JPH08507693A - 腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子に関する。詳しくは、前記腫瘍拒絶抗原先駆体、即ち”ＴＲＡＰ”は、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原に加工される。この発見の派生効果もここに記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子発明の分野 本発明は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子に関する。より詳しく は、本発明は、その腫瘍拒絶抗原先駆体が、特に、細胞表面上においてＨＬＡ− Ａ２分子によって提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングさ れる遺伝子に関する。背景及び先行技術 ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識し、これらに対して反応 するプロセスは複雑である。このシステムの重要な一面は、Ｔ細胞応答である。 この応答は、Ｔ細胞がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、又は主要組織適合抗原（ＭＨ Ｃ）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これと相互作用す ることを必要とする。前記ペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞 によってプロセッシングされる大きな分子から誘導される。この点に関しては、 メール（Ｍａｌｅ）他の”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（ＪＰ． Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６〜１０章を参 照。前記Ｔ細胞とＨＬＡ／ペ プチド複合体との相互作用は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組合せに特異的な Ｔ細胞を必要とするとする点で、限定されたものである。たとえ、特定の複合体 が存在しても、特異的なＴ細胞が存在しなければＴ細胞応答は起こらない。同様 に、Ｔ細胞が存在しても、特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。 このメカニズムは、免疫システムの、自己免疫病状に於ける外来の物質に対する 応答や、細胞異常に対する応答に関係している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合 ペプチドにプロセッシングされるメカニズムに関して多くの研究が行われている 。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８ ８０（１９９２）； フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５７：９１９（１９９２）； マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２５７：９２７（１９９２）； ラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５７：９６４（１９９２）参照。 Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは癌にも関連付けられてきた。例えば 、ここに参考文献として添付される１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１ 月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、細胞表面上に発 現されるペプチドにプロセッシングされ、 特定のＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を可能にする遺伝子の一つのファミリが開示 されている。これらの遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原先駆体」、即ち、“ＴＲＡＰ” 分子をコード化するものであると言われており、これらから誘導されるペプチド は、「腫瘍拒絶抗原」、又は“ＴＲＡ”と呼ばれている。この遺伝子ファミリの 詳細については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇ ｅｎｅｔｉｃｓ ３５：１４５（１９９２）；ヴァン・デア・ブルッゲン（ｖａ ｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３（１９９ １）参照。 その開示内容をここに参考文献として添付する米国特許出願第９３８，３３４ 号には、前記ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されてい る。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が既知 であれば、特定のペプチドが一つのＨＬＡ分子に結合し、他の分子には結合しな いと予期される、と教示している。これは重要である。というのは、保有するＨ ＬＡ表現型は個体それぞれで異なるからである。その結果、ある特定のペプチド が特異的ＨＬＡ分子のパートナとして同定されることが様々な診断上又は治療上 の派生効果を有するとしても、これらはこの特定の ＨＬＡ表現型を保有する個体にしか関連性を有していない。細胞異常は一つの特 定のＨＬＡ表現型に限られていないので、この分野において更に研究が必要であ り、標的治療のためには対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が 必要である。 ここに参考文献として添付する１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第０ ０８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現生成物が、第２ＴＲＡにプロセッシング されるという事実が開示されている。この第２ＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃ１０−分子 によって提示される。この開示には、或るＴＲＡＰが複数のＴＲＡを産出するこ とが可能であることが示されている。 ここに参考文献として添付する１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第 ９９４，９２８号には、腫瘍拒絶抗原先駆体としてチロシナーゼが記載されてい る。この文献には、いくつかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって生成 される分子が、腫瘍細胞内でプロセッシングされてＨＬＡ−２Ａによって提示さ れる腫瘍拒絶抗原を作ることが開示されている。 これまで、もう一つの核酸分子が、前述したものとは別の腫瘍拒絶抗原先駆体 をコード化することが発見された。本発明のＴＲＡＰは、ＨＬＡ−２Ａによって 提示さ れる少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされるが、その配列分析に 依れば、本発明のこのＴＲＡＰはチロシナーゼとは異なり、またチロシナーゼに 関連するものでもない。従って、本発明は、腫瘍拒絶抗原先駆体、即ちＴＲＡＰ 分子をコード化する核酸分子に関する。このＴＲＡＰ分子はチロシナーゼではな い。更に、本発明のＴＲＡＰは、ＨＬＡ−２Ａ分子によって提示される少なくと も一つの腫瘍拒絶抗原、即ちＴＲＡにプロセッンングされる。前記ＴＲＡは、チ ロシナーゼと関係しておらず、本発明のＴＲＡＰから誘導される他のＴＲＡは他 のＨＬＡ分子によって提示可能である。 本発明及びその様々な側面を、以下の開示において詳述する。図面の簡単な説明 図１Ａは、ＬＢ３９−ＭＥＬ，Ｋ５６２，及びＬＢ３９芽細胞に対してＣＴＬ クローンＩ／９５を使用した細胞溶解実験の結果を示している。 図１Ｂは、ＳＫ２３−ＭＥＬ及びＳＫ２９−ＭＥＬに対してＣＴＬクローンＩ ／９５を使用した溶解を示している。 図２は、様々な細胞系をＣＴＬ Ｉ／９５と使用した ＴＮＦ放出アッセイの結果を示している。 図３Ａは、ＣＴＬクローンＩ／９５でテストされた場合の、トランスフェクシ ョン体を含む様々な細胞系によって誘発されたＴＮＦ放出を示している。 図３Ｂは、ＣＴＬクローンＩＶＳＢを使用したＴＮＦ放出データを示している 。 図３Ｃは、ＣＴＬクローン１０／１９６を使用したＴＮＦ放出を示している。 図４は、組織、細胞系及び腫瘍のパネルの、ここに記載の核酸分子から由来の オリゴヌクレオチドプローブを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用 した遺伝子ＡａＧｌｃ１２４の発現のテストを示している。好適実施例の詳細な説明 例１ 標準方法を使用して、患者ＬＢ３９から得たメラノーマ細胞からメラノーマ細 胞系”ＬＢ−３９−ＭＥＬ”を定着した。細胞の定着後、そのサンプルを照射し て、これを非増殖性とした。次に、これらの照射済みサンプルを使用して、これ に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞（”ＣＴＬｓ”）を分離した。 末梢血液単核細胞（”ＢＭＣｓ”）のサンプルを、 患者ＬＢ３９から採取し、前記照射済みメラノーマ細胞に接触させた。この混合 物のメラノーマ細胞の溶解を観察したところ、該サンプル中に、メラノーマ細胞 によって提示されたペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的なＣＴＬｓ が存在することが判った。 上述の使用した溶解アッセイは、ここに参考文献としてその開示内容を添付す るヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３９：３９０〜３９６ （１９８７）に基づくクロム放出アッセイであった。但し、このアッセイについ てはここに記載しておく。標的メラノーマ細胞を生体外で生育し、次に、これを １０ｍＭのＨＥＰＥＳと１０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中で１０⁷ｃｅｌ ｌｓ／ｍｌに再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄と４７℃で ４５分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを添加したＤＭＥ Ｍで３回洗浄した。次に、これらを１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１０％のＦＣＳとを 追加したＤＭＥＭ中に再懸濁させ、その後、１０³個の細胞を含む１００μｌの アリコットを、９６ウェルマイクロプレート中に分布させた。ＰＢＬｓのサンプ ルを、１００μｌの同じ培地に添加し、同じようにアッセイを行った。プレート を１００ｇで４分間遠心分離し、３７℃で８０％のＣＯ₂雰囲気中にて４時間 培養した。 プレートを再び遠心分離し、１００μｌの上清のアリコットを採取し、計数し た。⁵¹Ｃｒ放出の百分率は以下の式に基づいて計算された。 ここで、ＥＲは観察された実験⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³ラベル化細胞を２ ００μｌの媒体中のみで培養することによって測定された自発的放出量、そして ＭＲは、１００μｌの０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を標的細胞に添加するこ とによって得られた最大放出量である。 高いＣＴＬ活性をしめした前記単核血液サンプルを制限希釈によって拡張及び クローン化し、同じ方法を使用して再スクリーニングした。このようにして、Ｃ ＴＬクローンＬＢ３９−ＣＴＬ Ｉ／９５を分離した。 同じ方法を使用して、標的Ｋ５６２細胞と、自己移植ＰＨＡ誘発Ｔ細胞芽をテ ストした。図１Ａに示されたこれらの結果は、このＣＴＬクローンがメラノーマ 細胞系は認識して溶解するが、Ｋ５６２とＴ細胞芽細胞はいずれも認識も溶解も しないことを示している。次に、上述したものと同じ方法によって、ＣＴＬ、Ｌ Ｂ３９−ＣＴＬをメラノーマ細胞系ＳＫ２３−ＭＥＬ及びＳＫ２９ ＭＥＬ に対してテストした。これらのラインの両方からの細胞も又溶解された。これら の系は、共に、ＬＢ３９と同様に、ＨＬＡ−Ａ２として分類された患者から分離 されたものであった。このことは、前記ＣＴＬクローンＬＢ３９−ＣＴＬ Ｉ／ ９５がＨＬＡ−Ａ２によって提示される抗原を認識することを示すものであった 。例２ ＬＢ３９−ＣＴＬ Ｉ／９５が標的細胞と接触された時に、腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）も生成したか否かを調べるために更に研究を行った。ここで使用した方法 は、ここにその開示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅ ｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５〜１５２（１９９ ２）に記載されたものであった。簡単に説明すると、前記ＣＴＬ系のサンプルを 、培地中にて対象となる標的細胞のサンプルと結合した。２４時間後、前記培養 物からの上清を除去し、次に、ＴＮＦ感応性のＷＥＨＩ細胞上でテストした。前 述したＬＢ３９−ＭＥＬ及びＳＫ２３−ＭＥＬに加えて、別のＨＬＡ−Ａ２系、 即ち、ＳＫ２９−ＭＥＬ．１、ＨＬＡ−Ａ２欠失変異体、即ち、ＳＥＫ２９−Ｍ ＥＬ１．２２、及び非ＨＬＡ−Ａ２系、即ち、ＨＬＡ−Ａ１であるＭＺ２− ＭＥＬをテストした。 図２は、その結果を、前記上清に対する曝露によって死滅したＷＥＨＩ細胞の 百分率として示している。これらの結果は、前記ＨＬＡ−Ａ２欠失変異体ＳＫ２ ９−ＭＥＬ．１．２２は、もはや、ＣＴＬクローンを刺激することは出来ず、従 って、ＬＢ３９−ＣＴＬ−Ｉ／９５によって認識される抗原がＨＬＡ−Ａ２によ って提示されるものであることを示している。例３ 例２からの結果は、ＳＫ ＭＥＬ２９．１が目的の標的抗原を提示したことを 示すものであった。従って、これを、ｃＤＮＡライブラリを準備するための全ｍ ＲＮＡ源として使用した。 前記細胞系から全ＲＮＡを分離した。前記ｍＲＮＡは、周知の技術に従って、 オリゴ−ｄｔ結合キットを使用して分離した。ｍＲＮＡが得られた後、これを、 再び標準的方法を使用して、ｃＤＮＡに転写した。次に、製造業者の指示に従っ て、このｃＤＮＡをＥｃｏＲＩアダプタに連結し、プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／ ＡｍｐのＥｃｏＲＩサイトにクローン化した。次に、組換えプラスミドを、ＪＭ １０１ Ｅ．ｃｏｌｉに電気穿孔した（電気穿孔条 件：２５μファラド１パルス、２５００Ｖ）。 トランスフェクションしたバクテリアを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で 選択し、次に、これらをそれぞれが１００クローンから成る８００のプールに分 割した。分析に依れば約５０％のプラスミドがインサートを有していたので、各 プールは約５０種類のｃＤＮＡを示すものであった。マニアティス（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ）他，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．， １９８２）従って、各プールを飽和状態にまで増幅し、プラスミドＤＮＡを、フ ェノール抽出無しで、アルカリ溶解、酢酸カリウム沈澱によって分離した。例４ 例３に記載したライブラリの準備後、前記ｃＤＮＡを真核生物細胞にトランス フェクションした。このトランスフェクションは、前述したトランスフェクショ ンと全く同様に行った。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％の胎児ウシ血清を 添加したＤｅｌｂｅｃｏ’ｓ 変成Ｅａｇｌｅｓ培地（”ＤＭＥＭ”）中で、組 織培養平底マイクロウェルに１５，０００細胞／ウェルの割合で接 種した。これらの細胞を３７℃で一晩培養し、培地を取り除き、これを、４００ μｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭ クロロキン、１００ｎｇの プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２、及び１００ｎｇの前述のｃＤＮＡラ イブラリのプールのＤＮＡを含むＤＭＥＭ培地３０μｌ／ウェルにて置換した。 プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２は、ＳＫ２９−ＭＥＬからのＨＬＡ− Ａ２遺伝子を含有している。３７℃、４時間の培養後、前記培地を除去し、１０ ％のＤＭＳＯを含む５０μｌのＰＢＳによって置換した。この培地を２分後に除 去し、１０％のＦＣＳを添加した２００μｌのＤＭＥＭによって置換した。 この培地の交換後、ＣＯＳ細胞を３７℃で４８時間培養した。次に培地を廃棄 し、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、１０％のプールされたヒト血清を含有す る１００μｌのＩｓｃｏｖｅ培地中で、１０００細胞のＣＴＬ Ｉ／９５を添加 した。２４時間後に上清を除去し、参考文献として前述したトラヴァーサリ（Ｔ ｒａｖｅｒｓａｒｉ）他の記載に従い、ＴＮＦ含有量をＷＥＨＩ細胞上のアッセ イで測定した。 テストした８００のプールの内、９９％が前記上清中で３〜６ｐｇ／ｍｌの濃 度のＴＮＦ放出を刺激した。二 つのプールは、８ｐｇ／ｍｌ以上産出し、その複製ウェルも８ｐｇ／ｍｌ以上産 出した。例５ 前記上清中で多量のＴＮＦを産出した前述の二つのプールを選択して更に研究 した。詳しくは、前記バクテリアをクローン化し、各プールから８００のバクテ リアをテストした。ここからプラスミドＤＮＡを抽出し、前述したものと同じ方 法でＣＯＳ細胞の新たなサンプルにトランスフェクションし、再び、これらの細 胞のＬＢ３９−ＣＴＬクローンＩ／９５の刺激をテストした。ＡａＧｌｃ１２４ と称する一つの陽性クローンが見つかった。この陽性クローンからのｃＤＮＡと 前記ＨＬＡ−Ａ２遺伝子とによってトランスフェクションしたＣＯＳ細胞と、Ｈ ＬＡ−Ａ２のみによってトランスフェクションしたＣＯＳ細胞と、系ＳＫ２９− ＭＥＬとの比較テストを行うことによって、トランスフェクションされた細胞が ＣＴＬによって認識されるという確証が得られた。ＣＴＬ上清中のＴＮＦの放出 を、これを前述した方法で、ＷＥＨＩ細胞上でテストすることによって測定した 。ＭＴＴを使用して生存ＷＥＨＩ細胞の光学密度を測定した。図３Ａは、ＣＴＬ クローンＩ／９５で得られた結果を示している。 更にテストしたところ、前記のトランスフェクションした細胞中でＨＬＡ−Ａ ２によって提示されたペプチドは、以前に観察されたもの、即ち、チロシナーゼ 由来ペプチドと異なっていることが判った。ＣＴＬクローンＩＶＳＢは、チロシ ナーゼ由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ２との複合体に対する特異性を有する。このＣ ＴＬクローンをＡａＧｌｃ１２４とＨＬＡ−Ａ２とでトランスフェクションした 細胞と接触させたところ、図３Ｂに示すように、ＴＮＦ放出は僅かであった。例６ 前記陽性クローンからのｃＤＮＡを除去し、公知の技術に従って配列決定した 。配列検索したところ、前記プラスミドインサートは、公知の遺伝子やタンパク 質に対する相同性を有さないことが判った。配列認識番号（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＩＤ ＮＯ）：１は、ｃＤＮＡヌクレオチド情報を表し、これは１１９個のアミ ノ酸から成るタンパク質生成物に対応する、位置７５から４３１までの大きな転 写解読枠を示している。配列認識番号（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＩＤ ＮＯ）：２は 、前記配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１がその一部である配列の拡張配 列を示す。例７ ＣＴＬクローンＬＢ３９−ＣＴＬ Ｉ／９５を分離したのと同じ方法で、ＰＢ ＭＣｓと患者ＳＫ２９（ＡＶ）から発達させたメラノーマ細胞系のサンプルを使 用してＣＴＬクローンＳＫ２９−ＣＴＬ １０／１９６を分離した。この新しい 細胞系を、例５で記載したものと同じ方法でテストした。図３Ｃに示すそのアッ セイの結果は、ＡａＧｌｃ１２４によってコード化された腫瘍拒絶抗原（以後、 ＬＢ３９−Ａａと言う）もこのＣＴＬクローンによって認識されることを示して いる。これらの実験は、他の患者は、この抗原に対して特異的なＣＴＬを生成す ることが出来、事実、これらを生成している、ということを示すものである。 前述の配列からオリゴヌクレオチドプローブを誘導し、標準のポリメラーゼ連 鎖反応法に使用し、前記遺伝子の正常組織、腫瘍及び腫瘍細胞系における発現を 調べた。これらの結果は図４に示され、これはテストした正常組織の内、メラニ ン細胞のみが前記遺伝子を発現したことを示している。テストされた腫瘍サンプ ルのすべて及び／又はメラノーマ細胞系中の発現もテストしたことに注目された い。 上記実験は、腫瘍拒絶抗原先駆体、即ち、ＴＲＡＰ分 子をコード化する、新たに分離された核酸配列を記載している。この分子は、細 胞内で、その結果としてＨＬＡ−Ａ２によって提示される少なくとも一つの腫瘍 拒絶抗原、即ち”ＴＲＡ”が生成されるような方法でプロセッシングされる。こ れまでＨＬＡ−Ａ２分子がチロシナーゼから誘導されるペプチドを提示すること が観察されていたが、本発明の核酸配列は、チロシナーゼをコード化するもので はなく、前記ＴＲＡｓはチロシナーゼ由来ではない。 従って、本発明は腫瘍拒絶抗原先駆体、即ちＴＲＡＰを、ＴＲＡＰがチロシナ ーゼでないという条件下で、コード化する分離された核酸分子に関する。このコ ード化されるＴＲＡＰは、細胞表面上においてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示さ れる少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原、即ちＴＲＡにプロセッシングされるＴＲＡ Ｐである。本発明の核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性Ｄ ＮＡ（ｃＤＮＡ）、又はＲＮＡの形のいずれであってもよい。本発明は、更に、 前述の分子に対して相補的な分離された核酸分子にも関する。本発明の特に好ま しい態様は、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１に記載された配列を有す る分子である。 本発明は、更に、プロモータに作動可能に連結され、 本発明の前記核酸分子を含むベクターをもその範囲に含む。これらのベクターは 、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコード化する分子を含むことができる。これら二つの分 子、即ち、ＨＬＡ−Ａ２とＴＲＡＰが細胞融解Ｔ細胞応答を起こすのに必要であ るので、本発明は、更に、ＴＲＡＰとＨＬＡ−Ａ２をコード化する核酸分子が例 えばキット中で互いに分離した部分として提示される発現システムも含む。本発 明は、更に、ここに記載したベクターによってトランスフェクションされた細胞 系、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核生物細胞や、チャイニーズハムスタの子宮（ ”ＣＨＯ”）又はＣＯＳ細胞等の真核生物細胞等もその範囲に含むものである。 前述したように、ＴＲＡとＨＬＡ−Ａ２の複合体は、細胞溶解Ｔ細胞応答を誘 発する、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との分離さた複合体も、前述した 核酸配列によってコード化される分離された腫瘍拒絶抗原先駆体とともに本発明 の範囲に含まれる。 ここに記載した本発明は数多くの利用方法があるが、そのうちのいくつかを次 に述べる。先ず第１に、ＨＬＡ−Ａ２分子によって特異的に提示される腫瘍拒絶 抗原と、その平行腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子との同定によって 、当業者は、前記ＴＲＡＰの発現によっ て特徴付けられる疾患を診断することが可能になる。これらの方法は、前記ＴＲ ＡＰ遺伝子、及び／又は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示され、これから誘導される ＴＲＡ等の、ＴＲＡｓの発現の検出を含む。本発明のＴＲＡＰｓから誘導され、 異なったＨＬＡ分子によって提示される他のＴＲＡｓもある。前者の場合、その ような測定は、ポリメラーゼ連鎖反応や又は、標識化ハイブリダイゼーションプ ローブによるアッセイ等を含むすべての標準核酸測定アッセイによって行うこと が可能である。後者の場合、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体に対する、抗体等の結合 パートナによるアッセイが特に好適である。 前記ＴＲＡＰ遺伝子の分離によって、前記ＴＲＡＰ分子自身、特に、前記配列 認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のアミノ酸配列を有するＴＲＡＰ分子を分 離することも可能になる。これらの分離された分子は、ＴＲＡとして、あるいは 、ＨＬＡ−Ａ２等のＴＲＡとＨＬＡとの複合体等として提示された場合、アジュ バント等の物質と結合させて前記ＴＲＡＰ分子の発現によって特徴付けられる疾 患の治療に役立つワクチンを製造することが可能となる。更に、非増殖性癌細胞 、非増殖性トランスフェクタント（移入体）、等のような、前記ＴＲＡ／ＨＬＡ 複合体をその表面に提示する細胞からもワクチンを作る ことができる。細胞がワクチンとして使用される場合はすべて、ＣＴＬ応答を証 明するのに必要な前記成分の一方又は両方のためのコード化配列をトランスフェ クションされた細胞か、あるいは、トランスフェクション無しで両方の分子を発 現する細胞を、その細胞とすることができる。更に、前記ＴＲＰ分子、その関連 ＴＲＡｓ、及びＴＲＡとＨＬＡとの複合体は、周知の標準的技術を使用して抗体 の製造に使用することが出来る。 尚、ここでいう「疾患」とは、前記腫瘍拒絶抗原先駆体が発現されるすべての 病状のことを指す。このような障害の一例としては、特に、癌性メラノーマが挙 げられる。 この開示内容に基づく種々の治療アプローチは、ＨＬＡ−Ａ２細胞等のＴＲＡ 提示細胞の溶解をもたらす、対象体の免疫システムによる応答を前提条件として いる。このようなアプローチの一つは、前記複合体に対する特異性を有するＣＴ Ｌｓの、問題の表現型の異常細胞を有する対象体への投与である。当業者は、こ のようなＣＴＬｓを生体外で発育することが出来る。具体的には、血液細胞等の 細胞のサンプルを、前記複合体を提示し、かつ、特定のＣＴＬの増殖を誘発する ことが出来る細胞に接触させる。標的細胞は、前述したタイプのＣＯＳ細胞等の トランスフェクタントであってよい。これらのトランスフェクタントは、その表 面に前記所望の複合体を提示し、問題のＣＴＬと結合すると、その増殖を刺激す る。ここで使用したようなＣＯＳ細胞は容易に入手可能であって、他の適当な宿 主細胞も同様である。 養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）と称される前記治療方法（ グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏl．１３６（５）： １９１７（１９８６）； レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５７：２３８（７−１０−９２）； リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３〜１４１０（１９９１）； カスト（Ｋａｓｔ） 他，Ｃｅｌｌ ５９：６０３〜６１４（１１−１７−８９）について詳述すると 、所望の複合体を提示する細胞を、ＣＴＬｓと結合させ、この細胞に対して特異 的なＣＴＬｓを増殖させる。次に、この増殖したＣＴＬｓを、前記特定の複合体 を提示している前記異常細胞のいずれかによって特徴付けられる細胞異常を有す る対象体に投与する。すると、ＣＴＬｓが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を 達成する。 上述の治療方法は、対象体の異常細胞の内の少なくともいくつかが前記ＨＬＡ ／ＴＲＡ複合体を提示すること を前提としている。これは、その技術が特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定 する方法と、前記の配列を有するＤＮＡを発現する細胞を同定する方法とに非常 に類似しているため、非常に容易に判断することができる。一旦分離した後は、 そのような細胞を、対象体の異常細胞のサンプルについて使用し、生体外で溶解 を測定することができる。溶解が観察されれば、このような治療において特定の ＣＴＬｓを使用することによって、前記異常細胞に関連する状態を軽減すること が可能である。より単純な方法は、標準アッセイを使用して異常細胞のＨＬＡ表 現型を調べ、例えば、ＰＣＲ法を使用した増幅によって発現を測定するものであ る。 養子移入のみが本発明によって利用可能な治療方法ではない。種々のアプロー チを使用して、生体内でＣＴＬｓを誘発することも可能である。一つのアプロー チ、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に記載した。 このアプローチに於て使用される細胞としては、前記複合体を正常時において発 現する細胞、例えば、照射済みメラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前 記遺伝子の一つ又は両方によってトランスフェクンョンされた細胞、等を使用出 来る。このアプローチの一具体例はチェン（Ｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８： １１０〜１１４（１９９１年１月）に記載 されており、ここには、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクション細 胞の、治療法に於ける使用が示されている。様々な細胞タイプを使用することが できる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を担持するベクターを使用するこ とができる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらの システムにおいて、問題の遺伝子は、例えば、ワクシニアビールスやバクテリア ＢＣＧ等によって担持され、これらの物質が実質的に（ｄｅ ｆａｃｔｏ）宿主 細胞を「インフェクション」する。その結果得られる細胞は、問題の複合体を提 示し、自己移植ＣＴＬｓによって認識され、増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又は前 記先駆体自身を、問題のＨＬＡ分子を提示するＨＬＡ−Ａ２提示細胞への組込み を促進するアジュバントと結合させることによっても類似の効果を達成すること ができる。前記ＴＲＡＰはプロセッシングされてＨＬＡ分子のペプチドパートナ ーを生成し、他方、ＴＲＡは、更なるプロセッシングを必要とせずに提示される 。 本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろう。したがって、ここで は繰り返す必要はない。 ここに使用した用語及び表現は、説明のための用語で あって限定的なものではなく、従って、これらの用語及び表現の使用において、 図示記載された特徴構成又の均等物又はそれらの一部を除外する意図はなく、本 発明の範囲内において様々な変形態様が可能であると理解される。 （1）一般情報 （i） 出願人： ブリチャード，ヴィンセント， ファン・ペル，アリーン， トラヴァーサリ，カティア， ヴォルフェル，トーマス， ブーン‐ファラー，ティエリー， デ・プラーン，エティエンヌ （ii） 発明の名称：腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子 （iii）配列の数： ２ （iv） 連絡先： （A） 宛名 ： フェルフェ・アンド・リンチ （B） 通り名 ： サード・アベニュー 805 （C） 都市名 ： ニューヨーク・シティ （D） 州名 ： ニューヨーク （E） 国名 ： アメリカ合衆国 （F） 郵便番号： 10022 （v） コンピュータ読み取り可能フォーム （A） 媒体型式： 5.25 インチ フロッピーディスク，360 kb メモリ （B） コンピュータ： IBM PS/2 （C） オペレーティング・システム： PC-DOS （D） ソフト・ウェア： ワードパーフェクト（Wordperfect） （Vi） 先の出願データ： （A） 出願番号： 08/032,978 （B） 出願日 ： 1993年３月18日 （Xiii） 弁理士／代理人情報： （A） 氏名 ： ハンソン，ノーマン，ディ （B） 登録番号： 30,946 （C） 参照／書類番号： LUD 309 （ix） 通信情報： （A） 電話 ： （212）688-9200 （B） ファックス： （212）838-3884 （2）配列認識番号１の情報： （i） 配列特徴： （A） 長さ： 354基本ペア （B） タイプ： 核酸 （C） 鎖の数： 単一 （D） トポロジー： 直鎖状 （xi） 配列の記述： 配列認識番号１： （2）配列認識番号２の情報： （i） 配列特徴： （A） 長さ： 676基本ペア （B） タイプ： 核酸 （C） 鎖の数： 単一 （D） トポロジー： 直鎖状 （xi） 配列の記述： 配列認識番号２：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１月３１日 【補正内容】特許請求の範囲： １． ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされ る腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子をコード化する、又は、該核酸分 子に対する相補性を有する分離された核酸分子であって、前記腫瘍拒絶抗原先駆 体は、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１に記載のアミノ酸配列を有する 。 ２． 請求項１の分離された核酸分子であって、前記核酸分子は、前記腫瘍拒絶 抗原先駆体をコード化する。 ３． 請求項２の分離された核酸分子であって、前記核酸分子はＤＮＡである。 ４． 請求項３の分離された核酸分子であって、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。 ５． 配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列を有する請 求項４の分離された核酸分子。 ６． プロモータに作動可能に連結された請求項１の核酸分子を有する組替え発 現ベクター。 ７． 配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列から成る請 求項６の組替え発現ベクター。 ８． 請求項１の分離された核酸分子にて形質転換され又はトランスフェクショ ンされた原核生物細胞種または真核生物細胞系。 ９． 請求項８の原核生物細胞種又は真核生物細胞系であって、前記核酸分子は 、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列を有する。 １０．組替え発現ベクターによってトランスフェクションされた請求項８の原核 生物細胞種又は真核生物細胞系。 １１．請求項１０の原核生物細胞種又は真核生物細胞系であって、前記組替え発 現ベクターは、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列を 有する。 １２．ＨＬＡ−２Ａをコード化する核酸分子によってトランスフェクションされ た請求項８の原核生物細胞種又は真核生物細胞系。 １３．請求項６の組替え発現ベクターであって、該ベクターは、更に、ＨＬＡ− ２Ａをコード化する核酸分子を有する。 １４．ＨＬＡ−Ａ２分子と複合体を形成する腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされ る腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を診断する方法であっ て、対象体からのサンプルを、前記複合体に対して特異性を有する薬剤に接触さ せ、前記複合体と前記薬剤との相互作用を検出することによって前記疾患を検出 する。 １５．配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１に記載の配列を有する核酸分子 によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患 を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列に対して特異性を 有する抗原又はその発現生成物と接触させる工程と、前記薬剤と前記配列又は前 記発現生成物との間の相互作用を検出して前記疾患を検出する工程とを有する方 法。 １６．請求項２の核酸分子によってコード化される分離された腫瘍拒絶抗原先駆 体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ (72)発明者 ファン・ペル，アリーン ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 トラヴァーサリ，カティア イタリア国 ミラノ セスト・エッセ・ジ ョヴァンニ 20099 (72)発明者 ヴォルフェル，トーマス ドイツ連邦共和国 デー‐6500 マインツ ランゲンベックシュトラーセ １ (72)発明者 ブーン‐ファラー，ティエリー ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 デ・プラーン，エティエンヌ ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされ る腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子をコード化するか、又は該核酸分 子に対する相補性を有する、分離された核酸分子。 ２． 請求項１の分離された核酸分子であって、前記核酸分子は、前記腫瘍拒絶 抗原先駆体をコード化する。 ３． 請求項２の分離された核酸分子であって、前記核酸分子はＤＮＡである。 ４． 請求項３の分離された核酸分子であって、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。 ５． 配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列から成る請 求項４の分離された核酸分子。 ６． プロモータに作動可能に連結された請求項１の核酸分子を有するベクター 。 ７． 配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列から成る請 求項６のベクター。 ８． 請求項１の分離された核酸分子によってトランスフェクションされた細胞 系。 ９． 請求項８の細胞系であって、前記核酸分子は、配列認識番号（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列である。 １０．ベクターにてトランスフェクションされた請求項８の細胞系。 １１．請求項１０の細胞系であって、前記ベクターは、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列である。 １２．ＨＬＡ−Ａ２をコード化する核酸分子によってトランスフェクションした 請求項８の細胞系。 １３．請求項６のベクターであって、該ベクターは更に、ＨＬＡ−Ａ２をコード 化する核酸分子を有する。 １４．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原によってプロセッシン グされる腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体 を治療する方法であって、前記対象体に、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２との 複合体に対して特異性を有し、かつ、前記複合体を提示する細胞を融解する細胞 融解Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を投与することを有する方法。 １５．核酸分子によってコード化されるとともに、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列から成る腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特 徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して 、ＨＬＡ分子と前記腫瘍拒絶 抗原先駆体から誘導される腫瘍拒絶抗原との複合体に対する特異性を有する細胞 融解Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を投与することを有する方法。 １６．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされ る腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療 する方法であって、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対する免 疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発す るのに十分な量を前記対象体に投与することを有する方法。 １７．配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のヌクレオチド配列を有する核 酸分子によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられ る疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ ２分子との複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細 胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量を前記対象体に投与することを有す る方法。 １８．ＨＬＡ−Ａ２分子と複合体を形成する腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされ る腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を診断する方法であっ て、 対象体からのサンプルを、前記複合体に対する特異性を有する薬剤に接触させ、 前記複合体と前記薬剤との相互作用を検出することによって前記疾患を検出する 。 １９．配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１に記載の配列を有する核酸分子 によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患 を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列に対する特異性を 有する抗原又はその発現生成物と接触させる工程と、前記薬剤と前記配列又は前 記発現生成物との間の相互作用を検出して前記障害を検出する工程とを有する方 法。 ２０．請求項２の核酸分子によってコード化される分離された腫瘍拒絶抗原先駆 体。