JPH08506801A

JPH08506801A - Ｃｄ４４エキソン６に対応するペプチド、そのペプチドに特異的な抗体、および、腫瘍診断にそれらの抗体を使用する方法

Info

Publication number: JPH08506801A
Application number: JP6512889A
Authority: JP
Inventors: タリン，デヴィッド; 保広松村
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-22
Publication date: 1996-07-23
Also published as: WO1994012631A1; EP0672130A1; CA2149635A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍では、対応する正常組織に比較して、ＣＤ４４遺伝子の多数のスプライシングされた変異型が著しく過度に発現する。この観察は、体組織、体液、老廃物の試料を分析することによって腫瘍形成を診断する方法の基礎を成す。129塩基対から成る新規のエキソン６が、位置づけられ配列された。このエキソン６に特異的な抗体が調製されたので、ＣＤ４４タンパク質の検出と腫瘍のin vivo撮像および治療に使用するために適した新規の化合物の特許を請求する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、そのペプチドに特異的な抗体、および、腫瘍診断にそれらの抗体を使用する方法背景本発明は、ＣＤ４４遺伝子またはＣＤ４４遺伝子の一部の発現を用いて、腫瘍形成を検査することに関する。このような検査には、体組織、体液、その他の試料を患者から採取し、診断を行い、予後を定め、既に実行されている療法を評価することを含む。特に、本発明は、患者に苦痛を与えずに得ることができる体液試料またはその他の試料を用いて、腫瘍形成をルーチンとしてスクリーニングする単純な方法を提供する。現在、腫瘍を診断する通常の方法は、細胞または組織薄片を顕微鏡で観察することによって行われ、非常に効果的である場合が多いが、いくつかの顕著な制約がある。試料が小さい場合、診断が非常に困難になって、多数の細胞が利用できなくなるが、患者から大型の試料を得ることは望ましくなかったり、不可能であったりする。信頼できる診断を下すことができずじまいの例が５０％にも及び、明かに癌であるという証拠や、患者が実際に癌ではないという確信が持てない場合がある。確たる診断方法を下すには、患者に苦痛を与えるような検査が必要である。予後の判定は、顕微鏡下で検視された場合の細胞の外観に依存する。一般に、一次腫瘍の細胞が異様であるほど、転移の可能性が多くなるが、相関関係は決して完全ではない。何が最も効果的な処置であるかを判断するには、転移が起こる可能性があるか否かを正確に予知できることが有効であることは明かであろう。ヒトＣＤ４４遺伝子は、サイズの異なる種々のグリコシル化細胞表面タンパク質をコードし、それらの機能の多くは未だ十分に確証されていないが、ＣＤ４４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在によってそれと認識されるエピトープを共有する。ヒトＣＤ４４遺伝子は、造血細胞や他の多くの細胞タイプに発現される標準的な部分から成り、その中へさらにエキソンから成る生成物が種々に組み合わされてスプライシングされ、様々なタンパク質を生成することが知られている。これは、核生物においてはっきりと認められるメカニズムであり、機能上は関係のない場合が多い複数のタンパク質を同じ遺伝子から生成するためのもので、オルタナティヴスプライシングとして知られている。これまでに、広く知られる２つのＣＤ４４のイソ型、すなわち、ｉ）重クリコシル化された37kDの中心コアから成る90kD型と、ii）基部膜外ドメインに挿入された135個のアミノ酸を余分に有し、さらに重グリコシル化された180kD型が精製され特徴付けられている（Stamenkovic et al. 1989）。免疫細胞化学的試験と免疫沈降試験によって、多種多様な細胞および組織に90kD型と180kD型が広範囲に分布することがわかっている。90kD型は、循環白血球、骨髄細胞およびその他多数の細胞タイプに存在する造血型または標準型として知られている。180kD型は、上皮変異型として知られており、複数の上皮細胞タイプで検出することができる。両イソ型とも、同型接着相互作用および異型接着相互作用を仲介する受容体として機能し、細胞を相互にまたは隣接細胞外スカホールドに接着すると考えられる。以前、ある種のHermes-3モノクローナル抗体の存在によって認識されたＣＤ４４エピトープは、循環白血球が周辺リンパ節を認識し通り抜けすることを可能にする周辺リンパ節受容体を構成するものとして特定された。さらに、後にこの抗原に対するモノクローナル抗体が利用できるようになり、Stamenkovic et al.（ 1989）は、その一つを使用してＣＯＳ細胞の発現ライブラリーから取り出した標準型分子をコードするｃＤＮＡをクローニングした。彼らは、さらにノーザンブロット法によって、この遺伝子がリンパ系細胞だけではなく、種々の癌細胞系や代表的な固形癌腫によっても発現され、その中で２つのクローン癌腫が正常なクローン上皮に比べ多く発現するように思われた。 Birch et al.は、ヌードマウスの場合、Hermes-3抗体によって認識される80-9 0kD型のＣＤ４４抗原を強く発現するメラノーマ細胞クローンは、ＣＤ４４抗原を弱く発現するクローンよりも相当転移性が高いことを報告した（1991）。Sy e tal. は、ヌードマウスにおけるヒトリンパ腫細胞の転移能力は、上皮変異型をコードする構成体によってトランスフェクトされた後ではなく、ヒトリンパ腫細胞が標準型ＣＤ４４遺伝子によってトランスフェクトされた後に穏やかに高まることを述べた（1991）。Gunthert et al.は、ラットＣＤ４４抗原に刺激された新たな抗体によって認識されるリンパ腫帰巣受容体の変異型は、ラット膵臓腺癌細胞が転移行動するために必要であることを示唆する結果を得た（1991）。この抗体を使用して、彼らは、ＣＤ４４の変異型に対応するｃＤＮＡ配列をクローニングし、以前に確認されていないエキソンを含むことを発見した。転移細胞系に特有のｃＤＮＡ配列を過度に発現するよう設計された構成体によって同一細胞系由来の非転移性クローンをトランスフェクトすると、転移行動が誘発されると思われる（Gunthert et al.、1991）。上述の所見のため、種々の組織発生源から由来するその他の培養された転移性ヒト腫瘍細胞系および非転移性ヒト腫瘍細胞系は、ＣＤ４４生成物を特異的に発現させた。細胞または組織における遺伝子の発現は、遺伝子生成物に対応するｃＤＮＡ部分に優先してアニーリングさせるために選択された特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｃＤＮＡを細胞メッセンジャーＲＮＡから生成し当該の領域をポリメラーゼ連鎖反応によって拡大することによって最高の効率と感受性で研究することができる。しかし、この方法を用いたHofmann et al.および本出願人による後の研究では、ＣＤ４４の発現は、ヌードマウスの転移能力、あるいは、上述の細胞培養系の腫瘍形成能力でさえ、終始一貫として確実に相関するわけではないという結果を得た。このころ、３つのグループ（Hofmann et al. 、1991；Stamenkovic et al.、1991；Jackson et al.、1992）は、彼らが種々のヒト細胞系におけるこの遺伝子によって発現されることを発見した別のスプライス変異型に関する配列のデータを公表した。本発明本発明は、乳癌患者および結腸癌患者とその転移部分から採取した新鮮組織試料および新鮮体液試料におけるＣＤ４４遺伝子の種々の部分の発現を調査する試験結果から生ずる驚くべき発見に基づく。試験結果は、ＣＤ４４の発現について i）転移（悪性）腫瘍、ii）非転移性の局部侵入性腫瘍および良性腫瘍、iii）正常組織の間には、一目瞭然の差異があることを示した。グループi）とグループi i）の差異は、療法の適否判断に重要であり、グループii）とグループiii）の差異は、初期の診断とスクリーニングに重要である。本発明の一部は、1993年７月20日に提出された発明者らの国際特許出願PCT/GB 93/01520の対象であり、ひとつの態様として、腫瘍形成診断方法を提供し、その方法は試料中のＣＤ４４遺伝子発現の分析から成る。さらにひとつの態様として、上述の出願は、ＣＤ４４遺伝子またはその一部から成る生成物について試料を検定する方法を提供し、この検定方法は、ｃＤＮＡを試料中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から生成し、ＣＤ４４遺伝子またはその一部に対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）部分を増幅させ、増幅されたｃＤＮＡの検出から成り、増幅されたｃＤＮＡを腫瘍形成診断に使用することを特徴とする。腫瘍形成の診断は、腫瘍組織の初期検出にほかならないとも言えれば、また転移腫瘍と非転移腫瘍を識別するステップであるとも言える。従って、本出願で使用される用語「診断」については、理解できよう。この方法は、特に固形腫瘍、特に、具体的には癌などの悪性腫瘍の診断に利用できる。検定が実行される試料は、体組織または体液であり、in vitro培養細胞ではないことが好ましい。試料は、固形腫瘍から採った組織の小片または細胞の微細針状吸引物（ＦＮＡ）で良い。あるいは、血液、尿またはその他の体液から成る試料や、頚管掻爬や、痰、尿または便など患者に苦痛を与えずに得られた試料でも良い。ｃＤＮＡは、標識付けされた特異的オリゴヌクレオチドプローブを一つ以上使用することによって検出され、その際、このプローブは増幅されたｃＤＮＡ配列の一部にアニーリングさせるように選択される。あるいは、標識付けされたオリゴヌクレオチドプライマーおよびモノヌクレオチドまたはその一方を用いることもできよう。放射性標識など、使用できる適切な検出可能な標識は多数ある。次に添付の図面について説明する。図１から図５までは、以下に報告される種々の実験結果を示すオートラジオグラフである。図６は、エキソン、プローブおよびプライマーを示すＣＤ４４遺伝子のマップである。エキソンの番号はG・R・Screaton et al.のつけたものと一致する。図７は、図６に示されるエキソン６の核酸配列と、それに対応するアミノ酸配列を示す図である。図８は、別の実験結果を示す一連のオートラジオグラフである。図９は、HIV2（gp32）−ＣＤ４４エキソン６融合遺伝子のＤＮＡ配列を示す図である。図１０は、HIV2（gp32）−ＣＤ４４エキソン６融合抗原のタンパク質配列を示す図である。図６は、エキソン６−１４を示すＣＤ４４遺伝子のマップである。理論的には、塩基性タンパク質すなわち標準タンパク質は、これらの９つの特別なエキソンのいずれか１つ、複数またはすべてに由来する転写物の挿入によって修飾することができる。エキソン６は、本特許出願の優先日には未知であったが、本発明に係る別の態様を構成するものである。エキソン６は、腫瘍において過度に発現されるが、正常組織においては発現されず、エキソン７−９付近に位置する。エキソン６の配列は、図７に示されている。この配列は、129の塩基対を含み、標準ＣＤ４４配列はこの配列の5'側にあり、エキソン７は常に3'側にある。エキソン９−１１とは対照的に、エキソン６から成る生成物（新たに配列されたエキソン）は、正常組織の試料ではほとんど検出できない。これは、エキソン６が腫瘍形成の診断において無類の価値があることを示唆する。別の態様では、本発明は、新規の化合物として、図７に示すようなエキソン６の核酸配列、その標徴フラグメント、縮重された配列および対立遺伝子変異を示す配列またはその一方、相同核酸配列、プローブ、プライマーおよびそれらの配列および相同体を用いてハイブリッド形成することができるその他の試薬を提供する。これらの化合物および試薬は、すべて、上述の方法においても有用であろう。本発明によれば、図７に示されるようなＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド配列、対立遺伝子変異、その二次修飾体、その標徴フラグメントを使用し、in vitro診断とin vivo診断に有用な抗体を生成することができる。上記の抗体は、図７に示されるＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、二次修飾体およびその標徴フラグメントに対応するペプチドに特異的であり、すなわち、このような抗体はこのペプチドに結合し、その他関連するＣＤ４４タンパク質やその他のタンパク質に対する交又感受が低い。上記の抗体は、モノクローナル抗体かポリクローナル抗体である。この抗体は、単数の抗原として図７に示されるＣＤ４４エキソン６に対応する完全なペプチド配列を使用することによって、また、複数の抗原として、好ましくはＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド配列の部分をコード化する最低の長さである６個のアミノ酸から成る短いペプチドを使用することにによって生成することができる。抗原として使用されるペプチドは、当業者に知られている方法によって、組換えてまたは化学的に生成することができる。例えば、本発明によるペプチド抗原は、Merryfield，JACS 85（1964），2146に従って合成することができる。免疫原合成の場合、これらのペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体分子に結合することができる。ビオチン化が必要な場合、これは、PNAS U SA 80（1983），4045などに従って実行することができる。ＣＤ４４エキソン６またはその対立変異型に対応するペプチドを原核宿主に発現させるには、ＣＤ４４エキソン６の融合遺伝子または原核宿主における発現レベルが高い遺伝子を持つ対立遺伝子変異を用意することが好ましい。例えば、HI V2のタンパク質gp32をコード化する遺伝子の一部は、大腸菌（E.Coli）に適切である。それによって、エキソン６またはその対立遺伝子変異に準じてペプチド配列を一部として有する融合タンパク質が得られる。融合遺伝子のＣＤ４４エキソン６遺伝子を複製するなどして、融合タンパク質などのＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドエピトープ数を増加させることも好ましい。ＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、その二次修飾体、標徴フラグメントに対応するペプチド配列に対抗するポリクローナル抗体は、適切な実験動物に効果的な量のペプチドまたは抗原成分を注射し、その動物から血清を採取し、既知の特異抗体吸着体技術によって特異抗原を単離することによって、調製される。この方法によって生成されるポリクローナル抗体は、免疫検定のいずれにも使用することができるが、一般には不均質になることがあるので、あまり好ましくはない。 in vitro診断テストにモノクローナル抗体を使用することは、大量の抗体すべてが同様の特異性を持つように生成することがてきるので、特に好ましい。モノクローナル抗体生成のためのハイブリドーマ細胞系の調製は、不死化された細胞系と抗体産生リンパ球を融合することによって行われる。これは、当業者によって知られる既知の技術によって行われる（Harlow，E．and Lane，D.，Antibodie s：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Press 1988，Bessler et al．I mmnobiol．170（1985），239-244，Jung et al.，Angew．Chimie 97（1985），8 83やCianfriglia et al，Hybridoma Vol.2，（1983），451-457などを参照のこと）。図７に示されるＣＤ４４エキソン６の発現産物または標徴エピトープなどのそのフラグメントに対抗する産生モノクローナル抗体である以下のハイブリドーマ細胞系は、ＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，D-3300 Braunschweig，Federal Republic of Germ anyにおけるブダペスト条約に基づき1993年11月16日に寄託された。 MAK〈CD44〉M-1.1.12 MAK〈CD44〉M-2.42.3 MAK〈CD44〉M-4.3.16 MAK〈CD44〉M-1.1.12については、アミノ酸9-23に対応する合成ペプチドを、M AK〈CD44〉M-2.42.3についてはアミノ酸29-43に対応する合成ペプチドを、MAK〈 CD44〉M-4.3.16については図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６のアミノ酸1-13に対応する合成ペプチドを使用した。細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.1 2によって生成される抗体は、肺腫瘍、結腸腫瘍、膀胱腫瘍と、免疫組織化学によって検出された細胞系ZR75-1（ヒト乳癌種−−ATCC CRL 1500）の細胞に特異性を示す。特異的反応と表現したのは、強い反応が腫瘍組織を用いて観察されるが、正常組織では弱い反応しか示さないということである。同じ系統では、MAK 〈CD44〉M-4.3.16によって生成される抗体が、結腸腫瘍の組織およびZR75-1細胞に特異性を示す。ＣＤ４４タンパク質または試料におけるＣＤ４４エキソン６に準ずるペプチド配列の存在は、免疫検定のタイプを問わず実質的にはモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかの上述のように調整された抗体を使用して検出することができる。さまざまな免疫検定技術が、Harlow et al.の参考文献（Antibodies: A Laboratory Mamual，Cold Spring Harbour Press 1988）に見られるように利用できる。これには、当然、非競合的なタイプの単一点検定、二点検定、「サンドイッチ」法や、競合的な結合測定法などを含む。サンドイッチ法は、その中で最も有用で一般に使用されている検定方法である。多数のサンドイッチ法の変種が存在し、そのすべてが本発明によって含まれるように意図されている。上述の検定の例には、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ＦＰＩＡやエレクトロケミルミネッセンスなどの免疫蛍光検定、金ゾル粒子などの色素粒子などの直接標識を用いる免疫検定、ＣＥＤＩＡあるいはＥＭＩＴなどの均質検定、ラテックス粒子凝集検定のような濁度測定法、比濁測定法がある。サンドイッチ法では、本発明に係る２つの抗体を使用することができる。この場合、この２つの抗体は、ＣＤ４４エキソン６に応じたペプチド配列の異なるエピトープまたは部位に結合しなければならない。これら２つの抗体は、例えば、異なる２つの合成ペプチドをＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドの異なる標徴フラグメントに対応する免疫原として使用することによって、調製することができよう。サンドイッチ法では、本発明に係る抗体一つだけを用いることもできる。もうひとつの抗体は、別のＣＤ４４エキソンに対応する別のペプチドまたはＣＤ４４の標準型に対応する別のペプチドに対する抗体であっても良い。このような抗体は在来技術の中にあることが知られている。例えば、尿、全血、子宮頚部スミア、便や、試料としての生検用体組織、痰細胞などを使用することができる。多くの場合、ＣＤ４４タンパク質は、天然の形態で検出することができる。好ましくは、ＣＤ４４タンパク質は、本発明に係る抗体には線状エピトープまたはその天然の形態でＣＤ４４分子内に隠ぺいされているエピトープに好んで結合するものがあるので、検出の前または間に変性させることが好ましい。変性方法としては、デタージェントまたはカオトロピック剤を用いる処置など当業者に知られている方法が適切である。ある場合には、ＣＤ４４分子が固相に吸着することによって、抗体の結合に十分な部分的な変性が起こる。ＣＤ４４タンパク質は、ほとんどの細胞タイプで発現されるが、本発明に係る抗体を使用した場合、腫瘍組織と正常組織の識別が多くの場合に可能であることが認められた。従って、この抗体を癌診断に使用することができる。抗体は、結腸組織、膀胱組織または肺組織の癌診断に使用することが好ましい。例えば、ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12から得られた抗体を用いた場合、強い反応が、結腸癌組織、膀胱癌組織、肺癌組織を用いた免疫組織化学的方法に観察されるが、これに対し、前記の部位から採られた正常細胞組織は、かすかに反応するだけである。本発明に係る抗体を、Wong et al，Arch．Surg．125（1990），187-191に従った方法などの免疫複合体分析に使用することもできる。このため、ＣＤ４４タンパク質またはその標徴部分および自己抗体の腫瘍関連免疫複合体の検出が可能である。本発明に係るペプチド抗原は、ＣＤ４４定量法のための免疫テストに標準化合物として使用することもできる。従って、本発明は、さらに、本発明に係るペプチド抗原をＣＤ４４を定量するための免疫テストにおける基準として使用することに関する。ある場合、凝集テストなどでは、配列の異同を問わず本発明に係る複数のペプチドを担体分子に結合させるためのは好都合である。本発明に係るペプチドは、競合的な免疫検定において本発明に係る抗体に対する結合相手として使用することもできる。この場合、ペプチドは標識付けされ、当業者に知られる方法によって直接もしくは間接に（ストレプト）アビジン／バイオチンなどの特異的結合相手を介し固相に結合される。本発明のもう一つの態様は、緩衝剤、デタージェント、安定剤、固相などの免疫検定に必要なその他の化合物がある中で、図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、その二次修飾体、その標徴フラグメントに対応するペプチドに対抗すべく意図された抗体を少なくとも１つ含むテストキットである。必要に応じて、本発明に係るペプチド抗原を標準として含むこともできる。さらに別の態様では、本発明は、腫瘍の療法およびin vivo撮像のための手段を提供する。この手段に有用な薬剤は、現在の技術水準で製造することができる。悪性疾患患者から得られた試料のＣＤ４４遺伝子の種々の部分の発現を調査する試験から得られたデータは、驚いたことに、ＣＤ４４の可変部のエキソン６を相当過度に発現することを示している。正常組織と比較して悪性腫瘍にエキソン６を含むＣＤ４４スプライス変異型が相対的に多量であり、正常組織と比較して腫瘍細胞の表面上でエキソン６によってコード化されたペプチド配列を含むＣＤ４４タンパク質が増加することによって、治療、in vivo診断、in vitro診断、in vivo撮像のための腫瘍特異抗原としてエキソン６によるコード化されたペプチド配列を使用する道が開ける。好ましくは、モノクローナル抗体（Kohler and Milstein（1975），Nature 15 6,495-497）またはその誘導体を診断または治療の目的で使用する。本発明では、ＣＤ４４のエキソン６によってコード化されたエピトープに対抗するモノクローナル抗体が提供される。さらに、これらの抗体が腫瘍細胞に選択的に結合することを示すデータが提示される。本発明に係る抗体は、図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、燐酸化生成物、グリコシル化生成物およびその標徴フラグメントに対応するペプチドを認識する。このような抗体は、その他のＣＤ４４エキソンに対応するその他のペプチドの存在下においても、ＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドに特異的である。治療の目的上、この特異性は本発明に係る抗体が、エキソン６によってコード化されるタンパク質以外のタンパク質にはわずかしか結合しないだけに決定的である。この非特異的な結合は、本発明に係る抗体が腫瘍治療またはin vivo診断に使用される場合に、大きな損傷が健康な細胞に生じない程度にとどめなければならない。抗体は、適切な方法でエキソン６タンパク質に結合している限りは、全体として抗体そのもの、そのフラグメント（Ｆｖ、（Ｆｖ）₂、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂など）、キメラ抗体、ヒューマナイズド抗体またはキメラヒト型抗体を使用することができる。エキソン６ペプチドを特異的に結合するＣＤＲ領域またはその部分しか含まない短連鎖フラグメントも、特に、抗体が標識付けされたものである場合に、適切である。本文では、抗体をそのまま悪性疾患の療法に使用する（Hale et al.，Lancet2 （1988）1394-1399; Cobbold et al.，Prog．Clin．Biol．Res.（1990）333,139 -151）。別の方法では、抗体またはその一部を、毒素分子（immunotoxin）に接合または翻訳融合するため、腫瘍細胞の特異的な死滅がもたらされる（Brinkman n et al．1991，Proc Natl．Acad．Sci．USA 88，8616-8620; Pastan et al.（199 1），Cancer Res.51，3781-3787; FitzGerald and Pastan（1989），J．Natl．C ancer Inst．81，1455-1461）。本発明に係る好ましい実施例では、ポリペプチド鎖のin vitro再結合、ハイブリッドハイブリドーマ生成またはdiabodyの構成によって（Holliger et al.（1993），Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，6444-6 448; Holliger and Winter（1993），Current Opin．Biotechnol．4，446-449）、構成することができる二重特異性抗体を腫瘍治療に使用する（Bonino et al（ 1992），BFE 9，719-723）。さらに、放射性物質または蛍光性物質に結合された抗体は、呼吸器系、胃腸系、尿性器の癌腫や、眼球癌、皮膚癌などの腫瘍の検出および治療に好ましい（Pr ofio（1988），Proc．Soc．Photoopt．Instr．Eng．907，150-156; Jiang et al ．（1991），J．Natl．Cancer Inst．83，1218-1225）。免疫応答を阻止するために、ヒト由来の抗体に可及的に近似する抗体を使用することが好ましい（Glaasy and Dillman（1988），Mol．Biother．1，7-13）。例えば、このような抗体は、キメラ抗体、ヒューマナイズド（ＣＤＲ移植）抗体である。このような抗体は通常、げっ歯類のモノクローナル抗体から作られている（Morrison（1992），Annu．Rev．Immunol．10，239-265; Winter and Milste in（1991），Nature 349，293-299などを参照）。本発明に係る具体的に好ましい実施例では、腫瘍特異性ヒト型抗体（Borrebaeck et al.（1988），Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 85，3995-3999; Borrebaeck（1988），Immunol．Today 9，3 55-359）が治療目的で使用される。さらに、ヒトＭａｂｓを、Griffithらによる EMBO J．12（1993）725-734などに記載されているように、ファージ表示ライブラリによって調製することが特に好ましい。治療の目的上、エフエクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を提供する抗体を使用することが特に好ましい（Bruggemann et al.，J．Exp．Med．166（1987）1357- 1361）。特に好ましくは、ヒト同位体IgG 1抗体を使用する。免疫毒素に関しては、本発明に係る抗体をシュードモナス外毒素、ジフテリア毒素や、その他の毒素に結合することが好ましい（FitzGerald and Pastan（198 9））。抗体をドキソルビシンなどの化学療法剤や、細胞障害効果を有する放射性標識物質に結合することも好ましい。放射性物質または蛍光性物質を用いるなどしてin vivo撮像する場合、特に、ヒトの抗体においては、本発明に係る抗体の接合体も好ましい。本発明の治療用化合物は、既知の薬学的技術を用いて、脈管内、腹腔内、皮下、筋内などに非経口投与することができる。本発明に係る活性薬剤成分は、液状、粉末状、凍結乾燥状の形態で使用され、水、生理食塩水、水溶性デキストロース、水溶性緩衝剤などの希釈剤や担体と組み合わせることができる。保存薬も添加することができる。選択された投与経路のいかんに関わらず、本発明に係る化合物は、当業者らに知られる従来の薬学的に許容できる剤形に構成される。この化合物は、薬学的に許容できる酸添加塩または塩基添加塩を用いて形成することもできる。さらに、化合物またはその塩は、適切に水酸化させた形態にして使用することもできる。選択された投与経路のいかんに関わらず、本発明に係る毒性がないが治療的に効果的な量の一つ以上の化合物をいかなる治療にも使用することができる。治療用の投薬方法は、体型、年齢、体重、性別、患者の医学的状態、腫瘍タイプ、投与経路、治療に使用された特定の化合物などの種々の因子に従って選択される。一般的な水準の医師ならば、既知の抗体治療方法の際に必要な効果的な薬剤量をを即座に決定し処方することができる（Hale（1988），Cobbold（1990））。そのような処置では、医師は初め相対的に低量の投薬をし、後に、最大の反応が得られるまで増量する。腫瘍におけるＣＤ４４遺伝子の多数のスプライシングされた変異型が無秩序に過発現するということは、特定のエキソンが特定の細胞試料によって過発現されたり、過発現されなかったり、全く発現されなかったりするということである。従って、どのようなエキソンによってでも発現されるペプチドに対する抗体を使用する免疫検定は、間違った結果を導くこともある。従って、本発明は、腫瘍形成の免疫学的診断のため、２つ以上のＣＤ４４エキソン好ましくは、９つすべてのエキソンに対する抗体を混合使用する方法を含む。以下の例では、ヒトＣＤ４４遺伝子の発現が、正常な体組織と比較すると、種々の固形腫瘍において、一貫して弁別的に増加することが認められた。悪性（すなわちすでに転移している）腫瘍は、局所侵入性腫瘍や良性の腫瘍とは、観察される変化のパターンおよび大きさにおいて異なる。試験は、46のの腫瘍から得られた試料について行われ、そのうち、44の腫瘍が局所侵入性、あるいは転移性であり、２つの腫瘍が良性であった。ＣＤ４４の発現に関する分析は、ＰＣＲを用いて新鮮な外科的生検試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって作成されたｃＤＮＡを増幅することによって行われた。特異的にＣＤ４４の遺伝子のいくつかの部分をアニーリングさせるオリゴヌクレオチドプライマーを選択すると、上述の結果から、診断および予後の上で重要な意味を持つＣＤ４４遺伝子部分を増幅することができる。今述べたような修飾ＣＤ４４の発現と腫瘍形成の間の強い関連を見たからといって、遺伝子の個々のエキソンのいずれもが腫瘍形成時または転移性腫瘍に進行する際にのみ発現されることを示していると考える必要はない。近年、多くの実験室で得られた証拠（Knudson 1985，Tarin 1992，Hayle et al 1992などを参照）は、これらの異常プロセスは細胞増殖および移動などの正常な細胞活動をコードする遺伝子の調節が妨げられた結果であろうと示唆する。従って、どのような遺伝子または遺伝子部分でも、腫瘍形成または転移をプログラムするだけしか機能を持ってないとは思われない。正常組織のエキソン10/11から得られた転写物の本試験の所見は、転移能力がある腫瘍からのＰＣＲ生成物において放射性標識付けされたプローブＥ４をハイブリッド形成するバンドの数およびシグナル強度が著しく増加した場合でも、このエキソンが転移行動にのみ関与しているわけではないことを示唆する。従って、別の裏付けとなる現象が、ＣＤ４４エキソン10/11が発現して転移活動が行われると考えるためには必要であると考えられる。それにも関わらず、このエキソンから得られた転写物が転移性腫瘍から得られた試料において過度に発現したとの観察結果は、予後判断の非常に有用な指標として有望である。さらに調査しても、個々のエキソンのいずれかからの天然の（非突然変異の）生成物が、腫瘍細胞にだけユニークに存在し、正常な細胞には存在しないことが発見されるとは思われない。それどころか、ＣＤ４４遺伝子座に関して今に報告されたように、過発現と遺伝子の産物の不適切な組み合わせから成る遺伝子活動の異常パターンが、悪性化に関与すると思われる。これらの変化自体が悪性変換のために必要なのかもしれないし、またこのような変換を生じるその他の遺伝的障害の結果なのかもしれない。たとえそうであるとしても、この問題を解決せずともこれらの技術を使用する観察者は、腫瘍形成範ちゅうのものなのか、それとも非腫瘍形成範ちゅうのものなのか、試料を振り分ける方法に関して情報を得ることができる。例方法直径0.5-1cmの新鮮な組織試料を乳癌および結腸癌の患者34名から治療時に除去された外科的切除標本から得た。試料は、病理学的標本受入場所に到着後10分以内に液体窒素で急速冷凍して、使用するまで液体窒素に保存した。診断用に切除された組織にリンパ節転移巣および血行性転移巣があれば、その一部も収集した。正常な胸部組織、正常な結腸粘膜、胸の腫瘍に隣接する正常なリンパ節、正常な肝臓も外科的に切除された標本やその他の非腫瘍形成状態との比較のために切除された標本から収集された。正常の末梢血白血球を、10名の志願者から得て、骨髄を３名の志願者から得た。腫瘍およびその臨床段階の組織学的特徴は、表１に記載した。組織試料からの細胞性ＲＮＡの抽出は全て、ChomizynskiおよびSacci（1987）によって記載された方法に従って行われた。液体試料からの抽出は、Invitrogen によって市販されているMicrofasttrackキットを使用した。ｃＤＮＡ合成およびその後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は、このキットに供給される緩衝剤および試薬を用いてSuperscript^TM前増幅装置（BRL Life Technologies Inc.，Middlesex，UK）を使用して行われた。すなわち、これは、テンプレートおよび供給されたヌクレオチドトリホスフェートとしてＲＮＡ試料を使い、逆転転写酵素を用いて行う一次鎖ｃＤＮＡ合成の最初のステップに関係する。後のＰＣＲの場合、各試料は、油を薄く塗って、５分間94℃で加熱し、核酸を変性させ、ＰＣＲの30サイクルを、以下のサイクルパラメータで行った。すなわち、94℃ で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間で行った。反応混合物にテンプレートｃＤＮＡが存在しない負の遺伝子制御を各バッチに対し型通りに実施した。ヒトＣＤ４４ｃＤＮＡに関して公表された配列情報（Hofmann et al，1991，Stamenkovic et al，1991，Jackson et al，1992）（図６）を用いて発明者らが考案したプライマーおよびプローブ配列は以下の通りであった。 P1＝5'GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC P4＝5'GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT Ｐ１は（1989年にStamenkovic et al.によって公表された配列のヌクレオチド 782および783の間の）標準ＣＤ４４分子の挿入部位から324bp上流に起点を置き、Ｐ４はこの部位から158bp下流に起点を置く。試料が標準ＣＤ４４（いわゆる造血ＣＤ４４）を発現する場合は、これらのプライマーは、482bpのＰＣＲフラグメントを生成し、試料が選択的にスプライシングされた転写物を含む場合には、ＣＤ４４およびその他のバンドの上皮形態に関しては878bpのＰＣＲフラグメントを生成する。10μlの各ＰＣＲ生成物は、1.2%の寒天ゲル中で電気泳動され、Hybond N⁺（Amersham UK，Little Chalfont，UK）ナイロン膜に移され、オリゴヌクレオチド・プローブＥ４（＝5'TGAGATTGGGTTGAAGAAATC-3'）をハイブリッド形成する（図６参照）。ブロッティングおよびオートラジオグラフィーを、検出感度および解像力向上のために行われた。プローブは、ポリヌクレオチドキナーゼの存在下でy³²P-ATPで放射性標識を付けた。プレハイブリッド形成後、10％のデキストラン、６×ＮＥＴ、５×Denhardt溶液、0.5％のNP40および100μg/ml のサケ精子ＤＮＡ内で42℃で一晩のハイブリッド形成を行った。次に、フィルターを２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳを含めた0.5％ＳＳＣ内で２度連続各15分間42℃で洗浄した。フィルターをKodakＸ線フィルムに2-16時間暴露した。この後、フィルターは、プローブをストリッピングするために0.5％ＳＤＳで煮沸し、別の放射性標識プローブすなわち発明者らがＣＤ４４の標準部分をアニーリングさせるように設計したＰ２（＝5'CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC）（図６）で再ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成、洗浄およびオートラジオグラフィに使用される条件は、上述と同様である。小数の細胞を検出するための方法の感度校正は次のように行った。塩化アンモニウム緩衝液（沈層赤血球1ml当たり50mlの溶菌緩衝液）を添加することによって沈層赤血球を溶解した15分後に遠心分離することによって末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は全て20mlの全血から精製した。白血球ペレットを４本の試験管に分け、 HT29結腸癌腫細胞の懸濁液（１ml当たり5000細胞）をそれぞれの試験管に0μl、 1μl、10μl、100μずつ入れた。次に、ＲＮＡすべてを抽出したが、各試験管の収量は約20μgだった。ｃＤＮＡ合成は、各試験管から得られたＲＮＡの４μgの分別アリコートに対して行い、分別した試料一点当たりそれぞれの腫瘍細胞は、 0個、1個、10個、100個であった。ＰＣＲは、上述の試料、正の遺伝子制御（腫瘍細胞のみ）、負の遺伝子制御（ＤＮＡ無）に対して、発明者らが図６のエキソン６および１４を特異的にアニーリングさせる設計をしたプライマーＤ１およびＤ５を用いて行われた。先の試験から、HT29細胞は、両方のエキソンやその他のエキソンをＰＢＬから容易に区別できるパターンで発現し、発明者らは増幅すべきセグメントを短縮することによって感度を高めたかったので、オリゴヌクレオチドプライマーＤ１およびＤ５を選択した。これらのプライマーを使用することで、この特異的な目的のためにプライマーＰ１およびＰ４を用いる問題が回避できると結論されたが、その理由は、これらの大半が遺伝子の標準部分をアニーリングさせることによって浸漬されるからである。ＰＣＲのサイクルパラメータ、ブロッティング条件、プローブ条件、洗浄条件は上述の通りである。プローブに使用されるオリゴヌクレオチド配列は、³²P標識付けしたＥ４であった。結果の概観プライマー（Ｐ１、Ｐ４）は、スプライス生成物挿入部位を越えて増幅するので、標準分子の介在部分に加え、付加的なエキソンド・メインから得られた転写物を含む選択的にスプライシングされた変異型のいずれかが増幅される。このため、この座から同定される配列の可能な組み合わせすべてを考慮すれば標準型に対するプローブ（例えば、Ｐ２）などを用いて検出できると思われる生成物の総数は大きい。プローブＥ４を用いて、上述の16の組み合わせ、すなわち、エキソン１１から得られたＥ４転写物を含む組み合わせは、電気泳動によって解像される異なる分子サイズのバンドとして視覚化することができると思われる。実際には、可能な組み合わせのすべての範囲を上述の結果では検出できなかったが、複数（９つまで）の選択的スプライシング変異型が各プローブでハイブリッド形成した腫瘍形成組織において観察された。胸部、結腸部、およびリンパ節から得られた体組織は、ある種のＥ４含有転写物（図１および図３）の他、標準分子（図２および図４）も発現したが、末梢血リンパ球（図５）および肝蔵（図４）は、プローブおよびプライマーのこの組み合わせを用いた場合には、後者のみ検出可能状態で発現した。例１胸部組織資料胸部組織試料の試験から得られた結果を図１および図２に示す。転移腫瘍沈着物とすべての症例から得られたそれら沈着物に対応する原発腫瘍は、エキソン１１から得られた転写物含有の複数の選択的スプライシング生成物を過発現した（図１ａ）。少なくも、８つのバンドが、すべての腫瘍において1500bpと1650bpで存在する二重縞と一緒に頻繁に観察された。正常胸部組織および正常リンパ節は、このプローブによって２つのバンド（1150bpおよび860bp）を呈した。上述の二重縞は、正常試料には一切認められなかった。バンドの数、サイズ、結合プローブからの信号強度の差異は、正常範ちゅうと悪性範ちゅうの間では、試験されたすべての試料において明かであった。偶々採取した予定外の試料については、長期間Ｘ線フィルムにフィルターを暴露し、弁別的な差異を観察しなければならなかったが、この所見は試験されたすべてについて確認された。転移関連の臨床的証拠がない局所侵入性腫瘍から得られた試料と２つの繊維腺腫から得られた試料も、正常組織に比べてエキソン10/11から得られた転写物を含むスプライス生成物を過度に発現したが、この程度は、悪性腫瘍とその転移巣を用いて得られた結果とは容易に区別された。正常組織に認められるパターンからの区別も容易である（図１ｂ）。ただし、一つの試料だけは、悪性腫瘍と類似する結果を示した（レーン１４）（以下参照）。２つの繊維腺腫は非転移性癌腫から得られたパターンと類似したバンド・パターン示し、胸部の嚢胞疾患例から得られた試料は、正常の非腫瘍形成胸部組織のパターンと類似していた。これは、本方法による最も確実な診断の第１の例である。組織片は、当直の死亡診断医によって良性腫瘍すなわち肉眼によるむ初期の視診では肉眼的外観上は繊維腺腫から得られたものとして提供された。次に、この組織片は、そのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅後、明確に非腫瘍性であるとして特徴付けられ、その後、組織片顕微鏡検査によってこれが確認された。プローブＥ４によって認められる差異が有効であり、技術的な人工産物でないことを確認するために、同じフィルターがプローブＰ２でハイブリッド形成された場合に得られた結果を図２に示す。これは、i）すべての試験組織が遺伝子の標準型を発現し、ii）エキソン10/11由来の転写物を含まないその他のエキソンスプライス生成物が腫瘍および転移巣に存在し、iii）上述の差異がこの複合フィルター上の種々のパネルおよびレーンのトラック（track）を不均等にローディングしたことによるものではなく、選択的なスプライシングから生じたもであることを示す。この実験におけるすべての条件は、フィルターをＸ腺フィルムに暴露する露光時間（図１の場合、１０時間露光、図３では1.5時間）を除いて、Ｅ４を用いてハイブリッド形成した場合の条件と同じである。例２結腸試料結腸癌腫に関する所見は、乳癌に関する所見と一致した。このため、すべての場合において、結腸癌腫組織は、正常の結腸粘膜やその他の正常組織よりもプローブＥ４よって強く標識付けられた分子量の大きいバンド数の増加を示した。乳癌腫の場合のように、プローブＰ２によるハイブリッド形成は、分子の標準型の発現度において差異を示さなかった（図４）。例３方法の感度の校正既知数のHT29結腸癌腫細胞を接種した末梢血白血球のＰＣＲ産物のオートラジオグラムを精査した結果、10⁷個の白血球中の腫瘍細胞が10個のレベルまで腫瘍細胞特有のバンドの存在を示せることがわかった。検定条件を微細に調整することによって、10mlの血液中のただ１つの腫瘍細胞をも検出することが可能であると考えられる。上述のシリーズでは、腫瘍形成細胞の試料すべてが、ＣＤ４４遺伝子の選択的スプライシングされた生成物を過発現し、非腫瘍性組織から得られた試料では、全く発現を示さなかった。従って、正常組織由来または腫瘍組織由来の試料とＣＤ４４の発現パターンは完全に対応した。ある例では、転移巣の臨床的証拠が現在ない患者（患者Ｂ１６、図１のレーン１４）から除去された腫瘍は、転移能力を示す発現パターンを有することが認められた。現在、これが偽陽性であるのか、転移が差し迫っている徴候であるのかを知ることは不可能である。この患者は、現在フォローアップクリニックで観察下にある。例４発明者らは、以下のように発明者らの所見に従ってオリゴヌクレオチドプライマーを設計し合成した。標準部分に関しては以下の通りである（Stamenkovic 1989）。プライマーＰ１＝5'-GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC（458-484）プライマーＰ２＝5'-CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC（488-518）プライマーＰ３＝5'-TGGATCACCGACAGCACAGAC（746-767）プライマーＰ４＝5'-GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT（912-941）エキソンに関しては以下の通りである（Hofmann 1991）。プライマーＥ１＝5'-TTGATGAGCACTAGTGCTACAGCA プライマーＥ２＝5'-CATTTGTGTTGTTGTGTGAAGATG プライマーＥ３＝5'-AGCCCAGAGGACAGTTCCTGG（534-554）プライマーＥ４＝5'-TGAGATTGGGTTGAAGAAATC（558-578）プライマーＥ５＝5'-TCCTGCTTGATGACCTCGTCCCAT（585-608） D1：5’GAC AGA CAC CTC AGT TTT TCT GGA（63-86） D5：5’TTC CTT CGT GTG TGG GTA ATG AGA（888-911）Ｅ１およびＥ２は、エキソン６上に存在する。直径0.5-1cmの新鮮な組織片試料を外科的切除標本からまたは剖検時に得た。この研究に使用される試料はすべて診断試料が採取された後に残存する組織残部から得られたが、本来ならば廃棄されたはずのものである。試料は、病理学的標本受付場所に到着後10分以内に液体窒素で急速冷凍され、使用されるまで液体窒素で凍結される。ｃＤＮＡは、テンプレートとして細胞ＲＮＡの全量5μgを用いてウイルス逆転転写酵素によって合成し、プライマーＰ１およびプライマーＰ４を用いるＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅、電気泳動およびハイブリッド形成は、標準条件下で行われた。ＰＣＲ産物を放射性標識付けしたＥ２またはＥ４によってハイブリッド形成した場合、癌腫から得られた試料すべてが複数のスプライス変異型を過発現したが、各プローブによって観察されたバンドのパターンは異なった。このため、エキソン６生成物に対するオリゴネクレオチドプローブは、腫瘍形成試料を非腫瘍性試料から区別する場合に有効であるが、少なくとも固形組織から得られた試料についてはＥ４に比べて著しく感受性が大きいというわけでなく、播種性転移細胞または確定した転移巣の由来器官を検出するために有用であろう。その後、同じフィルターをストリッピングし、プローブＰ２によってハイブリッド形成したところ、正常組織を含むすべての試料がＣＤ４４の標準部分を産生することがわかった。これによって、Ｅ２およびＥ４を用いて探査された正常試料および腫瘍試料を用いて得られた結果間に観察された差異は、ＰＣＲ生成物の不均等なローディングによるものではないことが確認された。累積結果を表３にまとめたが、これは、これらのの変化がさまざまな普通型癌に観察されることを示すものである。発明者らは、ある種の骨格筋の悪性腫瘍を調査し、骨肉腫にいて多数のスプライシングされた変異型が著しく過度に発現することを観察した。例５臨床的に収集された尿試料のＰＣＲ検定による癌診断約50mlの自然排尿を各人から得て、実験室に可能な限り急速に運んだ。患者90 名から得た標本を試験したが、その内訳は、生検済膀胱癌患者から44例と膀胱が非腫瘍性炎症（膀胱炎）患者および正常志願者46から得られた46例である。各尿試料を完全に混和した後1mlずつ採取し、細胞学的検査を行った。別の1mlの尿をフルオレセイン・ジアセテート・エチジウム・ブロミド染色によってチェックし、試料中の細胞の生存度を評価した。残りの尿を2000rpmで、10分間、遠心分離を行い、細胞ペレットを使用するまで-70℃で保持した。ｍＲＮＡの抽出をオリゴｄＴセルロース錠（Invitrogen）を用いて行った。ｃＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素（Invitrogen）を用いて合成された。完成したｃＤＮＡ溶液を均等に２本の試験管に分配したが、一方はＥ１およびＥ５を用いたＰＣＲ用であり、特定のｃＤＮＡ転写物を増幅し、発明者らは、診断価値の高いことを認め、他方は、Ｐ１およびＰ４を用いるＰＣＲ用であり、内的制御物としてスプライス変異型すべてを有するか有しないＣＤ４４の標準型を増幅した。ＰＣＲの35サイクルを実行した。サイクル条件は、95℃１分間、55℃１分間、 72℃２分間であった。「ホットスタート」法をすべての試料に採用した。結果は図８に示されている。等しい容積のＰＣＲ生成物を1.2％の寒天ゲルの各レーンにローディングしエチヂウムブロミドで染色した。尿中の細胞がエキソン６からエキソン１４までのすべてを発現するものであれば、現在のＰＣＲプロトコルの場合、プライマーＥ１およびＥ４を使用することによって735bpのバンドを生じることが予想された。正常尿から得られたｃＤＮＡまたは非腫瘍性膀胱炎患者のｃＤＮＡを含むトラック（track）にはバンドがないが（レーン１−８）、ＰＣＲをプライマーＥ１およびＥ５を用いて行った場合（上部パネル）、鮮明な735バンドが膀胱癌患者から得られた尿試料すべてにおいて観察されている（レーン９−１６）。ＣＤ４４型の標準型を表す482bpのバンドは、ＰＣＲをＰ１およびＰ４を用いて実行した場合（下部のパネル）、すべての場合にほぼ均等に得られた。これは、膀胱癌患者から得られた尿と対照から得られた尿との間の診断的に有意な差異は、トラック（track）の不均等なローディングによって引き起こされるのではなく、ＣＤ４４遺伝子の選択的スプライシングによって生じることを示唆する。レーン１−４：正常尿。レーン５−８：膀胱炎の尿。レーン９−１６：膀胱癌患者１−８から得られた尿。全体の結果では、735bpバンドは、正常な７尿標本中７標本と膀胱炎の９尿標本中９標本には存在しなかった。すなわち、０％の偽陽性である。また、膀胱癌患者から得られた19尿試料中14試料（74％）は、陽性の結果（すなわち26％の偽陰性）を示した。偽陰性の試料では、フルオレセイン・ジアセテート・エチジウム・ブロミド染色によって示されるように生存可能な癌細胞が不足していた。例６患者12名から得られた便を本文に記載された技術によって検定した。結腸直腸がん患者９名から得られた試料中５試料は、陽性の結果を示した。正常な患者３名から得られた試料すべてが陰性の結果を示した。前処理を課さない細菌に満ちた試料から得られた数値は、細菌生存可能診断検定法を容易に開発することができると確信させるものである。この方法を用いて腫瘍細胞を検出する発明者の更なる実験では、以下の観察結果がその診断的ポテンシャルを調査するその他の実験に有用となろう。結果の信頼性および再現性は試料から得られたｍＲＮＡの質および技術を実施する際のケアに決定的に依存することを重大な考察として認識すべきである。主な必要条件は、質の高いｍＲＮＡが日常的に得られることを確実にし、内部標準をすべての反応に用いてＰＣＲ増幅ステップをモニタリングして偽陰性の結果が出ることを排除することである。偽陽性の結果はあまり多く観察されないのであれば、同じ試料または更に採取した試料に対する複製検定とその他の臨床データを参照すれば、偽陽性と認識することができるので、重要な問題ではない。発明者らは、腫瘍細胞を含有する小型臨床試料の中から異常なＣＤ４４遺伝子の活性を機械的にＰＴ−ＰＣＲ検出することを確実にするために必要な手順を検討した。組織片試料をアリコートに分割し、その半数を液体窒素中で直後に凍結し、残りは周囲温度で放置した場合、ＣＤ４４スプライス変異型を検出する能力が、標本処理の時間とモード次第ではどのように低下するかを示すことができる。切除30分以内にｍＲＮＡ抽出した新鮮試料は、最も信頼できる結果を示し、新鮮組織片を周囲温度に放置された場合には、次の数時間で質が次第に低下する。試料が最初に急速冷凍された場合には、解凍直後にＲＮＡを抽出しさえすれば満足できるものである。だが、最初の15分間で急速に低下し始め、大型の変異転写物が最初に損失し最終的には標準型までも損失する結果が得られた。急速に冷凍された細胞および組織片の試料が-70℃で保管された場合、ｍＲＮＡが解凍直後に抽出された場合でさえも、結果は４週間後に低下した。従って、冷凍中に破壊された細胞から放出されたリボヌクレアーゼによるＲＮＡの質低下は、この温度でさえも、速度は遅いとは言え、継続する。さらに、ＲＮＡ抽出用に採取された試料は、壊死部分または繊維症部分から得られる場合には、生存可能な腫瘍組織に観察される典型的な結果を得られないとも考えられる。このため、試料選択および標本処理における注意は、信頼できるデータを得るために必要である。このようなことから、発明者らは新鮮な試料が、ｍＲＮＡを抽出するために凍結または処理される前に24時間以上放置されないこと、解凍試料がｍＲＮＡ抽出のために処理される前に２時間以上放置されないことが好ましいと考える。本文に記載される診断方法は、一日で行うことができ、数時間でおこなうことができる場合もあり、自動化することもできる。この診断方法の使用は、さまざまな試料に関して多種多用な癌を検出するために、また、血液試料および尿試料に関しても証明してきた。従って、発明者らは、この方法を癌のスクリーニングおよび診断にとって便利で実践的な方法として提供する。原則として、この診断方法は、癌の検出プログラムと予防プログラムに広く一般的に適用できるので、疫学的価値および公衆衛生的価値がある。この方法の感度、特異度、簡易性を適切に利用することによって、初期の癌診断の他、体内の疾患の程度の評価、処置の効率の判定、腫瘍再発の早期検出ができるようになろう。図の記号説明注記：Ｎ＝正常、Ｔ＝原発腫瘍、Ｍ＝転移図１胸部組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオグラムをＥ４を用いて探査そた（試料フィルターをＸ線フィルムに１０時間照射）。パネルＡ：転移巣を有する悪性原発乳癌。トラック１、２、３：患者Ｂ１、トラック４、５、６：患者Ｂ２、トラック７、８、９：患者Ｂ３、トラック１０、１１：患者Ｂ４、トラック１２、１３：患者Ｂ５。標準胸部組織片と比較して、原発癌腫およびその転移沈着物は、複数のスプライス変異型を過発現した。1500bpおよび1650bp（矢印）におけるダブレットは、トラック５に最も良く観察されることに注目されたい。これは、腫瘍および転移巣のすべてに存在するが、今回の露光によってその他のトラックではかぶり画像となっている。はるかに長い露光時間（23時間）でさえ、正常試料では検出されなかった。パネルＢ：転移の臨床的証拠がない乳癌腫。トラック１４−２０は、患者Ｂ１５−２１から得られた。腫瘍はすべて種々の変異型を過発現したが、トラック１６（患者Ｂ１７）以外は、バンド数は少なく、シグナル強度は弱かった（テキスト参照）。1500/1650bpのダブレット（矢印）は、トラック１５、１６、１８では露光の長さにおいて容易に認識することができ、長い露光についてはその他すべての腫瘍含有トラックにおいて検出できるようになった。しかし、図では、強いシグナルを有するトラックがかぶり映像となるのを防ぐためには短い露光がよいことを示す。パネルＣ：繊維腺腫瘍（ＦＡ）および嚢胞性乳腺症（Ｃｙｓｔ）。トラック２１、２２は、良性腫瘍試料（試料Ｂ２２、２３）を含み、トラック２３（試料Ｂ２４）における非腫瘍性（嚢胞性疾患）試料よりも多く発現した。図２プローブＰ２を用いて探査された胸部組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオグム（試料フィルターをＸ線フィルムに1.5時間露光）。この結果は、図１に使用されたものと同じフィルターを、以前のプローブをストリツピングした後再探査することによって得られた。ここでは、i）図１に観察される差異は、トラックの不均等なローディングによるものではなく、ii）分子の標準型の発現は、どの変異型よりも量的に多く、iii）標準型は、調査されたすべての組織片に発現され、iv）エキソン３転写物を含まない変異型も更に存在し、腫瘍細胞に過発現される。1500/1650bpダブレットは、パネルＡの腫瘍に認められるが、パネルＢおよびパネルＣで検出できるようにするには長時間の露光が必要である。図３Ｅ４を用いて探査した結腸組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオグラム（試料フィルターを写真フィルムに１０時間露光）。トラック１、２、３：患者Ｃ１、トラック４、５、６：患者Ｃ２、トラック７、８、９：患者Ｃ３、トラック１０、１１：患者Ｃ４、トラック１２、１３：患者Ｃ５、トラック１４：正常肝試料。画像は、図１の説明に記載した特徴と同じであり、所見は結腸の癌腫に適合することを示す。1500/1650bpダブレット（矢印）は、複数の腫瘍トラック（２および８−１２）で容易に目止められ、トラック３、５、６、１３に対応する位置の微弱なシグナルは、露光時間が長い場合には強くなった。しかし、トラック１、４、７、１４（正常組織）ではこの近傍に一切認められなかった。図４Ｐ２を用いて探査された結腸組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオグラム（試料フィルターを写真フィルムに1.5時間露光）。これは各トラックは均等にローディングされたことを確証し、また、図２に示されたようにその他のポイントは結腸癌腫にあてはまることを確証している。正常肝臓は、ＣＤ４４の標準型を発現することに留意されたい。図５正常末梢血白血球、ＰＢＬ（３名から得られた）および、Ｅ４（パネルＡ；写真フィルムに８時間露光）とＰ２（パネルＢ；写真フィルムに５時間露光）を用いてプローブされたその他の正常組織から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオグラム。トラック６は、乳癌（患者Ｂ）から得られたＰＣＲ生成物を正の遺伝子制御として含む。プライマーおよびプローブのこの組み合わせを用いれば、白血球がＣＤ４４分子の標準型を発現することがわかるが、スプライス変異型は検出されない。トラック４および５の試料は以下のように、臨床的に腫瘍形成の証拠がない個体から得られた。すなわち、トラック４は細菌性心内膜炎で死亡した女性の身体から剖検によって得られた胸部組織、トラック５は軸捻のために切除された結腸である。参考文献例７Ｉ．ペプチド合成図７に示されるＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド配列のアミノ酸１−１３、９−２３、１９−３３、２９−４３、１−４３に対応する５つのペプチドを、Applied Biosystems，Inc.社のモデル431Aペプチドシンセサイザーにかけて専売の標準スケール（0.25mmol）Fmoc化学オプションを用いて9-フルオロエニルメチロキシカルボニル（Fmoc）化学固相ペプチド合成（Atherton and Sheppard，1 989）によって合成した。このために、403mgの4-（2'，4'-ジメトキシフェニル −Fmoc-アミノメチル）-フェノキシ樹脂（Rink，1987）を0.62mmol/gの樹脂と置換して用いる。アミド樹脂は、最初のカップリングサイクル以前にN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の20％のピペリジンを用いて処理することによって脱保護化（Fmoc開裂）する。ペプチドを合成するには、4mol過剰な以下のFmoc-アミノ酸誘導体とその他のカルボキシル酸を用いる。 N-Fmoc-L-アラニン N-α-Fmoc-N^G-（2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル）-L-アルギニン N-α-Fmoc-N-β-（トリチル）-L-アスキパラギン N-α-Fmoc-L-アスパラギン酸-β-t-ブチルエステル N-Fmoc-S-トリチル-L-システイン N-α-Fmoc-N-γ-（トリチル）-L-グルタミン N-α-Fmoc-L-グルタミン酸-γ-t-ブチルエステル N-α-Fmoc-N-im-トリチル-L-ヒスチジン N-α-Fmoc-L-ロイシン N-α-ブチロキシカルボニル-N-ε-Fmoc-L-リシン N-α-Fmoc-N-ε-ブチロキシカルボニル-Fmoc-L-リシン N-Fmoc-L-ノルロイシン N-Fmoc-L-プロリン N-Fmoc-O-t-ブチル-L-セリン N-Fmoc-O-t-ブチル-L-トレオニン N-α-FMoc-N-ε-ブチロキシカルボニル-L-トリプトファン N-Fmoc-γ-アミノブチル酸 N-Fmoc-ε-アミノカプロン酸（⁺）-ビオチンカップリングを行う前に、アミノ酸誘導体をＤＭＦに溶解し、１当量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾル（HOBt）をN-メチルピロロリジノン（ＮＭＰ）に添加し、１当量のN,N'-ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）をＮＭＰに添加することによって活性化させる。HOBt-エステルアミノ酸の20分間のカップリングをＤＭＦ中で実行する。カップリングに続き、N-末端の脱保護化（Fmoc開裂）をＤＭＦに 20％のピペリジンで３分、続いて10分処置することによって達成する。ペプチド鎖は、活性化／カップリング／脱保護化サイクルを繰り返すことによって延伸する。後に免疫原合成に使用されるペプチドにN-末端アミノカプロン酸スペーサおよびシステインを供給し、それによってペプチドは担体タンパク質につながれる。スクリーニング試薬として使用されるペプチドに関し、異なるN-末端が合成され、３つのγ-アミノブチル酸成分、リシン、（リシンのε−アミノ基に取り付けられている）ビオチンを含む。合成に続き、ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）切除によって樹脂支持体から除去される。ペプチド含有樹脂を１時間室温（ＲＴ）で20mlのトリフルオル酢酸、1mlの水、1mlのチオアニソール、0.5ml のエタンジチオール、1.5gのフェノールを含む開裂カクテルと反応させる。アルゴン下で行われた酸-不安定側鎖保護基の除去は、上述のカクテル溶液内でさらに2.4時間の反応時間後室温で完了される。短時間冷却した後、脱保護化されたペプチドは、ジイソピルエーテルの添加によって沈降させる。沈澱物をろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、50％酢酸で溶解し、凍結乾燥させた。ペプチドの純度は、逆相ＨＰＬＣ（カラム−Vydac 218tp54、Ｃ₁₈、300Å、5μm、4.6 ×250mm、移動相−Ａ：0.1％ＴＦＡ含有の水、Ｂ：0.1％ＴＦＡ含有の水／アセトニトリル（35/65、容積/容積）；勾配−90分間で0-100％Ｂ、流量−1ml/分、検出−226nm）。純度が60％未満の上述のペプチドを逆相ＨＰＬＣ（カラム−Wat ers DeltaPak Ｃ₁₈、100Å、15μm、50×300mm、移動相−Ａ：0.1％ＴＦＡ含有の水、Ｂ：0.1％ＴＦＡ含有の水／アセトニトリル（35/65、容積/容積）；勾配−130分間で0.50％Ｂ、流量−15ml/分、検出−226nm）。ペプチドの素性は、プラズマ脱着質量分析によって検証される。免疫原合成に使用されるペプチドに関する特徴的なＨＰＬＣ維持時間特性および質量分析データを表２に記載した。 II．担体タンパク質の活性化免疫原分析に関して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかの担体タンパク質をヘテロ二官能架橋試薬であるN-スクシニミジル3-マレイミドプロピオネート（ＭＰＳ）を用いてリシンのε-アミンを介して修飾する。このことがスルフヒドリルペプチドが後に共役される「ハンドル」付きの担体タンパク質を付与する。ＫＬＨの場合、10μM のＫＬＨ溶液をpH8.35の0.1Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液によって調製する。懸濁液のpHは、8.3に調整され、簡単に遠心分離される。bicinchoninic酸（ＢＣＡ）タンパク質検定（Smith，et al.，1985）によってタンパク質濃度を測定した後、ジメチルスルホキシドに含めた3000当量の0.3モルＭＰＳ溶液をかくはんされたＫＬＨ溶液に滴下し、室温で１時間反応させた。溶液のpHは、0.1モルのHCLによって7.0に調整され、活性化された担体タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって過剰のＭＰＳから分離された（カラム−AcA202、IBF Biotechn ics、5×12cm）室温；緩衝液−0.1MのKH₂PO₄/K₂HPO₄、pH7.0、0.1MのNaCl；流量 -6ml/分、検出−226nm）。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質検定によって再度測定され、活性化KLHのマレイミドプロピオアミド（ＭＰ）置換の程度（KLH-M P）をエルマン試薬ＤＴＮＢを用いて測定した（Ellman、1959）。ＢＳＡに関しては、190μMのＢＳＡ溶液を0.1モルのKH₂PO₄/K₂HPO₄、pH7.0に含めて調製し、1 00当量のＭＰＳ（1,4-ジオキサン中40mM）に滴下した。反応混合物を2時間室温でかくはんした後、サイズ排除カラムにローディングした。活性化されたＢＳＡ（ＢＳＡ−ＭＰ）を精製し、ＫＬＨ−ＭＰに似たような方法で分析した。20-35: 1および200-600:1の置換値は、活性化された担体タンパク質であるＢＳＡ−ＭＰとＫＬＨ−ＭＰに関して各々機械的に達成された。 III.ペプチドと活性担体タンパク質の共役チオエーテル結合の形成によって、チオ含有ペプチドは、ＭＰ活性化担体に共役される。ＢＳＡ−ＭＰの場合、pH7.0の0.1MのKH₂PO₄/K₂PO₄に含めた74μMのBS A-MP溶液を（ＭＰに関して）１当量の4mMペプチド溶液を同じ燐酸緩衝液に含めて反応させた。溶液をゆっくりとかくはんし、室温で一晩反応させた。遠心分離後、可溶性ＢＳＡ-ＭＰペプチド共役体をサイズ排除クロマトグラフィー（II．節のと同じクロマトグラフィー条件）によって未結合ペプチドを分離した。タンパク質共役体の分析には、ＢＣＡによるタンパク質濃度決定の他、エルマン試薬を用いての未反応ＭＰ-基の残存数を確認することを含む。ＫＬＨ−ＭＰペプチド共役体は、活性担体タンパク質およびペプチドの濃度それぞれ3μMと18μMを除いて、分析した。参考文献略号ＢＣＡ − bicinchoninic酸ＢＳＡ − ウシ血清アルブミンＢＳＡ−ＭＰ N-スクシニミジル 3-マレイミドプロピオネートで活性化されたウシ血清アルブミンＤＣＣ − N,N'-ジシクロカルボジイミドＤＭＦ − N,N'-ジメチルホルムアミドＤＴＮＢ − ジチオ-bis-（2-ニトロ安息香酸）、エルマン試薬 Fmoc − 9-フルオレニルメチロキシカルボニル HOBt − N-ヒドロキシベンゾトリアゾルＫＬＨ − キーホールリンペットヘモシアニンＫＬＨ−ＭＰ − N-スクシニミジル 3-マレイミドプロピオネートで活性化されたキーホールリンペットヘモシアニンＭＰ − マレイミドプロピオンアミドＭＰＳ − N-スクシニミジル 3-マレイミドプロピオネートＮＭＰ − N-メチルピロロリジノンＲＴ − 室温ＴＦＡ -トリフルオロ酢酸例８組換HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原／免疫原の製造ＣＤ４４遺伝子のエキソン６は、図７に示すように43個のアミノ酸から成るペプチドをコードする。ペプチドおよびアミノ酸100個未満の小型タンパク質は、概して、む微生物の細胞質発現によって組換えることができない。このため、大腸菌において容易に発現可能な遺伝子（HIV2レトロウイルスのエンベロープタンパク質gp32の一部）とＣＤ４４エキソン６-ＤＮＡを含む融合遺伝子を作成した。融合タンパク質のＣＤ４４エキソン６エピトープを増加させるために、（ＣＤ４４のエキソン５の３つのＣ末端アミノ酸をコードする）適切なリンカーを用いてＤＮＡレベルでＣＤ４４エキソン６を複製した。金属キレートアフィニィティクロマトグラフィによってより簡単に抗原／免疫原を単離するために、６個のヒスチジン残基（コドン）をＤＮＡレベルでHIV2（ gp32）-ＣＤ４４エキソン６融合タンパク質のN-末端領域に挿入した。組換ＤＮＡ技術標準的な方法を用いてMolecular Cloning: A laboratory manualCold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York（1989）においてSambrook，J．e t al. によって記載されたようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者のマニュアルに従って使用した。 HIV2（gp32）-部分的遺伝子（プラスミドpUC18 HIV2-gp32）の作成 HIV2-gp32遺伝子のアミノ酸48-162のコード部をオーバーラップ化学遺伝子合成（overlap chemical gene synthesis）によって合成した後、プラスミドpUC18 を用いてサブクローニングした。プラスミドpUC18HIV2-gp32の生成と分類記載については、欧州特許出願第0 440 207号に開示されている。大腸菌発現ベクターpDS56-6HIS-HIV2-gp32の作成以下のプラスミド作成では、アミノ酸配列MRGSHHHHHHTDPEFのN-末端（ポリ-Hi sテイル）をコードする融合遺伝子と、選択されたHIV2-gp32抗原を作成した。この目的のため、ベクターpQE-10を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindI IIによって消化し、約3.4kbpの長さのBamHI/HindIII-pQE-10ベクターフラグメントを寒天ゲル電気泳動によって単離した。pQE-10ベクター［同義：pDS56/RBSIII 、６×His（-1）］は、ドイツ国のDiagenから供給され、Stuber，D．et al．（1 990）Immunol.Methods IV: 121-152に記載されているものである。別の調製では、プラスミドpUC18 HIV2-gp32を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindIIIによって消化し、約400-bpの長さのBamHI/HindIII-HIV2-gp32フラグメントを単離し、約3.4bpの長さのBamHI/HindIII-PQE-10ベクターフラグメントに結合した。所望のプラスミドは、制限マッピングを用いた同定により、pDS56-6HIS-HIV2-gp 32であると判明した。大腸菌発現ベクターpDS56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６の作成アミノ酸配列MRGSHHHHHHTDPEFに対するN-末端（ポリ-Hisティル）をコードする融合遺伝子と、選択されたHIV2-gp32抗原と、ＣＤ４４エキソン６抗原の２つのコピーを作成した。ＣＤ４４エキソン６遺伝子の２つのコピーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した［Mullis，K.B．and Faloona，F.A．（1987）Methods Enzym ol. 155: 355-350］。最初のＰＣＲ反応では、塩基対の位置397-538から得られたＣＤ４４エキソン５−６のＤＮＡ配列を増幅し（図９：HIV2（gp32）-CD44エキソン６融合遺伝子のＤＮＡ配列）、適切な個別の部位に制限エンドフクレアーゼ開裂（BamHIおよびHaeIII）を形成した。増幅はサブクローニングされたＣＤ４４ｃＤＮＡ（エキソン５− １１）および以下のプライマー対を用いて行った。 BamHIプライマー（1）:5'-aaaaaaCGATTCccgctgccacttttgatgagcactagtgctac-3' ProAlaThrThrLeuMetSerThrSerAla.．エキソン５エキソン６ HaeIIIプライマー（2）:5'-aaaaaaCGCCGGagccatttgtgttgttgtgtg-3' 約160-bpの長さのＰＣＲ生成物をBamHIおよびHaeIIIを用いて消化し、約150-b pの長さのBamHI/HaeIII-ＣＤ４４エキソン６フラグメントを寒天ゲル電気泳動によって単離した。２回目のＰＣＲ反応では、塩基対の位置が539-672番目のＣＤ４４エキソン５ −６ＤＮＡ配列（図９参照：HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６融合遺伝子のＤＮＡ配列）を増幅し、テンプレートＤＮＡとしてサブクローニングされたＣＤ４４ｃＤＮＡエキソン５−１１を用いるとともに下記のプライマー対を使用して、増幅されたＤＮＡ配列に対して適切な単一の制限ヌクレアーゼ開裂部位を与えた。 HaeIIIプライマー（3）:5'-aaaaaaCCGGCCACCACTttgatgagcactagtgctac-3' ProAlaThrThrLeuMetSerThrSerAla.．エキソン５エキソン６ HindIIIプライマー（4）:5'-aaaaaaAAGCTTTTATCAgccatttgtgttgttgtgtg-3' 約150-bpの長さのＰＣＲ生成物をHaeIIIおよびHindIIIによって消化し、約140 -bpの長さのBamHI/HaeIII-ＣＤ４４（エキソン６）のフラグメントを寒天ゲル電気泳動によって単離した。その後、最初のＰＣＲ反応から得られたBamHI/HaeII-ＣＤ４４エキソン６フラグメントと２回目のＰＣＲ反応から得られたHaeIII/HindIII-ＣＤ４４エキソンを３つのフラグメントで結合することによって約3.8bpの長さのBgIII/HundIII-p DS56-6HIS-HIV2-gp32ベクターフラグメントとした。所望のプラスミドは、制限マッピングによって同定され、ＰＣＲ合成ＤＮＡ領域は、ＤＮＡ配列（構造：pD S56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６）によってチェックされた。大腸菌におけるHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原の発現大腸菌においてHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原を発現するために、大腸菌Ｋ１２株RM82（メチオニン復帰突然変異体であるEX8654、Murry、N.E．et a l ．（1977）Mol．Gen．Genet．150: 53-61）を、HIV（gp32）-ＣＤ４４エキソン６発現プラスミドpDS56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６（耐性アンピシリン）およびI acIリプレッサープラスミドpUHA1（耐性カナマイシン）を用いて形質転換した。プラスミドｐＵＨＡ１の生成および分類記載はStuber，D．et al．（1990） 45 Immunol.Methods IV: 121-152に記載されている。 RM82/pUHA1/pDS56-HIV2-CD44エキソン６細胞をＤＹＴ媒体（1％（w/v）酵母エキス、１％（w/v）Bacto Tryptone、Difco、0.5％塩化ナトリウム）内で、50mg/ lのアンピリシンおよび50mg/lのカナマイシンを用いて、550nmにおいて光密度が 0.6-0.9になるまで培養し、IPTG（最終濃度1-5mmol/l）を用いて誘導した。4-8 時間の誘導期の後、細胞を遠心分離によって収集し、pH6.8、10mmol/lの燐酸緩衝液で洗浄し、さらに処理を行うまで−２０℃で保管した。 1mlの培地から得られた細胞ペレット（RM82/pUHA2/pDS56-HIV-ＣＤ４４エキソン６細胞）を0.25ml,10mmol/l、pH6.8の燐酸緩衝液と1mmol/l EDTAに含めて再度懸濁し、細胞をフレンチプレスによって機械的に溶菌した。遠心分離後、1/5容量の5×SDS試料緩衝液：pH6.8、50mmol/lのトリス-塩酸、1％SDS、1％メルカプトエタノール、10％グリセロールおよび0.001％ブロモフェノールブルー）を上澄みに添加した。不溶性細胞破片分画を0.3mlの1×SDS試料緩衝液中で6-8M尿素を用いて再懸濁した。次に、試料を5分間95℃でインキュベートし、遠心分離を行った。その後、タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離して（Laemmli，U.K.（1070）Nature227: 680-685）、クーマシーブリリアントブルーＲ色素を用いて染色した。大腸菌で合成されたHIV（gp32）-CD44エキソン６抗原（図１０）は均質であり、不溶性細胞分画にのみ観察される。HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原に関する発現レベルは、大腸菌の総タンパク質に対して30-50％であった。大腸菌由来のHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原の調製封入体（ＩＢ）の細胞溶菌および調製。 20g（生重量）のRM82/pUHA1/pDS56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６細胞をpH7.0、10 0m10.1mol/lのトリス-塩酸で0℃で再懸濁した。30mgのリゾチームを添加し、混合物を20分間0℃でインキュベートした。次に、細胞を機械的高圧分散によって完全に溶菌し、ＤＮＡを2mmol/lの塩化マグネシウムおよび1mgのデオキシリボヌクレアーゼを添加することによって30分25℃で消化した（Boehringer Mannheim ，Germany，Cat.No.154709）。次に、50m,160mmolのEDTA、6％のトリトンX100と、1.5mmol/lの塩化ナトリウムをpH7.0で消化溶液に添加し、この混合物をさらに 30分間0℃でインキュベートした。不溶性成分（細胞破片およびＩＢ）をSorvall 遠心分離器にかけて遠心分離した。ペレットを100ml0.1molの燐酸緩衝液内でpH8 .5で再懸し、25℃30分間インキュベートし、ＩＢ生成物を遠心分離によって単離した。金属キレートクロマトグラフィーを用いるHIV（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原の精製 2.5gのＩＢペレット（生重量）を、25℃2時間かくはんすることによって、25m l6mol/lのグアニジン-塩酸、0.1mol/lの燐酸緩衝液、pH8.5に懸濁した。不溶性成分は、遠心分離によって分離され、透明な上澄みが6mol/lのグアニジン-HCl、 0.1mmol/l燐酸緩衝液、pH8.5によって平衡化されたNTAカラムに適用された（カラム容量：50ml,ドイツ国のDiagen Company製のNTAゲル；Hochuli，E．et al.（ 1988）. Bio/Technology 6: 1321-1325）。カラムは、約5カラム容量の8mol/l尿、10mmol/lトリス-塩酸、0.01mmo/lの燐酸緩衝液、pH8.5で洗浄した。その後で、HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原を8mol/lの尿と0.01mol/lの燐酸緩衝液、pH4.0で溶出し、HIV2（gp32）-CD44エキソン６抗原含有分画をプールした。大腸菌におけるHIV2（gp32）-担体抗原の発現および単離 HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原と同様に、HIV（gp）32抗原をプラスミドpDS56-6HIS-HIV2-gp32を用いて生成した。 HIV2（gp32）-ＣＤ３４エキソン６抗原のビオチン化ビオチン化は、ビオチニル-＊-アミノカルン酸-N-ヒドロキシ-スクシンイミド（Bi-X-NHS）（Boehringer Mannheim，Germany Cat．No．1003933）を用いて1:3 、1:6、1:10のモル比で行った。8Mの尿、0.1M燐酸ナトリウム緩衝液、10mMトリス中に約pH６で7.1mg/mlの濃度で存在している融合タンパク質ＨＩＶ２（gp32） -ＣＤ４４エキソン６を透析緩衝液（0.1M燐酸ナトリウム緩衝液、0.5％ＳＤＳ、 10mMDTT、pH8.5）で希釈し、上述の緩衝液に対して室温で透析し、さらに1mg/ml に希釈した。適切な量のBi-X-NHSを融合タンパク質に添加し、約２時間室温でインキュベートし、反応を1Mリシン/HCL、pH6.5を2mMに添加することによって停止させた。0.1Mナトリウムの燐酸緩衝液、0.5%のSDS、pH6.0に対して透析した後、試薬ＨＩＶ２（gp32）-ＣＤ４４エキソン6-Biを−２０℃で保管した。ペプチドＨＩＶ２（gP32）も同様にビオチン化された。参考文献例９マウスの免疫化マウスの免疫化を、Cianfriglia et al．（1983）．Hybridoma，Vol.2，No.4: 451-457.に従って行った。免疫源として担体タンパク質（例７参照）に結合させたアミノ酸1-13、9-23、19-33、29-43および1-43に対応する合成ペプチドとHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原を使用した。生後12週のBalb/cマウスを完全フロイントアジュバントに含めて50μg免疫原によって、融合の15日、８日前に腹膜内注射によって免疫化した。融合3日前に、マウスをＰＢＳ緩衝液に含めて200μgによって腹膜内注射によって免疫化し、融合2日前と融合前最終日にマウスを腹膜内注射および静脈注射によって100μ免疫原をＰＢＳに含めて免疫化した。融合およびクローニング脾臓細胞懸濁液の製造マウスを頚部脱臼させて死亡させて、その脾臓を無菌条件下で除去した。脾細胞をRPMI1640基礎培地内の結合組織から取りだした。細胞懸濁液をシーブに通して、RPMI基礎培地の200g（遠心分離管）で遠心分離した。融合免疫化マウス由来脾細胞を1+5の比率でP3×63Ag8-653骨髄腫細胞（ATCC CRL 8 375）に混合し、遠心分離した（10分、300g、4℃）。細胞を再びRPMI基礎培地で洗浄し、400gで遠心分離した。上澄みをデカントし、1mlPEG（Mr4000、Merck）を添加し、ピペット分注によって混合した。水浴1分後、5mlRPMI1640基礎培地を室温で5-6分にわたって滴下し、混合物と培地（RPMI1640+10%FCS）を併せて50ml にした。この後、これを10分間400g4℃で遠心分離した。沈降細胞をRPMI1640培地+10%ＦＣＳに添加し、96ウェル培養プレートにウェルあたり2.5×10⁴脾細胞を 200μl選択培地（100μMヒポキサンチン、1μg/mlアザセリンをRPMI1640+10％FC Sに含有）に含めて接種した。［FCS=ウシ胎血清］ 10日後、これらの一次培養について特異抗体合成に関してテストした。適切な特異性を有する培養をＦＡＣＳ（細胞選別器）を用いて96培養プレート内でクローニングした。増殖因子として、インターロイキン６（Boehringer Mannheim Ca t．No.1271172，100U/ml）を培地に添加した。このようにし、以下のハイブリドーマ細胞系統を単離した。それらは、Brauns chweig内のDMS設備で析出された。 MAK〈CD44〉M-1.1.12 MAK〈CD44〉-2.42.3 MAK〈CD44〉-4.3.16 図７に示すアミノ酸配列を有するCD44エキソン６のうち、MAK〈CD44〉M-1.1.1 2に対してはアミノ酸9-23に対応する合成ペプチド、MAK〈CD44〉-2.42.3に対してはアミノ酸29-43を、MAK〈CD44〉-4.3.16に対してはアミノ酸1-13が使用された。抗体の生成腹水からの抗体取得 5×10⁶のハイブリッド細胞を0.5mlのPristanで前処置した２匹のマウスに腹膜内注射した。1-3週間後、IgG濃度が5-20mgの腹水が得られた。この腹水から抗体が通常の方法で単離された。細胞培養上澄みからの抗体の取得サイブリドーマ細胞をTechne生物学的かくはん機（THERMO-DUX，Wertheim/Mai n，Model MCS-104XL，Cat．No.144-050）によってRPMI1640+10％FCSに含めて1× 10⁵細胞／ｍｌの接種濃度で7日間操作した。培養上澄みの平均濃度は、100μgMA B/mlだった。精製は、標準タンパク質化学法を用いて精製を行った。例10 生成された抗体特異性の評価合成ＣＤ４４ペプチドに対する抗体ハイブリドーマ細胞培養上澄みの抗体特異性を実証するために、部分的ペプチドおよび完全なエキソン６に対する反応性を、阻害テストによって並行して測定した。96ウェルタイタープレート（Nunc）を200μl/ウェルのストレプタビジン［10μg、コーティング緩衝剤＝0.2mol/l炭酸/重炭酸ナトリウム］でコーティングした。ストレプタビジンによるコーティング後、1-13ビオチン、9-23ビオチン、29-43ビオチン、などのビオチン化ペプチド、ｃ＝2.5μg/mlをインキュベーション緩衝剤［燐酸ナトリウム緩衝剤、40mM、0.5％Crotein C、100μl/ウェル、1 時間のインキュベーション、室温］に結合させた。自由結合部位を遮断緩衝剤［ 0.9％塩化ナトリウム、1%Crotein C、200μl、30分、室温］で飽和した。遊離ペプチドエキソン６（1-43）NH₂、ｃ＝5μg/mlを用いた試験と用いない試験に供すべき抗体溶液を添加し、1時間インキュベートした。さらに1回洗浄［0. 9%塩化ナトリウム、0.05%Tween］した後、ヒツジ由来のポリクローナル抗体からマウスκおよびマウスλ［BM、マウスIg測定キット、瓶２および瓶６］に100μl のＰＯＤ標識付けしたFabフラグメントを添加した。これを１時間室温でインキュベートした。さらに洗浄した後、着色物質100μl［ABTS、BM:#811769、#68735 9］を30分間室温でインキュベートした。450/490nmにおける吸光度をDynatech M R 700マイクロプレートリーダで測定した。後に、付着細胞系陽性の抗体すべてをドットブロットおよび免疫組織学的方法によってスクリーニングした。組換ＣＤ４４（融合タンパク質）に対する抗体抗原としての組換ＣＤ４４を有する融合物由来の抗原体特異性を測定するには、さらに別のスクリーニングテストを行う。抗体試料について、融合タンパク質との反応性と、平行ELISA検定におけるHIV-gp32との架橋反応を調べるためのテストを行った。ストレプタビジンでコートしたマイクロタイタープレート（セクション１参照）をビオチン化融合タンパク質HIV2（gp32）-ＣＤ４エキソン6-Bi （XOSU）またはHIV2（gp32）-Bi（XOSU）［C=5μg/ml、100μl/ウェル、１時間室温］を用いてインキュベートした。自由結合部位を遮断緩衝剤［0.9%塩化ナトリウム、1%Croteiｎ C、200μl、30分室温］で遮断した。洗浄ステップ［0.9%塩化ナトリウム、0.05%Tween］後、ウェルあたり100μ、抗体試料c=5-10μg/mlをインキュベーション緩衝剤（40mMの燐酸ナトリウム緩衝剤）で希釈して、1時間室温インキュベーションした。以下のステップをペプチド合成に関して上述の例のように行った。組換ＣＤ４４に対して強い反応をし、HIV2（gp32）タンパク質に対して弱い架橋反応をする一次培養が得られた。このような培養はドットブロットおよび免疫組織学的方法によってさらに評価した。細胞および組織に対する抗体特異性の測定（免疫染色）方法Ａ：腫瘍細胞系（ZR-75 1またはMDA 4A4）をフラスコから削って取り出し、細胞懸濁液をガラススライドに滴下し、乾燥し、メタノールで固定した。方法Ｂ：腫瘍および正常組織の凍結乾燥部分をアセトンで固定した。 5％スキムミルク-TBSによって37℃60分で遮断し、2分間TBSで洗浄し、試料（希釈していない細胞培養上澄み）を120分間37℃で抗体を用いてインキュベートした。慎重にTBS X3で洗浄した後、さらにインキュベーションをビオチン化抗マウスIg（Dakopatts）を用いて60分間37℃で行った。さらに洗浄した後（TBS）、 HRPOアビジン-ビオチン錯体（Dakopatts）を添加し、室温で60分間試料を用いてインキュベートした。TBS X1で洗浄した後、1%グルタルアルデヒド溶液を１分間室温で添加した。さらに洗浄ステップ後、基剤（ＤＡＢ）を添加し試料を用いてインキュベートした（15-20分）。水道水で洗浄後、核をヘマトキシリンで30分間染色した。試料を乾燥させ、Cristal Mountに埋封した（Kaiserゼリー）。細胞系MAB〈CD44〉M-1.1.12および4.3.16由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を表４に示した。方法Ｂでは、MAB〈CD44〉1.1.12は、肺、結腸および膀胱由来の腫瘍組織に対して高い特異性を示し、MAB〈4.3.16〉は結腸由来の腫瘍組織に対して特異性を示した。方法Ａは、MAB1.1.12およびMAB4.3.16は、細胞系MDA4A4（エキソン６低生成物）に比べ、細胞系統ZR-75-1（エキソン６高生成物）、ヒト乳癌細胞系（ATCC CRL 1500）に対する反応は高かった。この細胞系は、細胞系MDA-MB-435Sのサブクローンである（腺管癌、膀胱、ヒト；ATCCH TB 129；サブクローンは、Bao et al，Differentiaion 52（1993），239-246; M DA4A4は本文の参考のMDA-MB-435-C2に一致する）。組換生成ＣＤ４４融合タンパク質を免疫原として得られた一次培養内で（上述参照）、培養PK 9.00.22は、方法Ｂを用いた場合に結腸腫瘍組織に高い特異性を示した。方法Ａを用いた場合、この培養細胞系も細胞系ZR75-1に対して顕著な特性を示した。ドットブロットによる生成抗体の特異性測定細胞抽出物の調製細胞系HT29（ATCCHTB 38-結腸腺癌）およびMDA4A4をＡＴＣＣカタログに従って培地を培養し、プロテアーゼ付加物を選択的に収集した。プロテアーゼ付加物を用いずに収集した細胞を遠心分離し、２倍の体積の溶菌緩衝剤（50mM燐酸カリウム緩衝剤、150mM塩化ナトリウム、pH8.0）に添加し、Do unceホモジナイザーに含めてホモジナイズし、タンパク質の量を測定した。このタンパク質値に基づいて、デタージェント［1%トリトンX-100（Boehringer Mann heim，Germany Cat．No．743119）、0.6％ＣＨＡＰＳ（Boehringer Mannheim，G erm any Cat．No．810681）、1%HECAMEG（Boehringer Mannheim，Germany Cat．No． 1382225）、0.9%オクチルグルコシド（Boehringer Mannheim，Germany Cat．No ．411469）または0.05%ドデシルマルトシド（Boehringer Mannheim，Germany Ca t．No．808342）］を選択的に用いて細胞懸濁液を用いて、タンパク質の濃度を1 -2mg/mlに調整し、2時間かくはんした。遠心分離後、ＣＤ４４またはＣＤ４４ｖを4℃または-20℃で保管し、使用法は変更しなかった。膜を遠心分離した後得られた上澄みは、ＣＤ４４（標準型）とＣＤ４４ｖ（別のエキソンを含むＣＤ４４）を抗体評価たるために十分含んでいた。細胞のｍＲＮＡ濃度のために、MDA4A4 は、ＣＤ４４標準型を多く含み、エキソン６含有のエキソンＣＤ４４ｖHT29細胞のいずれもほとんど含まないことが仮定される一方、多くのエキソン６含有ＣＤ４４ｖを含むことが望ましい。ＣＤ４４またはＣＤ４４ｖを得ることができる別の単純な方法は、その後に細胞分離を行い上述の細胞を収集する代わりにトリプシンで細胞を収集することである。トリプシン阻害剤を添加し、細胞から遠心分離した後に得られた上澄みも、ＣＤ４４およびＣＤ４４ｖを抗体評価するために含む。ドットブロットによる抗体評価さまざまな溶液（例７に従って図７に示されるアミノ酸配列1-43合成生成ＣＤ４４エキソン６ペプチド、HT29細胞抽出物、MDA4A4細胞抽出物）は、毛管によってニトロセルロースに利用した。Crotein Cによる遮断後、抗体（ＡＢ）を用いたニトロセルロースのインキュベーションを行った。抗体と同様に、様々なMAB 〈CD44〉-M細胞系の上澄みを使用した。結合Abの検出は、アルカリ性ホスフェートに接合されたポリクローナル抗Ig抗体を用い行われた。結腸反応には、NBT/X ホスフェートを使用した。反応特異性は、ニトロセルロースのインキュベシーション前に遊離ペプチドを Abに添加することによって示される。反応がエキソン６またはＣＤ４４ｖに特異的である場合、遊離ペプチドを添加した後にニトロセルロースにＡＢは結合しないか、非常にわずかにしか結合しない。以下のクローンを用いた結果が最高のものであった。 MAB〈CD44〉M-1.1.12 MAB〈CD44〉M-2.42.3 以下の化合物は、ニトロセルロース（Schleriher & Schuell 401180）に毛管を用いてスポットした。Ａ：合成生成ＣＤエキソン６、1-43-NH₂、（0.1mg/ml）Ｂ：HT29抽出物（1.2mg/ml）Ｃ：MDA4A4抽出物（1.35mg/ml）インキュベーション緩衝剤（20mMトリス/HCL、150mMNaCl、1%Crotein C、pH7. 4）を用いてニトロセルロースを遮断した後、各場合に２または３滴の１ブロットが、（各ケースについてインキュベーション緩衝剤中希釈または未希釈の1:4 、1:16、1:64、1:256および1:1024の）細胞培養上澄みを用いてインキュベートされた。結合抗体は、PAB〈M-Ig〉S-Fab-Apおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート/4-ニトロブルー-テトラゾリウムクロリド（NBT/Xホスフェート）を色素基剤として検出された。 AB特異性をテストするために、遊離エキソン６、1-43ペプチドの10fg/mlの一つについて抗体のプレインキュベションを行い、テストを二度並行して行った。阻害は、エキソン６特異反応について観察されることが望ましい。細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12およびMAK〈CD44〉M-2.42.3によって生成された抗体は、ドットされたＣＤ４４エキソン６ペプチドおよびHT29細胞の抽出物に結合することができるが、MDA4A4細胞に結合することはできない。モノクローナル抗体をドット済みのＣＤ４４エキソン６ペプチドとHT29細胞の抽出物することは、両方の抗体を合成ＣＤ４４エキソン６によってプレインキュベーションすることによってニトロセルロースに抗原が結合することが阻害されるので、ＣＤ４４ｖの腫瘍特異変異型に特異的である。（表５）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/705 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号ＰＣＴ／ＧＢ９３／０１５２０ (32)優先日 1993年７月20日 (33)優先権主張国世界知的所有権機構（ＷＯ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、その対立変異型、リン酸化生成物、グリコシル化生成物およびその標徴フラグメントに特異的な抗体。２．モノクローナルまたはポリクローナルであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の抗体。３．ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2.42.3または MAK〈CD44〉M-4.3.16によって得られる図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドに特異的なモノクローナル抗体。４．ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2.42.3または MAK〈CD44〉-4.3.16によって生成されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識する請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。５．請求の範囲第１項記載の抗体を生成する方法において、適切な実験動物に図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソンに対応するペプチド、その対立変異型またはそのフラグメントを含む効果的な量の抗原化合物を注入し、該実験動物から血清を収集し、免疫吸着技術によって特異的抗体を単離することを含む方法。６．請求の範囲第１項記載の抗体を生成する方法において、適切な実験動物に、図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含む効果的な量の抗原化合物を注入し、抗体産生細胞を単離し、該細胞を不死化させ、請求の範囲第１項記載の抗体を産生する不死細胞系をスクリーニングし、前記不死細胞系をクローニングし、腹水症から得られた抗体または培養された不死細胞系の上澄みを得ることを含むことを特徴とする方法。７．請求の範囲第５項または第６項記載の抗体を生成する方法において、免疫原として適切な免疫原担体に結合された請求の範囲第１７項記載の融合タンパク質または請求の範囲第１３項記載のペプチドを使用することを特徴とする方法。８．ＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドを含むＣＤ４４タンパク質を検出する免疫検定法であって、図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６ペプチド、その対立変異型またはその標徴フラグメントを使用することを特徴とする免疫検定法。９．ＣＤ４４タンパク質の検出に請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載の抗体を使用する方法。１０．癌診断に請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載の抗体を使用する方法。１１．抗原特異的免疫錯体の検出に請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載の抗体を使用する方法。１２．図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に応じたペプチド配列、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含む免疫検定において使用する標準化合物。１３．図７に示すアミノ酸配列に対応するアミノ酸の長さの少なくとも６個分のペプチド、その対立変異型またはその標徴フラグメント。１４．標識または固相に直接もしくは間接に２つの特異的結合相手によって結合される請求の範囲第１３項記載の方法。１５．免疫検定において請求の範囲第１３項記載のペプチドを使用する方法。１６．請求の範囲第１項から第４項記載の抗体を少なくとも１つ含むことを特徴とするテストキット。１７．図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含む融合タンパク質。１８．図７に示すエキソン６、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含む融合遺伝子。１９．図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、その対立変異型、燐酸化生成物、グリコシル化生成物およびその標徴フラグメントに特異的な抗体を、腫瘍療法用の治療剤または腫瘍のin vivo撮像用の薬剤を製造するために使用する方法。２０．前記抗体がモノクローナルであることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の抗体を使用する方法。２１．前記抗体がハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2. 42.3またはMAK〈CD44〉M-4.3.16によって得られる図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドに対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第１９項または第２０項記載の抗体を使用する方法。２２．ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2.42.3または MAK〈CD44〉M-4.3.16によって産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識することを特徴とする請求の範囲第１９項または第２０項記載の抗体を使用する方法。２３．前記抗体が標徴フラグメント、キメラ抗体、ヒューマナイズド抗体またはヒト型抗体であることを特徴とする請求の範囲第１９項から第２２項までに記載の抗体を使用する方法。２４．前記抗体がヒトIgG1抗体であることを特徴とする請求の範囲第１９項から第２３項記載のモノクローナル抗体を使用する方法。２５．前記抗体がフラグメント、キメラ抗体、ヒューマナイズド抗体またはキメラヒト型抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項記載のモノクローナル抗体。２６．前記抗体がヒトIgG1抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項または第２５項記載のモノクローナル抗体。