JPH08507530A

JPH08507530A - トランスフォーミング成長因子βによる受胎能調節

Info

Publication number: JPH08507530A
Application number: JP6520281A
Authority: JP
Inventors: フェインバーグ，ロナルド・エフ; クリマン，ハーヴィー・ジョン
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1993-03-10
Filing date: 1994-03-08
Publication date: 1996-08-13
Also published as: DK0688365T3; EP0688365A4; EP0688365A1; US5395825A; DE69432951D1; CA2156613A1; EP0688365B1; AU6399894A; ATE245196T1; US5693479A; AU676727B2; DE69432951T2; WO1994020637A1

Abstract

(57)【要約】本発明により、成長因子トランスフォーミング成長因子βの治療的および診断的使用法を提供する。好ましい実施態様において、子宮着床に対する受胎産物の受容能力を決定するおよび改良する方法を、哺乳動物における雌性不妊症を決定するための方法と同様に提供する。

Description

【発明の詳細な説明】トランスフォーミング成長因子βによる受胎能調節発明の背景哺乳動物の繁殖の分野において、診断を行ない且つ適当な行動方針を選択する場合に繁殖業者を助ける多数の診断法が存在する。現在、ヒトの場合の不妊症とは、１年間避妊せずに性交して受胎しないこととして定義される。約１０〜１５％の夫婦が不妊症に冒されている。不妊症の危険は、３０才〜３４才の女性と比較して、３５才〜４０才の女性で２倍である。１９６８年中に、約６００，０００組の夫婦が専門的治療を必要とした。しかしながら、１９８０年代初めに、不妊症についてのこの数は、年間２００万を越える診察件数にまで増加した。受胎能パターンの変化は、人口構成に対してかなり影響がある。２１世紀中頃までには、移民を除く米国の人口は減少すると予測されている。更に、６５才を越える人口の割合は、次の１００年間で２３％を越えて増加し、高年齢で且つ少ない労働人口をもたらすであろう。米国における不妊症の大部分は女性側の問題によって説明が可能である。女性の不妊症を評価することは複雑な場合が多い。ファロピーオ管の検査は、骨盤炎症性疾患の著しい徴候ゆえに、哺乳動物受胎能評価において重要な最初の段階である。現在、子宮卵管造影（ｈｙｓｔｅｒｏｓａｌｐｉｎｇｏｇｒａｍ；ＨＳＧ）は、ファロピーオ管の開存を検査するのに選択された方法である。ＨＳＧの他に、光ファイバー装置による子宮の直接的検査である子宮鏡検査は、子宮内膜ポリープ、粘膜下平滑筋腫および子宮自体にある他の異常の存在を決定するのに重要である。診断法のもう一つのカテゴリーとしては、排卵および月経周期の黄体期中のプロゲステロンの分泌を含む卵巣機能の検査がある。卵巣機能は、月経周期中の基礎体温の測定および排卵期ごろの子宮頚管粘液試験によって大まかに評価することができる。より正確な試験は、周期中頃の急変後に排卵を誘導する下垂体ホルモンである黄体形成ホルモンを測定することによって行なうことができる。最後に、血清プロゲステロン濃度を測定して、月経周期の正常な黄体期について評価することができる。子宮内膜自体は、月経開始予定日の３日前に子宮内膜生検を実施することによって直接的に評価することができる。哺乳動物子宮内膜を評価する場合、現在の婦人科および不妊症の担当医師は、パラフィン固定された検体のヘマトキシリンおよびエオシン染色による子宮内膜生検を検査するのに病理学者に頼る。不妊症患者についてのこれらの生検の解釈は、排卵後の周期日数、黄体期の妥当性および他の可能なデータ、例えば、子宮内膜の感染、炎症または新形成についての情報を与える。しかしながら、多くの場合、子宮内膜の機能的および生化学的特性は評価されないし、患者の不妊症の問題を説明する組織学的解釈は得られないことが多い。最終的に、不妊症患者は腹部切開による内視鏡検査を受けて、卵巣、ファロピーオ管および子宮の外面を直接的に可視化して、それまでの検査によって検出されなかった何等かの重大な病変を可視化することができる。臨月まで妊娠していることができない女性の大部分が、概して最初の６週間以内に自然流産する。最初の６週間中の流産は、１５〜２０％程度に高いことが知られている。更に、生産することなく連続して流産した後に幸運にも生産する可能性は４０〜５０％にすぎない。体外受精（ＩＶＦ）は、哺乳動物卵巣から卵を取り出し且つこれらの卵を体外で精子にさらす必要がある。それぞれの卵の受精は、少なくとも１個の生精子が卵の透明帯（外被）に貫入し且つ前核と融合することを必要とする。いったんこれが生じ且つ卵が受精すると、それらは子宮に移動して、そこで子宮壁に着床するようになりうる。着床した場合、まるで生体内で受精したかのように妊娠が進行しうる。体外受精は職業的且つ社会的に広く受け入れられている。しかしながら、ますます増え続けるこの方法の頻度および精巧さにもかかわらず、体外受精の試みが妊娠につながらないことが極めて多い。体外受精による妊娠率は、現在のところ約１５〜２０％にすぎない。様々な理由のために、卵を精子にさらしても必ずしも受精しない。更に、たとえ卵が受精した場合でも、子宮中の卵の置かれた状態によって常に正常に着床するわけではない。ＩＶＦの低い成功率は、しばしば、不妊症の夫婦に過度の経済的および心理的負担をもたらす。他の人工的生殖技術としては、ＩＶＦ法の二つの変法がある。第一は、配偶子のファロピーオ管内移入（ＧＩＦＴ）であり、第二は、接合子のファロピーオ管内移入（ＺＩＦＴ）である。ＧＩＦＴ法において、回復された接合子嚢および精子を一緒に混合し、そしてファロピーオ管に戻し入れ、そこで受精させる。次に、受精した接合子は、ファロピーオ管を介して子宮内膜腔に下降し、そこで着床するかもしれないしまたはしないかもしれない。ＺＩＦＴ法は、標準的なＩＶＦの場合と同様にインビトロで受精させることができ、次に、受精した接合子をファロピーオ管に戻し入れ、そこでそれは引続き子宮に下降して着床する。最後に、ドナーの女性から多数の接合子嚢を回復させることが不可欠な高刺激プロトコルは、子宮内膜自体に悪影響を及ぼすことがありうるし且つ着床率を減少させることがあるということは理解される。この問題を克服するのに二つの基本的な方法が用いられてきた。第一は、非刺激接合子嚢回復が考えられる。１個の卵を回復させ、受精させ、そして着床させるためにファロピーオ管または子宮に戻し入れる。他の技法は、ＩＶＦ法の高刺激部分を行なって、卵を回復させ且つインビトロで受精させる。次に、子宮内膜が着床を一層よく受け入れることを期待して、数回の正常周期後の患者に接合子を戻し入れるために凍結する。これらの技法はいずれも、受精後に生じた接合子である卵の特性および子宮内膜の受容性を最大限にすることを試みている。標準の１５〜２０％を越えて着床率を増大させると考えられる方法はいずれも、これらの技術のいずれかに顕著な効果を与えると考えられる。したがって、哺乳動物における人工的生殖技術の成功率を改善するための方法が大いに望まれることは明らかである。子宮着床に対する特定の受精卵、受胎産物の受容能力を決定する手段は人工的生殖の成功率を直ちに改善するので、このような手段が特に望ましい。着床に対する受胎産物の受容能力を改良するための方法も同様に極めて望ましい。更に、雌性不妊症を決定するための方法も望まれる。中絶（ｃｏｎｔｒａｇｅｓｔｉｏｎ）すなわち性交後避妊は、現在二つの基本的な方法、すなわち、外科的および薬剤による方法によって実施されている。１９７０年代において、「モーニングアフターピル」（ジエチルスチルベストロール）は、性交後避妊法として一般的であった。より最近では、受精および着床直後に妊娠をとめる抗プロゲステロンＲＵ−４８６の使用が欧州において広く受け入れられている。最初のトリメスター中に妊娠を止める最も一般的な方法は外科的流産による。外科的流産は、概して、頚管拡張子宮内膜掻爬術または陰圧吸引を伴う。最終的には、最初のトリメスター後、オキシトシンおよびプロスタグランジンなどの分娩誘導薬を用いて早産を誘導し、それによって妊娠を止めることができる。上記薬剤技法は、多数の副作用および潜在的合併症があることが知られている。外科的技法は、子宮裂傷、出血および感染をもたらすことがある。米国において一般的に用いられる避妊法としては、経ロステロイド避妊薬、注射若しくは植込みステロイド避妊薬、子宮内器具、物理的、化学的または物理化学的バリヤー技術、抜去、排卵期ごろの性的禁欲、母乳育児および永久不妊手術がある。これらの方法のいくつかの高い失敗率に加えて、多数のこれらの方法は使用者に重大な潜在的合併症をもたらす。例えば、経口避妊薬によって誘導された代謝変化に加えて、新形成、栄養傷害、心臓血管作用、血栓塞栓症および死亡することさえある危険が増大する可能性がある。避妊および中絶を行なう方法、特に、患者に対する副作用が少ないかまたは全くない方法が大いに望まれる。一連の生殖過程の初期段階で中絶を阻止する方法は特に望ましく、当生殖科学業者によって長い間追求されてきている。発明の概要本発明は、子宮着床に対する受胎産物の受容能力を決定する方法であって、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）を受胎産物に対して投与し、そして受胎産物による栄養膜フィブロネクチンの生産レベルを評価することを含む上記方法を提供する。栄養膜フィブロネクチン生産は受容能力を示す。本出願人は、ＴＧＦβに対する胚応答性がその着床の全体的可能性に関係し、したがって着床に最適な胚の選択に役立つことを確認した。本発明は、更に、不妊症が疑われる患者において女性不妊症を決定する方法であって、患者の組織液または体液のトランスフォーミング成長因子βの存在について検定することを含む上記方法を提供する。したがって、本発明の方法は、不十分なＴＧＦβのために不妊症の哺乳動物を診断するための手段を提供する。本発明は、更に、人工的生殖の成功率を増加させる方法であって、トランスフォーミング成長因子βを卵、精子または受胎産物に対して投与した後、投与すると同時にまたは投与する前に、該卵、精子または受胎産物を雌の哺乳動物の生殖路中に導入することを含む上記方法を提供する。本出願人は、正常な哺乳動物の妊娠中に胎盤−子宮結合に局在する栄養膜フィブロネクチンは、着床にとって重要であることを発見した。したがって、（１）栄養膜フィブロネクチンの生産を付随的に剌激し；そして（２）細胞外基質に対する栄養膜の接着性を促すことが分かっているＴＧＦβは、卵または受胎産物の着床を有効に促進する。更にまた、本発明は、哺乳動物において栄養膜フィブロネクチン合成を増大させる方法であって、該哺乳動物に対して有効量のトランスフォーミング成長因子 βを投与することを含む上記方法を提供する。本出願人は、哺乳動物生殖における栄養膜フィブロネクチンの重要性を確認し、そして栄養膜フィブロネクチンの生産を増大させることは受胎能治療の重要な方法であることを発見した。このような増大は、トランスフォーミング成長因子βによって起こることが分かっている。本発明は、更に、哺乳動物においてトランスフォーミング成長因子β合成を阻害する方法であって、トランスフォーミング成長因子β阻害剤、例えば、トランスフォーミング成長因子βをコードしているｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法を提供する。阻害剤は、哺乳動物におけるトランスフォーミング成長因子βの生産または作用を妨げる。本発明の方法によるＴＧＦβの生産または作用の阻害は、特に、避妊および中絶の方法を提供する。本発明は、更にまた、哺乳動物において栄養膜フィブロネクチン、特に、トロホ−ウテロネクチン、ＴＵＮ合成を阻害する方法であって、該哺乳動物におけるトランスフォーミング成長因子βの生産または作用を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子βアンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法を提供する。本発明は、更に、哺乳動物において栄養膜フィブロネクチン、特に、トロホ− ウテロネクチン（ｔｒｏｐｈｏ−ｕｔｅｒｏｎｅｃｔｉｎ；ＴＵＮ）合成を阻害する方法であって、該哺乳動物におけるトランスフォーミング成長因子βの生産または作用を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子β受容体アンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法を提供する。更に、本発明は、哺乳動物において受胎を妨げる可能性を増大させるのに有効な量のトランスフォーミング成長因子βアンタゴニスト、例えば、トランスフォーミング成長因子βに対する抗体を該哺乳動物に対して投与することを含む避妊および中絶の方法を提供する。ＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、ＴＵＮ合成を刺激するのに利用可能なＴＧＦβの量を減少させる。したがって、これは、妊娠自体を維持することができないし且つ受胎の可能性をなくする。発明の詳細な説明最近、本出願人は、栄養膜フィブロネクチン、特に、トロホ−ウテロネクチン（ＴＵＮ）が、妊娠中の栄養膜によってインビボでもインビトロでも結合部位で合成されることを発見した。トロホーウテロネクチンは、胎盤−子宮結合に局在していた。栄養膜フィブロネクチン、特に、トロホ−ウテロネクチンは、子宮細胞外基質に対する栄養膜接着を調節する場合に重要な働きをすると考えられる。ファインバーグ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）ら、１９９１年、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１３８（３）：５３７〜５４３。更に、受胎産物の栄養膜細胞は、着床過程の重要な部分として子宮との接触を決定することが確証された。ハーティヒ（Ｈｅｒｔｉｇ），Ａ．Ｔ．およびロック（Ｒｏｃｋ），Ｊ．、１９５６年、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｔｏｍｙ，９８，４３５〜４９４。本出願人は、ここで、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）が、トロホーウテロネクチンを含む栄養膜フィブロネクチンの生産を刺激することを発見した。本明細書中で用いられるトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、血小板のα顆粒から放出されるタンパク質である。最近、ＴＧＦβは、妊婦か外科的に取り出された着床部位のヒト胎盤−子宮界面に局在していた。グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９９２年、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４６：５６１〜５７２。ＴＧＦβは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セント・ルイス、ＭＯ、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ＭＮおよびコラボレーティブ・リサーチ（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）、ニューベツドフォード、ＭＡなどから商業的に入手可能である。ＴＧＦβとは、ＴＧＦβのイソ型全部を意味する。例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３およびＴＧＦβ４を本発明の若干のまたは全部の態様に包含しうる。栄養膜フィブロネクチンとは、栄養膜によって生産されたフィブロネクチンタンパク質のいずれかまたは全部を包含する。一つの栄養膜フィブロネクチンであるトロホ−ウテロネクチン（ＴＵＮ）は、本発明の実施に特に重要であることが分かったが、他の栄養膜フィブロネクチンもまた重要であると考えられる。本発明により、子宮着床に対する受胎産物の受容能力を決定する方法であって、トランスフォーミング成長因子βを受胎産物に対して投与し、そして受胎産物による栄養膜フィブロネクチンの生産レベルを評価することを含む上記方法を提供する。子宮着床に対する受胎産物の受容能力という用語によって、着床に対して重要な特性を意味する。例えば、栄養膜によるフィブロネクチンの生産は着床に対して重要である。したがって、インビトロでこのような応答を引き起こす能力は、受胎産物を子宮中に導入後の胎児のインビボでの発育に重要なフィブロネクチンおよび他の因子を受胎産物が有効に生産することを示すと考えられる。本明細書中で用いられる「受胎産物（ｃｏｎｃｅｐｔｕｓ）」という用語は、胚外膜、胎盤および栄養膜並びに胚または胎児を含む、受精から誕生までのいずれかの発育段階における受精卵の誘導体全体を意味する。本発明の方法は、概して、哺乳動物に対して適用しうる。例えば、本発明の方法は、特に、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコおよびヒト哺乳動物に対して適用することができる。受胎産物によって生産される栄養膜フィブロネクチンのレベルは、タンパク質を検出するが、受胎産物の完全性を維持する任意の方法によって評価することができる。例えば、評価は、受胎産物または受胎産物を取り囲む培地を、検出可能に標識された栄養膜フィブロネクチン特異的抗体と接触させることによって達成しうる。本出願人は、培養された栄養膜のフィブロネクチン、更に詳しくはＴＵＮを培地中に分泌する能力を予め実証した。ファインバーグら、１９９１年、ＡｍeｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１３８（３）：５３７〜５４３。例えば、ＦＤＣ−６は、本明細書中においてそのまま援用する米国特許第４，８９４，３２６号明細書に開示されたように、トロホ−ウテロネクチンなどの栄養膜フィブロネクチンを認識する適当な抗体である。当業者が理解するように、１種類またはそれ以上のの栄養膜フィブロネクチンを特異的に認識する他の抗体を用いてもよい。検出可能な標識は、便宜上、酵素、発色団、発蛍光団、補酵素、化学発光物質、酵素阻害剤および常磁性金属並びに放射性ヌクレオチドから成る群より選択される。本発明において用いるのに更に適当であると考えられる検定は、受胎産物を、栄養膜フィブロネクチンをコードしているｍＲＮＡとハイブリッド形成可能な、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡプローブトと接触させ且つ標識オリゴヌクレオチドを検出する工程を含むｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成検定法である。ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成検定法の一般的な手順は、例えば、本明細書中においてそのまま援用する参考文献、ストループ（Ｓｔｒｏｏｐ）ら、１９８４，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：２７〜３８に記載の通りである。本発明の方法は、更に、不妊が疑われる雌の哺乳動物において雌性不妊症を決定するのに有用でありうる。したがって、患者の組織液または体液を、受胎対照濃度に等しい活性のおよび／または免疫学的トランスフォーミング成長因子βの存在について検定することができる。トランスフォーミング成長因子βの存在は受胎能を示す。トランスフォーミング成長因子βの欠損は、着床に対する受容性の欠損、したがって不妊症を示す。有用であると考えられる体液としては、例えば、血漿、血清および子宮頚管吸引液がある。このような検定において有用であると考えられる細胞種の例としては、子宮内膜生検材料がある。概して、着床および受胎対照において栄養膜フィブロネクチンの合成を刺激する能力に関係した生殖体液または細胞種はいずれも有用であると考えられる。便宜上、機能性ＴＧＦβの免疫学的反応性量および活性の検定は商業的に利用可能であり、当業者によって容易に利用される。本発明のもう一つの態様において、人工的生殖の成功率を増加させる方法を提供する。これらの方法は、トランスフォーミング成長因子βを受胎産物に対してインビトロで投与した後、該受胎産物を雌の哺乳動物の生殖路中に導入することを含む。トランスフォーミング成長因子βは、典型的に、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌの用量で投与される。好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５ｎｇ／ｍｌを投与する。また更に好ましくは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβを投与し、濃度は、受胎産物が懸濁されている体液に関係する。本発明のもう一つの好ましい実施態様において、約１．５ｎｇ／ｍｌ〜約２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβを受胎産物に対して投与する。投与は、例えば、ＴＧＦβを培地に加えることによることができる。このような場合、ＴＧＦβの濃度は、受胎産物の体液環境中の最終濃度に関係する。本発明のもう一つの態様において、哺乳動物における栄養膜フィブロネクチン生産を増大させる方法であって、該哺乳動物に対して有効量のＴＧＦβを投与することを含む上記方法を提供する。投与は、当業者に知られている任意の有効な方法によって達成しうる。例えば、ＴＧＦβは、子宮内浸剤、ゲル剤または生理学的液剤によって投与することができる。更に、投与は、全身的に、例えば、非経口、静脈内、皮下または皮内に行なうことができる。例えば、皮内にＴＧＦβ を供給する「パッチ」を恥丘部分に使用しうる。ＴＧＦβは、卵、精子または受胎産物を自然にかまたは人工的生殖技術によって雌の哺乳動物の生殖路中に導入する前に、これらの方法のいずれか一つによって投与することができる。例えば、ＴＧＦβを含む子宮内浸剤、ゲル剤または生理学的液剤を用いて、ＴＧＦβを腟、子宮頸管、子宮およびファロピーオ管中に導入することができる。更に、人工的生殖技術の場合、ＴＧＦβをインビトロで卵または受胎産物と接触させた後に生殖路中に導入することができる。ＴＧＦβは、更に、雌の哺乳動物の生殖路中に卵、精子または受胎産物を導入するのと同時に投与することができる。例えば、ＴＧＦβを含むゲル剤を調製することができ、体外受精の際にはその中に受胎産物を懸濁させることができるし、配偶子のファロピーオ管内移入の際には卵および精子を懸濁させることができるし、または接合子をファロピーオ管内移入の際に懸濁させることができる。ＴＧＦβを含む生理学的液剤も、これらのような人工的生殖法と同時に投与することができる。本発明の更にもう一つの方法により、卵、精子または受胎産物を雌の哺乳動物の生殖路中に導入後にこれらの方法によってＴＧＦβを投与することができる。例えば、卵、精子または受胎産物を子宮中に導入後のＴＧＦβの生理学的液剤の静脈内注射は、妊娠を維持する可能性を支持する予防措置法として投与することができる。当然ながら、当業者は、投与量および方法が、治療される患者の年齢、体重および症状、栄養膜フィブロネクチン合成を正常受胎対照濃度まで増加させる目的によって変化することを理解する。本発明の更にもう一つの態様において、哺乳動物におけるトランスフォーミング成長因子β合成を阻害する方法であって、該哺乳動物におけるトランスフォーミング成長因子β合成を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子 β阻害剤を該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法を提供する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、哺乳動物栄養膜または子宮内膜によるＴＧＦβ合成を阻害することができる。最近、オリゴヌクレオチドアンチセンスＤＮＡプローブを細胞に対して加えると、それらの対応するタンパク質の生産が特異的に停止されることが実証された。例えば、トルトラ（Ｔｏｒｔｏｒａ）ら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，７０５〜７０８を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に知られている多数の方法で容易に製造することができるし且つ投与することができる。例えば、１９９２年３月２４日発行の米国特許第５，０９８，８９０号明細書を参照されたい。哺乳動物におけるＴＧＦβ合成の阻害には種々の用途がある。例えば、ＴＧＦ β濃度が正常な受胎対照と等しいかまたはそれを超過していることが確認された哺乳動物は、ＴＧＦβ阻害の候補でありうるし、それによって正常な受胎対照の範囲内のＴＧＦβ濃度をもたらすように阻害が設計される。ＴＧＦβ阻害は、更に、避妊法として、正常な受胎対照と比較して不十分なＴＧＦβ濃度を維持するのに用いることができる。更に、正常に受胎した雌に存在するＴＧＦβ濃度未満までＴＧＦβを阻害することを用いて妊娠を止めることができるし、したがって中絶（ｃｏｎｔｒａｇｅｓｔｉｏｎ）法を提供することができる。本発明のもう一つの態様において、哺乳動物における栄養膜フィブロネクチン合成を、正常に受胎した雌で見出される栄養膜フィブロネクチン濃度未満に阻害する方法であって、該哺乳動物における栄養膜フィブロネクチン合成を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子βアンタゴニストまたはＴＧＦβ 受容体アンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法を提供する。例えば、ＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体に対する抗体を前記哺乳動物に対して投与してよい。このような抗体は、当業者に知られている標準法によって製造することができる。或いは、このような抗体は、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮなどから商業的に入手可能であり、そして周知の方法によって投与することができる。免疫学的に妊娠を中断させることができる。例えば、精製抗ｈＣＧの５ｍｇおよび２５ｍｇを３人の子宮外妊娠患者に注射して、一人の患者はその卵管妊娠を完全に消散したが、他の二人は、プロゲステロンおよびエストロゲンの濃度を顕著に低下させ、妊娠の可能性の顕著な低下が示唆された。フライドマン（Ｆｒｙｄｍａｎ）ら、「子宮外妊娠の女性における単クローン性抗ヒト絨毛膜ゴナドトロピン抗体のI期臨床試験（ＰｈａｓｅＩｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ−ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｗｏｍｅｍｗｉｔｈａｎｅｃｔｏｐｉｃｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」，ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ５２：７３４〜８（１９８９）。これらの著者らはマウス単クローン性抗体を用いた。ヒト単クローン性抗体を用いたより最近の論文において、腎臓移植後のＣＭＶの治療にヒト化抗体を用いることができるということが示された。スカープ（Ｓｋａｒｐ）ら、「腎臓移植後の危険なサイトメガロウイルスの治療のためのヒト単クローン性抗サイトメガロウイルス抗体の使用（Ｕｓｅｏｆａｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ−ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｅｖｅｒｅｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓａｆｔｅｒｒｅｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」，ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｃ２２：２３４（１９９０）。全身的に与えられる他に、これらの特定の単クローン性抗体を子宮腔内に、可能ならば前記のようにファロピーオ管内に直接的に適用することもできる。ＴＧＦβ並びにそれらの阻害剤およびアンタゴニストの投与は、前記のように、例えば、非経口によって、静脈内注射によって、子宮内浸剤、ゲル剤若しくはスポンジによってまたは当業者に明らかな他の方法で行なうことができる。様々な症状を治療するためのこれらの方法を記載している参考文献は知られている。卵巣の内分泌機能は子宮内浸剤によって顕著に変化しうることが分かっている。ヘルマー（Ｈｅｌｍｅｒ）ら、１９８９年、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，８７：８９〜１０１。黄体形成ホルモン放出ホルモンを子宮内注射されたラット子宮は、注射されなかった子宮と比較して着床率が有意に増加したことが分かった。ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｒ．Ｃ．、「黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＲＨ）の子宮内注射によって処置された卵巣摘出ラットにおける胚盤胞結合（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔａｔｔａｃｈｍｅｎｔｉｎｔｈｅｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄｒａｔｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈａｎｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ（ＬＨＲ））」，ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（コペンハーゲン）１０３：２６６〜８（１９８３）。液剤の使用の他に、分娩および出産を容易にするために子宮頚管内に点滴注入されるゲル剤の使用が知られている。例えば、エクマン（Ｅｋｍａｎ）ら、「稽留流産または子宮内胎児死の患者におけるＰＧＥ２−ゲルの子宮頚管内点滴注入（ＩｎｔｒａｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｏｆＰＧＥ２−ｇｅｌｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｉｓｓｅｄａｂｏｒｔｉｏｎｏｒｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｆｅｔａｌｄｅａｔｈ）」，ＡｒｃｈＧｙｎｅｃｏｌ２３３：２４１〜５（１９８３）を参照されたい。更に、現在市販されているものと同様であるかまたは、ＴＧＦβ若しくはＴＵＮの合成を増大させうるか若しくは低減させうる薬剤の徐放を促すように変更された子宮内ビヒクルを用いることができる。このような徐放性子宮内ビヒクルの例は、ジュー（Ｚｈｕ）ら、「ヒト子宮内膜の出血プロフィールおよび形態学的構造に対する子宮内器具、ステンレススチールリング、銅Ｔ２２０および放出性レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）の効果−３種類のＩＵＤの比較試験。９６症例の体型測定試験（Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｄｅｖｉｃｅs，ｔｈｅｓｔａｉｎｌｅｓｓｓｔｅｅｌｒｉｎg，ｔｈｅｃｏｐｐｅｒＴ２２０，ａｎｄｒｅｌｅａｓｉｎｇｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ，ｏｎｔｈｅｂｌｅｅｄｉｎｇｐｒｏｆｉｌｅａｎｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ−−ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｒｅｅＩＵＤｓ．Ａｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃｓｔｕｄｙｏｆ９６ｃａｓｅs）」，Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ４０：４２５〜３８（１９８９）に見出される。更に、フィブロネクチン生産を決定するためのキットであって、生理学的に許容しうる溶液中のトランスフォーミング成長因子βおよび栄養膜フィブロネクチンの検定を含む上記キットを提供する。従来のキット成分、例えば、緩衝剤、抗細菌剤、安定剤および賦形剤も、本発明のキットに包含される。このような成分は当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書中においてそれぞれの開示をそのまま援用する、ＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−−ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＦｏｒｍｕｌａｒｙ，第２２改訂版、１９９０年１月１日、マック・パブリッシング・カンパニー（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ＰＡ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ′ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ジェナーロー（Ｇｅｎｎａｒｏ），Ａ．Ｒ．監修、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡ（１９８５）で論及されている。以下の実施例は、本発明を単に例証するものであり、いずれの場合にも本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。これらの実施例およびそれらの均等物は、本開示および請求の範囲を考慮に入れて当業者に一層明らかになるものである。実施例１細胞培養栄養膜細胞層を、クリマン（Ｋｌｉｍａｎ）ら、１９８６年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１８：１５６７〜１５８２の方法によって正常分娩胎盤から調製した。単離された栄養膜を、クリマン、上記に記載のように計数した。細胞を平板培養する前に、グルタミンおよびゲンタマイシンを加えられた、血清含有または不含のダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中に栄養膜を懸濁させた。平板培養前のこの細胞懸濁液の濃度は２Ｘ１０⁶／ｍｌであった。実施例２血清中の血小板誘導ＴＵＮ刺激因子の識別ガラスまたはプラスチック支持体上に、実施例１に記載のように栄養膜細胞培養物を調製した。血清含有培地中の栄養膜によるＴＵＮ生産は、種々の血清濃度で栄養膜を培養することによって観察された。ＴＵＮの生産は用量依存性であることが確認され、培地中の血清濃度が１〜１０％まで段階的に増加するにつれて、培地中の検出可能なＴＵＮ濃度は１〜２０ｐｇ／ｍｌまで段階的に増加した。１〜１０％血清含有培地は、形態学的に同一と見られる細胞を生じ、凝集体および合胞体の拡大および形成は良好であった。栄養膜を血清不含培地およびＴＧＦ β不存在下で培養した場合、ＴＵＮ生産は見られなかった。重症な免疫異常血小板減少症（重症な血小板欠損）の乳児からの瞬帯血清試料の使用は、極めて僅かなＴＵＮ刺激しかもたらすことがなく、臨界的ＴＵＮ刺激因子は血小板由来であることが示唆された。ＴＵＮ刺激因子が実際に血小板由来であることを実証するために、健康なドナーから血液を採取し、そして抗凝血物質が加えられた２本の遠心管に分別した。一方の管を高速（２０００ｒｐｍＸ１０分間）で回転させた。もう一方の管を低速（５００ｒｐｍＸ１０分間）で回転させた。高速管の上澄み中には血小板がなく、低速管の上澄み中にはほとんど全部の血小板が残った。両方の血漿を凝固させ、得られた血清を血小板の多いもの（低速回転）および血小板の少ないもの（高速回転）として標識した。血小板の多い血清によってのみ栄養膜はＴＵＮ濃度を増加させた。実施例３ＴＧＦβの添加によるＴＵＮの刺激実施例１に記載のように調製された栄養膜を、外因的に加えられたＴＧＦβ１の存在下の２％の血小板の少ない血清または免疫異常血小板減少症新生児由来血清中で培養した。５０および２００ｐＭのＴＧＦβでは、４８時間後に３〜４倍のＴＵＮ誘導反応が引き起こされ、培地中のＴＵＮ濃度は約１μｇ／ｍｌ〜４μ ｇ／ｍｌに増加した。実施例４ＴＧＦβアンタゴニストはＴＵＮの生産を阻害する血小板の多い血清を、５０〜１００ｐｇ／ｍｌの濃度の２種類の異なる商業的に入手可能なＴＧＦβ中和抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）と一緒に別個に６時間プレインキュベートした。ＴＧＦβ中和抗体と一緒にプレインキュベートされた血清を用いて実施例１に記載のように調製された栄養膜のＴＵＮ合成濃度は、ウェスタンイムノブロットによって検出できなかった。（栄養膜単独かまたは１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ と組合わせた４８時間の培養に対する血小板由来成長因子１ｎｇ／ｍｌの添加は、ＴＵＮ生産に対して相加作用がなかった）。この知見は、更に、ＴＧＦβがＴＵＮの刺激において重要な役割を有することを確証する。実施例５プレートの製造６ウェルプラスチック皿を、リン酸緩衝溶液中１０ｐｇ／ｍｌの濃度で調製された血漿フィブロネクチン（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））の溶液で予め被覆した。この溶液１ｍｌを各６ウェル皿に塗布した。プレートを室温で８〜１０時間インキュベートした。実施例６栄養膜結合に対する添加ＴＧＦβの効果血漿フィブロネクチン面への栄養膜結合に対するＴＧＦβの効果を試験した。実施例１に記載のように調製された血清不含培地中細胞懸濁液１ｍｌを、実施例５に記載のように製造された６ウェル皿の各皿に対して加えた。細胞を平板培養後、トランスフォーミング成長因子β（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）の原液（１ｎｇ／μｌ）を細胞培養に対して加え、栄養膜培養中の最終濃度を１ｎｇ／ｍｌとし、それにＴＧＦβを加えた。細胞を４８時間培養した。次に、培地を除去し、培養物をＰＢＳで静かに洗浄し、そして１０％中性緩衝ホルマリンで１０分間固定した。光学顕微鏡による細胞の詳細な検査により、ＴＧＦβで処理された細胞とＴＧＦβで処理されなかった細胞との間に明白な定量的差が示された。予め被覆された血漿フィブロネクチンが不存在の場合、約９７％の細胞に丸みがあった。血漿フィブロネクチンを加え、１０μｇ／ｍｌで被覆した場合、約７０％の細胞に丸みがあり、残りは中間〜平たんに分類された。酸によって活性化されたＴＧＦβを１ｎｇ／ｍｌ加えた場合、２５％未満の細胞に丸みがあり、約４０％は中間であり、そして約３５％の細胞が平たんであった。これらの結果は、予め被覆された血漿フィブロネクチンおよび添加ＴＧＦβ両方の組合わせがＴＵＮの栄養膜分泌を刺激して、血清不含条件下の培養面に対する栄養膜結合を促進することができることを示唆している。更に、予め被覆されたフィブロネクチンは、栄養膜によって容易に分解され、培地中にいくつかのタンパク質分解フラグメントを放出することが分かった。逆に、予め被覆された羊水および栄養膜フィブロネクチンは、栄養膜による消化に対して極めて耐性であり、僅かな量のタンパク質分解フラグメントしか見出されなかった。これは、栄養膜がどのように母体子宮細胞外基質に侵入し且つ同時にそれを消化することができるか、更に、着床の際の新規のＴＵＮ含有、プロテアーゼ耐性細胞外基質成分をどのように合成し且つ同時に付着することができるかを説明しうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＣ１２Ｑ 1/02 6807−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｆ 8310−2ＪＡ６１Ｋ 37/24 ＡＣＺ (72)発明者フェインバーグ，ロナルド・エフアメリカ合衆国ニュージャージー州08003, チェリー・ヒル，アナポリス・レーン 1009 (72)発明者クリマン，ハーヴィー・ジョンアメリカ合衆国コネチカット州06525，ウッドブリッジ，フォード・ロード 161

Claims

【特許請求の範囲】１．子宮着床に対する受胎産物の受容能力を決定する方法であって、トランスフォーミング成長因子βを受胎産物に対して投与し；そして受胎産物による栄養膜フィブロネクチンの生産レベルを評価することを含む; 栄養膜フィブロネクチン生産が受容能力を示す上記方法。２．栄養膜フィブロネクチンがトロホ−ウテロネクチンである請求項１に記載の方法。３．前記決定手段が、受胎産物または受胎産物を取り囲む培地を、検出可能に標識された栄養膜フィブロネクチン特異的抗体と接触させ且つ標識抗体を検出することを含む請求項１に記載の方法。４．抗体がトロホ−ウテロネクチン抗体ＦＤＣ−６である請求項３に記載の方法。５．前記決定手段が、受胎産物を、栄養膜フィブロネクチンをコードしているｍＲＮＡとハイブリッド形成可能な標識オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡプローブと接触させ且つ標識オリゴヌクレオチドを検出することを含む請求項１に記載の方法。６．不妊症が疑われる患者において女性不妊症を決定する方法であって、患者の組織液または生殖体液のトランスフォーミング成長因子βの存在について検定することを含む上記方法。７．人工的生殖の成功率を増加させる方法であって、トランスフォーミング成長因子βを卵または受胎産物に対して投与した後、該卵または受胎産物を雌の哺乳動物の生殖路中に導入することを含む上記方法。８．約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング成長因子βを受胎産物に対して投与する請求項７に記載の方法。９．人工的生殖の成功率を増加させる方法であって、トランスフォーミング成長因子βを雌の哺乳動物の生殖路に対して投与した後、卵、精子または受胎産物を雌の哺乳動物の生殖路中に導入することを含む上記方法。１０．人工的生殖の成功率を増加させる方法であって、雌の哺乳動物の生殖路中への卵、精子または受胎産物の導入と同時に、トランスフオーミング成長因子 βを投与することを含む上記方法。１１．人工的生殖の成功率を増加させる方法であって、雌の哺乳動物の生殖路中に卵、精子または受胎産物を導入後に、トランスフォーミング成長因子βを投与することを含む上記方法。１２．哺乳動物において栄養膜フィブロネクチン合成を増大させる方法であって、該哺乳動物に対して有効量のトランスフォーミング成長因子βを投与することを含む上記方法。１３．栄養膜フィブロネクチンがトロホ−ウテロネクチンである請求項１２に記載の方法。１４．哺乳動物においてトランスフォーミング成長因子β合成を阻害する方法であって、該哺乳動物におけるトランスフォーミング成長因子β合成を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子β阻害剤を該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。１５．哺乳動物においてトロホ−ウテロネクチン合成を阻害する方法であって、該哺乳動物におけるトロホ−ウテロネクチン合成を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子βアンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。１６．前記アンタゴニストが、トランスフォーミング成長因子βに特異的な抗体である請求項１５に記載の方法。１７．哺乳動物においてトロホ−ウテロネクチン合成を阻害する方法であって、該哺乳動物におけるトロホ−ウテロネクチン合成を阻害するのに有効な量のトランスフォーミング成長因子β受容体アンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。１８．前記アンタゴニストが、トランスフォーミング成長因子β受容体に特異的な抗体である請求項１７に記載の方法。１９．避妊法であって、哺乳動物において受胎を妨げる可能性を増大させるのに有効な量のトランスフォーミング成長因子βアンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。２０．前記アンタゴニストが、トランスフォーミング成長因子βに特異的な抗体である請求項１９に記載の方法。２１．避妊法であって、哺乳動物において受胎を妨げる可能性を増大させるのに有効な量のトランスフォーミング成長因子β受容体アンタゴニストを該哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。２２．前記アンタゴニストが、トランスフォーミング成長因子β受容体に特異的な抗体である請求項２１に記載の方法。２３．中絶法であって、中絶が行なわれる可能性を増大させるのに有効な量のトランスフォーミング成長因子βアンタゴニストを哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。２４．前記アンタゴニストが、トランスフォーミング成長因子βに特異的な抗体である請求項２３に記載の方法。２５．中絶法であって、中絶が行なわれる可能性を増大させるのに有効な量のトランスフォーミング成長因子β受容体アンタゴニストを哺乳動物に対して投与することを含む上記方法。２６．前記アンタゴニストが、トランスフォーミング成長因子β受容体に特異的な抗体である請求項２５に記載の方法。２７．栄養膜フィブロネクチン生産を決定するためのキットであって、生理学的に許容しうる溶液中のトランスフォーミング成長因子βおよび栄養膜フィブロネクチンの検定を含む上記キット。