JPH08507221A - アルカリ耐性キシラナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はpH9.0および温度70℃でかなりのキシラナーゼ活性を有する酵素を開示している。本酵素は好アルカリ性バチルスに関連する登録された株から入手しうる。この酵素は製紙およびパルプ生産工程で使用するのに適している。

Description

【発明の詳細な説明】 アルカリ耐性キシラナーゼ 技術分野 本発明は新しい微生物および新しい酵素に関する。特に、該酵素はアルカリ耐 性キシラナーゼである。これらのキシラナーゼは、グラム陽性であってアルカリ 耐性の微生物から得られる。このキシラナーゼは製紙およびパルプ工業で使用さ れる条件下、即ちpH9および温度70℃で使用しうる。 発明の背景 キシランは植物ヘミセルロースの成分である。キシランは1,4-グリコシド結合 したβ−D-キシロースからなる。通常、キシランはキシロースおよびその他のペ ントース、ヘキシロースおよびウロン酸を含む側鎖を有している。 製紙工業においてパルプの漂白は重要なステップである。製紙およびパルプ工 業におけるパルプ処理に使用されるステップの概略を以下に示す： いわゆる酸素脱リグニンステップにおいてパルプをpH10-12、80℃で処理し、大 部分のリグニンを除去する。残ったパルプは2-5%のリグニンを含む。このリグニ ンがパルプを茶色にしている。続いてパルプを多段階漂白プロセスにおいて漂白 する。この漂白では塩素、二酸化塩素、過酸化水素および／またはオゾン等の化 学物質を使用して高品質紙用のパルプを得る。 パルプの茶色の原因となっているリグニンを除くのに塩素および塩素含有化学 物質が使用されることが多い。これらの化学物質の使用でダイオキシンおよびそ の他の塩素化有機化合物が生成する。これらの化合物は環境を脅かすので、同様 の廃棄物を生ずる化学物質の使用を控える傾向にある。 この事は無塩素の方法；全塩素フリー（TCF）およびエレメンタリー塩素フリ ー（ECF）を開発する傾向を推進している。これらの方法では過酸化水素または オゾンを漂白に使用している。 製紙およびパルプ生産工程に酵素ステップを導入することには、幾つかの利点 がある。 キシラナーゼは製紙およびパルプ処理に非常に有用であることが分かってきた 。キシラナーゼはパルプからのリグニンの抽出を増加するという報告がある。キ シラナーゼは酸素脱リグニンステップの後に使用されることが多い。 キシラナーゼはリグニンとセルロースに連結しているヘミセルロース鎖を切断す る。キシラナーゼ処理後、リグニンは次のステップで容易に除去される。 従って、キシラナーゼの使用は予備漂白における活性塩素の消費を25-30%減少さ せる。この塩素の減少は生成する紙の質を低下させることはない（ビカリ（Viik ari）等、1986．Proc．of the third Int．Conf．Biotechnology in Pulp andPa per Ind.，ストックホルム、p.67-69およびバパイ（bajpai）およびバパイ（baj pai）．1992．Process Biochemistry．27：319-325）。 また、キシラナーゼ処理は漂白工程における他の化学物質の必要量も減少させ る。 クラフトパルプの漂白における菌類由来のキシラナーゼの使用が報告されてい る。この酵素の至適pHおよび温度は、pH=3-5およびT=30-50℃である。これらの 値は従来の条件であるpH≧9および温度≧70℃の漂白工程で使用するには理想的 とは言えない。 高いpHおよび／または温度至適値を有する細菌由来のキシラナーゼも漂白工程 で使用した報告が成されている。これらの一部を以下に示す；バチルス パミラ ス（Bacillus pumilus）（pH=7.9，T=40℃、ニッセン（Nissen）等、1992．Prog ress in Biotechnology 7：325-337）、ジクトボグロマス サーモフィラム（Di ctvoglomus thermophilum）（pH=6-8，T=70℃、ヨーロッパ特許出願EPO 511 933 ）、B．ステアロサーモフィラス（stearothermophilus）T-6（pH=9.0，T=65℃、 ショーハム（Shoham），Y等、（1992）Biodegradation 3,207-218）、B．ステア ロサーモフィラス（stearothermophilus）（pH=9，T=50℃、WO 91/18976）およ びサーモアネアロバクター エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus） （68℃、デブロイス（Deblois）およびウィーゲル（Wiegel）．1992．Progress inBiotechnology 7：487-490）。 上述のほとんどのキシラナーゼはpH≧9および温度≧70℃で活性を示すが、工 業的条件（即ち、パルプの漂白）における有効性、例えばパルプのブライトネス の増加に関する有効性は限られたものであり、有意に変化しうる（例えば、WO 9 1/18976参照、pH9および50℃におけるパルプのブライトネスの増加はISO規格で 僅か0.5%であった）。 発明の概要 本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関してお り、かつ、該キシラナーゼが16SリボゾームDNA配列がSEQ.ID No.20に示したよう にDSM8721株の16SリボゾームDNA配列と92%の一致を示す微生物に由来することを 特徴とする。 また、本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関 しており、かつ、該キシラナーゼが以下に示す登録番号：CBS666.93、667.93、6 69.93および673.93で登録されている株を含む群から選択される微生物に由来す る事を特徴とする。 さらに、本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに 関しており、かつ、該キシラナーゼがpH9.0、温度65℃でパルプの酵素処理を行 うECFパルプ漂白工程において酵素未処理のパルプよりもソフトウッド・パルプ のISOブライトネス1.0%、望ましくは1.5乃至5.0%の増加をもたらすことを特徴と する。 また、本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関 しており、かつ、該キシラナーゼがpH9.0、温度65℃でパルプの酵素処理を行うE CFパルプ漂白工程において酵素未処理のパルプよりもソフトウッド・パルプのIS Oブライトネス1.0%、望ましくはハードパルプのISOブライトネス1.5乃至5.0%の 増加をもたらすことを特徴とする。 発明の詳細な説明 本発明は東アフリカのケニアのアルカリソーダ湖の周辺で採取された土壌およ び水試料から単離された微生物に関する。これらの微生物は好アルカリ性、グラ ム陽性であり、バチルス属に属する（以下参照）。 この微生物をさらにキシラン寒天拡散検定法でスクリーニングした。このテス トで透明帯を示す株を潜在的なキシラナーゼ生産株として単離した。 この株をpH10およびT=45℃で生育させた。遠心後、培養培地をpH9および温度8 0℃の検定でキシラナーゼ活性を調べた（実施例2）。 この条件下でキシラナーゼ活性を生産する8種の株が見つかった。これらの微 生物は登録番号CBS 666.93、667.93、668.93、669.93、670.93、671.93、672.93 および673.93でオランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・デ・シメルカ ルチャーに寄託された。 これらの株のほとんどはニールセン（Nielsen）等（1994、FEMS Microbiol．L ett．117，61-65）によって示された16SリボゾームDNA配列比較を使用した同定 のためにデスチェ・サムルング・ホン・ミクロオーガニズメン・ウンド・ゼルク ルツレンGmbH（DSM）に送られた。この配列比較に基づき、8種の株はバチルス属 と指定され、B.アルカロフィラス（alcalophilus）（DSM485^T）と非常に関連が 深い。さらに、配列比較はこれらの8種の株が2つのグループに分類されることを 示した。最初のグループはDSM8721に非常に似ているか、または殆ど同一であり 、株1-16-2、1-25-2および1-43-3（各々CBS 670.93、671.93、672.93）を含んで いる。第2のグループはDSM8718と非常に関連が深く、株2-47-1、2-M-1、1-47-3 および2-26-2（各々CBS 666.93、667.93、669.93および673.93）を含んでいる。 これら2つのグループへの分類はキシラナーゼ・ザイモグラムで確認された。意 外にも、第1グループの株、すなわちDSM8721に関連する株（1-16-2、1-25-2およ び1-43-3を含む）に由来するキシラナーゼはパルプ漂白において顕著な性能を示 した。この性能は本発明の酵素で処理した場合のソフトおよびハードパルプのブ ライトネスの増加で示され、特にソフトパルプの場合に顕著である。この点で第 2グループ、すなわちDSM8718に関連する株の殆どから得られるキシラナーゼの性 能は、他の株と比較して1-47-3株由来のキシラナーゼがハードパルプに関して最 良の性能を示したものの十分なものではなかった。本発明の酵素で得られるブラ イトネスの増加は非酵素処理コントロールパルプと比較して△最終ISOブライト ネス増加として少なくとも1.0%である。望ましくはソフトウッド・パルプの場合 のブライトネス増加は1.5乃至5.0%であり、ハードウッド・パルプの場合は 1.2乃至3.0%である。 本発明はキシラナーゼ活性を有し、かつ、pH9および温度約70℃でかなりのキ シラナーゼ活性を有する酵素を開示している。該酵素は上述の登録株から入手し うる。また、該酵素は該寄託株の変異株からも入手しうる。 「かなりの活性」という表現は、本発明の酵素がpH9で、それらがpH7で有する 活性の40%、望ましくは60%、さらに望ましくは約80%を有することを意味してい る。本発明の殆どの望ましい態様では、キシラナーゼの活性がpH7よりpH9の方が 高い。 また、本発明は遺伝子工学を用いて開発されたキシラナーゼの生産方法を開示 している。第１ステップとして本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子をλフ ァージ（発現）ベクターおよび大腸菌宿主細胞を用いてクローニングする。別に 、保存的ドメインに基づいて設計したコンセンサス・プライマーを用いたPCRク ローニングを使用することもできる。多くのキシラナーゼのホモロジー比較に基 づき、種々のクラスの差が提唱されている（ギルケス（Gilkes）等、1991，Micr obiol．Rev．55,303-315）。各クラスに対して特異的な保存ドメインが同定され ている。クラスFおよびクラスGのキシラナーゼはこの決定方法に基づいて同定し うる。２つの保存ドメイン間にあるDNAフラグメントをPCRでクローニングしうる 。全長クローンはインバースPCRまたは遺伝子ライブラリーのハイブリダイゼー ション・クローニングで得ることができる。大腸菌における本発明のキシラナー ゼをコードする遺伝子の発現は活性タンパク質を提供することを示している。該 タンパク質はpH9および温度70℃で活性である。 大腸菌における第1のクローニングステップ後、キシラナーゼ遺伝子は、バチ ルスまたはストレプトマイセス種、アスペルギラス等の繊維状菌類、または酵母 等の工業的に望ましい発現宿主に転移することができる。これらの宿主生物で得 られる高い発現および分泌レベルは培養培地における本発明のキシラナーゼの蓄 積を可能にし、つづいてキシラナーゼをそこから回収しうる。 さらに、本発明は該寄託株から得られ、かつpH9および温度70℃でかなりの活 性を有するキシラナーゼの調製法に関する。この方法には、適当な培地における 本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を発現する寄託微生物または組み換え 宿主微生物の培養、およびそれに続くキシラナーゼの回収が含まれる。 本発明の酵素はオート・スペルト・キシランおよびバーチウッド・キシランに 関してかなりの活性を有することが示されている。 さらに、本発明の酵素は漂白活性に関しても検定された。酵素調製物キシラナ ーゼは少なくとも80℃の温度、少なくともpH9の条件でウッドパルプを脱リグニ ンすることができる。「ウッドパルプ」とは広く解釈するべきもので、全てのリ グノセルロース物質が含まれる。本発明の酵素は製紙およびパルプ生成工程にお ける酸素脱リグニンステップの直後に使用しうる。この酵素は酸素脱リグニンス テップの前に使用するのが望ましい。このステップにおけるリグニン濃度はより 高く、従ってキシラナーゼの使用の効果がより大きくなる。 本発明の酵素についてハードウッドおよびソフトウッドの両方に関する検定を 行った。カッパ還元とは別に、2つのパルプ、ソフトウッドおよびハードウッド ・クラフトパルプに関してECF漂白検定法でブライトネスの増加を測定した。本 発明のキシラナーゼで生成したブライトネスの増加は漂白化学物質の量の減少を もたらすと同時に、酵素を使用しない場合と同様のブライトネスが達成できた。 さらに、本発明は本発明の酵素調製物の応用、特にウッドパルプを本発明の酵 素調製物で処理する工程、およびウッドパルプおよびフラッフを本発明の酵素調 製物で処理する工程に応用することに関する。 さらに、本発明は本発明の酵素調製物で処理したウッドパルプから生成する紙 、板およびフラッフパルプに関する。 さらに、本発明の酵素調製物は低いセルラーゼ活性を有することが示された。 実施例1 アルカリーおよび熱耐性キシラナーゼの単離 試料 土壌および水試料は東アフリカのケニアにあるアルカリソーダ湖の周辺から採 取した。 キシラナーゼ生産微生物のスクリーニング キシラナーゼ生産微生物の単離には2つの方法を採用した： i）土壌および水試料を0.85%の食塩水に懸濁し、キシラン・寒天拡散検定に直接 使用した。 ii）土壌および水試料をキシラン含有液体最小培地またはGAM培地中で各々、45 、55および70℃の温度で1-3日間インキュベートした。細菌増殖を示した培養物 はキシラン・寒天拡散検定法を用いたキシラナーゼ活性を分析した。 培地 キシラン・寒天拡散検定法および濃縮操作で使用した最小培地（pH9.7）にはK NO₃ 1%、酵母抽出物（Difco）0.1%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄・7H₂O 0.02%、Na₂CO₃ 1%、NaCl 4%および4種の市販キシラン混合物（各0.05%）（オート・スペルト由 来のキシラン（シグマX-0376）、バーチウッド由来のキシラン（シグマX-0502） 、オート・スペルト由来のキシラン（サーバ38500）、ラーチウッド由来のキシ ラン（ICNバイオケミカルズ103298））を含んでいる。固体化には1.5%の寒天を 添加した。 酵素生産に使用した複合培地（GAM）にはペプトン（Difco）0.5%、酵母抽出物 （Difco）0.5%、ぶどう糖・H₂O 1%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄・7H₂O 0.02%、Na₂CO₃ 1%、NaCl 4%が含まれている。pHは1%キシラン添加後4 M HClで9.5に調整した。 キシラン・寒天拡散検定法 0.85%塩溶液中の細胞懸濁液をキシラン含有最小培地にプレーティングした。 各々45および55℃で1-3日間インキュベーション後、コロニーの周辺に透明帯を 示す株を潜在的キシラナーゼ生産微生物として単離した。 アルカリーおよび熱耐性キシラナーゼ生産株の単離 寒天拡散検定法で透明帯を示した株を100ml振盪フラスコ中の25mlGAM培地で45 ℃、250rpmのインキュベーター・シェーカー（ニュー・ブランズウィック・ サイエンティフィック、エジソン、NJ，USA）を用い72時間培養した。キシラナ ーゼ活性はpH9および80℃の培養培地中で測定した（実施例2）。 粗酵素調製物の単離 振盪フラスコ培養は500mlのGAM培地を含む2リットル三角フラスコで行った。 このフラスコを45℃、250rpmの振盪インキュベーターで48-96時間インキュベー トした。遠心で細胞を培養溶液から分離した（8000rpm）。無細胞培地はYN5フィ ルターを装着したアミコン・スタード・セル・モデル8400を用いた限外濾過で濃 縮した。 実施例2 アルカリ-および熱耐性キシラナーゼの特性 分析法 キシラナーゼ活性の検定法はサムナー（Sumner）検定法（J．Biol．Chem．192 1．47，5-9）の修正法を用いて行った。 操作1 オートスペルト・キシランに関するキシラナーゼ活性 200μlの4%オート・スペルト・キシラン懸濁液および適当なバッファで希釈し た600μlの無細胞培養培地（実施例1）で試験管を満たす。この試験管を水浴中 で15分間インキュベートする。インキュベート後、7.2mlのDNS（ジニトロサリシ ン酸）試薬を添加する。この混合物を水浴中100℃で10分間加熱する。加熱後こ の試験管を氷中で冷却する。575nmの吸光度を測定する。酵素試料のバックグラ ンド吸光度を除去するため、以下のようにコントロール実験を行った。基質を含 む試験管を上記試験管と同様の条件でインキュベートした。インキュベート後、 7.2mlDNSおよび酵素調製物を（この順序で）添加した。キシラナーゼ活性1ユニ ット（xU）は1分間にキシランから還元糖として測定される1μmolのキシロース を生成する酵素量と定義される。 実際の測定条件はpH7および9、および温度70および80℃であった。バッファ にはリン酸バッファpH7および硼酸／KCl pH9を使用した。結果は相対活性として 表1に示す。 表1、2および3に示した1乃至8の株は以下の寄託番号で寄託されている。 2-47-1=CBS 666.93，2-m-1=CBS 667.93 2-16-1=CBS 668.93，1-47-3=CBS 669.93 1-16-2=CBS 670.93，1-25-2=CBS 671.93 1-43-3=CBS 672.93，2-26-2=CBS 673.93 操作2 バーチウッド・キシランに関するキシラナーゼ活性 操作1と同様の方法を使用した。4%オート・スペルト・キシラン懸濁液の代わり に、4%バーチウッド・キシラン懸濁液を使用した。検定条件は各々pH7および9、 および温度70℃および80℃である。結果を表2に示す。 実施例3 70℃および80℃における脱リグニン検定 カッパ検定法 カッパ検定法はTAPPI T236プロトコールを一部修正して行った。酵素溶液はパ ルプ1g当たり10xU投与し（パルプnb1に対してオート・スペルト・キシランおよ びパルプ2および3に対してバーチウッド・キシラン）（乾燥重量）、pH9、70℃ および80℃で2時間インキュベートした。コントロールは酵素添加無しで同様の 条件、同様の時間のインキュベーションを行った。3種類のパルプを使用した。 1］クラフト・ソフト・パルプ 2］酸素脱リグニン化後のクラフト・ソフト・パルプ 3］酸素脱リグニン化後のクラフト・ハード・パルプ 酵素添加のカッパ数と酵素無添加のカッパ数の差はカッパ・リダクションと呼ば れており、脱リグニン化の指標となる。カッパ・リダクションを表3Aに示す。 60℃における脱リグニン化 カッパ検定法 カッパ検定法はTappi T236プロトコールを一部修正して行った。酵素溶液をパ ルプ1g当たり10xUの割合で投与し（バーチウッド・キシランに基づき）（乾燥重 量）、pH9、60℃で2時間インキュベートした。コントロールは酵素無添加で同条 件、同時間インキュベートしたパルプである。2種のパルプ： -酸素脱リグニン化後のクラフト・ハードウッド・パルプ（nb2） -酸素脱リグニン化後のクラフト・ソフトウッド・パルプ（nb4） 酵素添加におけるカッパ数と酵素無添加のカッパ数の差はカッパ・リダクショ ンと呼ばれ、脱リグニン化の指標となる。カッパ・リダクションを表3Bに示す。 実施例4 セルラーゼ活性 セルラーゼ活性の検定はPAHBAH（パラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）検定法 （Anal．Biochem．1972，47：273-279）の修正法で行った。 0.9mlの0.5%CMC（カルボキシメチルセルロース）を0.1mlの希釈酵素調製物とp H9、70℃で1時間インキュベーションした。インキュベーション後、3mlのPAHBAH 試薬（0.5M HCl中5%のPAHBAH溶液10mlを40mlの0.5M NaOHと混合した：PAHBAH試 薬）を添加し、この反応混合物を100℃で5分間加熱した。氷上での冷却後、420n mの吸光度を測定した。酵素試料のバックグランド吸光度を除去するために、コ ントロール実験を以下のように行った。CMCをpH9、70℃で30分間インキュベーシ ョンし、PAHBAH試薬添加後、酵素溶液を添加した。1セルラーゼ・ユニット（cU ）は毎分1μmolのグルコースを生成するのに必要な酵素量と定義され（基質とし てCMCを使用）、この値はキシラナーゼ活性と相関を有する。検定した全ての株 はキシラナーゼユニット当たり10mU以下のCMCase活性を有していた。 実施例5 キシラナーゼ遺伝子およびその断片のクローニング 染色体DNAは従来法（マニアチス（Maniatis）等、コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラトリーズ、1989）に従い実施例2で述べた株から単離した。スト ラタジーン製のZAP Expressクローニング・システムを使用し、選択した株各々 に対しゲノム・ライブラリーを構築した。宿主／ベクターシステムは業者の説明 書に従って使用した（カタログ番号＃239212，1993年6月30日）。構築を目的と して、BamHI部位にライゲーションしたSau3A消化物またはEcoRI部位にライゲー ションしたEcoRIリンカーを有するランダム切断DNAを使用した。 組み換えファージを業者の推奨するプラスミド・ベクターにトランスホーメー ションした。これらのプラスミド・ベクターについてRBBキシラン・インジケー ター・プレートを使用してキシラナーゼ発現を検定した。 陽性コロニーを単離し、以下の培地を使用してキシラナーゼ生産を検定した： 生産培地： 4×LBC： 20g 酵母抽出物 40g バクト・トリプトン 10g NaCl 4g カザミノ酸 を0.25mlの消泡剤を含む脱イオン水で1リットルとし、120℃で20分間滅菌する。 コロニーを激しい振盪条件下、30℃で24時間培養した。 熱ショック法（65℃、10分間）で細胞を分解し酵素を単離した。キシラナーゼ 活性は上述のように測定した。各コロニーの検定結果を表4に示す。 実施例6 選択されたキシラナーゼ・コード挿入物の特性 キシラナーゼ生成クローンのDNA挿入物はDNAシーケンシングで特徴付けること ができる。KEX106の挿入物を分析し、アルカリ耐性キシラナーゼをコードする遺 伝子を同定した。該遺伝子のDNA配列をSEQ.ID No.1に示す。 コードされているタンパク質のアミノ酸配列（SEQ.ID No.2）の比較はキシラ ナーゼタンパク質配列との93%のホモロジーを示した（ハマモト（Hamamoto）等 、1987、Agric．Biol．Chem.，51，953-955）。 従って、本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列はSEQ.ID No.2のアミノ酸配列と9 3%以上の一致、望ましくは少なくとも95%の一致、より望ましくは少なくとも98% の一致、最も望ましくは99%以上の一致を示しうる。 実施例7 アルカリ耐性キシラナーゼをコードする遺伝子の内部フラグメントの同定および クローニング 遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための別法としてPCRクローニングに 基づく方法を検討した。多くのキシラナーゼ配列の比較に基づき、保存的配列ボ ックスを含むコンセンサス・オリゴヌクレオチド・プライマーを設計した。一組 のプライマーはF型のキシラナーゼに対するものであり、別の組のプライマーはG 型のキシラナーゼに対するものである。 以下のコンセンサス・プライマーを構築した： FA：5’CAC ACT/G CTT/G GTT/G TGG CA3’：フォワード・プライマー、コンセン サス・ボックス1（SEQ.ID No.3） FB：5’CAT ACT/G TTT/G GTT TGG CA3’：フォワード・プライマー、コンセンサ ス・ボックス1（SEQ.ID No.4） FR：5’TC/AG TTT/G ACC/A ACG/A TCC CA3’：リバース・プライマー、コンセン サス・ボックス2（SEQ.ID No.5） プライマーFAおよびFBは同じコンセンサス・ボックスに結合するが、ヌクレオ チド配列の差が僅かなのでこれらは相補的な特異性を示す。 PCR条件は以下のとおりである：［94℃、1分］，［50℃、1分］および［72℃ 、1分］30サイクル。F型のプライマーを用いた増幅から生ずるフラグメントをア ガロース・ゲルで精製し、サブクローニングした。つづいて、そのDNA配列を決 定した。 G_AF：5’GAA/G TAT/C TAT/C ATT/C/A GTN GA：フォワード・プライマー、コンセ ンサス・ボックス1（SEQ.ID No.6） G_BF：5’GAA/G TAT/C TAT/C GTN GTN GA：フォワード・プライマー、コンセンサ ス・ボックス1（SEQ.ID No.8） G_AR：5’CG/TN ACN GAC CAA/G TA：リバース・プライマー、コンセンサス・ボッ クス2（SEQ.ID No.7） G_BR：5’CG/TN ACA/G CTC CAA/G TA：リバース・プライマー、コンセンサス・ボ ックス2（SEQ.ID No.9） G_CR：5’CCR CTR CTK TGR TAN CCY TC：リバース・プライマー、コンセンサス・ ボックス3（SEQ.ID No.10） PCR条件は以下のとおりである：［94℃、1分］_,［40℃、1分］および［72℃、 1分］30サイクル。 Gプライマーを用いた最初のPCRはボックス1およびボックス3に関して構築した プライマーで行った。種々のサイズのフラグメントの混合物をアガロース・ゲル で精製し（250-340bp）、ボックス1およびボックス2に関して構築したプライマ ーで行う第2のPCRに提供した。単一のフラグメントが増幅され、これをサ ブクローニングした。PCRフラグメントの平滑末端の修復はPCR混合物に0.5mM A TP（ベーリンガー・マンハイム）、10ユニット T4 DNAキナーゼ（BRL）および T4 DNA ポリメラーゼ（BRL）を添加し、37℃で1時間インキュベートした。この 混合物をQuiagenのPCR抽出キットで精製した。このフラグメントをマニアチスの 方法に従ってアプリジーン製のpUC18xSmaI（CIAP）ベクターにライゲーションし た。エレクトロポレーションを使用して大腸菌HB101laqlqにライゲーション混合 物をトランスホーメーションした。多くのクローンのDNA配列を決定した。 分析から選択した株が数種のキシラナーゼ遺伝子を宿しており、その一部はF 型のコンセンサス・プライマーでクローン化され、他のものはG型のプライマー でクローン化されていることが明らかになった。例として株1-43-3、1-47-3、1- M-1、2-26-2（全てF型）および1-43-3および1-25-2（全てG型）由来の種々のキ シラナーゼフラグメントを配列リスト中に示した（表5参照）。 次に、特異的プローブとしてクローン化したフラグメントを使用し、ストリン ジェント・ハイブリダイゼーション条件を使用しラムダZAP遺伝子ライブラリー 由来のクローン化した遺伝子フラグメントを単離した。全てのクローン化した遺 伝子はこの方法で単離しうる。 これらの遺伝子は実施例5で示した方法の検出から逃れるので、この方法は特 に大腸菌において内在する遺伝子調節シグナルからうまく発現しない遺伝子に対 して有効である。サブクローニング法およびDNA配列分析を使用して、種々のア ルカリ耐性キシラナーゼをコードする完全な遺伝子を単離し、大腸菌内で生産す るための発現シグナルを装着しうる。 実施例8 キシラナーゼ・クローンの特性 コンセンサス・プライマーおよび特異的プライマーの両方を用いて、実施例5 で述べたクローンの特性を調べた。クローン化した挿入物の一部にはキシラナー ゼ遺伝子のクラスターが存在することが明らかになった。この発見に基づき、単 一の遺伝子を大腸菌および枯草菌の両方に対する発現ベクターにサブクローニン グした。単一要素キシラナーゼの発現が大腸菌および枯草菌の両方へのトランス ホーメーションで得ることができた。バチルス発現システムはPlugBug技術［ref l］に基づくものである。 実施例9 選択されたG型キシラナーゼをコードする挿入物の特性 クローンKEX301の挿入物を分析し、G型キシラナーゼをコードするオープン・ リーディング・フレームを同定した。このORFの配列をSEQ.ID No.18に示し、キ シラナーゼの誘導アミノ酸配列をSEQ.ID No.19に示した。EMBLデータベース（リ リース39、バージョン2）内の相同遺伝子の探索は、G1キシラナーゼの配列がユ ニークなものであることを示した。68%以上のDNAホモロジーは発見できなかった 。また、タンパク質配列もデータベース配列と比較した。最も近い（72%）ホモ ロジーはxynY キシラナーゼ配列で見つかった（ユ（Yu）等、1993，J．Microbi ol．Biotechnol．3，139-145）。 従って、本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列は少なくとも72%、望ましくは 少なくとも80%、より望ましくは少なくとも90%、さらに、より望ましくは少なく とも95%、最も望ましくは99%以上のホモロジーをSEQ.ID No.19のアミノ酸配 列と共有する。 refl：クワックス（Quax）、W.J.等、1993、Industrial Microorganisms：Bas icand Applied Molecular Genetics，ASM，ワシントンDC.，p143。 実施例10 寄託株由来の上清を使用したパルプ漂白実験 全ての実験はXwDED漂白シーケンスを用いたエレメンタリー塩素フリー（ECF） 漂白である。パルプの酵素処理はpH9、65℃で2時間行った。実験中の適正な温度 を保証するために、酵素を添加する前にパルプをマイクロ波で65℃に加熱した。 実験はpH調整した水道水を添加することでパルプを10%一定に保った。寄託株の キシラナーゼ含有培養上清に関するECF漂白の結果を表6に示す。 実施例11 大腸菌で発現されるクローン化されたキシラナーゼ遺伝子によるパルプ漂白 寄託株から得られたクローン化されたキシラナーゼ遺伝子を発現する大腸菌ク ローン3種に由来するキシラナーゼを、実施例10で説明したパルプ漂白実験で検 定した。大腸菌クローンを実施例5と同様に培養した。組み換え酵素は以下に示 す3種の方法のうちの1種を用いて大腸菌から単離した。 1.全分解物 この場合、全細胞培養物（細胞＋増殖培地）を収穫した。細胞を超音波で破壊 し、65℃で10分間加熱した。この分解物を遠心で清澄化した。 2.細胞ペレット 細胞を遠心で培地から分離した。細胞ペレットを50mM トリス-HCl（pH7.0） で10ml／g湿重量となるように懸濁した。この細胞懸濁液を超音波で処理し、「 全分解物」で述べたように加熱した。 3.培養上清 遠心で培養培地を全細胞から分離した。清澄化した培地を限外濾過して（タン ジェンシャル・フロー、10,000MWCOメンブレン）全容積を減少させ、かつ、50mM トリス-HCl（pH7.0）で置換した。 漂白実験の結果を表7に示す。 実施例12 寄託株の同定 これらの株のほとんどはニールセン（Nielsen）等（1994、FEMS Microbiol．Let t．117，61-65）によって報告されている16SリボゾームDNA配列の比較を用いた 同定を行うためにデスチェ・サムルング・ホン・ミクロオーガニズメン・ウンド ・ゼルクルツレンGmbH（DSM）に送られた。この同定の結果を表8に示した。この 配列比較に基づき8種の株はバチルス属と指定され、また、これまで知られてい るバチルス属のうちB.アルカロフィラス（alcalophilus）（DSM485^T）と最も関 連が深い。 さらに、配列比較はこれらの8種の株が2つのグループに分類されることを示し た。最初のグループはDSM8721に非常に似ているか、または殆ど同一であり、株1 -16-2、1-25-2および1-43-3（各々CBS 670.93、671.93、672.93）を含んでいる 。第2のグループはDSM8718と非常に関連が深く、株2-47-1、2-M-1、1-47-3およ び2-26-2（各々CBS 666.93、667.93、669.93および673.93）を含んでいる。 本発明のキシラナーゼは第１グループの株、すなわちDSM8721（1-16-2、1-25- 2および1-43-3を含む）に関連する株から得られる。従って、本発明のキシラナ ーゼは16SリボゾームDNA配列がDSM8721と少なくとも92%、望ましくは少なくとも 93.3%、より望ましくは少なくとも96.6%、さらに望ましくは少なくとも99%、最 も望ましくは100%のホモロジーを有するバチルス株から得られる。 配列リスト （1）一般的情報： （i）出願人： （Ａ）氏名：（ギストブロケーズ）Ｂ．Ｖ． （Ｂ）町名：ウォータリンクセウェブ１ （Ｃ）市：デルフト （Ｅ）国：オランダ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：２６１１ ＸＴ （ii）発明の名称：アルカリ耐性キシラナーゼ （iii）配列数：２０ （iv）コンピュータ仕様： （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパチ （Ｃ）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.0、バージョン＃1.2 5（ＥＰＯ） （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報： （i）配列特性： （Ａ）長さ：１１９１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−４７−３ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６６９．９３ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）場所：１．．１１９１ （Ｄ）その他の情報：／生産物＝“キシラナーゼ” （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９６アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：タンパク質 （iii）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＦＡ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＦＢ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＦＲ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＧＡＦ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＧＡＲ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離：ＧＢＦ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＧＢＲ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ｃ）単離物：ＧＣＲ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４２塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−４３−３ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−４７−３ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６６９．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：２−２６−２ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７３．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：２−ｍ−１ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６６７．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−２５−２ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７１．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−４３−３ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−４３−３ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：７４４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （iii）アンチ・センス：なし （vi）起源： （Ｂ）株：１−４３−３ （Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）場所：１．．７４４ （Ｄ）その他の情報：／生産物＝“キシラナーゼ” （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４７アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：タンパク質 （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９： （2）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５２１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖型：二本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：なし （vi）起源： （Ａ）生物名：（バチルス）ｓｐ． （Ｃ）単離物：ＤＳＭ８７２１ （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アイヴァーソン サラ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02173 レキシントン チェイス アベニ ュー 60 (72)発明者 ファーレル ロバータ リー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01450 グロートン オールド エアー ロード 264 (72)発明者 ヘルベス ウィルヘルミナ テレージア オランダ国 エヌエル‐2201ベーヴェー ノールドウェイク シャールホレン 47 (72)発明者 ファン デル クライ ウィルヘルムス アントニウス ヘンドリクス オランダ国 エヌエル‐2671デーヘー ナ ールドウェイク ホーヘ ウールド 26 (72)発明者 ヘルウェイエル マルガレータ アドリア ナ オランダ国 エヌエル‐1018ヴェーヘー アムステルダム ニウ ケイゼルスフラヒ ト 464 (72)発明者 ファン ベックホーヴェン ルドルフ フ ランシスカス ウィルヘルムス コルネル ス オランダ国 エヌエル‐4834エーカー ブ レーダ ホッフウェイクストラート 69 (72)発明者 クアックス ウィルヘルムス ヨハネス オランダ国 エヌエル‐2253ヴェーベー フォールショッテン イェー ファン ガ ーレンラーン ８ (72)発明者 ヘーデヘブール フリッツ オランダ国 エヌエル‐3137エヌアー ヴ ラールディンヘン ベルンウェッヒ 43 (72)発明者 ジョーンズ ブライアン エドワード オランダ国 エヌエル‐2263ヴェーアー レイドシェンダム フラーヴィン ユリア ーナ ファン ストールベルグラーン 24

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．pH9.0および温度70℃でかなりの活性を有するキシラナーゼ。 ２．16SリボゾームDNAの配列がSEQ.ID No.20に示したDSM8721株の16Sリボゾーム DNA配列と92%以上のホモロジーを共有する微生物から得られることを特徴とする 請求項1記載のキシラナーゼ。 ３．バチルス種DSM8721から得られることを特徴とする請求項1または2記載のキ シラナーゼ。 ４．前記キシラナーゼのアミノ酸配列がSEQ.ID No.19に示したアミノ酸配列と72 %以上のホモロジーを共有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか1項記 載のキシラナーゼ。 ５．pH9.0および温度70℃でかなりの活性を有するキシラナーゼであって、寄託 番号：CBS 666.93，667.93．669.93および673.93で寄託されている株からなる群 から選択される微生物から得られることを特徴とするキシラナーゼ。 ６．前記キシラナーゼのアミノ酸配列がSEQ.ID No.2に示したアミノ酸配列と93% 以上のホモロジーを共有することを特徴とする請求項５記載のキシラナーゼ。 ７．pH9.0および温度70℃でかなりの活性を有するキシラナーゼであって、pH9.0 および温度65℃でパルプ処理を行うECFパルプ漂白処理において、非酵素処理パ ルプと比較してソフトウッド・パルプのISOブライトネス増加が少なくとも1%以 上、望ましくは1.5乃至5%の増加を示すことを特徴とするキシラナーゼ。 ８．pH9.0および温度70℃でかなりの活性を有するキシラナーゼであって、pH9.0 および温度65℃でパルプ処理を行うECFパルプ漂白処理において、非酵素処理パ ルプと比較してソフトウッド・パルプのISOブライトネス増加が少なくとも1%以 上、望ましくはハードウッド・パルプのISOブライトネス増加が1.2乃至3.0%であ ることを特徴とするキシラナーゼ。 ９．請求項1乃至8のいずれか1項記載のキシラナーゼをコードする単離されたDNA 配列。 10．微生物宿主細胞をトランスホーメーションしうるベクターであって、請求項 9記載のDNA配列を含むことを特徴とするベクター。 11．DNA配列が微生物宿主中において該DNA配列の発現を保証する発現シグナルに 機能的に結合することを特徴とする請求項10記載のベクター。 12．請求項10または11記載のベクターを含む微生物宿主。 13．前記微生物宿主が前記DNA配列を発現することを特徴とする請求項12記載の 微生物宿主。 14．前記キシラナーゼが適当な培地におけるキシラナーゼを生産する微生物の培 養、および培養物からのキシラナーゼの回収により入手しうることを特徴とする 請求項1乃至8のいずれか1項記載のキシラナーゼの調製方法。 15．前記微生物が請求項13記載の微生物宿主である請求項14記載の方法。 16．請求項1乃至8のいずれか1項記載のキシラナーゼの使用を含むキシランの分 解方法。 17．請求項1乃至8のいずれか1項記載のキシラナーゼの使用を含むウッド・パル プの脱リグニン化方法。 18．請求項1乃至6のいずれか1項記載のキシラナーゼの使用を含むパルプの漂白 方法。