原に直接接触しないポリペプチドの領域にて）行われうる。突然変異した或いは改変した蛋白質及び他の類似体は、一般に、生物活性（即ち、ＣＭＶ結合及び中和活性）を有する。詳細な説明本発明以前は、ヒト抗サイトメガロウイルスモノクローナル抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９は、作られてもおらずまた特徴付けもされていなかった。従って、本発明の目的は、サイトメガロウイルスに対するヒトモノクローナル抗体、該抗体を製造するための方法及び該抗体を用いた方法を提供することである。本発明の更なる目的は、サイトメガロウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体を製造するための方法であって、ミエローマ細胞ＳＰＡＺ−４を、既にサイトメガロウイルスに対して免疫応答を有しかつインビトロにてＣＭＶ抗原で二次刺激を受けているヒト脾臓からのリンパ球、又はサイトメガロウイルスに対する抗体が増加しているヒトからの末梢血リンパ球のいずれかと融合し、次いで所望のハイブリッドを選択し、かくして作られたハイブリドーマセルライン（該ハイブリドーマセルラインは、ナショナルコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（ＮＡＣＣ）に１９８５年１０月９日に、番号８５１００８０３にて寄託された）はインビトロ培地で培養され、そして、モノクローナル抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９がこの培地より単離されることを特徴とする製造方法を提供することである。米国特許出願シリアル番号第０８／０１０，２２８（１９９３年１月２８日に出願された）はＥＶ２− ７及びＭＳＬ１０９を記載しており、そしてこの出願は引用することにより明細書の一部である。本発明の更なる目的は、モノクローナル抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９の特徴付けを行い、そして慢性病のために又は予防的に該抗体を用いる方法を提供することである。ヒト抗ＣＭＶモノクローナル抗体の製造本発明に従って、ＣＭＶに対するモノクローナル抗体が、ミエローマ細胞としてＳＰＡＺ−４細胞（これは、例えば、ＮＩＧＭＳＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＭｕｔａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙから参照番号ＧＭ３５６６９Ａ（米国ＤＨＨＳ１９８２ＣａｔａｌｏｇｏｆＣｅｌｌＬｉｎｅｓ参照）として入手可能な薬剤耐性セルラインＳＰ−２から調製される）を用いて得られる。ＳＰＡＺ４の調製を以下に概略する。ＳＰ−２セルラインを、慣用の技術により正常ヒト末梢リンパ球と融合する。多数のハイブリッドを得、そして約５週間後に、速い成長を示すが抗体産生を行わないクローンを選択する。これらの細胞を８−アザグアニンに対する耐性で選択し、そしてこれらを用いて、２０μｇ／ｍｌの８ −アザグアニンに対して耐性である変異株を得ることができる。これらの細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地に対して感受性にされ、このことはそれらの細胞が、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを産生する能力を欠失していることを示す。これらのセルラインの一つがＳＰＡＺ−４である。リンパ球は、例えばトラウマチン破壊のために取り除かれたヒト脾臓に由来する。単一細胞懸濁液がこれらの脾臓から（摘出の後の２〜４時間以内に）得られ、そしてリンパ球を、融合まで−７０℃にて適当な凍結培地中にて保存する。多くの脾臓の中から、ＣＭＶ免疫供与体由来の脾臓を選択した。これは、ＣＭＶ抗原で細胞を刺激し、その後、チミジンの取り込みを測定することにより行った。次いで、そのように予備選択された脾臓のリンパ球をインビトロで７〜１４日にわたってＣＭＶ抗原で刺激し、引き続き公知の方法によりＳＰＡＺ−４細胞と融合した。或いは、リンパ球は、もしサイトメガロウイルス抗体の力価増加の時に可能であるならば、サイトメガロウイルス感染しているヒトから採った血液サンプルから由来する。リンパ球は、公知の方法により血液から単離され、そしてＳＰＡＺ−４細胞と融合される。次いで、ハイブリッド細胞を公知の方法で（例えば、ＨＡＴ培地中で）選択した。次いで、得られたセルラインは、ＣＭＶを中和する抗体を産生しているかについてテストされる。陽性の培養物をサブクローン化し、そして長期間のインビトロでの培養により、中和抗体を産生する安定なセルラインへと発展させた。このようにして、ＥＶ２−７と呼ばれる安定なハイブリドーマラインが得られた。（このセルラインは、１９８５年１０月９日、ナショナルコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（ＮＣＡＣＣ）に、番号８５１００８０３のもと寄託された）。このセルラインは、中和モノクローナル抗体ＳＤＺＭＳＬ−１０９を産生し、該抗体は、いずれの量にても得られることができ、そして公知の方法で精製後、ヒトのＣＭＶ感染の治療及び予防のために利用できる。抗体は、サブクラスＩｇＧ１に属し、そして軽鎖としてカッパ鎖を有する。抗体は、インビトロにて、３つの実験室株（Ｔｏｗｎｅ、ＡＤ１６９及びＤａｖｉｓ）を含むサイトメガロウイルスの一連のテストした株、並びに一連のテストした新鮮な臨床の分離株を中和した。抗体はプロテインＡに結合した。従って、抗体は、プロテインＡセファロースでのアフィニティークロマトグラフィーにより、培養上清より精製されうる。ヒト抗ＣＭＶ抗体の組み換え発現本発明のポリヌクレオチド及び組み換えにより製造された本発明のヒト抗ＣＭＶ抗体は、本技術分野にて公知のそしてマニアティスら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．及びベルガーとキメル、ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１５２，ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）、アカデミックプレス、インコーポレーテッド、サンディエゴ、ＣＡ（これらは引用することにより本明細書の一部である）に記載された方法に従って本明細書中に記載された配列データに基づいて調製されうる。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは合成オリゴヌクレオチドから形成される。このような組み換えポリヌクレオチドは、本技術分野で公知の標準法に従って原核又は真核宿主細胞中で発現されることができ、好ましくは、哺乳動物細胞、例えばリンパ球セルラインが宿主細胞として用いられ得る。典型的には、このようなポリヌクレオチド構築物は、少なくともＳＤＺＭＳＬ１０９重鎖及び／又は軽鎖可変領域をそれぞれが有する完全なヒト免疫グロブリン重鎖及び／又は完全なヒト免疫グロブリン軽鎖をエンコードする。或いは、ＳＤＺＭＳＬ１０９免疫グロブリン鎖に元々付随するもの以外のヒト定常領域配列（重鎖及び／又は軽鎖）が代用されることができ、これはヒト定常領域イソタイプを含みうる。このような代替のヒト定常領域配列は、本技術分野の熟練者によって、種々の文献より選ばれ得る。これは、Ｅ．Ａ．カバットら、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｏｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７），ナショナルインスチチュートオブヘルス、ベセスダ、ＭＤに列記されたものを含むがそらに限定されない。配列番号３及び配列番号４として以下に示された可変領域配列は、このような抗体にＣＭＶ結合性を与える。一つの実施態様において、配列番号４へのアミノ末端ペプチド連結（即ち、インフレーム融合）を有するヒト軽鎖定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をエンコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号３へのアミノ末端ペプチド連結を有する免疫グロブリン重鎖定常領域をエンコードするポリヌクレオチド配列が発現され、そして重鎖／軽鎖ダイマー及び他の抗体タイプを形成する。ヒト定常領域配列に加えて、他の非免疫原性定常領域も用いられ得る（例えば、非ヒト霊長類配列、配列変異型）。自然のＭＳＬ１０９に比べて可変ドメインの結合活性を実質上減少しない配列変異型が作られうる。一般に、原核生物は、ヒト抗ＣＭＶ免疫グロブリン鎖をエンコードするＤＮＡ配列をクローニングするために用いられ得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な原核生物宿主の一つである。或いは、オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト合成を含む種々の方法により化学的に合成されうる。ポリヌクレオチド構築物は、典型的には、自然に付随する又は異種のプロモーター領域を含む、コーディング配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む。好ましくは、発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質変換又はトランスフェクトできるベクター中の真核生物プロモーター系である。いったんベクターが適当な宿主中に導入されれば、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルでの発現、及びヒト抗ＣＭＶ免疫グロブリンの回収及び精製に適した条件下で維持される。前記した如く、ＤＮＡ配列は、配列が発現調節配列に作動可能に連結された後（即ち、構造遺伝子の転写及び翻訳を保証するように配置された後）に宿主中で発現されうる。これらの発現ベクターは、典型的には、宿主生物中で、エピソームとして或いは宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれた部分としてのいずれかにより複製可能である。通常、発現ベクターは、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性又はヒグロマイシン耐性を含み、所望のＤＮＡ配列を有する形質転換された細胞の検出を可能とする（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号明細書参照、これは引用することにより本明細書の一部となる）。微生物、例えば酵母が、発現のために用いられ得る。サッカロミセスが、所望の発現調節配列、複製起点及び終結配列等を有する適したベクターを持った好ましい酵母宿主である。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導可能な酵母プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ及びマルトース及びガラクトース利用のための酵素からのプロモーターを含む。真核微生物、例えば酵母に加えて、哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを製造するために用いられ得る（ウイナッカー、「ＦｒｏｍＧｅｎｅｓｔｏＣｌｏｎｅｓ」ＶＣＨパブリッシャーズ、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照、これは引用することにより本明細書の一部となる）。哺乳動物細胞は、現実に好ましい。何故なら、無傷の異種蛋白質を分泌できる多くの適した宿主セルラインが本技術分野で開発されているからである。それらは、ＣＨＯセルライン、種々のＣＯＳセルライン、ＨｅＬａ細胞、ミエローマセルライン等を含む。これらの細胞のための発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー（クイーンＣ．ら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９、これは引用することにより本明細書の一部となる）及び必須のプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結部位を含むことができる。好ましい発現調節配列は、内生遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス及びウシパピローマウイルス等から由来のプロモーターである。コ、Ｍ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９参照、これは引用することにより本明細書の一部となる。目的のＤＮＡセグメントを含むベクターは、細胞性宿主のタイプに依存して、公知の方法により宿主細胞中へ転移されうる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞のために通常用いられ、一方、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）或いはウイルスに基づいたトランスフェクションが他の細胞性宿主のために用いられ得る。哺乳動物細胞を形質転換するために用いられる他の方法は、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションの使用を含む（一般に、サムブロックら、前掲参照）。典型的には、抗ＣＭＶ抗体の重鎖及び／又は軽鎖をエンコードするポリヌクレオチド配列は、免疫グロブリンをグリコシル化するグリコシル化細胞中に導入されそしてその中で発現される。本明細書で用いた「グリコシル化細胞」とは、蛋白質をグリコシル化できる細胞、特に、該細胞中で発現された少なくとも一つのポリペプチド、特に分泌された蛋白質の少なくとも一つのグリコシル化部位配列に、少なくとも一つのマンノース残基を含むＮ−連結された「コアオリゴ糖」を付加できる及び／又はＯ−連結された糖を付加できる真核細胞である。従って、グリコシル化細胞は、蛋白質又はポリペプチド中のグリコシル化部位配列への糖残基の付加を触媒する少なくとも一つの酵素活性を含み、そして細胞は実際、少なくとも一つの発現されたポリペプチドをグリコシル化する。例えば、これに限定はされないが、哺乳動物細胞は典型的にグリコシル化細胞である。他の真核細胞、例えば、昆虫細胞及び酵母はグリコシル化細胞であり得る。ひとたび発現されれば、本発明のヒト抗ＣＭＶ免疫グロブリンは、ＨＰＬＣ精製、分画カラムクロマトグラフィー及びゲル電気泳動等を含む本技術分野の標準法に従って精製されうる（一般に、スコープス、Ｒ．、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、スプリンガー−ベルラグ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）参照）。所望の如く、部分的に又は均質にまでひとたび精製されば、ポリペプチドは、治療的に、又は検定方法の開発及び実行にて、又は市販の研究試薬として用いられうる。ヒト抗ＣＭＶ抗体の治療的利用ハイブリドーマセルラインから製造されたモノクローナル抗体、特にＳＤＺＭＳＬ１０９は、ヒト及び多くの非ヒト霊長類において、ほんの僅かに免疫原性を有するか又は有しない。このことは、サルにおいて、及びそれに引き続きヒトの臨床試験により立証することができた。アカゲザルの免疫グロブリンとヒトの免疫グロブリン間の大きな類似性故、アカゲザルは良い動物モデルである。３匹のサルへの０．５ｍｇ／ｋｇ体重の抗体の静脈内投与（６．１〜７．３ｋｇの体重、２００日の期間にわたって動物当たり１２回投与）は、いずれかの確認できる免疫応答を引き起こさず、特に抗イディオタイプ抗体を介しての免疫応答を引き起こさなかった。何故なら、ＳＤＺＭＳＬ１０９抗体は、数週間にわたって（１８０〜２５０日まで）血清中に検出され得るが、薬物動態学は免疫応答の場合に予想されるそれに対応していなかったからである。更に、抗体は並外れて長期間血流中に留まる。即ち、ＥＬＩＳＡテストで測定されたＳＤＺＭＳＬ１０９抗体の半減期は１８日であった（「サンドイッチアッセイ」：合成物質上に吸着された抗ＳＤＺＭＳＬ１０９イディオタイプヤギ免疫グロブリン：ホースラディシュパーオキシダーゼと複合された抗ウサギヤギＩｇＧを有するウサギ抗ＳＤＺＭＳＬ１０９イディオタイプを用いた、結合したＳＤＺＭＳＬ１０９抗体の検出）。このことは、ヒトの場合に少なくとも半減期の長さに対応するであろう（シュルツェＨ．Ｅ．とＪ．Ｆ．ヘレマンズ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｕｍａｎＰｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈＳｐｅｃｉａｌＲｅｆｅｒｅｎｃｅｔｏＰｌａｓｍａＰｒｏｔｅｉｎｓ、第１巻、エルセヴィアパブリッシングコーポレーテッド、ニューヨーク、第４８０頁、１９６６年）。これらの発見は驚くべきことである。それらは、本発明に従ったモノクローナル抗体がヒトにおいて抗イディオタイプ抗体の形成を引き起こすことは予期されないということを示す。それ故、それらは、長期間にわたっての複数回、例えば年間当たり６〜１２回の注入により投与されることができ、それにより、血中の抗体濃度は、約１μｇ／ｍｌの値を超えて、数カ月間維持されうる。実際、もし医学上必要であれば、抗体は患者の生命の残りの期間投与されうるということが期待されうる。投与量及び平均血中濃度は、時間に伴い変化し、そしてそれ故、典型的にはモニターされ且つ調節される。それ故、本発明に従ったモノクローナル抗体は、慢性病の場合でさえ治療的用途に、又は予防用途に適している。モノクローナル抗体を用いた治療又は予防に適した病状の例は、器官移植（例えば、腎臓、心臓又は肝臓）又は骨髄移植を受けた又はＡＩＤＳに罹った患者のＣＭＶ網膜炎及びＣＭＶ肺炎、及び先天性ＣＭＶ疾患等を含むＣＭＶ疾患である。治療組成物治療的又は予防的使用のために、薬理学的有効投与量の１以上のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を含む無菌組成物が、サイトメガロウイルス感染の治療のためにヒト患者に又は獣医の非ヒト患者に投与される。典型的には、組成物は、ＳＤＺＭＳＬ１０９と同一の又は実質上類似のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を含む。例えば、もしヒト患者がｈＣＭＶに感染していれば、有効投与量のＳＤＺＭＳＬ１０９を投与するのが好ましい。いくつかの実施態様において、ＳＤＺＭＳＬ１０９と実質上同一であるがＣＭＶへの結合を著しく変更しないマイナーな配列の変化を含むヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を用いるのが望ましいかもしれない。薬学上許容できる基剤又は賦形剤が、このような無菌組成物においてしばしば用いられる。投与経路は、典型的には、筋肉内又は静脈内注入、皮下又は経皮投与である。本発明のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を含む薬学組成物は、局所又は非経口投与（即ち、皮下的、筋肉内的、眼内的、静脈内的又はイオン導入法（例えば、経皮的）による）のために有用である。非経口投与のための組成物は、通常、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体の溶液又は許容できる基剤、好ましくは水性基剤に溶解されたそれらの混液を含む。種々の水性基剤、例えば、水、緩衝化水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等が用いられ得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般的には微粒子物質を含まない。これらの組成物は、慣用の良く知られた滅菌法により滅菌されうる。組成物は、適当な生理学的条件のために要求される薬学上許容できる補助物質、例えばｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含みうる。これらの製剤中のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体の濃度は、大きく、即ち、約０．０１重量％未満から通常は少なくとも約０．１重量％から、５重量％もの多量まで変化することができ、そして第一に、選択された特定の投与様式に従って、液容量、粘度等に基づいて選択される。従って、筋肉内注入のための典型的な薬学組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水及び約１〜５０ｍｇのヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を含むように調製されうる。静脈内注入のための典型的な組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液及び約１０〜５００ｍｇのヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体を含むように調製されうる。非経口投与組成物の調製のための実際の方法は、本技術分野の熟練者に良く知られているか又は明白であり、更に詳細には、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’s ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、第１５版、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルバニア（１９８０）（これは引用することにより本明細書の一部となる）に記載されている。局所適用のための典型的な薬学組成物は、適した皮膚軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏及び溶液、呼吸用エーロゾル及び他の賦形剤を用いて作られうる。賦形剤は、調製物の活性成分であるヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体と化学的に適合すべきであり、そして、一般には、活性成分の分解、変性又は凝集を増加させるべきでない。本発明のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体は、貯蔵のために凍結乾燥されることができそして使用に先だって適した基剤中で再構成されうる。この技術は慣用の抗体に有効であると示されており、そして本技術分野で知られた凍結乾燥及び再構成の技術が用いられ得る。凍結乾燥及び再構成は、種々の程度で生物活性の損失をもたらしうること、および使用レベルはそれを補うために調製されなければならないかもしれないということが本技術分野の熟練者に認識されるであろう。好ましい組成物は、２０ｍｇ〜２００ｍｇのヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体（例えば、ＳＤＺＭＳＬ１０９）を含む。最も通常には、ＳＤＺＭＳＬ１０９が、患者への注入に先だって、無菌緩衝水性溶液、例えば、無菌生理的食塩水等の中に懸濁又は溶解される。治療的及び予防的投与治療的適用において、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体（例えば、ＳＤＺＭＳＬ１０９）を含む組成物は、既に特定のＣＭＶ関連疾患（例えば、網膜炎）に冒された患者に、ＣＭＶの感染力及び感染の再発を阻害することにより状態の進行及びその併発症を治し、部分的に阻止し又は検出できるほど遅らせるのに十分な量にて投与される。このことを成し遂げるために十分な量は、「治療的有効投与量」又は「有効投与量」と定義される。この使用のための有効量は、状態のひどさ、患者の一般的状態及び投与経路、（もしあれば）他の抗ウイルス剤との組み合わせに依存するが、一般には、投与当たり約１ｍｇ〜約１ｇヒト抗ＣＭＶ抗体の範囲内であり、患者当たり１０ｍｇ〜１００ｍｇの１回の投与単位が更に通常用いられ、そして患者当たり２０ｍｇ〜８０ｍｇの投与単位が更に典型的である。例えば、急性ＣＭＶ網膜炎の治療のために、約２０ｍｇ〜８０ｍｇのヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体（例えば、ＳＤＺＭＳＬ１０９）が、静脈内注入にて全身的に投与されうる。或いは、投与量レベルは、一般に、約０．２５ｍｇ／ｋｇ患者体重〜おおよそ５ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、更に大きな投与量も場合により用いられる。通常、複数回の投与が、治療のコースに従って行われ、典型的な投与スケジュールは、１日約１回〜月１回投与された（隔週の投与が典型的である）治療的有効投与量を含む。予防適用において、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体又はそれらの混液を含む組成物が、患者の抵抗性を増すために又はＣＭＶ関連疾患（例えば、ＣＭＶ網膜症）の進行を阻害するために、まだＣＭＶ疾患状態にない患者に投与される。このような量は、「予防的有効投与量」と定義される。この使用において、正確な量はやはり、患者の健康状態及び一般の免疫レベルに依存するが、一般には、投与当たり１ｍｇ〜１ｇ、特には患者当たり１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内である。ＣＭＶ感染再発を防ぐために用いるヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体、例えばＳＤＺＭＳＬ１０９の典型的な製剤は、１単位投与形態当たり約２０〜８０ｍｇの抗体を含む。組成物の１回の又は複数回の投与は、治療内科医によって選択された投与量レベル及び投与様式にて行われうる。どんな場合であっても、薬学製剤は、患者を有効に治療するのに十分な本発明のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体（例えば、ＳＤＺＭＳＬ１０９）の量を提供すべきである。典型的には、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体（例えば、ＳＤＺＭＳＬ１０９）は、唯一の活性成分として又は１以上の他の活性成分（例えば、ホスカネット、ガンシクロバー又はＣＭＶ阻害性のテイル（ｔａｉｌ）ペプチド（米国特許出願シリアル番号第０７／８６７，８３１））と組み合わせて投与される。一般に、免疫無防備状態の患者におけるＣＭＶ関連疾患の治療のための、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体の適した有効投与量は、投与当たり、受容者の体重１キログラム（ｋｇ）当たり０．０１〜１００ミリグラム（ｍｇ）の範囲内であり、好ましくは、投与当たり、体重１ｋｇ当たり０．１〜５ｍｇの範囲内である。望ましい投与量は、好ましくは、治療プロトコルに従って適当な間隔にて投与される１、２、３、４又はそれ以上の副投与量（ｓｕｂｄｏｓｅ）で表される。これらの副投与量は、例えば、単位投与形態当たり５〜２００ｍｇ、好ましくは２０〜８０ｍｇの活性抗体を含む単位投与形態として投与されうる。ひとたび、患者の状態の検出できるほどの改善が起これば、必要ならば維持投与量が投与される。次いで、投与の量或いは頻度、又は両者が、症状の関数として、改善された状態が維持されるところのレベルまで減少されうる。症状が所望のレベルまで緩和したとき、治療は中止されるか又は予防的有効投与量レベルまで減少されうる。しかしながら、患者は、疾患症状の再発に基づいて長期間または疾患症状の再発を防ぐ予防手段として、間欠的な治療を要求しうる。これらの治療にて用いられる組成物は、種々の形態であり得る。好ましい形態は、意図される投与様式及び治療用途に依存する。典型的には、水性溶媒（例えば、生理的食塩水）中のヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体（例えば、ＳＤＺＭＳＬ１０９）の無菌溶液が静脈内投与される。ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体は、ＣＭＶ感染（例えば、ＣＭＶ網膜炎）に罹った患者に、単独で、又はＣＭＶウイルス病因の進行の遅延、阻止又は逆行が起こるところの期間を増加するためにホスカネット及び／又はガンシクロバー、又は他の抗ＣＭＶ剤、例えばＨＰＭＰＣと組み合わせて投与される。投与の量及びスケジュールは、幾分かは、処置内科医の臨床判断において内科医により及び／又は個々の患者の投薬力価によって決定されうる。以下の実施例は、本発明を更に完全に説明する。実施例は、説明的意味を持ち、限定的意味は有しない。実験的実施例実施例１親のミエローマセルラインの特徴付け親のミエローマセルライン、ＳＰＡＺ−４は、マウス×ヒトハイブリドーマである。この細胞は、ネズミハイブリドーマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４を、健常な成人男性から得られた末梢血リンパ球へ融合することにより構築された。ＳＰ２／Ｏ −Ａｇ１４は、ＳＰ２／ＨＬＧＫ（抗ヒツジ赤血球活性を有するＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞とミエローマセルラインＰ３Ｘ６３Ａｇ８間のハイブリッド）由来のＳＰ２／ＨＬ−Ａｇの再クローンとして単離される。ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４は、いずれの免疫グロブリン鎖も合成せずまた分泌もせず、２０μｇ／ｍＬの８−アザグアニンに対して耐性でありそしてヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）含有培地中で生存できない。このセルラインは、全く自由に入手可能であり、ＡＣＴＴ番号ＣＲＬ１５８１を有している。用いたセルラインは、エルランゲン大学（エルランゲン、ドイツ（ツールハウゼン教授））から得た。ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞を、以下の操作により、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（ファルマシア、ウプサラ、スゥーデン）上で遠心してヘパリン処理した血液から単離したヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に融合させた：生理的食塩水で洗浄後、ＰＢＬを８−アザグアニン耐性ミエローマセルに、２：１（ＰＢＬ：ミエローマ）の比にて融合した。融合は、ガルフレら（１９７７）ネーチャー、２６６：５５０に従って、フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）として、無血清ダルベッコＭＥＭ中のＰＥＧ４，０００（ロス、カールスルーエ、ドイツ）の５０％溶液を用いて行った。細胞を、平らな底を有したマイクロタイタープレート中に、ＨＡＴ含有培地１ｍｌ当たり１０⁶ ミエローマ細胞と同等の濃度にて播種した。培地は、２０％の加熱不活性化（５６℃、３０分）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＮＣＴＣ−１０９及び追加のアミノ酸、インシュリン、ピルベート及びオキザロ酢酸を含むダルベッコＭＥＭであった。４日後、培地を、ＨＴのみを含む成長培地に代え、そして３日後に上清を、ヒト抗体の存在についてＥＬＩＳＡによりテストした。多数の培養物が、ヒト抗体を産生していることが判ったが、予期したとおり、続く数週間後にはこの能力は失われた。この方法により得られたいくつかのセルラインを、８−アザグアニン（３週間、２０μｇ／ｍｌの濃度にて用いた）中での戻し選択（ｂａｃｋ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）について選択した。培養は、大多数の細胞死を示したが、速やかに成長する細胞を回収することが可能であった。この細胞はまた、ＨＡＴ培地中で速やかな死を示した。これらのセルライン中最も良好に成長するもの（ＳＰＡＺ−４と名付けた）を次の実験のために選択した。このセルラインは、敏感なＥＬＩＳＡテストにより、マウスばかりでなくヒトの免疫グロブリンも産生しないことが示された。このテストは、Ｉｍｍｕｎｏ− ｐｌａｔｅ（ヌンク、ロスキルデ、デンマーク）に対して、ウサギ抗マウス（又は抗ヒト）免疫グロブリン抗体を吸着することにより行った。上清及び界面活性剤で溶解した細胞の希釈液を、ウェル中で温置し、そして再び洗浄後、マウス（又はヒト）免疫グロブリンに対する多価のホースラディシュパーオキシダーゼ複合化ウサギ抗体（ミレス−イェダ、レホボット、イスラエル）と共に温置した。温置及び洗浄後、結合した酵素を、１，２−フェニレンジアミンジハイドロクロリド（フルカ、ブッフス、スイス）を用いて検出した。ネズミ及びヒト免疫グロブリンの標準は、このテストが、低いｎｇ／ｍｌの範囲においても感受性であることを示したが、ネズミ又はヒトの免疫グロブリン鎖のいずれもＳＰＡＺ−４物質中には見いだされなかった。ＳＰＡＺ−４セルラインは、マイコプラズマ汚染が無いことが繰り返し示され、そして、検出されない汚染の危険を除くために抗生物質の無い培地中で日常的に維持された。実施例２抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９の調製及び同定免疫細胞を、ヒト脾臓細胞のインビトロ免疫により得た。脾臓は、ランデルスクランケンハウス（国立病院）アイゼンスタット、アイゼンスタット、オーストリアにおける手術を受けた、他の点では健康な自動車事故の犠牲者から得た。脾臓は、手術より４時間以内に、サンド社の研究所（ウイーン、オーストリア）に運び、単一細胞の懸濁物を、使用まで液体窒素中に冷凍保存した。予備実験にて、細胞は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原によりインビトロで刺激されることが示された。インビトロ刺激のためのＣＭＶ抗原は、ＣＭＶのＴｏｗｎｅ株に感染したＭＲＣ−５細胞から調製した。培養物が完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したとき、細胞を、ラバー−ポリスマンを用いて培地中に掻き採り、遠心により培地と分離し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１７５ｃｍ² の組織培養フラコからの細胞を、１ｍｌの０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ９．５中に懸濁して、ダウンスホモジナイザーでホモジナイズした。等体積のＰＢＳを加え、更に懸濁液を、超音波処理により３０秒間ホモジナイズした。細胞破片を低速度遠心分離により除き、そして上清を０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。物質を１時間５６℃で加熱して潜在的に残った感染力を不活性化し、そして使用まで−７０℃で保存した。ヒト脾臓細胞（８×１０⁷）を、５％の加熱不活性化ヒト血清及び２．５μｇｍｌのシメチジンを含んだＲＰＭＩ１６４０の５０ｍｌ中で培養した。（シメチジンの培地中への含有は、ジメチジンがＴサプレッサー細胞の活性を阻害し、そしてそれ故インビトロ免疫応答を誘発する助けとなるという科学文献の示唆に基づいて行った）。培養の３日後、細胞を遠心分離し、そしてＣＭＶ抗原を１：１００の最終濃度にて含む新鮮培地中に懸濁した（ウイルス抗原バッチＶＺ５４７）。抗原のこの濃度は、最初のスクリーニング実験において最適な刺激を与えると判っていた。ＣＭＶ抗原の存在下での培養の７日後、２×１０⁷細胞を収集し、そしてフソゲンとして５０％ＰＥＧ４０００を用いて同様の数のＳＰＡＺ− ４細胞と融合させた。融合した細胞（１０⁶細胞／ｍｌの濃度にて）を、実施例１の記載如く、同じ培地中にて、底が平らな９６ウェルの組織培養マイクロタイタープレート中に播いた。しかしながら、この場合、ＨＴのみを培地中に入れ、アミノプテリンは２４時間後に等容量の培地中に加えた。ハイブリドーマ様の形態を有したコロニーの成長が観察されたとき、上清を、実施例１の記載の如くＥＬＩＳＡ検定によりヒト免疫グロブリンについて検定した。次いで、陽性のウェルを、ミクロ中和検定にて、ＣＭＶに対する中和抗体についてテストした。このテストは、５０μｌの上清を、５０μｌの所定希釈度のウイルスと、３７℃にて１時間混合することにより行った。この温置後、２５μｌのテンジクネズミの補体の希釈液を加え、そして培養を３７℃にて２時間続けた。組織培養物で処理された、ＭＲＣ −５細胞の密集単一層を含む９６ウェルプレートから、細胞上に約５０μｌの培地を残して培地を吸引した。５０μｌのサンプル−ウイルス−補体混合物を細胞に加え、３７℃にて２時間温置した。その後、１００μｌの５％のＦＢＳを含むイーグル培地を加えた。安定な細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまで、引き続く２週間にわたって、結果を繰り返し倒立顕微鏡で記録した。このテストにて陽性の結果を示したハイブリドーマ培養物を採取し、そして限界希釈法により、９６ウェル組織培養プレートに上記と同じ培地中にてクローン化した。クローンが成長したとき、それらを再び、ＣＭＶを中和する抗体を産生する能力についてテストした。そして、陽性のクローンを更に増やし、液体窒素中に凍結した。この方法により得られた一つのハイブリドーマをＥＶ２−７と命名した。このハイブリドーマは抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９を産生する。このセルラインからの抗体は、その後、テストした研究室株Ｄａｖｉｓ及びＡＤ１６９、並びに８つの臨床ＣＭＶ単離物を中和することが示された。中和能力は、ウイルス貯蔵品の品質に大きく依存している（もしウイルス調製物が大量の非感染性ウイルスを含んでいれば、これは抗体を吸収しそしてより低い中和力価を与えるであろう）が、典型的には、抗体は１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する場合にウイルスを中和できる。抗体は、補体を用いた中和テストにより同定されたが、後の研究により、中和に補体が要求されないことが示された。ハイブリドーマ細胞は、５％の加熱不活性化（５６℃、３０分）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコのＭＥＭからなる培地中で、バルク培養にて、規則正しく成長する。長期間、より少ない血清で細胞を成長させることが試みられ、最終的には、血清を完全に除くことを試みた。多くのタイプの「無血清」培地が市場にあるが、このような製品は常に、添加された蛋白質、例えば、トランスフェリン、アルブミン及び成長因子例えばインシュリンを含む。このような培地は、血清含有培地に比べて制限された利点、特に精製に関する利点を提供するが、それらは、蛋白質性の原材料の確認テスト、及び蛋白質が最終製品から除かれていることを証明するテストを要求する。「無血清培地」は、ＦＢＳ含有培地に比べて、ほんの少しの（もし、あったとしても）コストの利点を有する。それ故、血清を除く努力のゴールは、他の蛋白質性の添加物で血清をおきかえることなしに血清を除くことである。細胞は、血清の濃度を減少した場合でさえ成長するが、血清濃度が１％未満の場合は、生存性及び生産性を維持できない。しかしながら、重要な解決策は、培地中で高濃度のＦｅ⁺⁺⁺を用いる方法であり、培地を、ダルベッコのＭＥＭとハムのＦ１２（この培地はまた１７．３ μｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムを含む）の１：１の混合物として作ることであった。どのようにして鉄添加物を添加するかが重要である：０．１Ｍ硝酸第二鉄及び０．２Ｍのクエン酸ナトリウムの保存溶液から、０．５ｍｌを培地の各１リットルに加え、５０μＭＦｅ⁺⁺⁺の最終添加濃度とする（基本培地は、約０．１２μＭのＦｅ⁺⁺⁺を含んでいる）。この高濃度の第二鉄イオンが、トランスフェリン−トランスフェリンリセプター機構により成長中の細胞に対して鉄を与えることの必要性を克服するようである。しかしながら、この培地中ですら、細胞はより低い血清レベルに適合するための時間を必要とする。しかし、最終的に、血清は完全に除くことができて、細胞はなお無制限な期間成長しうる。高細胞密度は増殖のための要求であると思われるので、血清の不存在下での細胞のクローン化は、まだ再現性良く可能ではない。上記した如く、抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９は、第一に、インビトロでのサトメガロウイルス活性を中和する能力に基づいて同定された。簡単な結合検定よりもこのような骨の折れる方法を用いる理由は、サイトメガロウイルスに感染した細胞溶解物へ強く結合する抗体は、主にカプシド蛋白質に対して向けられたものであり、全く中和活性を有しないという我々の経験からである。抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９は、サイトメガロウイルスに感染した細胞溶解物におけるＥＬＩＳＡテストにおいては、ほんの弱い活性を有する。このような結合研究に用いる抗原は、本質的に、抗原調製物が界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮＸ−１００）によって可溶化されることを除いては、上記した刺激抗原調製物と同じように調製される。抗原は、イムノプレートに吸着され、そして過剰の抗原を洗い流した後、抗体の希釈物がウェル中で温置される。洗浄後、結合した抗体は、ホースラディシュパーオキシダーゼと複合されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン試薬によって示される。抗体はまた、偽の感染した抗原調製物においてもテストされたが、このような系では完全に陰性であった。抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９によって認識される抗原の同定を試みた。用いた方法は、還元及び非還元条件下でのウエスタンブロット、放射性ラベルされた感染した細胞の免疫沈降及び連結された抗体とのカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを含む。我々は、³⁵Ｓ−メチオニンラベルされた、ＣＭＶに感染したＭＲＣ −５線維芽細胞の溶解物からの免疫沈降により８２，０００ダルトンの成分を同定することができた。この蛋白質は、既に記したＣＭＶのｇＨ糖蛋白質として同定されうる。抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９は、ＩｇＧ１、カッパタイプである。抗体がカッパタイプであることを示すために、上記した免疫グロブリン−ＥＬＩＳＡを少し改変して行った。つまり、ヒト免疫グロブリンに対する多価ホースラディシュパーオキシダーゼ複合ウサギ抗体を、カッパ鎖決定基をそれぞれ特異的に同定する試薬と置き換えた。このようなサブグループを区別できる非常に確かな試薬は、例えば、Ｔａｇｏ、Ｉｎｃ．、ブールリンガム、カリフォルニアから入手可能である。重鎖サブクラスの決定は、４つのヒトＩｇＧサブクラスの全てを同定するネズミモノクローナル抗体のパネルを用いて容易に達成される。用いた試薬は、ＩｇＧ１のためにはＪＤＣ１（サザンバイオテクノロジーアソシエーツ、ビルミンガム、アラバマ）、ＩｇＧ２のためにはＨＰ６００２及びＨＰ６０１４、ＩｇＧ３のためにはＨＰ６０４７及びＨＰ６０５０、ＩｇＧ４のためにはＨＯ６０２３及びＨＰ６０２５である（これらは全て、テキサス大学、ヘルスサイエンスセンター（ヒューストン）、ドクターロバートＧ．ハミルトンから入手）。同定は、ＳＤＺＭＳＬ１０９をイムノプレートに吸着し、抗サブクラスモノクローナル抗体の適当な希釈物と共に温置し、そしてヤギ抗マウスＩｇ試薬を用いて結合を検出することにより行う。このような実験設定において、ＳＤＺＭＳＬ１０９は、抗ＩｇＧ１試薬との強い反応を示したが、他のいずれとも反応しなかった。ＳＤＺＭＳＬ１０９の調製物は、ＩｇＧ以外のヒト免疫グロブリン重鎖クラス（ＩｇＭ）ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをテストした）又はλ−鎖決定基について敏感なＥＬＩＳＡテストでテストすると完全に陰性である。還元されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のパターンは、重鎖及び軽鎖が共に、高解像度の銀染色したゲルにおいて、狭い、均質なバンドとして現れることを示した。等電点電気泳動ゲルは、抗体調製物にいつも見られる微小不均一性を考慮すれば、均質な免疫グロブリン生成物と良く一致する４つのバンドを示した。このことは、親のミエローマセルラインの情報と一緒になって、このハイブリドーマセルラインが追加の軽鎖又は重鎖を同時に生産していないということの証明である。実施例３モノクローナル抗体の精製モノクローナル抗体ＳＤＺＭＳＬ１０９は、血清の不存在下でハイブリドーマセルラインから細胞培養物中で生産される。このことは、細胞性物質からの成分のみを最終製品から除く必要があることを意味している。ＳＤＺＭＳＬ１０９は、それ自身免疫原性であると予測さないヒトモノクローナル抗体であるので、全ての潜在的に免疫原性の成分を除くことが非常に重要となる。精製操作のゴールは、９９．９％を超える純度の最終製品である。反応器中の殆どの細胞が微小球によって保持されているけれども、割合多くの数の細胞が、回収された上清中に存在する。細胞成分による培地の著しい汚染を避けるために、上清を、回収タンクから取り出した直後にポリビニリデンジフルオリド０．６５μｍプロスタック／フィルター（ミリポア）を通して濾過した。このタイプのフィルター装置は、フィルターが詰まることなしに大量の粒状物質の濾過を可能とする接線流様式にて働く。澄んだ培地は、冷却されたステンレススチールタンク中に回収した。ならし培地を、ミリポアコーポレーションより市販されている公称３０，０００ダルトンのポリスルホンが螺旋状に巻かれた膜を用いて濃縮した。濃縮後、ｐＨを１Ｍの酢酸を用いて７．０に設定した。物質を、サルトブラン−ＰＨ０．８／０．２μｍ（ザルトリウス）フィルター（０．８μｍ成分がポリエステル、０．２μｍ成分が酢酸セルロース）を通して濾過滅菌し、その後４℃にて保存した。物質を、精密濾過し（０．２２μｍ、ミリポア）、そしてポリプロピレンの出荷容器中に充填した。精製段階は、スタヒロコッカスアウレウスのプロテインＡに対するヒトＩｇＧ１抗体の高親和性を利用した。プロテインＡは、既にアガロースにアミド結合により共有結合的に連結されたものを購入した。ゲルをカラムに充填後、カラムを、その内容物及び連結されたチューブとともに、７０％エタノール水溶液を用いて２４時間洗浄した（これは、１．０ＮＮａＯＨ洗浄に代えることができる）。次いで、カラムをＰＢＳ、ｐＨ７．０平衡化した。この処理は、プロテインＡ又はアガロース粒子に全くダメージを与えない。プロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー分離の実行は、以下の順次の工程を含む：Ａ／負荷．濃縮されたならし培地をポンプを用いてカラムに負荷した。カラムからの溶出液を集め、ヒト免疫グロブリンＥＬＩＳＡにより抗体の存在をモニターした。測定可能な量の抗体含有液がカラムを通過するような程度まで、カラムに負荷した。このことはカラム物質の最大利用を与える。過負荷した画分は別個に回収し、そしてそれが２０ｍｇ／ｍｌを超えるＳＤＺＭＳＬ１０９を含んでいる場合は再利用した。Ｂ／洗浄．未結合の物質を除くために、カラムを、塩化ナトリウムが０．５Ｍの最終濃度にて添加されたリン酸塩緩衝化食塩水、ｐＨ７でよく洗浄した。この洗浄に引き続き、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．６の緩衝液を用いて第二の洗浄を行った。この洗浄により、少量のヒト抗体が遊離する。Ｃ／溶出。結合したモノクローナル抗体を、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０からなる緩衝液を用いてカラムから溶出した。溶出された物質は、連続して、ある容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で希釈し、素早くほぼ中性条件に戻した。プロテインＡ精製は、以下の設備からなるウォーターズ６５０プロテインピュリフィケーションシステムを用いた閉鎖系で行う。システムは、ウォーターズ６００Ｅシステムコントローラーで制御される。ポンプ系は、８０ｍｌ／分までの流速をだせる２つの４００μｌポンプへッドからなる。吸収は、ウォーターズ４４０アブソーバンスディテクターを用いてモニターする。閾を有したＩＳＣＯモデル２１５０ピークセパレーターを、液流の分割のための６ポートの空気バルブを用いてピークを検出及び単離するために用いた。或いは、分離は、６００Ｅコントローラーによってコントロールされた時間に基づいたバルブ切り替えにより行われうる。ｐＨは、オンラインのプローブ及びＪＥＮＣＯモデル６０７１ｐＨメーターを用いてモニターされる。信号は、ｐＨメーター及び吸収ディテクターからＡＢＢＧｏｅｒｚモデルＳＥ１２０レコーダーに送られ、クロマトグラムとｐＨ変化が記録される。プロテインＡは、ファルマシアＢＰＧ１００／５００バイオプロセスカラム中に充填される。全ての緩衝液の交換、及び廃棄プールから洗浄プール及び溶出プールへの流出液の方向の向け直しは、ソレノイドバルブにより制御する。ゲルは、ゲルの上部に混合容量を全く設けることなしにカラムを用いることを可能とする、２つの調節可能なアダプター間に充填する。このことは、緩衝液の交換が、突然にそして異なった緩衝液間の混合が最少にて起こることを意味する。カラムの性能は、ＵＶモニターでカラムからの流出液を直接モニターすることによりモニターする。カラムは、ゲル１ｍｌ当たり少なくとも１０ｍｇのＳＤＺＭＳＬ１０９を結合できるはずである。次の精製工程を更に有効に且つ簡便にするために、プロテインＡカラムからの溶出液は、上記したのと同じタイプのＰｙｒｏｓａｒｔユニットを用いて少なくとも５ｍｇ／ｍｌのＳＤＺＭＳＬ１０９まで濃縮する。濃縮物を、０．２μＭのフィルター（ナルゲン又はコーニング）を通して濾過滅菌し、そして滅菌濃縮物を、次の精製工程に十分な物質が回収されるまで４℃にて保存する。抗体調製は、約１０リットルのベッド容量にて、ファルマシアＢＰ１１３／１２０カラムに充填されたセファクリルＳ−３００ハイレゾリューション（ファルマシア）ゲルを用いて行う。カラムは、ＬａｃｔａｔｅｄＲｉｎｇｅｒ’s ＩｒｒｉｇａｔｉｏｎＵＳＰ（トラベノールラボラトリーズ）中に充填する。カラムの溶出は、ウォーターズ６５０プロテインピュリフィケーションシステムによってモニターする。システムは、ｐＨメーターが無いことを除いてはプロテインＡピュリフィケーションシステムと同様の設備からなる。この工程の目的は、主として追加の精製ではなくて緩衝液の交換である。プロテインＡカラムの溶出後、抗体は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びトリス−ＨＣｌからなる複合した、高浸透圧の緩衝液中にある。この緩衝液混合物は、静脈注入のビヒクルとしては直接用いることができない。この工程後の緩衝液は、静脈内注入及び長期間の冷凍保存に共に適している。濃縮上清中に存在するＤＮＡの大半を除くプロテインＡクロマトグラフィー及びモノクローナル抗体製造物よりも著しく大きいか又は著しく小さいかのいずれかであるＤＮＡ分子を除くセファクリルＳ−３００ＨＲの後ですら、少量の、しかし検出可能な量のＤＮＡが抗体調製物中に存在する。我々は、この汚染を、強アニオン交換体；Ｑ−セファロース（ファルマシアインコーポレテッド）を用いたイオン交換工程により除くことを選択した。乳酸化リンゲル液のｐＨにて、抗体蛋白質は陽の電荷を持ち、そしてアニオン交換体と反発する。しかしながら、核酸は、このｐＨで負の電荷を持ちそしてカラムに結合する。カラムは、製品仕様書に従って充填した。ゲルが入れられている２０％のエタノール溶液をデカント後、１００ｍｌのゲルを２００ｍｌの乳酸化リンガル液中に懸濁した。スラリーを、ファルマシアＫ５０／３０カラム中に注ぎ、ゲルが自身で一定の容量まで充填されたとき、１カラム容量の０．５Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄し、引き続き３カラム容量のダルベッコＰＢＳで、そしてその後５カラム容量の乳酸化リンゲル液で洗った。使用の直前に、カラムを更に５カラム容量の乳酸化リンゲル溶液で洗浄した。次いで、サンプルをカラムに通し、そして通過した液を滅菌コンテナ中に集めた。この精製案は、例示のためにのみ記したものであり、本技術分野の熟練者に良く知られた多くの他の精製方法が代わりに用いられ得るということが理解できよう。実施例４ＳＤＺＭＳＬ１０９の分子分析ＳＤＺＭＳＬ１０９を、以下の標準法を用いて配列決定した。ＤＮＡの配列決定のために、標準方法論を用いて、ハイブリドーマｍＲＮＡから、ファージλＺＡＰ（ストラタジーンインコーポレーテッド）中にｃＤＮＡライブラリーを調製した。ｃＤＮＡライブラリーを、単離したヒトカッパ定常領域又はヒトＩｇＧ１定常領域をプローブとして用いてスクリーニングした。適当な大きさのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上のＢａｍＨＩ消化したｃＤＮＡから選択し、バクテリオファージラムダＥＭＢＬ４中にクローン化した。ファージプラークをそれぞれのプローブを用いてスクリーニングし、そして陽性のクローンをヌクレオチド配列決定のためにバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８中にクローン化した。配列決定は、マニアティスら（マニアティスＴ、フリチュＥ．Ｆ．とサムブロックＪ．、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）に従って行った。蛋白質配列を決定するために用いた方法：ＤＮＡ配列を遺伝暗号を用いて蛋白質配列に翻訳した。ＳＤＺＭＳＬ１０９のＶ_H及びＶ_L領域のＤＮＡ配列を、それぞれ以下に配列番号１及び配列番号２として示す。成熟Ｖ_H及びＶ_L領域のペプチド配列を、下に、それぞれ配列番号３及び配列番号４として示す。これらの配列及び他の発表された免疫グロブリン配列及びクローン化された免疫グロブリンエンコード配列を用いて、本質的に配列番号３よりなる可変領域を有する重鎖を含み、かつ本質的に配列番号４よりなる可変領域を有する軽鎖を含む広範囲の種々のヒト配列抗体。他の実施態様において、１〜数個のアミノ酸置換、欠失又は追加が、ＣＭＶ結合及び中和の特性が実質上保持されている限り、配列番号３及び／又は配列番号４に対して成されることができ、このような変化は通常、同類置換であり、そして好ましくは最少の配列変化である。実施例５ヒト治療効果平均年齢が４４歳で、ＣＭＶ網膜炎と診断されている１７人の男子ＡＩＤＳ患者を、ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体、ＳＤＺＭＳＬ１０９の薬物動態学及び抗体に対する寛容性を決定するための、抗体の実験的投与のために選択した。ＤＨＰＧ又はホスカネットを、ＣＭＶ網膜炎の最初の治療のために各患者に投与した。ＤＨＰＧ／ホスカネット治療開始の約２週間又はそれ以上の後に、ＳＤＺＭＳＬ１０９を、２週毎に、全１６週間（８回投与）、静脈内注入として各患者に投与した。各投与のＳＤＺＭＳＬ１０９の投与量は、投与当たり、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇの固定投与、８０ｍｇの固定投与のいずれかであり、各患者について一貫していた。全ての患者は、ＳＤＺＭＳＬ１０９の投与を受けている間は２週毎に、そしてその後の４週及び８週に眼科医により診察を受けた。各患者において、ＣＭＶ網膜炎の進行又は進行の阻止がモニターされた。ＳＤＺＭＳＬ１０９の投与に関して不利な反応は観察されず、全ての投与量レベルが良好に寛容であった。薬物動態学的研究は、投与摂生は、抗イディオタイプＥＬＩＳＡ検定により測定された如くＳＤＺＭＳＬ１０９濃度の投与量依存様式を生じるということを証明した。トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）レベルは、常に、ＥＤ₅₀（約０．５μｇ／ｍｌ）を超えた。いずれの患者も、ＳＤＺＭＳＬ１０９に対する検出可能な抗体応答を発現しなかった。患者群に対するＳＤＺＭＳＬ１０９の投与は、検出可能な網膜炎進行の再発（「ブレークスルー」）までの平均時間を２０２日とした（図１）。これは、進行がない状態（「阻止」）が、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：２１３（１９９２）で報告された、ガンシクロバー又はホスカネット単独での慣用の抗ウイルス治療による進行までの平均時間（即ち、ガンシクロバー治療の５６日、及びホスカネット治療の５９日）に比べて著しく延長している。理解の明確化のために、説明及び実施例により上記の発明を詳細に説明してきたけれども、ある種の変更又は修飾が添付の請求の範囲の範囲内において成されうるということは明らかである。配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：オステベルグ、ラルスＧ（ii）発明の名称：サイトメガロウイルスに対するヒトモノクローナル抗体（iii）配列の数：４（iv）通信住所：（Ａ）名あて人：タウンゼントアンドタウンゼントコーリーアンドクルー（Ｂ）ストリート：３７９リットンアベニュー（Ｃ）市：パロアルト（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国：アメリカ（Ｆ）郵便番号：９４３０１（ｖ）コンピューター読みとり可能形式（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ＃１．０、Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５（vi）現出願データ（Ａ）出願番号：米国０８／０８２，６２３（Ｂ）出願日：１９９３年６月２５日（Ｃ）分類：（vii）前出願データ（Ａ）出願番号：米国０８／０１０，２２８（Ｂ）出願日：１９９３年１月２８日（viii）代理人情報（Ａ）名前：スミス、ウィリアムＭ（Ｂ）登録番号：３０，２２３（Ｃ）ファイル参照番号：１１８２３−０５５−１（ix）電子通信情報（Ａ）電話：（４１５）３２６−２４００（Ｂ）テレファックス：（４１５）３２６−２４２２（２）配列ＩＤ番号１に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：３６９塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖特性：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（vi）起源：（Ａ）生物：ホモサピエンス（ix）性質：（Ａ）名前／キー：混成性質（ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ）（Ｂ）位置：１〜３６９（Ｃ）他の情報：／標準名＝「ＳＤＺＭＳＬ１０９のＶ−ｈ領域のヌクレオチド配列」（xi）配列記載：配列ＩＤ番号１：（２）配列ＩＤ番号２に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：３３９塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖特性：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（vi）起源：（Ａ）生物：ホモサピエンス（ix）性質：（Ａ）名前／キ−：混成性質（ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ）（Ｂ）位置：１〜３３９（Ｃ）他の情報：／標準名＝「ＳＤＺＭＳＬ１０９のＶ−１領域のヌクレオチド配列」（xi）配列記載：配列ＩＤ番号２：（２）配列ＩＤ番号３に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１２３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：線状（ii）分子タイプ：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物：ホモサピエンス（ix）性質：（Ａ）名前／キー：ペプチド（Ｂ）位置：１〜１２３（Ｃ）他の情報：／標準名＝「ＳＤＺＭＳＬ１０９のＶ−ｈ領域のペプチド配列」（xi）配列記載：配列ＩＤ番号３：（２）配列ＩＤ番号４に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１１３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：線状（ii）分子タイプ：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物：ホモサピエンス（ix）性質：（Ａ）名前／キー：ペプチド（Ｂ）位置：１〜１１３（Ｃ）他の情報：／標準名＝「ＳＤＺＭＳＬ１０９のＶ−ｌ領域のペプチド配列」（xi）配列記載：配列ＩＤ番号４：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ナドラー、ポールアメリカ合衆国、ニュージャージー州 07869、ランドルフ、ルックアウトロード 14

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト抗ＣＭＶ抗体の有効投与量を含む、ＣＭＶウイルス感染の治療のための薬剤組成物。２．ＣＭＶウイルス感染が網膜炎であり、かつヒト抗ＣＭＶ抗体が、配列番号３の可変領域配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖及び配列番号４の可変領域を含むヒト免疫グロブリン軽鎖を含む１組の重鎖−軽鎖ダイマーを含む請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。３．該ヒト抗ＣＭＶ抗体がＳＤＺＭＳＬ１０９である請求の範囲第１項又は第２項に記載の薬剤組成物。４．該ＳＤＺＭＳＬ１０９モノクローナル抗体がＥＶ２−７ハイブリドーマセルラインによって生産される請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物。５．ＳＤＺＭＳＬ１０９抗体及び、ホスカネット及びガンシクロバーからなる群より選ばれる抗ウイルス剤を含む請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物。６．有効投与量が約２０ｍｇ〜約８０ｍｇである請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物。７．有効投与量が約０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約５ｍｇ／ｋｇ患者体重である請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物。８．ヒト抗ＣＭＶ抗体がＣＭＶｇＨ糖蛋白質に結合する請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。９．ＣＭＶウイルス感染を有するヒト患者の治療方法において、該方法がヒト抗ＣＭＶモノクローナル抗体の有効投与量を投与する段階を含むことを特徴とする方法。１０．ＣＭＶウイルス感染が網膜炎であり、かつヒト抗ＣＭＶ抗体が、配列番号３の可変領域配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖及び配列番号４の可変領域を含むヒト免疫グロブリン軽鎖を含む１組の重鎖−軽鎖ダイマーを含む請求の範囲第９項に記載の方法。１１．該ヒト抗ＣＭＶ抗体がＳＤＺＭＳＬ１０９である請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．該ＳＤＺＭＳＬ１０９モノクローナル抗体がＥＶ２−７ハイブリドーマセルラインによって生産される請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．更にホスカネット及びガンシクロバーからなる群より選ばれる抗ウイルス剤を投与する段階を含む請求の範囲第９項又は１１項に記載の方法。１４．投与量が静脈内投与により複数回投与にて投与されかつ、個々の投与が約２０ｍｇ〜約８０ｍｇのＳＤＺＭＳＬ１０９抗体を含む請求の範囲第１１項に記載の方法。１５．投与量が静脈内投与により複数回投与にて投与されかつ、個々の投与が約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇのＳＤＺＭＳＬ１０９抗体を含む請求の範囲第１１項に記載の方法。１６．投与量が少なくとも１６週間、隔週で投与される請求の範囲第１４項に記載の方法。１７．投与量が１６週間、隔週で投与される請求の範囲第１５項に記載の方法。１８．ヒト抗ＣＭＶ抗体がＣＭＶｇＨ糖蛋白質に結合する請求の範囲第９項に記載の方法。１９．ＳＤＺＭＳＬ１０９ヒト抗ＣＭＶ抗体の約２０ｍｇの投与量〜約５ｍｇ／ｋｇの投与量を２週毎に１６週間、静脈内注入により投与することを含む、ガンシクロバー又はホスカネットの投与後のＡＩＤＳ患者のＣＭＶ網膜炎の進行のない期間を延長するための方法。２０．有効投与量のＳＤＺＭＳＬ１０９を静脈内注入により投与することを含むＣＭＶ網膜炎に罹った患者の治療方法。