JPH08506661A - 磁性粒子の特異的結合による検定の方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、測定方法および装置ならびにこれらに用いるアダプターに関する。本発明の方法では、固相において、容器から離れている粒子（８）の外部表面に結合されている分離試薬と、サンプルが反応し、そののち、移動器（３．２）を使用して容器から粒子が除去され、必要ならば１もしくは複数の中間段階用容器を経由して測定用容器に移される。少なくとも１つの容器は、この容器に粒子が入れられたばあいに、そこで行なわれる測定段階に必要な媒体を含む。本発明は、自動免疫測定システムでの使用にとくに適する。

Description

【発明の詳細な説明】 磁性粒子の特異的結合による検定の方法および手段 技術分野 本発明は、測定方法および装置ならびにこれらにもちいるアダプターに関する 。本発明はとくに自動免疫測定システム（system）に適する。 背景技術 固相免疫測定は、通常、１つの容器で行なわれ、そのため、サンプルに含まれ るであろう被測定分析物は、まず、固相に結合した分離試薬と反応し、さらに測 定に必要なそのほかの段階も同じ容器中で行なわれる。ここで厄介なことは、多 量の試薬投入と液体の除去が行なわれなければならないことである。いくつかの 異なる測定が行なわれるばあいには、異なる試薬を多量に貯蔵しておくことも必 要になる。 測定の各段階で使用される溶液が、あらかじめ各段階の容器に配置されている システムも知られている。その固相は、使い捨てのピペット噴出口（pippette j et）の内部表面により形成される。各段階で、ピペット噴出口が対応する容器に 導かれ、溶液は噴出口にくみ上げられて反応が起こり、そののち、噴出口を空と し、つぎの容器に移す。その段階の間、溶液は噴出口の中をいききする。装置は ポンプを備えた複数の吸い上げシリンダーを有し、その結果、複数の測定が平行 して行われる。この装置では精密な投入器は必要とされない。この装置はい かなる溶液貯蔵器もまた必要としない。しかしながら、この欠点は気相を通じて 、自動的に洗浄することのできない装置のシリンダーと、サンプルが連接するこ とである。これは、コンタミネーション（混入）の危険を引き起こしうる。また 、液体がピペットの噴出口に残留したままで、つぎの段階へ移動するであろう。 加えて、ピストンポンプは容易に予測できずに摩滅し、この理由によりこれらの ポンプの状態をしばしば点検する必要がある。もう１つの問題は、ピペット噴出 口と吸上げ用シリンダーとの密封である。考慮されるすべてのことを考えると、 この装置は多くの問題を引きおこしうる。そのうえ利用することのできる固相表 面領域は、ピペット噴出口の内部表面にのみ限定される。 発明の開示 請求の範囲第１項に規定される測定方法を発明した。その好都合な応用をその ほかの請求の範囲に示す。 ここで使用されるばあいには、分離試薬とは、被測定分析物と反応し、固相に おいて、その被測定分析物と結合するような物質を意味する。免疫測定において 、通常、分離試薬は抗原もしくは抗体である。ここで一般的に媒体（medium）と は、反応溶液もしくは洗浄液のような、ある測定段階で使用される溶液を意味す る。 本発明の方法において、反応容器から離れている（separate）固体粒子の外部 表面が、固相として使用され、そして、その測定段階は２もしくはそれより多く の容器中で行なわれる。粒子は、特定の移動器（remover）を用いて、一方の容 器からもう一方の容器 へと移される。粒子はサンプルを含む容器に保持され、分離反応が起こる。そし て、ほかに必要な段階が、別の容器で行なわれ、最後に粒子は測定用容器に移さ れる。測定に必要な媒体は、あらかじめ容器に投入されている。 粒子は、好ましくは磁性粒子であり、それにより移動器は、好ましくは移動器 と関連して移動可能な磁石を含有する。 複数の容器は好ましくは１つのユニット（unit）として形成される。しかしな がら、原則として、いくつかの段階、とくに形成された反応物の測定段階は、所 望により、容器のユニットの外部で行なうことが可能である。外部の測定用容器 は、複合体が固相から、たとえば蛍光測定法または放射測定法により、直接測定 されるばあいにとくに使用することができる。 それに対して、いくつかの段階、たとえば洗浄を同じ容器中で行なうこともで きる。媒体をある容器に投入しまたはそれから除去することもできる。精密な投 入を必要とすることなく、たとえば複数の異なる測定において同じ媒体が使用さ れるような段階では、おそらく別々の投入（separate dosing）を行うことがで きるであろう。とくに、洗浄はおそらくそのような段階である。しかしながら、 一般的に、すべての異なる媒体が異なる容器に準備されているような、容器のユ ニットはさらに好都合である。 少なくとも洗浄は、通常、測定段階の中間で行われる。加えて、えられた反応 複合体は、通常、測定段階で検出されるトレーサーと中間段階で結合する。トレ ーサ ーは直接検出できるもの、または特定の基質から検出可能な化合物を放出するも のでありうる。通常、検出は蛍光的、発光的、吸光的、放射線的に行われる。 本発明の方法では、サンプルがプレート容器から装置に引き込まれないために 、コンタミネーションの危険性はない。そのうえ、本発明の方法は、簡単できわ めて信頼性のある操作を行なう自動装置を用いて行なうことができる。 本発明は、たとえば、免疫学的測定、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションまたは ホルモン測定に適する。 移動器の表面は、液体が可能なかぎり完全に表面から流れ切るような形状であ ることが好ましい。また、移動器の下端に先端部があるものも好ましい。反応容 器の最下部は、可能な限り少量の媒体を用いるために、移動器と同じ形状になる よう好都合に設計される。 移動器から離れている固相粒子を使用することによって、きわめて大きな固相 表面積がえられる。もっとも好都合なものは、いわゆる微小粒子（microparticl e）である。磁石の助けにより、移動器に容易に付着させられる磁性粒子が好ま しくは使用される。 非磁性分離粒子を使用するばあいは、移動器には、たとえば、媒体から粒子を 分離するためのグリッド（grid）またはフィルターが提供される。 多量の輸送およびたとえば、必要な反応時間をも速めるために、反応中に媒体 を撹拌するのが好ましい。これは好ましくは移動器を動かすことによって行なわ れる。移動器を垂直方向に動かすことはとくに好都合であり、それにより媒体は 容器と移動器の間の間隙を流れなけれ ばならず、このような混合はきわめて効果的である。さらに効果的に混合するた めには、容器と移動器の間に適切な細さの間隙が形成されるように移動器を幅広 く作製する。容器および移動器の適切な設計により、撹拌も促進されうる。 容器のユニットは１つの測定に使用するためのプレートを形成する。移動器は そのプレート中のある容器に入れることができる。異なる段階において使用され る容器は、異なる大きさであってもよい。 容器は好ましくはフィルムで閉じられ、そのフィルムは、本発明の方法を実施 するにあたり穿孔される。フィルムは移動器を用いて穿孔されうるが、別の穿孔 用尖端を使用してもよい。その尖端は、制御された方法で破れる小片（strip） を形成する鋭利な刃を備えていてもよい。穿孔用尖端は、装置中の移動器と同一 の作動器に取付けられてもよい。容器の先端は、穿孔されたフィルムの小片がか かる（rest）ことができるような伸張部を好ましくは有する。閉じられた容器は 、耐久性を向上するために、不活性な気相を含んでいてもよい。 装置は、段階が始められる前に、容器中の媒体の存在を確認する安全装置シス テムを備えることもできる。電気導電率測定にもとづくそのようなシステムの表 示器として、移動器が都合よく作動してもよい。 所望により、とくにサンプルが入れられる反応容器に、ある適切な物質が容器 の壁もしくは容器から離れて残存している固相に固定されていてもよく、そのよ うな物質はのちの測定段階を妨害する可能性のある、サンプル由来、もしくは形 成された複合体に由来する物質を捕 捉する。 プレートの容器は、移動器をプレートの水平面の直線進路にそってのみ動かせ ばよいように、一直線に並ぶのが好ましい。異なる段階のための容器は、互いに どのような順序で位置していてもよい。容器は別の容器と永続的に固定されてい るのが好ましい。プレートは適切な材料、好ましくはプラスチックから作られる のがよい。 プレートは移動どめ（detent）を好都合に備え、装置はそれに対応する部分を 備えるために、間違いによりプレートが誤った場所に位置することはできない。 以下に例をあげ、本発明のいくつかの応用例について記載する。 記載した図中、図１は、本発明の方法の実施例で使用するための反応容器中に ある磁性粒子の移動器を示し、図２ａおよび２ｂは、磁性粒子と別の移動器を使 用した本発明の方法の実施例を示し、図３は、本発明の実施例で使用可能な１組 の装置を示し、図４は、より大きな容量（capacity）を有する別の１組の装置を 示し、図５は、本発明の方法の実施例に使用可能な反応容器中に位置する第３の 磁性粒子の移動器を示し、そして図６は、図５の移動器の平面図を示す。 図１に従って、直線状に位置するウェル２からなるプレート１および円筒状の シース４を備える移動器３を用いて、免疫測定が行なわれる。移動器３はその下 端に鋭利な尖端５を有し、下端部は錐体６として形成される。移動器はその上端 にロボット工学に好都合なハンドル７を有し、そこで移動器はその水平および、 垂直位置の正確な制御について把握されることができる。被測定分 析物と反応して複合体を形成する分離試薬で被覆された磁性粒子８も、ウェルは 含む。移動器は、磁石１０を備える可動ピン１１を収容する穴９を有する。 図１の磁石１０は、同一極が互いに反対向き（ＳＮ−ＮＳ）となるように、１ つの磁石がもう一方の上にある２つの磁石を有する。このように、磁石の接合点 に磁界の強い変化と、移動器３表面のこの点に粒子を引きよせるための好都合な 状態も作られる。対応して、２つの磁石の外側の磁界は垂直方向に弱くなり、そ れによって粒子は磁石上のその位置にのみ、さらにあつまりやすくなる。複数の 磁石が同様に、互いの後方に位置することも可能である。細い（narrow）構造が 求められるときに、これは好都合である。 被験サンプルは、必要ならば適切な希釈剤を含む、プレート１の第１のウェル ２にまず導入され、さらに所望の分離試薬で被覆した磁性粒子８と移動器３をウ ェル２に導入する。この段階で、ピン１１は上部の位置にあり、そのため粒子は ウェルの中を自由に動いている。それによりサンプルに含まれているであろう分 析物は、分離試薬と反応し、免疫複合体を形成する。反応の間、移動器はウェル の中を動き、混合を促進する。インキュベーションののち、磁石は下部の位置に 移動し、それにより粒子は移動器の表面に集まり、第２のウェルに移されること ができる。第２のウェルにおいて、たとえば、洗浄やトレーサー反応を行なうた めに、粒子は再び解放され、そののち、ふたたび集められて先へ進むことができ る。最後に、測定に要する計測を最終のウェルで行なう。 反応および洗浄の間、移動器３はウェル２の中を上下に動かされ、それによっ て、媒体は効率よく混合される。 プレート１は適切なプラスチック材料により作成されることができる。 測定の間に液体の移動は必要とされず、それによって安全で簡単かつ信頼性の あるシステムが構築できる。 カバー４の直径はウェル２の直径に合うよう選ばれ、そのためカバーを上下す るばあいに、カバーのまわりに効率のよい流れがえられる。粒子を分離するばあ いは、複数の上下への動きはウェルの中でカバーをして行われることが好ましい （たとえば、１０秒間に約２０回）。弱く付着した粒子は落ちるが、それらはお そらくのちによりよく付着するであろう。 図２ａと２ｂは、別のデザインの移動器を使用した本発明の方法の実施例を示 す。 プレート１の最初のウェル２は、被測定分析物用分離試薬で被覆されている磁 性粒子８および必要ならば希釈液を含む。 移動器３．１は、その頂部から始まる穴９をもっており、その穴は、その下端 に磁石を有するピン１１をうけとめることができる。移動器は、その下端にドロ ップ様（drop-like）の伸張部１２とその先端には鋭利な先点（cusp）５を備え る。加えて、下端に近い伸張部表面に、環状の凹部１３が備えられる。 サンプルは最初のウェル２に入れられ、そののち移動器３．１が、上部の位置 にピン１１を有して、ウェル２へと押し入れられる。移動器が動かされると、媒 体と 粒子８は効率よく混和し、懸濁液を作る。インキュベーション完了と同時に、ピ ンは押し下げられ、それによって磁石１０により引っぱられる伸張部１２表面に 粒子が集められ、凹部１３に密集した塊を形成する（図２ｂ参照）。それから、 移動器はつぎのウェルに移され、ピンは引き上げられ、それにより粒子は再び媒 体と混和する。粒子は、第１の洗浄液を含んでいる第２のウェル、第２の洗浄液 を含んでいる第３のウェル、そして免疫複合体に付着する酵素結合体を含んでい る第４のウェルに移される。トレーサーとのインキュベーションののち、酵素用 基質（ここから酵素は蛍光測定法により検出可能な混合物を放出する）を含む最 後のウェルで計測するために、移動器はさらに３つの反応および洗浄用のウェル を経由する。基質反応後、移動器はわきに動かされ、励起発光（exitation radi ation）と放出発光（emissionradiation）の両方がウェルの入口を通じて導き出 されるような方法で、蛍光測定が行われる。 測定では、光はウェルの壁を通じて導き出される必要はない。この理由により 、可能なかぎり安価な材料と可能なかぎり簡単な製造技法が使われてよい。バッ クグラウンドでの発光を減少するため、材料は不透明であることが好ましい。 発光による測定は同様の方法で行なうことができる。 反応結果が吸光光度測定法により測定されるばあいは、測定用容器が透明であ るか、測定用容器から検出器までの特別な準備（たとえば、光を反射する底面） により、発光がえられなければならない。 図３は、同時に１０の測定を行なうことが可能な１組 の装置を示す。 測定プレート１はカセット１４中に位置する。各プレートの最終のウェル方向 の端に、検討される測定について装置に知らせるコード１５がある。加えて、そ のコードはほかのデータ、とくに経過時間を与えるために用いてもよい。 コードのある末端が最初に開口部１６を通るようにプレートの長手方向に、カ セット１４は装置に押し込まれ、そこでカセットは自動的に動かされる。装置は 、コードを読み取るための同定器１８と反応結果を確定する（establish）ため の測定器１９を備えた、可動検出ヘッド１７を、プレートの横方向に有する。移 動器およびウェルを閉じているフィルムを穿孔するユニットなどが用いられたり 、磁石ピン移動ユニットが用いられるばあいは、すべてアーム２０に設置される 。装置は、所望の温度にプレートの温度を保つためのサーモスタット付ヒーター も有する。 各サンプルプレートのための移動器は、アーム２０に設置される。サンプルは カセット１４中のプレート１の最初のウェルに投入され、カセットは内側に押さ れる。それがそのいちばん端の位置まで動いたところで同定器１８はコード１５ を読み取り、それによってコントロールユニットは測定を行なうのに必要な情報 を受けとる。移動器が第１のウェルに降される。インキュベーション後、移動器 は持ち上げられ、プレートは１段階前へ進んで第２段階目が行なわれる。このよ うにして、プロセスは１つのウェルからつぎのウェルヘ進み、最後に最終のウェ ルで測定が行われる。各プレートでの測定結果はデ ィスプレイ２１に示される。 プレートにおいて利用可能なウェル数で測定が行なわれるならば、すべての測 定が異なっていてもよい。すベての測定において、すべてのウェルが必要とされ なくてもよく、その場合にはそれらのウェルはいずれの媒体をも含まない。 もちろん、検出ヘッドと移動器の両方が同じアームに取り付けられている装置 を使用することもできる。 図４は、同時に６つのカセットを取り扱うことのできる１組のモジュール方式 装置（modular set ofequipment）を示す。 この装置に用いられるプレート１において、コード１５は第１のウェル方向の 端に位置する。カセット１４はインキュベーター２２で予め暖められており、そ れらのコード末端が最初に供給開口部１６を通るように装置に押し込まれる。各 カセットに必要とされる移動器は、対応するプレートの決まった場所にあるアー ム２０位置する。 装置は１つの共通の検出ヘッド１７をもち、それは横方向へ動くことができ、 同定器１８と測定器１９を備える。同定器は各プレートのコード１５を読み取り 、カセットは内側へ動いてそのいちばん端の位置につき、そこでサンプルおよび おそらくは希釈液も、第１のウェルに投入される。点線２３は、投入器の動作進 路を示す。カセットは外側に移動して、第１のウェルは移動器のあるアーム２０ の下に位置し、第１段階が行われる。そして、最終のウェルが計測器のところに 達するまで、カセットは各段階ごとに内側に移動する。 図４は、装置における電源供給ユニット２４、制御ユニット２５、サンプル投 入用ポンプ２５、風乾（airing）および希釈ユニット２６ならびに尖端洗浄用ウ ェル２７の線図を示す。 図５のプレート１はフィルム２８により閉じられており、それは移動器３.２ により穿孔される。ウェル２の入口には、穿孔されたフィルムがかかる拡大部２ ９がある。プレートの頂部表面には、ウェルとウェルの間に間隙３０がある。そ れはウェルとウェルの間に存在していてもよい漏水点を示し、また、そのような 漏水点を通じて、あるウェルから別のウェルへ液体が移動するのを防ぐ。 移動器３．２中の孔は、下端に磁石１０を備える可動ピン１１を収容する。 移動器３．２はその下端に伸張部１２．２を有する。その下端部は鋭利な尖端 ５を有する錐体状である。このように、伸張部はフィルム２８を穿孔するために 使用することができるため、磁性粒子８は伸張部上のシースの中に保護される。 伸張部は効果的な撹拌用ピストンとしても機能する。ウェル２の最下部は、伸張 部に合わせ、鋭利な錐体状である。 伸張部１２．２にある縁３１は、液滴の付着を最小限にするため、鋭利である 。それに対応して、ウェル２の拡大部の下側の縁３２は、移動器３．２がウェル から除かれるとき、これから残留している液滴を除くため、下側に向って適切に じようご状にひらいている（flare）。 移動器３．２の上端には、ウェル２の中でシースを中心に容易に位置させる錐 体状の入口の伸張部３３が備え られる。ウェルの入口を閉じるためのプラグ３４は、入口の伸張部の上に位置す る。 伸張部１２．２上の移動器３．２の表面は垂直な隆起３５を備える。磁性粒子 ８はこれらの隆起の間の溝３６に位置し、移動のときは保護されている。その溝 の最下部は、液体への解離を促進するために適した平面に形成されている。保護 用の隆起はねじ山のようなもの（たとえば、２つの末端をもった１つのねじ山） であってもよい。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．被測定分析物を含むであろうサンプルが、容器に含まれる媒体中で、容器か ら離れている固相に結合している分析物用分離試薬と反応し、分析物−分離試薬 複合体を形成し、必要ならば１もしくは複数の中間段階が行われ、その結果、形 成されたいずれの複合体をも確定する測定方法であって、 該サンプルが固体粒子の外部表面の固相に結合した分離試薬と反応でき、 その反応後、該粒子が付着させられる移動器を用いて該粒子が容器から移さ れ、 必要ならば、１もしくは複数の中間段階用容器を経由して、該容器に含まれ る媒体中で中間段階を行い、そののち測定用容器に移され、 粒子が入れられ、そこで行われる測定段階に必要な媒体を含む少なくとも１ つの測定用容器で形成されたいずれの複合体もが検出されることを特徴とする測 定方法。 ２．前記粒子が磁性粒子であり、該粒子が好ましくは磁石を用いて移動器に付着 させられることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記媒体が少なくともある測定段階の容器中で撹拌されることを特徴とする 請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の方法。 ４．前記媒体が移動器を用いて、好ましくは移動器を垂直方向に動かすことによ って、撹拌されることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。 ５．１もしくは複数の測定段階、該段階から粒子がつぎの段階に移される、好ま しくは第１段階において、サンプルまたは形成されたいずれの複合体もが、容器 の壁または媒体に加えられ、容器中に残存する固相に結合した、のちの測定段階 を妨害するいずれの物質とも結合する物質と反応できることを特徴とする請求の 範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方法。 ６．容器から離れている固相に結合した分析物用分離試薬とサンプルを、容器に 含まれる媒体中で反応させることにより、分析物−分離試薬複合体を形成し、必 要ならば中間段階を行ない、そののち形成されたいずれの複合体をも確定するこ とによって、分析物を含んでいるであろうサンプルからの分析物を測定するため の装置であって、該装置が、 該装置に設置される反応容器（２）および外部表面で固相に分離試薬が結合 されている該反応容器のための粒子（８）、 形成されたいずれの複合体をも検出するための測定用容器および測定器、 媒体中で行われる中間段階のための１もしくは複数の容器、ならびに 容器から粒子を取り出し、それらを別の、測定段階で使用する媒体を含む少 なくとも１つの容器へ移すための移動器（３）およびその作動器 からなることを特徴とする装置。 ７．粒子が磁性粒子（８）であり、反応後に粒子を移動器に付着させるために、 磁石（１０）が移動器に連結されていることを特徴とする請求の範囲第６項記載 の 装置。 ８．移動器が移動器の内部を垂直に動くことができる磁性的把握手段（１１）か らなることを特徴とする請求の範囲第７項記載の装置。 ９．密集した塊として、粒子を移動器に付着させるため、移動器表面が輪郭どら れた領域（３６／１３）を有することを特徴とする請求の範囲第７項または第８ 項記載の装置。 10．液体の流れを促進するため、移動器の表面が本質的にどこででも下向きの斜 面であり、好ましくは、その最下部の尖端に鋭利な小瘤も備えられていることを 特徴とする請求の範囲第６項から第９項のいずれかに記載の装置。 11．容器中の媒体を撹拌するための撹拌器が備えられていることを特徴とする請 求の範囲第６項から第１０項のいずれかに記載の装置。 12．移動器（３．１／３．２）が撹拌器として機能することを特徴とする請求の 範囲第１１項記載の装置。 13．反応容器および少なくとももう１つの容器が測定に必要とされ、好ましくは 測定に必要なすべての容器が１つの容器ユニット（１）に連結されていることを 特徴とする請求の範囲第６項から第１２項のいずれかに記載の装置。 14．容器から離れている固相に結合した分析物用分離試薬とサンプルを、容器に 含まれる媒体中で反応させることにより、分析物−分離試薬複合体を形成し、必 要ならば中間段階を行ない、そののち形成されたいずれの複合体をも確定するこ とによって、分析物を含んで いるであろうサンプルからの分析物を測定するために使用する１組の手段であっ て、該１組の手段が 反応容器（２）および外部表面で固相に分離試薬が結合されている該反応容 器のための固体粒子（８）、 媒体中で行われる中間段階のための１もしくは複数の容器（２）または形成 されたいずれの複合体をも検出するための測定用容器および 容器から粒子を除去し、それらを別の、測定段階に必要な媒体を含む少なく とも１つの容器へ移動するための移動器（３）からなることを特徴とする１組の 手段。 15．容器が測定に必要なすべての媒体を含むことを特徴とする請求の範囲第１４ 項記載の１組の手段。 16．少なくとも１つの容器、好ましくはすべての容器が、穿孔可能なフィルム（ ２８）を用いて閉じられていることを特徴とする、請求の範囲１４項または第１ ５項記載の１組の手段。 17．少なくともある閉じられた容器が不活性な気相を含むことを特徴とする請求 の範囲第１６項記載の１組の手段。