JPH08507784A

JPH08507784A - Virus vaccine

Info

Publication number: JPH08507784A
Application number: JP6520817A
Authority: JP
Inventors: チャールズイングリス，スティーブン; エドワードグリフスボースネル，マイケル; チャールズミンソン，アンソニー
Original assignee: キャンタブファーマシューティカルズリサーチリミティド
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-21
Publication date: 1996-08-20
Also published as: AU696336B2; WO1994021807A2; EP0689603A1; WO1994021807A3; AU6261794A; CA2158148A1

Abstract

(57)【要約】本願は、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥がある非レトロウイルス系変異ウイルス（特にHSV-1および／またはHSV-2）を含有する医薬を提供するものである。このウイルスは正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製しかつウイルス抗原遺伝子を発現できるが正常な感染性ウイルスを産生できない。この医薬は、正常な感染性ウイルスに感染した患者に免疫応答を起こさせて予防または治療を行うのに用いられる。上記非レトロウイルス系ウイルスが単純ヘルペスウイルス例えばHSV-1またはHSV-2である場合、その欠陥部分が糖タンパク質のgH遺伝子内にあるワクチンおよび治療用医薬は、特に上皮内、経口、膣内および鼻腔内の投与を行うために提供される。また、２型HSVの感染に対して患者に免疫応答を起こして予防または治療に用いる医薬を製造するための、HSV-1に基づいた変異体の使用も提供する。 (57) [Summary] The present application provides a drug containing a non-retroviral mutant virus (particularly HSV-1 and / or HSV-2) whose genome is defective in a gene essential for producing an infectious virus. It is provided. This virus infects normal cells and then replicates in those cells and can express viral antigen genes but is unable to produce normally infectious virus. This medicine is used for causing an immune response in a patient infected with a normal infectious virus to prevent or treat. When the non-retroviral virus is herpes simplex virus, such as HSV-1 or HSV-2, vaccines and therapeutic drugs whose defective portion is in the gH gene of glycoprotein, especially intraepithelial, oral, vaginal and Provided for intranasal administration. Also provided is the use of the HSV-1 based mutants for the manufacture of a medicament for causing an immune response in a patient against HSV type 2 infection for use in prevention or treatment.

Description

【発明の詳細な説明】ウイルス・ワクチン本発明はウイルス・ワクチンに関する。ウイルス・ワクチンには伝統的に２種類ある。第一の種類は“死菌ワクチン” であり、これは適切な化学薬品例えばβ−プロピオラクトンで処理して殺されたウイルスの製剤である。第二の種類は“弱毒化”生ワクチンであり、これはウイルスゲノムの特別の遺伝子操作またはより一般的にはある種の組織培養系での継代によって、宿主に対して病原性を少なくしたウイルスである。これら２種のワクチンは各々それ自体の欠点をもっている。死菌ワクチンは宿主内で複製しないので、通常、注射によって投与され、その結果、不適正な種類の免疫応答を生じることがある。例えばソークワクチン（ポリオウイルスの死菌製剤）は、免疫グロブリン（Ig）Ｇ抗体応答を起こすが、一次感染の自然部位である腸管でのIgA の産生を刺激しない。したがって、このワクチンは、ポリオの神経併発症から個体を防御できるが一次感染を遮断せずしたがって“集団免疫”を与えない。その上、死菌ウイルスは宿主細胞内に入って複製することがない。したがって複製中に産生される非構造タンパク質類に対する有益な免疫応答は得られない。また死菌ウイルスは、ウイルス抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞の産生を刺激できないことが多い。“死んだ”抗原は、抗原提供細胞によってピックアップされＴ細胞に提供することができる。しかしこの提供は、MHCクラスIIの分子によって起こり、Ｔヘルパー細胞が刺激される。一方、Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞が抗原に対して特異的な抗体を産生するのを援助する。細胞障害性Ｔ細胞の産生を刺激するには、ウイルス抗原は感染細胞内の特定の経路を通じてプロセスされそして切断されたペプチドフラグメントとしてMHCクラスＩ分子に提供されなければならない。この分解経路は感染細胞内で合成されるタンパク質に対して最も有効に作用すると考えられるので、宿主細胞内に入って免疫原性ウイルスタンパク質を発現するウイルスだけがウイルス特異的細胞障害性Ｔ細胞を生成できる。それ故、死菌ワクチンはウイルス感染に対する細胞障害性Ｔ細胞の貧誘導物質である。この観点から弱毒化生ワクチンの方がより満足すべきワクチンである。従来、弱毒化生ウイルスは、非必須遺伝子を欠失させるかまたは一つ以上の必須遺伝子に部分的に損傷を与える（この場合、その損傷はその遺伝子は依然として機能を有しているがそれほど有効には作動しないような損傷である）ことによって調製されている。しかし、弱毒化生ウイルスには宿主に対して有害な作用をする残留病原性が保持していることが多い。その上、弱毒化が特異的な欠失でなされていない場合は、一層強毒の形態に逆転する可能性がある。それにもかかわらず、ある種のウイルスタンパク質の産生が宿主中に起こるということは、弱毒化生ワクチンがこのようなウイルスタンパク質を産生できない死菌ワクチンより有効であることが多いことを意味する。弱毒化生ウイルスは、独自にワクチンとして使用されるだけでなく、他の遺伝子の“ワクチンベクター”、換言すればそれに対する防御が必要な第二のウイルス（または他の病原体）由来の遺伝子の担体としても使用することができる。一般にポックスウイルス科のメンバーの例えばワクシニアウイルスがワクチンベクターとして使用される。ウイルスがワクチンベクターとして使用される場合、病原作用を全く起こさないことが大切である。換言すれば、単純ウイルスワクチンを弱毒化するのと同じ方式で弱毒化することが必要である。それ故、上記欠点と同じ欠点がこの場合に加わる。ウイルスのゲノムから必須遺伝子を欠失させ、一方、その欠失遺伝子の産物をそのウイルスに与えるいわゆる‘相補’細胞（‘complementing’cell）を提供することが可能であることが見出されている。このことはある種のウイルス、例えばアデノウイルス類、ヘルペスウイルス類およびレトロウイルス類について達成されている。アデノウイルスの場合、ヒト細胞系がアデノウイルスの５型DNAのフラグメントで形質転換された（Graham，Simley，RussellおよびNairn,J.G.Virol.，36巻，59〜72頁，1977年）。その細胞系はある種のウイルス遺伝子を発現し、それらの遺伝子を欠失されたかまたは不活性化されたウイルス変異体の増殖を支持できることが発見された（Harrlson，GrahamおよびWilliams，Virology，77巻，319〜329頁，19 77年）。該ウイルスはこの細胞系（‘相補細胞系’）で良好に増殖して標準のウイルス粒子を産生したが、正常なヒト細胞では全く増殖しなかった。SV40ウイルスゲノム（パポーバウイルス）のＴ抗原をコードする領域を発現する細胞も、この領域を特異的に欠失しているウイルスの複製を支持できることが報告されている（Gluzman,Cell，23巻，182〜195頁，1981年）。ヘルペス単純ウイルスの場合、gB糖タンパク質（Caiら，J.Virol.，62巻，714〜721頁，1987年）、gD糖タンパク質（LigasおよびJohnson，J．Virol.，62巻，1486頁，1988年）および即時型タンパク質ICP4（Delucaら，J.Virol.，56巻，558頁，1985年）を発現する細胞系が製造されており、これらの細胞系は、対応する遺伝子の特異的に不活性化されたコピーを有するウイルスの複製を支持できることが報告されている。 1992年４月２日に公開された国際特許願公開第WO92/05263号は、そのゲノムが、感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥かあるので、正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製しかつウイルス抗原遺伝子を発現できるが正常な感染性ウイルスを産生できない非レトロウイルス系変異ウイルス（mutant non-retroviral virus）を提供した。国際特許願公開第WO92/05263号の教示による非レトロウイルス系変異ウイルスは、弱毒化ワクチンによるウイルスタンパク質の生体内産生によって誘発される余分の免疫応答で、死菌ワクチンの効力と安全性を兼ねそなえる独得の方法を提供している。好ましい実施態様において、国際特許願公開第WO92/05263号の発明には二つの特徴がある。第一に、選択された遺伝子が、通常、特定の欠失を生じさせることによって、ウイルスゲノム内で不活性化される。この遺伝子は、感染性ウイルスの産生に関与しているが好ましくはウイルスゲノムの複製を妨害しない。したがって被感染細胞は複製された遺伝子物質からより多くのウイルスタンパク質を産生することができ、そして場合によっては新しいウイルス粒子が産生されるが、これらのウイルス粒子は感染性ではない。これは、そのウイルス感染が接種部位から拡散することがないことを意味する。国際特許願公開第WO92/05263号の発明の第二の特徴は、ウイルスに、欠失遺伝子の産物を提供して、そのウイルスを組織培養で増殖できるようにする細胞である。したがってそのウイルスは必須タンパク質をコードする遺伝子を欠いているが、適正な宿主細胞内で増殖させると、増殖して、外観は原ウイルスから識別できない完全ウイルス粒子を産生する。この変異ウイルスの製剤は、欠陥ゲノムをもっているので正常宿主内で感染性ウイルスを産生できないという点で不活性であるから、宿主内で体液性応答を直接生成させるのに必要な量で安全に投与することができる。したがって、この変異ウイルスは、防御すべき宿主の細胞に対して感染性である必要はなく、単に通常の死んだウイルスのワクチンまたは弱毒化ウイルスのワクチンとほとんど同じ方式で作動する。しかし免疫化を行うウイルスは、細胞に結合し、細胞内に入り、次いでウイルスの複製サイクルを開始し、したがって防御すべき種の宿主細胞内で感染を開始してその中である種のウイルス抗原を産生できる点で、それ自体やはり感染性である方が好ましい。したがって、宿主の免疫系の細胞アームを刺激する追加の機会がある。特に、HSV-1の（上記のような）変異体型を用いてマウスに耳を通じて上皮内予防接種を行ったところ、野性型HSV-1によるその後の攻撃に対して、死んだHSV -1による同様の予防接種より優れた防御を行ったということを示す生体内データを国際特許願公開第WO92/05263号が提供したということは述べておかねばならない。また、頚神経節の潜伏感染の樹立を防御する明確な作用も変異HSV-1による予防接種に対して示された。出願人らは、上記の変異ウイルスをDISCウイルス（defective infectious sin gle cycleを意味する）と呼び、その基本概念を図１に示す。本願は国際特許願公開第WO92/05263号に開示されている研究から続いている。本願はその開示事項を要約すると以下のとおりである。（１）マウスの耳のモデルを用いる試験で国際特許願公開第WO92/05263号に報告された試験結果を確認した。DISC HSV-1を用いてマウスに上皮内予防接種を行ったところ、攻撃ウイルスの野生型（w.t.）HSV-1が複製しないように完全に防御を行った。同じ投与量の不活性化HSV-1を用いた場合、有効な防御はほとんど与えられなかった。またDISC HSV-1は頚神経節中に潜伏感染が樹立されないように防御した。（２）また上記のマウスの耳のモデルで、DISC HSV-1および同量の不活性化HS V-1で予防接種した動物間に抗体力価の有意差は全くみとめられなかったことを示す。（３）また上記のマウスの耳のモデルで、低い予防接種投与量の場合、不活性化HSV-1は遅延型過敏症（DTH）応答を樹立できなかったが、同じ投与量のDISC H SV-1はDTH応答を樹立したことを示す。高い投与量の場合は、DISC HSV-1と不活性化HSV-1の両者が類似のDTH応答を誘発した。（４）またマウスの試験で、不活性化HSV-1による予防接種とは逆に、DISC HS V-1による予防接種によってHSV-1特異的細胞障害性Ｔ細胞活性が誘発された。（５）マウスの耳の生体内モデルを用いて、DISC HSV-1の長期間の予防作用を試験した。DISC HSV-1を２回予防接種したところ、w.t.HSV-1による攻撃に対して、不活性化DISC HSV-1による２回の予防接種より優れた長期間の防御を行うことが見出された。（６）マウスの耳の生体内モデルを用いて、HSV-2の感染に対するDISC HSV-2 の予防作用を調べた。マウスにDISC HSV-2を上皮内予防接種すると、攻撃ウイルスのw.t.HSV-2の複製に対して、不活性化DISC HSV-2より優れた防御を行った。（７）モルモットの膣の生体内モデルを用いて、HSV-2感染に対するDISC HSV- 1の予防作用を試験した。DISC HSV-1による上皮内予防接種または膣内予防接種は、HSV-2の感染の一次症状に対して高度の防御を行うことを示した。DISC HSV- 1または不活性化ウイルスによる免疫化によって、攻撃ウイルスのw.t.HSV-2の膣内での増殖が阻害された。DISC HSV-1による別の膣内予防接種によって、その後の100日間における再発HSV-2の病巣の数が減少した。DISC HSV-1と不活性化ウイルスによる上皮内予防接種を行った場合も再発病巣が減少したが、DISC HSV-1による膣内予防接種と比べてその減少は少なかった。（８）モルモットをDISC HSV-1で経口および鼻腔内接種を行ったところ、w.t. HSV-2による攻撃に続いて起こる急性疾患の症状に対して防御がなされた。鼻腔内経路の方が経口経路より有効のようであった。経口または鼻腔内予防接種に比べて、経膣予防接種経路は、攻撃後に回復するウイルスのレベルが有意に低かった。（９）一次HSV-2疾患から充分に回復したモルモットに、DISC HSV-1の治療投与を膣内または上皮内に行ったところ、擬似予防接種がなされた（mockvaccinat ed）動物と比べて疾患の症状の再発の頻度が明らかに減少した。（10）一次HSV-2疾患から充分に回復したモルモットに、DISC HSV-2を膣内に治療投与を行ったところ、DISC HSV-1による治療より、疾患症状の再発の頻度を減少させるのに有効であった。本発明は、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製しかつウイルス抗原の遺伝子を発現できるが正常の感染性ウイルスを産生できない非レトロウイルス系変異ウイルスを含有し、感染性ウイルスに感染した患者に免疫応答を起こさせて予防もしくは治療に用いる医薬を提供するものである。上記の欠陥によって、非感染性のウイルス粒子を細胞から産生し放出することができる。本発明は、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製して、非感染性ウイルス粒子を該細胞から産生し放出できる非レトロウイルス系変異ウイルスを含有する医薬を提供するものである。この医薬は、この医薬で免疫化された患者を、非レトロウイルス系ウイルスによる感染または感染の結果に対して防御することができる。この医薬は、この医薬で免疫化された患者を、対応する野生型ウイルスによる感染または感染の結果に対して防御できるワクチンである。この医薬は、非レトロウイルス系ウイルスの感染が確定した患者を治療できる治療剤である。この医薬は、対応する野生型ウイルスの感染が確定した患者を治療できる治療剤である。この医薬は、皮下、筋肉内、皮膚内、上皮内（乱切ありもしくは乱切なしで）、鼻腔内、膣内、または経口で投与可能であり、選択された投与経路に適した賦形剤を含有している。該変異体は二本鎖DNAのウイルス由来のものでもよい。該変異体はヘルペスウイルス由来でもよい。該変異体は単純ヘルペスウイルス（HSV）由来のものでもよい。その変異体は１型HSVまたは２型HSVでもよい。その欠陥部はその糖タンパク質 gH遺伝子中にある。本発明は、そのゲノムが感染性HSV-2を産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製し、かつウイルス抗原を発現できるが正常な感染性ウイルスを産生できない２型HSVを、HSV例えばHSV-2に感染した患者に免疫応答を起こさせて予防または治療に用いるために提供するものである。変異HSV-2の上記欠陥によって、非感染性ウイルス粒子を細胞から産生し放出することができる。また、そのゲノムが感染性HSV-2の産生に必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製して非感染性のウイルス粒子を該細胞から産生し放出できる２型HSVも提供される。この変異体は、この変異体で免疫化された患者を、HSV例えばその対応する野生型ウイルスによる感染またはその感染の結果に対して防御できる。この変異体は、HSV例えばその対応する野生型ウイルスの感染が確定した患者を治療できる。その欠陥部は糖タンパク質gH遺伝子内にある。本発明は、そのゲノムがHSV-1を産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し次いでその細胞内で複製しかつウイルス抗原遺伝子を発現できるが正常な感染性ウイルスを産生できない変異１型HSVの、患者に２型HSVの感染に対抗する免疫反応を起こさせて予防または治療に用いる医薬を製造するための使用を提供するものである。その使用は、上皮内（乱切法を使用もしくは使用しない）、膣内、鼻腔内または経口内投与に用いる医薬に対する使用である。また本発明は、HSVの感染によって起こる症状を予防または治療するため患者に医薬を投与する方法に関する印刷説明書とともに、容器の注射器もしくはガラスバイアルびん／アンプルに好ましくは予め充填されているか、または該容器が添付されている上記医薬（予防用にはワクチンまたは治療用には治療剤）が入っているアセンブリーを提供するものである。その印刷説明書は顔面もしくは生殖器の病巣の予防または治療に関するものである。上記のこれら変異体を含有するワクチンは当該技術分野で公知の方法にしたがって製造することができ、すなわちその変異体は適切な賦形剤と混合して組み合わせる。適切な賦形剤としては、例えば食塩水またはウイルス感染を予防するために利用される組成物に使用する、当該技術分野で知られている他の添加物がある。このようなワクチンは、宿主に有効な投与を行うのに有用なワクチンを製造するため、本発明によって提供される変異体の有効量と、適切な量の賦形剤を含有している。薬剤投与率は公知の方法によって決定することができる。例えば薬剤投与率は、ワクチン製剤中の変異体の量を変えて投与することによってもたらされる、変異体に対する抗体の最適量を測定することによって決定することができる。ワクチン調製に関しその外の背景になっている詳細について、A.VollerおよびH.Frie dman編、ボルチモア所在のUniversity Park Press社1978年発行“New Trends an d Developments in Vaccines”に論じられている。本発明で提供される変異体を含有する治療剤は、治療用に有用な組成物を提供する公知の方法にしたがって配合することができ、すなわち変異体は医薬として許容される担体賦形剤と混合して組合わされる。適切な賦形剤とその配合についてはE.W.Martin著Remington's Pharmaceutical Scienceに記載されている。このような組成物には、宿主に有効な投与を行うのに適した治療剤として許容される組成物を調製するため、本発明の変異体の有効量を、適切な量の担体賦形剤とともに含有している。一般にワクチンは、液状の溶液または浮遊液のような注射剤（外傷性もしくは非外傷性）として調製される。また注射する前に、液状の溶液または浮遊液にするのに適した固体の形態のものも製造できる。これらの製剤はリポソームの中に封入してもよい。活性の免疫原性成分は、医薬として許容されかつその活性成分と相容性である賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤としては例えば水、食塩水、デキストロース、グリセリン、トレハロースなどおよびその混合物がある。さらに、所望により、ワクチンは、他の安定剤および／またはpH緩衝剤のような補助物質であって、ワクチンの安定性したがって有効性を高める物質を少量含有していてもよい。本発明のワクチンは、注射、例えば皮下、上皮内（乱切法を用いるか用いずに）に注射することによって非経口で投与することができる。その外の投与法に適した他の配合物、例えば経口用、膣用および鼻腔用の配合物も提供される。経口配合物は、例えば医薬グレードのトレハロース、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのごとき通常用いられる賦形剤を含有している。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性配合物または散剤の形態であってもよい。本発明のワクチンは、その剤形に適合した方式でかつ予防するのに有効な量で投与される。投与量は、最適な免疫応答を与えるため、前臨床試験および臨床試験（第Ｉ相）によって予め決定した。本発明のワクチンは一回投与の計画または好ましくは多数回投与の計画で投与できる。多数回投与計画では、予防接種の一次コースが１〜３回の別個の投与で行われ、続いて別の投与が免疫応答を維持しおよび／または強化するため必要な時間間隔を置いて行われ、例えば第二の投与を１〜４箇月目に行い、そして必要に応じて数箇月後に次の投与を行う。またこの投与計画は、期間中、最適の免疫応答を維持するように前臨床試験および臨床試験によって決定した。本発明をさらに明らかに理解するため、以下の図面を参照して、単に実施例として、本発明を限定せずにさらに説明する。図１はDISCウイルスの概念を示す。図２は、生DISC HSV-1または不活性化（β−プロピオラクトンで処理した）w. t.HSV-1（菌株SC16）で予防接種したマウスの耳の、野生型HSV-1（w.t.HSV-1）菌株SC16ウイルスのクリアランスを示す。４頭づつの群に、左耳たぶに対して乱切法によって指定の投与量で予防接種を行った。予防接種を行ってから14日後、マウスの右の耳たぶを２×10⁶pfuのw.t.HSV-1菌株SC16で攻撃し、攻撃してから５日後にウイルス力価を測定した。データは幾何平均値と該平均値の標準誤差として示す。図３は、w.t.HSV-1（菌株SC16）、生DISC HSV-1、死んだDISC HSV-1またはPBS で予防接種を行ったマウス中のw.t.HSV-1に対する抗体の中和力価とELISA力価の測定結果を示す。マウス由来の血清を、w.t.HSV-1に対する中和抗体に対する補体の存在について、プラーク減数検定法で検定した。個々の力価は、抗体なしで得られた感染力の50％を中和するのに必要な血清の希釈度の逆数（reciprocal d ilution）として示す。図４は、w.t.HSV-1（菌株SC16）、生DISC HSV-1、死んだDISC HSV-1またはPBS で予防接種を行ったマウスの遅延型過敏（DTH）応答を示す。マウスには指定の投与量で左の耳たぷに予防接種を行ってから14日後に、反対側の耳を10⁶pfuのw. t.HSV-1（菌株SC16）で攻撃した。耳の厚みを該攻撃を行ってから24時間後と48 時間後に測定し、攻撃された耳と予防接種された耳との差として示す。データは耳の厚み（μｍ）の差の平均値として示してある。図５は、生DISC HSV-1、死んだDISC HSV-1，MDK（チミジンキナーゼ陰性HSV-1 菌株）またはPBSで予防接種したマウスの細胞障害性Ｔ細胞（CTL）の応答を示す。マウスは３週間の間隔をおいて２回腹腔内投与を行って免疫化し、そして第二の注射をしてから10日後に脾臓から細胞浮遊液を作製した。細胞を生体外で４日間刺激した後、標的細胞として⁵¹Crの標識をつけたA20/2Jを用いてCTL検定法で試験した。データは各点において４個づつの試料からの⁵¹Cr放出％の平均値として示してある。これら平均値の標準誤差はすべて＜10％である。図６は、上皮内または膣内の経路によって３週間の間隔をおいて２回、10⁷pfu づつのDISC HSV-1の投与量で予防接種を行ってから、 10^5.2pfuのw.t.HSV-2（菌株MS）で攻撃した後のモルモットの紅斑の得点で評価した臨床症状を示す。図７は、上皮内または膣内の経路によって３週間の間隔をおいて２回、10⁷pfu づつのDISC HSV-1の投与量で予防接種を行ってから、10^5.2pfuのw.t.HSV-2（菌株MS）で攻撃した後のモルモットの全病巣の得点で評価した臨床症状を示す。図８は、上皮内または膣内の経路によって３週間の間隔をおいて２回、10⁷pfu づつのDISC HSV-1の投与量で予防接種を行ってから、10^5.2pfuのw.t.HSV-2（菌株MS）で攻撃を行った後のモルモット内での、後で攻撃したウイルスであるw.t. HSV-2（菌株ＭＳ）の複製を示す。図９ａと９ｂは、上皮内または膣内の経路によって３週間の間隔をおいて２回、10⁷pfuづつのDISC HSV-1の投与量で予防接種を行ってから、10^5.2pfuのw.t.HS V-2（菌株MS）で攻撃した後の、モルモットの再発疾患を示す。図９ａは、再発疾患を累積平均紅斑指数／動物として示す。図９ｂは、再発疾患を、一頭の動物当り疾患にかかっている日数の累積平均値で示す。図10は、w.t.HSV-2（菌株MS）に感染している動物（モルモット）に、膣、経口または鼻腔の経路で擬似ウイルス製剤、DISC HSV-1または不活性化DISC HSV-1 の予防接種を行った場合の該動物一頭当りの病巣の平均得点を示す。図11は、w.t.HSV-2（菌株MS）に感染している動物（モルモット）に、膣、経口または鼻腔の経路で擬似ウイルス製剤、DISC HSV-1または不活性化DISC HSV-1 の予防接種を行った場合の該動物一頭当りの紅斑の平均得点を示す。図12は、w.t.HSV-2（菌株MS）に感染している動物（モルモット）に、膣、経口または鼻腔の経路で、擬似ウイルス製剤、DISC HSV-1 または不活性化DISC HSV-1で予防接種を行った場合の該動物一頭当りのw.t.HSV- 2（菌株MS）のlog力価の平均値を示す。図13は、治療予防接種を行った後の再発疾患を示す。これは、上皮内もしくは膣内にDISC HSV-1を予防接種するかまたは膣内に擬似ウイルス製剤を予防接種したモルモット群をw.t.HSV-2（菌株MS）で攻撃した後に疾患が観察される日数（疾患／日）の平均累積値として示す。疾患は、一つ以上の病巣の存在または１以上の紅斑の得点で分類した。動物は、w.t.HSV-2（菌株）による最初の攻撃（ゼロ日）を行って４週間後から100日間監視した。動物には、２×10⁷pfuまたは指定されているのと均等な投与量でゼロ日、24日目および44日目に予防接種した。図14は、DISC HSV-1で予防接種を行ったマウスの、w.t.HSV-1（菌株SC16）による攻撃に対する長期間の防御作用を示す。このグラフは、攻撃してから５日後および予防接種してから223日後の耳におけるw.t.HSV-1の平均log力価を示す。図15は、DISC HSV-1で予防接種したマウスの、w.t.HSV-1（菌株SC16）による攻撃に対する長期間の防御作用を示す。このグラフは、上記予防接種を行ってから15日目、27日目、90日目、152日目および218日目の中和抗体の力価を示す。図16は、DISC HSV-2で予防接種したマウスの、w.T.HSV-2（菌株HG52）による攻撃に対す防御作用を示す。なお上記予防接種は生DISC HSV-2、死んだDISC HSV -2およびw.T.HSV-2（菌株HG52）の各種の投与量で行った。グラフは攻撃後の耳のw.t.HSV-2の平均log力価を示す。図17は完全なHSV-2gH遺伝子を含有する一本鎖プラスミドの構築を示す。図18は、一文字のアミノ酸記号でgH遺伝子を並行して示すgH遺伝子の領域におけるHSV-2菌株25766の配列を示す。図19は、gH遺伝子の領域における、HSV-1とHSV-2菌株25766のDNA配列の比較を示す。図20は、HSV-1菌株17とHSV-2菌株25766のgHタンパク質の推定アミノ酸配列の比較を示す。図21は、gH遺伝子の領域におけるHSV-1とHSV-2のDNA配列の間の類似性のレベルをグラフで示す（UWGCG program Plotsimimilarityによる）。図22は、HSV-1とHSV-2のgHタンパク質のアミノ酸配列の間の類似性のレベルをグラフで示す（UWGCG program Plotsimilarityによる）。図23はpIMMB26の構築を示す。すなわちHSV2gH遺伝子の左側と右側からの二つのフラグメントをPCRで増幅しpUC119中にクローン化した。四つのオリゴヌクレオチドMB57，MB58，MB59およびMB60を示す。図24はpIMMB45の構築を示す。図25は第一段階の組換えベクターpIMMB47+の構築を示す。図26は第二段階の組換えベクターpIMMB46の構築を示す。図27は組換え体のHG52-D，TKマイナスDISCウイルス、TKプラスDISCウイルスについての制限マップ分析の結果を示す。図28は、図27に示すような右側に隣接する配列でプローブされた各種のウイルスをBamHIで消化したもののサザーンブロットを示す。レーン５：HG52-Dウイルス；レーン２：TK−マイナス“第一段階”DISCウイルス；およびレーン３，４，６，７および８：TK−マイナス“第二段階”DISCウイルス類。糖タンパク質Ｈが欠失した単純ヘルペスウイルス（gH-HSV）単純ヘルペスウイルス（HSV）は、顔面および生殖器の再発病巣ならびに致命的なことが多いがまれな脳炎を含む広範囲の病原症状をヒトに起こす大きなDNAウイルスである。一般に１型HSV（HSV-1）は特に顔面の病巣に関連があるようであり、一方２型HSV（HSV-2）は特に生殖器の病巣に関連があるようである。HSVの感染は、医薬アシクロビルを用いる化学療法によってある程度防御できるが、一次感染およびその感染の結果を予防するのに利用できるワクチンはまだない。したがって、確定されたHSV感染症を治療するための優れた治療剤、およびHSV感染症の確定および／またはそれに付随する病状を予防する予防薬の両者が要望されている。 HSVに対する予防接種が困難なのは、このウイルスが通常、細胞から細胞へ直接転移することによって身体内に拡散するからである。したがって体液性免疫は、循環する抗体が細胞外のウイルスしか中和できないので有効ではないようである。ウイルスの感染を防御するのに一層重要なのは細胞性免疫であり、したがって体液性免疫と細胞性免疫の両者を発生させることができるが安全でもあるワクチンは非常に有利である。 HSVゲノム内で不活性化させるのに適切な標的遺伝子は糖タンパク質Ｈの遺伝子（gH）である。このgHタンパク質はウイルス外皮の表面に存在している糖タンパク質である。このタンパク質は、ウイルスが感染細胞中に入る間に、膜融合のプロセスに関与していると考えられている。その理由は、この遺伝子が損傷している温度感受性のウイルス変異体は、非許容温度では、ウイルスに感染した細胞から放出されないからである（Desaiら，J.Gen.Virol.，69巻，1147〜1156頁，1 988年）。このタンパク質は感染の後期に発現されるので、このタンパク質が存在しないときに、かなりの量のウイルスタンパク質の合成が起こっている。遺伝子操作手順はすべて、Sambrook，FritschおよびManlatis編集“Molecular Cloning”A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator y Press，1989年に記載されている標準法にしたがって実施する。方法 DISC HSV-1の製造Ａ．HSV-1 gH遺伝子を発現する細胞系の生成これは、1992年４月２日付けで公開された国際特許願公開第WO92/05263号（本願に援用する）の教示にしたがい、また当該技術分野の標準方法も利用して実施した。Ｂ．切断されたgH遺伝子を有するDISC HSVI型ウイルスの製造これは、1992年４月２日付けで公開された国際特許願公開第WO92/05263号（本願に援用する）の教示にしたがい、また当該技術分野の標準方法も利用して実施した。Ｃ．関連刊行物（ｉ）Forrester A.ら，J.Virol.，66巻，341〜348頁，1992年（ii）Farrell H.，ら，J.Virol.，68巻，927〜932頁，1994年DISC HSV-2の製造Ａ．HSV2 gHの遺伝子（ａ）単純ヘルペス２型（HSV2）のgH遺伝子はHSVの25766菌株の二つのBamH1 制限フラグメントの中に含まれている。pTW49は、pBR322中にクローン化されたH SV2菌株25766のBamH1Rフラグメントである。pTW54は、pBR322中にクローン化されたHSV2菌株25766のBamH1Sフラグメントである。完全gH遺伝子を含有する一本鎖プラスミドの構築を図17に示す。pTW49をBamHIとSalIで消化し、次に８70塩基対（bp）のフラグメントをアガロースゲルから単離した。同様に、pTW54をBamHI とKpnIで消化し、次に2620bpのフラグメントをアガロースゲルから単離した。これら二つのフラグメントはともに、SalIとKpnIで切断されたプラスミドpUC119に結合させてプラスミドpIMMB24 を得た。（ｂ）pIMMB24をSalIとKpnIで消化した。さらにそのプラスミドをDraI（ベクター配列中で切断する）で消化して3490bp挿入断片を単離した。HSV2の配列を含有するこの3490bp挿入断片をアガロースゲルから精製した。それを音波処理し、その両端を、T4DNAポリメラーゼとクレノウを用いて修復し、次いでアガロースゲル上で大きさによって分画した。長さが約300〜600bPのDNA分子を含有する画分を、SmaIで切断されたM13mp11（Amersham International UK）に結合した。その結合された混合物でイー・コリ（E.coli）菌株TG1を形質転換させ個々のプラークを採取した。採取した各プラークから一本鎖DNAを作製し、次いでクレノウ酵素もしくはSequenaseを用いそして³⁵SdATPを用いてジデオキシ配列決定法によって配列を決定した。Ｍ13配列内からプライムするオリゴヌクレオチドを用いてＭ13の配列を決定するのに加えて、配列のデータは、すでに得られている配列から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてpIMMB24プラスミドから直接配列を決定することによっても得た。gH遺伝子に隣接する領域から配列を得るため、いくつもの配列情報をプラスミドpTW49からも得た。 HSV2 DNAのＧ＋Ｃ比が高いので、ゲル上の‘圧縮（compression）’のため配列の解釈がいくつもあるという問題がある。この問題は今後解決しなければならない。それ故、少数の位置で、この配列は、すでに発表されたHSV1の配列との比較に基づいて、正しい配列は何かについて最高の推定を示す。（ｃ）gH遺伝子の領域中のHSV2菌株25766の配列を、一文字アミノ酸記号でgH を並行させて図18に示す。図19は、上記領域における HSV1とHSV2のDNA配列の比較を示す。図20は、HSV1とHSV2のgHタンパク質の推定アミノ酸配列の比較を示す。DNAレベルで全同一性（overall identy）は77％である。タンパク質レベルでも全同一性は77％であり、アミノ酸のうちのその外の 9.7％は特性が類似している。配列の類似度は、類似性のレベルをグラフで示す図21から分かるように、遺伝子の長さにそってある程度変わる。gH遺伝子にそって存在する変化より非常に顕著なのは、コーディング領域と非コーディング領域の間の、DNAレベルでのHSV1とHSV2間の同一性のレベルの差である。図19から分かるように、ヌクレオチド配列の同一性は、gH遺伝子のコーディング配列内の方が遺伝子間領域内より高い。図21は、TK，gHおよびUL21の遺伝子の位置に印を付けてグラフの形態で上記のことを示している。（ｄ）HSV-2gH遺伝子の周囲から、ヌクレオチド配列のデータが得られると、さらに構築を行うことができる。例えばウイルスゲノムから該遺伝子を正確に欠失させることができる組換えベクターを設計することができる。HSV1とHSV2の間に差があるので、特にそれらの遺伝子間の差は、HSV1の配列の知識だけで知ることは不可能であった。オリゴヌクレオチドのMB57，MB58，MB59およびMB75を、HSV2gH遺伝子に隣接する配列の領域を単離しクローン化するために設計した。図23に示すように、これらのオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で用いて該遺伝子の両側からのDNAのフラグメントを増幅した。制限部位がこれらのオリゴヌクレオチドに含有されているので、得られたフラグメントはこれらの部位をその両末端に有し、これらのフラグメントは適切に切断されたプラスミド中にクローン化することができた。HSV2の配列に基づいた下記のオリゴヌクレオチドを上記の目的に使用した。またこれらヌクレオチドの位置を図19に示す。国際特許願第PCT/GB91/01632号（WO92/05263）に記載の教示および通常の一般知識にしたがって、当業者は、かようなプラスミドに、gH遺伝子の配列を正確に欠いている欠陥HSV-2ウイルスを産生させることができる（下記事項参照）。これらの同じ配列を、HSV-2ゲノムから欠失されたgH遺伝子のコピーをもっている適切な細胞中にクローン化すると、この“相補細胞（complementing cell）”は gHタンパク質を与えることによって、欠陥HSV-2ウイルスの増殖を保持できる。これらの配列は、該細胞中の配列と該ウイルス中の配列との間に重複がないように選択されているので、該ウイルスが組換えによって該細胞から該遺伝子を得る可能性は事実上なくなる。Ｂ．gH欠失２型単純ヘルペスウイルス（DISC HSV-2）の構築相補細胞系 HSV-1gH遺伝子を発現する細胞（F6細胞，Forresterら，Journal of Virology ，66巻，341〜348頁，1992年）がgH遺伝子を欠いたHSV-2ウイルスの増殖を保持できることが発見された。しかし二つの新しい細胞系が作られた。CR1細胞は、F 6細胞と同じプロモーターとgH遺伝子を使用するが、その遺伝子の下流の配列は端が切り取られているので、最終のDISCウイルスと該細胞系の間に配列の重複がない。このことは、DISCウイルスと該細胞系DNAとの間に相同的組換えは起こり得ないことを意味するので非常に有用である。Forresterの前記報告におけるF6細胞とgH欠失ウイルスの場合、重複があると、野生型gHプラスウイルスが、組換えによって、10⁶個のうち約１個のウイルスの比率で生成する。またHSV-2菌株25766由来のgH遺伝子を発現するもう一つの細胞系CR2も製造した。この細胞系もDISC HSV-2の増殖を保持し、また該ウイルスと該細胞間に重複する配列はない。隣接する配列のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ウイルスDNAは標準の方法によってウイルスから精製する。gH遺伝子の両側に隣接している配列は、Taq DNAポリメラーゼより誤り率が低いVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs社）を用いてPCRで増幅する（図24参照）。PCRに用いるオリゴヌクレオチドとしては、特定のウイルス配列のみならず制限部位認識配列がある（下記参照）。二つのベクターを作製する。すなわち組換えの第一段階用の一つと第二段階用の一つである。両者のベクターの場合、右側に隣接している配列はgH遺伝子の右側の同じ位置で始まる。第一段階のベクターは左側に隣接する配列を有し、この配列はHSV-2のgH遺伝子を欠失しているに加えてそのウイルスのTK遺伝子の３′部分も欠失している。第二段階のベクターは、完全TK遺伝子を復活させ、そして最終のウイルスに所望されるようにgH遺伝子の５′末端まで右に延びる、左側に隣接する配列をもっている。使用されるオリゴヌクレオチドは次のとおりである。ベクターの構築第一段階の組換えベクター：pIMM47+ オリゴMB97−MB96およびオリゴMB57−MB58によって作製した二つのPCRフラグメントを、これらPCRオリゴヌクレオチドに含まれている部位に適合した制限酵素で消化する。MB97−MB96フラグメントをHindIIIとHpaIで消化する。MB57−MB5 8フラグメントをHpaIとEcoRIで消化する。これらのフラグメントを、HindIIIとE coRIで予め消化したベクターpUC119に結合させる。得られたプラスミドはpIMMB4 5と呼ぶ（図24参照）。第一段階組換え体を容易に検出できるように、シトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーターの制御下、イー・コリβ−ガラクトシダーゼの遺伝子をpIMMB4 5中に挿入する。このCMVプロモーター＋β−ガラクトシダーゼの遺伝子は、このプロモーターと遺伝子を有する適切なプラスミドから、一つ以上の適正な制限酵素を用いて切り取る。その両端は、必要な場合DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて充填される。これは本願出願人が採用した方法である。しかし代わりの方法は当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はSV40プロモーターの制御下にあってもよく、この場合、遺伝子とプロモーターはBamHIとTthlIIIを用いてプラスミドpCH110（Pharmacia PL Biochemicals）から切り取ることができ、そしてその両末端はDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて充填される（Ecob-Prince，M.S.ら，J.Gen.Vir ol.，74巻，985〜994頁，1993年）。そのフラグメントはゲルで精製する。プラスミドpIMMB45をHpaIで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）でホスファターゼ処理を行って自己結合を除き次いでゲルで精製する。ゲルで精製したフラグメントを結合してプラスミドpIMMB47+を製造する（図25参照）。第二段階の組換えベクター：pIMMB46 オリゴMB94−MB109およびオリゴMB57−MB108で製造した二つのPCRフラグメントを、これらPCRオリゴヌクレオチドに含まれている部位に適合した制限酵素で消化する。MB94−MB109フラグメントはHind IIIとHpaIで消化する。MB57−MB108 フラグメントはHpaIとEcoRIで消化する。これらのフラグメントを、予めHind II IとEcoRIで消化したベクターpUC119に結合する。得られたプラスミドをpIIMB46 と呼ぶ（図26参照）。使用したオリゴヌクレオチドは次のとおりである。組換えウイルスの構築ａ）第一段階ウイルスDNAは菌株HG52-Dから製造した。なおこの菌株はHSV-2菌株HG52のプラーク精製を行った単離菌株である。ウイルスDNA（2.5μｇ）とpIMMB47+プラスミドDNA（0.25μｇ）を、CaPO₄沈澱法（ChenおよびOkayama，Molecular and Cellu lar Biology，7巻，2745頁）を利用してCR1細胞中にトランスフェクトした。組換えが細胞内に起こり、そして組換え体と野生型ウイルスの混合物が産生される。この混合物を、アシクロビルの存在下（10μｇ／ml）、CR1 細胞上で３回プラーク精製を行い、TK−マイナスウイルスを選択した。次に単プラークを増殖させて分析した。そのウイルスを正常なVero細胞上およびCR1細胞上で滴定した。そのウイルスがgH欠失ウイルスであれば、CR1細胞上でのみ増殖しVero細胞上では増殖しないはずである。表１はそのとおりであることを示している。上記ウイルスは、ウイルス濃度が最高の場合でも非相補的Vero細胞上では全く増殖しないが、CR1相補的細胞系上ではよく増殖し、そして後者の細胞系はH SV-1gH遺伝子を発現する。上記ウイルスはHSV-2gH遺伝子を発現するCR2細胞上でもよく増殖する（データは記載していない）。ｂ）第二段階 DNAはこのTK−マイナスDISCウイルスから製造し、組換えはプラスミドpIMMB46 を使用し上記のようにして行った。この場合、TKプラス組換え体を、gH発現性TK −マイナスBHK細胞系上で、メトトレキセート、チミジン、グリシン、アデノシンおよびグアノシンを含有する培地内で増殖させることによって選択した。ウイルスを収穫し、次に選択条件下２回以上再び増殖させてから最終のプラーク精製をCR1で実施した。ウイルスを増殖させ、サザーンブロッティング法で分析した。元のHG52-D，TK−マイナスDISCウイルスおよびTK−プラスDISCウイルス由来のウイルスDNAをBamHIで消化し、次にアガロースゲル上で分離した。そのDNAバンドをサザーンブロッティング法でナイロン膜に移し、次いで右側に隣接する配列由来で放射能標識をつけたフラグメントでプローブした。図27はこれらウイルスの構造を示すが、Ba mHIで消化した後予想したバンドの大きさであった。使用したプローブは、破線の下に‘Ｒ’の印を付けてある。プローブはこれらの各ウイルスの異なるサイズのバンドとハイブリッドを形成するはずである。図28は上記のとおりであることを示している。レーン５はHG52-Dウイルスを示し、レーン２はTK−マイナス“第一段階”DISCウイルスを含有し、そしてレーン３，４，６，７および８はTK−プラス“第二段階”DISCウイルスを含有している。これは、これらの各ウイルスのDNA構造が予想どおりであることを確認している。本願にはHSV-1とHSV-2のある種の菌株が引用されている。本願に含まれている一般教示事項は、正確に上記菌株で実施する必要はない。本発明を実施できる、互いに配列相同性が高いHSV-1とHSV-2の菌株は容易に入手できる。例えばHSVの一つの供給源はAmerican Type culture Collection（ATCC）（米国，20852メリーランド州，ロックビル，パークローン・ドライブ12301所在）である。下記のものは提示した受託番号に基づいてATCCから入手できる。 HSV-1菌株F ：ATCC受託番号VR-733 HSV-1菌株MacIntype ：ATCC受託番号VR-539 HSV-1菌株MP ：ATCC受託番号VR-735 HSV-2菌株G ：ATCC受託番号 VR-734 HSV-2菌株MS ：ATCC受託番号 VR-540マウスの生体内試験防御試験予防作用を試験するため生体内マウス耳モデルを使用した。等しい投与量の不活性化野生型HSV-1（菌株SC16，Hillら，J.Gen.Virol.，28巻，341〜353頁，197 5年参照）とDISC HSV-1とを、w.t.HSV-1の複製に対する作用、w.t.HSV-1の攻撃に対抗して防御する性能およびHSV特異的中和抗体を誘発する性能について比較した。４〜５週齢のBALB/cマウスの左の耳たぶに乱切法によって、各種投与量のDISC HSV-1または不活性化ウイルスを予防接種した。ウイルスはβ−プロピオラクトンを用いて不活性化した（その外の詳細事項は1992年４月２日付けで公開された国際特許願公開第WO92/05263号参照。なおこの出願は本願に援用するものである）。これらのマウスは、予防接種を行ってから２週間後に反対側の耳を２×10⁶p fuのw.t.HSV-1（菌株SC16）で攻撃した。攻撃してから５日後にその耳に存在しているウイルスの量を、BHK細胞上でプラーキング（plaquing）を行うことによって検定した（図２参照）。５×10⁵pfuおよび５×10⁶pfuのDISC HSV-1で予防接種を行ったところ（pfuはD ISCウイルスについて相補細胞系上で測定した）攻撃ウイルスの複製を完全に防御したが一方、不活性化ウイルスを予防接種されたマウスには生きている攻撃ウイルスが存在していた。攻撃してから５日後に、予防接種動物の神経節からウイルス力価を検定したところ、類似の結果が得られた（データは記載していない）。DISC HSV-1の予防接種に対する血清学的応答 DISC HSV-1の予防接種によって与えられる抗体の、防御における役割を調べた。中和抗体の力価および全抗体の力価の両者を、ELISA法で測定されているようにして測定した。６頭づつのマウスからなる群に、５×10⁵pfuのDISC HSV-1、死んだDISC HSV-1 ，w.t.HSV-1（菌株SC16）またはPBSを予防接種し、次いで予防接種してから２週間後と14週間後に血清試料を採取した。中和抗体は補体の存在下で測定し、プラーク数が50％減少した血清の希釈度の逆数で示した。ELISA抗体力価は、HSV-1に感染したBHK細胞の溶解物をコートしたプレート上で測定し終点まで滴定した（図３参照）。 DISC HSV-1および同量の死んだDISC HSV-1で予防接種を行った動物の間に、抗体力価の有意差がみとめられなかったことは図３から分かる。DISC HSV-1の予防接種に対する遅延型過敏（DTH）応答ヘルペスウイルスの感染に対して防御するのにDTH応答が重要であることはよく報告されている。マウス群に、DISC HSV-1、死んだDISC HSV-1および生w.t.HS V-1を、左耳たぶに乱切法で予防接種することによって、DTH応答を起こすDISC H SV-1の性能を調べた。４種の投与量（５×10³，５×10⁴，５×10⁵および５×10⁶pfu）のワクチンを使用して予防接種してから２週間後その動物の反対側の耳を10⁶pfuのw.t.HSV-1 （菌株SC16）で攻撃した。攻撃部位におけるDTH応答を、攻撃してから24時間後と48時間に耳の厚みを測定して評価し、攻撃された耳と攻撃されなかった耳との間の差として示した（図４参照）。低いワクチン投与量（５×10³，５×10⁴pfu）では、死んだDISC HSV-1によってDTHは全くみとめられなかったがDISC HSV-1の予防接種の後には明確なDTH応答がみとめられたことが図４から分かる。高い投与量（例えば５×10⁶pfu）では、 DISC HSV-1と死んだDISC H SV-1の製剤は類似のDTH応答を誘発した。異なる投与量の各種ワクチン製剤によって誘発されるDTH応答は、攻撃ウイルスの複製に対抗する、ワクチンの防御作用と相関関係がある。したがって、低投与量のDISC HSV-1ワクチンによる予防接種で効力があるのは、Ｔ細胞性免疫の誘発が原因である。DISC HSV-1型ウイルスが細胞障害性Ｔ細胞を生成できることの実証細胞障害性Ｔ細胞が、HSVの一次感染の防御とその感染からの回復に関与していることはすでに報告されている。したがってDISC HSV-1で予防接種を行ったマウスを、HSV-1特異的細胞障害性Ｔ細胞活性の存在について試験した。免疫化に続いて細胞障害性Ｔ細胞活性が生成し、これを標準の方法、例えばMa rtin，S.ら，J.Virol.，62巻，2265〜2273頁，1988年およびGallichan，W.S．ら，J.Infect.Dis.，168巻，633〜629頁に例示されているような方法にしたがって検定した。さらに具体的に述べると、雌のBALB/cマウスの群を、０日目に２×10⁷ pfuのウイルス（DISC HSV-1；死んだDISC HSV-1；MDKチミジンキナーゼ陰性HSV -1菌株）を腹腔内に投与して免疫化し、次いで３週間後にこれらの免疫化（同じ投与量と経路）を繰返した。対照マウス群には、同時点に0.1mlのPBSを腹腔内に投与した。上記第二の免疫化を行ってから10日後、これらマウスの脾臓を取出し、各グループ毎にプールした。また、支持細胞（feeder cell）を調製するため脾臓を非免疫化BALB/cマウスから取り出した〔６個のエフェクター脾臓からなる４群に対して16個のフィーダー脾臓（feeder spleen）で充分である〕。その後に続くステップはすべて、無菌法を用いて、ラミナーフローフード中で実施した。脾臓を減菌ティーストレーナーを通過させ、10％の熱で不活性化させたウシ胎仔血清を補充したRPMI1640培地（エフェクター培地）によって単個細胞浮遊液を製造した。破片を沈降させ、次いで単個細胞浮遊液を新しい容器に移した。その単個細胞浮遊液を、エフェクター培地中で２回洗浄し（1100rpm,10分間）次に減菌ガーゼを通過させてすべての集塊を除去した。得られたエフェクター脾臓細胞浮遊液は必要になるまで氷上で貯蔵した。脾臓の支持細胞を、エフェクター培地中に１×10⁷細胞／mlまで再度浮遊させ、次にマイトマイシンＣを最終濃度20μｇ／mlまで添加した。この支持細胞を37 ℃で１時間インキュベートした。支持細胞を、１％FCSを補充したPBSで４回洗浄し次にタンパク質なしのPBSで１回洗浄した。生ウイルス（MDK）を、マイトマイシンＣで処理した支持細胞のペレットに、3pfuのウイルス／脾臓細胞の濃度で添加した。37℃で１時間インキュベートした後、支持細胞をエフェクター細胞培地で１回洗浄した。エフェクター細胞を５×10⁶細胞／mlまで再び浮遊させ、一方支持細胞を2.5× 10⁶細胞／mlまで再び浮遊させた。500μｌのエフェクター細胞浮遊液と500μｌの支持細胞浮遊液を、24ウエルプレートのウエルに添加した。これらのプレートを湿潤雰囲気内で37℃（５％CO₂）にて４日間インキュベートした。エフェクター細胞と支持細胞を24ウエルのプレートから収穫した。これらの細胞を１回遠心分離にかけ、そのペレットをエフェクター培地中に再び浮遊させた（５mlの培地／２プレート）。その細胞浮遊液をリンパ球分離培地上に加層し次に2500rpmで20分間遠心分離した。生エフェクター細胞を境界面から収穫し、次に２回洗浄した。１回目の洗浄は1500rpmで15分間であり次の１回は1100rpmで10 分間であった。このエフェクター細胞は、最終的に、必要な濃度でエフェクター培地中に再浮遊させ、次いで必要になるまで氷上で貯蔵した。標識標的細胞を細胞障害性を検定するために調製した。未感染の同系A202J標的細胞のA20/2J細胞を組織培養フラスコから収穫した。すなわち２×10⁷の細胞を二つの容器に添加した（感染標的および未感染標的にした）。これらの細胞を DMEM（添加物なし）で洗浄した。感染した細胞に、生MDKウイルスを10pfu/細胞加え、そして同容積のEMEMを未感染の細胞に添加した。1mCiの⁵¹Crを各ユニバーサル（universal）に添加し、細胞を37℃（湯浴中）で１時間インキュベートした。標的細胞を、標的培地（10％FCSを補充したDEEM）中で３回（1100rpmで10分間）洗浄し、最後に、標的細胞培地中、必要な細胞濃度まで再び浮遊させた。未感染のおよび感染した標的細胞の両方を、１×10⁶細胞／mlと１×10⁵細胞／ mlまで再浮遊させ、次いで100μｌづつ（すなわち１×10⁵標的／ウエルおよび１ ×10⁴標的／ウエルをそれぞれ与えるため）、丸底96ウエルプレートの適当なウエル中にプレートアウト（plate out）した。実験点はすべて４回づつ計画した。各エフェクター細胞型をエフェクター培地中に８×10⁶細胞／mlまで再浮遊させ次いで２倍希釈液を調製した。100μｌのエフェクター細胞浮遊液を標識標的細胞が入っているウエルに加えて、８×10⁵エフェクター細胞／ウエル、４×10⁵ エフェクター細胞／ウエル、２×10⁵エフェクター細胞／ウエルおよび１×10⁵エフェクター細胞／ウエルを得た。したがって、10⁵標的細胞／ウエルに対して、エフェクター対標的の比率は８：１、４：１、２：１および１：１であった。10⁴ 標的細胞／ウエルに対して、エフェクター対標的の比率は80：１、40：１、20 ：１および10：１であった。各標的細胞型の場合の最大クロム放出量は、100μ ｌの20％Triton×−100を、標的細胞だけが入っている（すなわちエフェクターが入っていない）ウエルに加えることによって得られた。各標的細胞型の場合の自発的放出は、100μｌのエフェクター細胞培地を、標的細胞だけが入っているウエルに加えることによって得られた。これらのプレートを湿潤雰囲気内で37℃で４時間インキュベートした。その後、これらのプレートを1500rpmで４分間遠心分離にかけ、100μｌの上澄み液を各ウエルから取り出した。その上澄み液をLP2管に移し、その管内に入っている放射能をガンマカウンタンで１分間計数した。比クロム放出百分率（％specific c hromium release）を下記式を使って求めた。結果を図５と表１に示す。 DISC HSV-1の予防接種によって、充分に複製できるMDKウイルスによる感染で産生されるのに匹敵するHSV-1特異的CTL活性が誘発された。これに対して死んだ DISC HSV-1で免疫化されたマウスまたはPBSで処理されたマウスには、ある種の非特異的キリング（Killing）がみとめられたが、HSV-1特異的CTL活性は全くみとめられなかった。この理由は明らかでないが、それは高レベルのNK細胞の活性を示している。マウスにDISC HSV-1を予防接種したところ、HSV-1ウイルス抗原に対する抗体、CTL活性およびDTH活性を誘発することを示した。広範囲のウイルスタンパク質に対する体液性および細胞性の免疫応答の両者を活性化する性能によって、DISC ウイルスによる予防接種の有効性が説明できる。長期間の防御生体内マウス耳モデルを使用してDISC HSV-1の長期間の予防作用を試験した。４〜５週齢のBALB/cマウスを各々６頭づつの群に分割した。これらの群に以下のとおり予防接種を行った。群予防接種 PBS PBSによる擬似免疫化 1K 不活性化DISC HSV-1による１回の免疫化 2K 不活性化DISC HSV-1による２回の免疫化 1L （生）DISC HSV-1による１回の免疫化 2L （生）DISC HSV-1による２回の免疫化 1S w.t.HSV-1（菌株SC16）による１回の免疫化 2S w.t.HSV-1（菌株SC16）による２回の免疫化全群について、左耳たぶに乱切法によって５×10⁵pfuを０日目に接種して免疫化し、次いで血液の試料を15日目、27日目、90日目、152日目および218日目に採取した。PBS，2K，2Lおよび2Sの群は、20日目にPBSまたは５×10⁵pfuの追加の免疫化を受けた。全ての群が、223日目に、５×10⁵のw.t.HSV-1（菌株SC16）の攻撃を受けた。攻撃されてから５日後に攻撃された耳（右）に存在するウイルスの量を、BHK細胞上でプラーキングを行うことによって検定した。図14に示す結果は、DISC HSV-1で２回予防接種すると（2L群）、不活性化DISC HSV-1（2K群）に比べて優れた防御をしているが、さらに優れた防御がw.t.HSV-1（菌株SC16）で得られたことを示している。w.t.HSV -1による予防接種の効力は勿論予想されることである。しかし正常な生ウイルスをワクチンとして使用することは一般に望ましくない。図15は種々の予防接種によって誘発された中和抗体の力価を示す。このことは、DISC HSV-1の２回投与が不活性化DISC HSV-1の２回投与と同じ力価を生成するので、DISC HSV-1の防御作用が単純に抗体の誘発によって説明できないことを示している。DISC HSV-2の予防作用生体内マウス耳モデルを使ってDISC HSV-2の予防作用を試験した。６週齢のBALB/cマウスを群に分割した。これらのマウスを、左耳たぶに対する乱切法によって次のように免疫化した。群予防接種の材料と投与量１５×10²pfuの生DISC HSV-2 ２５×10³pfuの生DISC HSV-2 ３５×10⁴pfuの生DISC HSV-2 ４５×10⁵pfuの生DISC HSV-2 ５５×10²pfuの死んだDISC HSV-2 ６５×10³pfuの死んだDISC HSV-2 ７５×10⁴pfuの死んだDISC HSV-2 ８５×10⁵pfuの死んだDISC HSV-2 ９５×10⁴pfuのw.t.HSV-2（菌株HG52） 10 ５×10⁵pfuのw.t.HSV-2（菌株HG52） 11 PBS DISC HSV-2は菌株HG52のgH欠失変異体であった。３週間後、全群を、右耳たぶの乱切法によって、５×10⁴のw.t.HSV-2（菌株HG 52）で攻撃した。攻撃してから５日後に攻撃された耳（右）に存在するウイルスの量を、BHK細胞上のプラーキングで検定した（図16参照）。図６に示した結果は、５×10³，５×10⁴および５×10⁵pfuの投与量のDISC HSV-2によって予防接種すると、死んだDISC HSV-2に比べて、w.t.HSV-2（菌株HG52）による攻撃に対して優れた防御を行うことを示している。しかし予想されるように、５×10⁴と５×10⁵pfuの投与量のw.t.HSV-2によって一層優れた防御が得られたが、正常な生きている野生型ウイルスをワクチンとして用いることは望ましくない。生体内モルモット試験さきに述べたように、HSV-2は生殖器の病巣に密接に関連しているようである。モルモットは現在、ヒトの一次および再発の生殖器疾患に対し最高の動物モデルを提供している（Stanberry，L.R．ら，J.Inf.Dis.，146巻，397〜404頁，198 2年）。したがって出願人らは、さきに述べたマウスの試験を、ヒトの生殖器のHSV-2 感染に対する候補のワクチンの免疫原性を評価するのに有用なシステムを提供する、HSV-2感染のモルモットの膣モデルまで拡張した。その膣モデルによって、H SV-2による膣内攻撃を行った後の一次の臨床症状の広範囲の評価、およびその後の再発の頻度の分析を行うことができる。（１）14頭づつの動物からなる群を、膣内への非外傷導入（腔内経路）または耳たぶの乱切法（上皮内経路）によって、DISC HSV-1のワクチンの２回の投与（３週間の間隔で２×10⁷pfu）で免疫化した。21頭の動物からなる対照群を、擬似ウイルス製剤で膣内に予防接種し、そして14頭の動物からなる別の群を、β−プロピオラクトンで不活性化したw.t.HSV-1の二つの等しい投与量で上皮内に予防接種した。予防接種された動物を、３週間後に10^5.2pfuのw.t.HSV-2ウイルス（菌株MS）で攻撃し、そして一次および再発の疾患の症状について監視した。（ａ）w.t.HSV-2による攻撃に続いて、動物を２週間にわたって毎日、一次感染の症状について評価した。臨床病巣を直接の数値として採点し、そして紅斑を１〜５の尺度で採点した。浮腫の指数として膣の面積も測定した（データは記載していない）。得られた結果を図６と７に示す。グラフ上の点は、１頭の動物の１日当りの紅斑の平均得点を示し（図６）および１頭の動物の１日当りの全病巣の平均得点を示す（図７）。これらの試験結果は、DISC HSV-1による上皮内および膣内への予防接種はともにHSV-2感染の一次症状に対して高度の防御を行うことを示している。驚くべきことには、上皮内の経路で不活性化HSV-1を投与したところ、DISCウイルスのワクチンによって行われた防御より明らかに低いが、かなりの防御を行った。（ｂ）攻撃後12日間にわたって毎日、膣スワブを利用して全動物から試料を採取し、膣内での攻撃ウイルスの増殖を監視するため、Vero細胞上でプラーキングを行うことによってウイルス力価を測定した。図８に示す試験結果は、擬似予防接種動物の感染ウイルスの力価は攻撃してから２日後に最高の３×10⁴まで上昇し、そして10日目まで検出できたことを示している。これに対して、予防接種を行った動物のウイルス力価は１日目から着実に減少し７日目には検出できなかった。DISC HSV-1または不活性化ウイルスの製剤によって免疫化された群の間に有意差は全くみとめられなかった。（ｃ）HSV-2による攻撃に続いて、28日目に急性期の疾患から充分に回復した動物を、疾患の再発について、さらに100日間毎日監視した。各群の動物の数は、DISC／膣内は14；DISC／上皮内は12；不活性化／上皮内は14；擬似／膣内は12 であった。臨床病巣は直接数値として採点し、紅斑は１〜５の尺度で採点した。結果を図９ａと９ｂに示す。グラフ中の点は１動物の１日当りの平均値の累積合計値を示す。これらの試験結果は、膣内経路でDISC HSV-1で予防接種した動物では、100日の追跡期間に起こる再発HSV-2病巣の数が約50％減少したことを示している。DIS C HSV-1および不活性化ウイルスによる上皮内予防接種でも再発病巣は減少したがその程度は小さかった。（２）また以下の実験は、HSV-1に基づいたDISCワクチンの候補の、生殖器HSV -2感染に対する免疫原性を評価するために計画した。この実験は、異なる予防接種経路（膣、経口および鼻腔、すなわち各種粘膜表面）およびDISC HSV-1または不活性化HSV-1の各種投与量をモルモットで比較するために計画した。材料と方法ウイルス（ｉ）1991年４月２日に公開された国際特許願公開第WO92/05263号にすでに報告されているようにしてHSV-1gH遺伝子でトランスフェクトされたVero細胞（F6 ）上で、DISC HSV-1を増殖させた。要約すると、F6細胞の集密的単層を、0.1pfu ／細胞の多重度でDISC HSV-1に感染させ、90〜100％のcpeが観察されたときに収穫した。細胞は細胞スクレーパーで収穫し、遠心分離を行ってペレット化し、そのペレットを小容積のイーグルの最少必須培地（EMEM）中に再浮遊させた。この浮遊液を１分間音波処理し、小分けして−70℃で貯蔵した。ウイルス力価はF6細胞上で測定した。（ii）0.05％の濃度でβ−プロピオラクトンを添加して、DISC HSV-1を室温にて１時間不活性化した。不活性化はそのウイルスをF6細胞に添加することによって検査した。（iii）HSV-2菌株MSは、上記のDISC HSV-1の場合と同じ方式でVe ro細胞上で増殖させて滴定した。動物雌のDunkin-Hartleyモルモット（300〜350ｇ）を、Davis Hall，Darley Oaks Farms，Newcharch，Nr．Burton-on-Trentから入手した。実験計画 12頭の動物からなる群に、８×10⁶pfuのDISC HSV-1または同投与量の不活性化 DISC HSV-1をこの実験の１日目と17日目に１回づつ合計２回投与することによって免疫化した。免疫化は0.05mlのウイルスを膣内に投与するか、0.2mlのウイルスを鼻腔内に投与するか、または0.2mlのウイルスを経口投与することによって実施した。12頭の動物からなる対照群は、音波処理を行ったVero細胞からなるウイルスの擬似製剤で膣内に予防接種を行った。全群を34日目に、10^5.2pfu HSV-2 （菌株MS）を用いて膣内で攻撃し、この実験は独立した職員によって動物のかごを無作為に選ばせて盲検方式で行った。攻撃に続く11日間、動物を一次疾患の症状について監視した。臨床観察結果を、膣領域に存在する病巣の数および紅斑の存在（尺度１〜５で採点）として採点した。さらに、攻撃ウイルスの膣内での増殖を監視するため、攻撃後12日間にわたって毎日膣スワブを使って試料を全動物から採取し、ウイルス力価をVero細胞上でのプラーキングによって測定した。統計的方法群の臨床得点の差はマン・ホイトニーのＵ検査法を用いて、有意性を検定した。ｐ＜0.1の値は有意であるとみなした。試験結果臨床疾患の状態各免疫化グループについて、１頭の動物当りの平均病巣得点、平均紅斑得点、および攻撃後のウイルスの複製に対する予防接種の作用をそれぞれ図10，11および12に示す。膣内経路でDISC HSV-1を予防接種した場合は、擬似予防接種がなされた動物に比べて、一次の感染症状に対して高度の防御がなされた。これに対して、同じ投与量の不活性化DISC HSV-1による予防接種は有意な防御をもたらさなかった。 DISC HSV-1による鼻腔内免疫化によって、膣内予防接種よりはるかに高い防御が得られた。このことは、６点以上の病巣得点で定義されている重篤な疾患にかかっている日数を調べると特に明らかであった（表２参照）。不活性化DISC HSV -1は鼻腔内経路によっていくらか防御を行ったが、DISC HSV-1による予防接種ほどに有効ではなかった。経口経路による予防接種も防御を行ったが、鼻腔内または膣内の予防接種よりも低い防御であった。やはり、DISC HSV-1ウイルスによる予防接種は不活性化DI SC HSV-1による予防接種より有効に防御を行った。したがって、生体外モルモットモデルによる上記実験から以下の結論を引き出すことができる。Ａ．膣内または鼻腔内の経路によるDISC HSV-1の予防接種によって、HSV-2の攻撃に続いて起こる急性の疾患症状に対して高度な防御がなされた。Ｂ．重篤な疾患（６個以上の病巣が存在することによって定義される）にかかっている日数を考察すると、DISC HSV-1の鼻腔内投与が最高度の防御を行った。Ｃ．不活性化ウイルスによって膣内予防接種を行うと、擬似感染モルモットに観察されたのと類似の臨床疾患症状になった。不活性化DISC HSV-1による鼻腔内予防接種によって、かなりの程度の防御が行われたが、この経路によるDISC HSV -1の予防接種ほど高くはなかった。Ｄ．DISC HSV-1を経口で予防接種された動物および擬似感染させた動物の疾患症状間に有意差が認められた。しかしこの場合の防御の程度は、DISC HSV-1を、鼻腔内または膣内の経路によって予防接種された動物に観察された防御程度より低かった。Ｅ．不活性化されたDISC HSV-1を経口で予防接種された動物の症状は、擬似感染群の症状と有意な差はなかった。Ｆ．シエッドウイルス（Shed Virus）に関するデータは重要である。驚くべきことには、膣経由予防接種経路を用いた場合、攻撃投与に続いて回復するウイルスのレベルが著しく低くなった。これは局部抗体産生が原因であろう。（３）以下の実験は、治療的予防接種に続いてHSV-2が誘発する再発疾患を調べるために計画した。このことは、ある種の組換えHSV-2抗体をアジュバントとともに治療のために投与すると、その後の再発の頻度を減らすことができることはすでに報告されているように重要であった（Stanberry，L.R．ら、J.In f.Dis.，157巻，156〜163頁，1988年；Stanberry，L.R．ら，J.Gen.Virol.，70 巻，3177〜3185頁，1989年a；Ho，R.J.Y.ら，J.Virol.，63巻，2951〜2958頁，1 989年）。したがって，攻撃されてから４週間後に一次HSV-2疾患から充分回復した21頭の動物を無作為に三つの群に分割し、次いで生DISC HSV-1を用いて膣内で処置するか（10頭の動物）または上皮内で処置した（11頭の動物）。予防的予防接種に対する対照としてさきに用い（上記（２）参照）そして一次疾患から充分回復した12頭の動物からなる群を、同量の擬似製剤で処置した（12頭の動物）。これらの動物にはさらに、24日後と48日後に同一の処置を行った。再発疾患の頻度は、最初の処置の日からさらに100日間監視し、累積した結果を図13に示し、下記の表３に要約した。 DISC HSV-1で処置した各群の場合、特に第二の予防接種に続く50日間にわたって疾患／日および挿間状態の合計数が適度に（約25％）減少するようであることが分かる。 100日間の観察期間の最後に、これらの動物から血清を集めた。その血清のELI SAとNT抗体の力価は攻撃後であるが治療処置前に記録されたこれらの力価より有意に高くはなかった。そして擬似処置群とDISC HSV-1で処置した群の間に力価の有意差は全くなかった。上記のように、DISC HSV-1ウイルスを膣内または上皮内に治療のために投与すると、擬似処置動物と比べて、再発の頻度が明らかに減少した（20〜25％）。（４）以下の実験は、HSV-2に基づいたDISCウイルスの治療効果を調べるために計画した。gH遺伝子が欠失しているDISC HSV-2（菌株HG52）を、先に述べたように、1992年４月２日付けで公開された国際特許願公開第WO92/05263号（本願に援用する）の一般教示事項にしたがってかつ当該技術分野の標準方法も利用して製造した。上記菌株のDISC変形体も国際特許願公開第WO92/05263号の教示にしたがって、HSV-2gHでトランスフェクトされたVero細胞中で増殖させた。この実験では、雌の350〜400ｇ重量のモルモットでDISC HSV-1とDISC HSV-2を直接比較した。モルモットを３群に分割した。すべてのモルモットを10^5.8pfuのHSV-2菌株M Sに感染させた。４週間で、一次疾患が発生し次いで消失し、そして再発が始まった。ついで動物を治療した。15頭の動物からなる第一群は、音波処理を行った Vero細胞からなるウイルスの擬似製剤で膣内治療を行った。13頭の動物からなる第二群は、10⁷pfuのDISC HSV-1で膣内治療を行った。14頭の動物からなる第三群は、10⁷pfuのDISC HSV-2で膣内治療を行った。治療は14日後に繰返した。結果を表４に示す。１日目〜13日目は２回の治療の間の期間を含んでいる。14日目〜27日目は第二の治療に続く２週間の期間を含んでいる。１日目〜27日目は全期間を包含している。試験結果で示されているように、DISC HSV-2による治療は、HSV-2菌株MSの感染によって起こる症状を軽減するのに有効であったことは明らかである。DISC H SV-2による治療は、DISC HSV-1による治療より有効であった。 Detailed Description of the Invention Virus vaccine The present invention relates to viral vaccines. There are two traditional types of virus vaccines. The first type is "killed vaccine" Which was killed by treatment with an appropriate chemical such as β-propiolactone It is a viral preparation. The second type is the "attenuated" live vaccine, which Special genetic manipulation of the Rus genome or, more commonly, passage in some tissue culture systems. It is a virus with reduced pathogenicity to the host. These two types Each Kuching has its own drawbacks. Killed vaccine does not replicate in the host Since it is usually administered by injection, it results in an inappropriate type of immune response Sometimes. For example, the soak vaccine (killed poliovirus preparation) IgA in the intestinal tract, which is the natural site of primary infection, but causes a lobulin (Ig) G antibody response Does not stimulate the production of. Therefore, this vaccine was used to prevent polio from neurological complications. It can protect the body but does not block the primary infection and thus does not confer "collective immunity". That Moreover, killed virus does not enter the host cell and replicate. Therefore being duplicated No beneficial immune response is obtained against the non-structural proteins produced by Escherichia coli. Death again Fungal viruses cannot stimulate the production of cytotoxic T cells against viral antigens. There are many. "Dead" antigen is picked up by antigen-providing cells and becomes T cells. Can be provided. However, this donation is caused by MHC class II molecules. , T helper cells are stimulated. On the other hand, in T helper cells, B cells are To produce specific antibodies. To stimulate the production of cytotoxic T cells Is a viral antigen Peptide fragments processed and cleaved through specific pathways in the cell Must be provided to the MHC class I molecule as This degradation pathway is the infected cell It is thought to act most effectively on proteins synthesized in Only viruses that enter cells and express immunogenic viral proteins are viruses Specific cytotoxic T cells can be generated. Therefore, killed vaccines are In contrast, it is a poor inducer of cytotoxic T cells. From this point of view of the live attenuated vaccine The vaccine is more satisfying. Traditionally, live attenuated viruses either delete non-essential genes or contain one or more essential genes. Partially damages the gene (in this case, the damage is Damage that does not work very effectively). Has been prepared. However, live attenuated viruses have harmful effects on the host. Often retained by residual pathogenicity. Moreover, attenuation is not a specific deletion. If not, it may revert to a more virulent form. Also kawaka In fact, the production of certain viral proteins in the host is attenuated. Kasei vaccine is better than killed vaccine that cannot produce such viral proteins It is often effective. Live attenuated viruses are not only used as vaccines on their own The child's "vaccine vector", in other words the second virus that needs protection against it It can also be used as a carrier for genes derived from sucrose (or other pathogen). one Generally, members of the poxviridae, such as vaccinia virus, Used as a target. When the virus is used as a vaccine vector, the disease It is important that no proto-effect occurs. In other words, simple virus vaccine Need to be attenuated in the same way that is there. Therefore, the same drawbacks as mentioned above are added in this case. From the viral genome You want to delete the essential gene while giving the product of the deleted gene to the virus. It is possible to provide so-called'complementing 'cells. Have been found. This means that some viruses, such as adenoviruses, Achieved for herpesviruses and retroviruses. Adenou In the case of Ils, a human cell line was transformed with a fragment of adenovirus type 5 DNA. (Graham, Simley, Russell and Nairn, J.G.Virol., 36, 59-72). , 1977). The cell line expresses certain viral genes and The ability to support the growth of deleted or inactivated viral variants has been demonstrated. Seen (Harrlson, Graham and Williams, Virology, 77, 319-329, 19) 77 years). The virus grows well in this cell line (the'complementary cell line ') and the standard Irus particles were produced but did not grow at all in normal human cells. SV40 Will Cells expressing the T antigen-encoding region of the genome (papovavirus) Have been reported to be able to support replication of viruses that are specifically deleted in the region (Gluzman, Cell, 23, 182-195, 1981). For herpes simplex virus , GB glycoprotein (Cai et al., J. Virol., 62, 714-721, 1987), gD glycotan Quality (Ligas and Johnson, J. Virol., 62, 1486, 1988) and immediate A type expressing the type protein ICP4 (Deluca et al., J. Virol., 56, 558, 1985). Cell lines have been produced and these cell lines are specifically inactivated by the corresponding genes. It has been reported that it is able to support replication of viruses with harbored copies. International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 published on April 2, 1992 , Defective in the gene essential for producing infectious virus, Stain and then replicate in the cells and A non-retrovirus that can express the ruth antigen gene but cannot produce a normal infectious virus We provided a mutant non-retroviral virus. Non-retroviral mutant virus according to the teaching of International Patent Publication No. WO92 / 05263 Is induced by the in vivo production of viral proteins by an attenuated vaccine Providing a unique method that combines the efficacy and safety of a killed vaccine with an extra immune response I am offering. In a preferred embodiment, the invention of International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 Has two characteristics. First, the selected gene usually results in certain deletions. By doing so, it is inactivated within the viral genome. This gene is infected Involved in the production of sex viruses but preferably does not interfere with the replication of the viral genome Yes. Therefore, infected cells will receive more virus from the replicated genetic material. Can produce proteins, and in some cases new viral particles However, these viral particles are not infectious. This is its viral infection Does not spread from the inoculation site. The second feature of the invention of International Patent Publication No. WO92 / 05263 is that a virus has a deletion gene. A cell that provides offspring products and enables the virus to grow in tissue culture. It Therefore the virus lacks the gene encoding the essential protein However, when it grows in a proper host cell, it grows and its appearance can be distinguished from the original virus. It produces intact viral particles. This mutant virus preparation has a defective genome. It is inactive in that it cannot produce an infectious virus in a normal host because it has Therefore, safely administered in an amount necessary to directly generate a humoral response in the host be able to. Therefore, this mutant virus is directed against the host cells to be protected. Need not be infectious and simply a normal dead virus vaccine or attenuated Virus It works in much the same way as Kuching. However, the immunizing virus Bind and enter the cell, then initiate the viral replication cycle and thus prevent Initiate infection within host cells of the species to be controlled and produce certain viral antigens therein It is preferable that the substance itself is infectious as well. Therefore, the host There are additional opportunities to stimulate the cell arms of the epidemics. In particular, using a mutant form of HSV-1 (as described above), in mice, through the ear and in the epithelium After vaccination, HSV died in response to subsequent attack by wild-type HSV-1 In-vivo data showing better protection than similar vaccination with -1 It must be mentioned that the international patent application WO 92/05263 provided Yes. In addition, the mutation HSV-1 also has a clear effect to prevent the establishment of latent infection in the cervical ganglion. Presented for vaccination. Applicants have described the above mutant virus as the DISC virus (defective infectious sin gle cycle), and its basic concept is shown in Fig. 1. This application is an international patent application It continues from the work disclosed in publication WO92 / 05263. The present application is summarized as follows. (1) Reported in International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 in a test using a mouse ear model. The test results announced were confirmed. Intraepithelial vaccination of mice using DISC HSV-1 However, the wild type (w.t.) HSV-1 of the attacking virus was completely prevented from replicating. I went. With the same dose of inactivated HSV-1, most effective protection I wasn't given. DISC HSV-1 also seems to prevent latent infection from being established in the cervical ganglion. Defended against. (2) Also, in the mouse ear model described above, DISC HSV-1 and the same amount of inactivated HS There is no significant difference in antibody titers between animals vaccinated with V-1 Indicates that it was not found. (3) In addition, in the mouse ear model described above, it was inactive at low vaccination doses. HSV-1 failed to establish a delayed hypersensitivity (DTH) response, but the same dose of DISC H SV-1 shows that it established a DTH response. DISC HSV-1 inactive at higher doses Both sexual HSV-1 elicited similar DTH responses. (4) In a mouse test, contrary to vaccination with inactivated HSV-1, DISC HS Vaccination with V-1 induced HSV-1 specific cytotoxic T cell activity. (5) Using the in vivo model of the mouse ear, the long-term preventive effect of DISC HSV-1 Tested. Vaccination with DISC HSV-1 twice resulted in an attack by w.t.HSV-1 And provide long-term protection superior to two vaccinations with inactivated DISC HSV-1. Was found. (6) DISC HSV-2 against HSV-2 infection using in vivo mouse ear model The preventive effect of was investigated. Intraepithelial vaccination of mice with DISC HSV-2 resulted in an attack virus It provided better protection against the replication of w.t.HSV-2 of S. cerevisiae than inactivated DISC HSV-2. (7) DISC HSV- against HSV-2 infection using an in vivo model of guinea pig vagina The preventive effect of 1 was tested. Intraepithelial or vaginal vaccination with DISC HSV-1 Have shown a high degree of protection against the primary symptoms of HSV-2 infection. DISC HSV- Vaccination of the attacking virus w.t.HSV-2 by immunization with 1 or inactivated virus Intragrowth was inhibited. After another vaginal vaccination with DISC HSV-1, The number of recurrent HSV-2 foci in 100 days was reduced. DISC HSV-1 and deactivation wheel Intraepithelial vaccination with ruth also reduced recurrent foci, but with DISC HSV-1 The decrease was less than that of vaginal vaccination. (8) Oral and intranasal inoculation of guinea pigs with DISC HSV-1 was performed. Protection was provided against the symptoms of acute illness secondary to HSV-2 challenge. Nasal cavity The internal route appeared to be more effective than the oral route. Vaginal vaccination route recovers after challenge compared to oral or intranasal vaccination The level of virus was significantly lower. (9) Treatment of DISC HSV-1 to guinea pigs that have fully recovered from the primary HSV-2 disease. When vaccination was given intravaginally or intraepithelically, a pseudo-vaccination was given (mockvaccinat ed) The frequency of recurrence of disease symptoms was significantly reduced compared to animals. (10) DISC HSV-2 in the vagina in guinea pigs that have fully recovered from the primary HSV-2 disease When treatment was administered, the frequency of recurrence of disease symptoms was higher than that with DISC HSV-1. It was effective in reducing. The present invention has a defect in a gene whose genome is essential for producing an infectious virus. Therefore, it infects normal cells and then replicates in those cells and inherits viral antigens. Non-retroviral mutations that can express offspring but fail to produce normal infectious virus Contains virus and causes immune response in patients infected with infectious virus Alternatively, the present invention provides a medicine used for treatment. The production and release of non-infectious viral particles from cells due to the above defects Can be. The present invention has a defect in a gene whose genome is essential for producing an infectious virus. Therefore, it infects normal cells and then replicates in those cells to produce non-infectious virus particles. Medicine containing a non-retroviral mutant virus capable of producing and releasing offspring from the cell It is to provide medicine. This drug is used to treat patients immunized with Can protect against infection or the consequences of infection by a rovirus-based virus It This drug treats patients immunized with this drug with the corresponding wild-type virus. It is a vaccine that can protect against infections or the consequences of infections. This drug can treat patients with confirmed non-retroviral infections It is a therapeutic agent. This drug treats patients with confirmed confirmed infection with the corresponding wild-type virus. It is a therapeutic agent that can be treated. This drug is subcutaneous, intramuscular, intradermal, intraepithelial (with or without scarification) It can be administered intranasally, intranasally, intravaginally, or orally, and is suitable for the selected route of administration. Contains excipients. The variant may be of double stranded DNA virus origin. The mutant is herpes It may come from Ils. Even if the mutant is derived from herpes simplex virus (HSV) Good. The variant may be HSV type 1 or HSV type 2. The defect is the glycoprotein It is in the gH gene. The present invention has a defect in the gene whose genome is essential for producing infectious HSV-2. So that it infects normal cells, then replicates in those cells and expresses viral antigens. Sensitive to HSV, such as HSV-2, for type 2 HSV that can produce normal infectious virus What is provided for causing an immune response in a stained patient to be used for prevention or treatment Is. Due to the above defects of mutant HSV-2, non-infectious virus particles are produced and released from cells can do. In addition, since its genome is defective in a gene essential for the production of infectious HSV-2, Infecting a normal cell and then replicating within that cell to obtain non-infectious viral particles Also provided is type 2 HSV that can be produced and released from This variant allows patients immunized with this variant to interact with HSV, such as its corresponding field. For infection with live virus or its consequences Can defend. This variant is used in patients with confirmed HSV, for example, its corresponding wild-type virus infection. Can be treated. The defect is in the glycoprotein gH gene. Since the genome of the present invention is defective in a gene essential for producing HSV-1, , Infecting normal cells and then replicating within those cells and expressing viral antigen genes Susceptibility to mutant type 1 HSV that cannot produce a normal infectious virus, but patients are susceptible to type 2 HSV To produce a medicine for preventing or treating by causing an immune reaction against staining Is intended to be used. Its use may be intraepithelial (with or without scarification), vaginal, intranasal or Is for use in medicine for oral administration. The present invention also provides a patient for preventing or treating the symptoms caused by HSV infection. With instructions on how to administer medicine to the The vial / ampoule is preferably pre-filled or the container is Contains the above medicine (vaccine for prevention or therapeutic agent for treatment) It provides an assembly. The printed instructions should be facial or reproductive It relates to the prevention or treatment of organ lesions. Vaccines containing these variants above were prepared according to methods known in the art. Can be prepared by mixing the variants with a suitable excipient. Tell Suitable excipients include, for example, saline or to prevent viral infections. There are other additives known in the art for use in compositions utilized for It Such vaccines will produce vaccines useful for effective administration to the host. Therefore, an effective amount of the variant provided by the present invention and an appropriate amount of excipients are included. Have. The drug administration rate can be determined by a known method. For example, the drug administration rate is , The effect of varying the amount of variant in the vaccine formulation It can be determined by measuring the optimal amount of antibody against the variant. Waku See A. Voller and H. Frie for additional background details on Chin preparation. Published by dman, University Park Press, Baltimore, 1978, “New Trends an d Developments in Vaccines ”. The therapeutic agent containing the variant provided by the present invention provides a composition useful for treatment. According to the known method of Combined in admixture with an acceptable carrier excipient. About suitable excipients and their formulations Are described in Remington's Pharmaceutical Science by E.W. Martin. this Such compositions are acceptable as therapeutic agents suitable for effective administration to the host. To prepare the composition, an effective amount of the variant of the invention is combined with a suitable amount of carrier excipient. It is also contained in In general, vaccines are injections such as liquid solutions or suspensions (traumatic or Atraumatic). Before injection, make a liquid solution or suspension. It is also possible to produce a solid form suitable for the preparation. These formulations are in liposomes It may be enclosed. An active immunogenic ingredient is a pharmaceutically acceptable and active ingredient thereof. Often mixed with excipients that are compatible with. Suitable excipients include, for example, water, Saline, dextrose, glycerin, trehalose, etc. and their mixtures It In addition, if desired, the vaccine may contain other stabilizers and / or pH buffers. Small amounts of auxiliary substances that enhance vaccine stability and therefore efficacy It may be contained. Vaccines of the invention may be injected, eg subcutaneously, intraepithelial (with or without scarification) ) Can be administered parenterally by injecting Wear. Other formulations suitable for other administration methods, such as oral, vaginal and nasal Formulations are also provided. Oral formulations include, for example, pharmaceutical grade trehalose, man Nitol, lactose, starch, magnesium stearate, saccharin nato Contains commonly used excipients such as sodium, cellulose, magnesium carbonate, etc. Have. These compositions are solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release. It may be in the form of a sex formulation or powder. The vaccine of the present invention is formulated in a manner compatible with its dosage form and in a prophylactically effective amount. Is administered. Dosages are preclinical and clinical trials to give the optimal immune response. Predetermined by trial (Phase I). The vaccine of the invention is administered in a single dose regimen or preferably in a multiple dose regimen. it can. In a multiple dose regimen, the primary course of vaccination may be 1 to 3 separate doses. Administration followed by another administration required to maintain and / or enhance the immune response. At timed intervals, eg the second dose is given in 1 to 4 months and The next dose will be given several months after treatment. This regimen also provides optimal immunity during the period. Pre-clinical and clinical studies determined to maintain the response. For a clearer understanding of the present invention, reference is made to the following drawings in which: The invention will now be further described without limitation. Figure 1 shows the concept of the DISC virus. FIG. 2 shows live DISC HSV-1 or inactivated (treated with β-propiolactone) w. Wild-type HSV-1 (w.t.HSV-1) in the ear of mice vaccinated with t.HSV-1 (strain SC16) 2 shows the clearance of strain SC16 virus. Disturb on left earlobe in groups of 4 Vaccination was carried out at the specified dose by the cut method. 14 days after vaccination, 2 x 10 on the right earlobe of the mouse⁶Attack with pfu's w.t.HSV-1 strain SC16, then attack 5 The virus titer was measured day after day. The data are the geometric mean and the standard error of the mean. Shown. Figure 3 shows w.t.HSV-1 (strain SC16), live DISC HSV-1, dead DISC HSV-1 or PBS. Of neutralizing titer and ELISA titer of antibody against w.t.HSV-1 in mice vaccinated with The measurement results are shown. Serum from mouse was supplemented with neutralizing antibody against w.t.HSV-1. The presence of the body was tested by the plaque reduction test. Individual titer without antibody The reciprocal of the serum dilution required to neutralize 50% of the infectivity obtained (reciprocal d ilution). Figure 4 shows w.t.HSV-1 (strain SC16), live DISC HSV-1, dead DISC HSV-1 or PBS. Shows delayed type hypersensitivity (DTH) response of mice vaccinated with. Designated for the mouse 14 days after vaccination of the left earlobe with a dose, the opposite ear 10⁶pfu w. It was challenged with t.HSV-1 (strain SC16). 24 hours after the attack and 48 Measured after hours and shown as difference between challenged and vaccinated ears. Data is It is shown as an average value of the difference in ear thickness (μm). Fig. 5 shows live DISC HSV-1, dead DISC HSV-1, MDK (thymidine kinase negative HSV-1 Strain) or PBS vaccinated mouse cytotoxic T cell (CTL) responses . Mice were immunized with two intraperitoneal doses at 3 week intervals and a second immunization. 10 days after the injection, the cell suspension was prepared from the spleen. Cells in vitro for 4 days As a target cell after stimulation for⁵¹CTL assay using A20 / 2J labeled with Cr Tested. Data from 4 samples at each point⁵¹The average value of Cr release% Is shown. The standard errors of these means are all <10%. Figure 6 shows 10 times twice via a 3 week interval via the intraepithelial or intravaginal route.⁷pfu After vaccination with each DISC HSV-1 dose, Ten^5.2Evaluated by guinea pig erythema score after challenge with pfu w.t.HSV-2 (strain MS) Shows the clinical symptoms. Figure 7 shows 10 times twice via a 3 week interval via the intraepithelial or vaginal route.⁷pfu After vaccination with each DISC HSV-1 dose,^5.2pfu w.t.HSV-2 (bacteria Shows the clinical symptoms evaluated by the scores of all lesions of guinea pigs after challenge with the strain MS). FIG. 8 shows two times at an interval of 3 weeks by intraepithelial or intravaginal route.⁷pfu After vaccination with each DISC HSV-1 dose,^5.2pfu w.t.HSV-2 (bacteria The virus that later attacked w.t. in the guinea pig after the attack with (MS strain MS). Shows replication of HSV-2 (strain MS). Figures 9a and 9b show two intra-epithelial or intra-vaginal routes at two 3-week intervals. ,Ten⁷After vaccination with a dose of DISC HSV-1 per pfu, 10^5.2pfu w.t.HS 4 shows recurrent disease in guinea pigs after challenge with V-2 (strain MS). Figure 9a is a recurrence Disease is shown as cumulative mean erythema index / animal. Figure 9b shows recurrent disease in one animal It is shown by the cumulative average value of the number of days with per disease. Figure 10 shows that vaginal and transdermal routes were obtained in animals (guinea pigs) infected with w.t.HSV-2 (strain MS). Mock virus preparation, DISC HSV-1 or inactivated DISC HSV-1 by oral or nasal route The average score of lesions per animal when vaccination was carried out is shown. Fig. 11 shows that vaginal and transdermal animals were infected with w.t.HSV-2 (strain MS) in animals (guinea pigs). Mock virus preparation, DISC HSV-1 or inactivated DISC HSV-1 by oral or nasal route The average score of the erythema per animal when vaccination was performed. Fig. 12 shows that vaginal and transdermal animals were infected with w.t.HSV-2 (strain MS) in animals (guinea pigs). By oral or nasal route, a pseudovirus formulation, DISC HSV-1 Or w.t.HSV- per animal when vaccinated with inactivated DISC HSV-1 The average value of the log titer of 2 (strain MS) is shown. FIG. 13 shows recurrent disease after therapeutic vaccination. This is in the epithelium or Immunize vagina with DISC HSV-1 or vagina with pseudovirus Days after disease was observed after challenge of guinea pig group with w.t.HSV-2 (strain MS) ( Disease / day). Disease is the presence of one or more lesions or more than one The erythema score above was classified. The animals will be challenged with the first attack (Zero) by the w.t.HSV-2 strain. After 4 weeks, monitoring was carried out for 100 days. 2 x 10 for animals⁷pfu or finger Vaccinations were given on days 0, 24 and 44 at doses equivalent to those specified. Figure 14 shows w.t.HSV-1 (strain SC16) of mice vaccinated with DISC HSV-1. It shows a long-term defense effect against attacks by. This graph shows 5 days after the attack And the mean log titer of w.t.HSV-1 in the ear 223 days after vaccination. Figure 15 shows w.t.HSV-1 (strain SC16) of mice vaccinated with DISC HSV-1 Shows long-term protection against attacks. This graph shows the above vaccination Shown are the titers of neutralizing antibodies on days 15, 27, 90, 152 and 218. Figure 16 shows w.T.HSV-2 (strain HG52) of mice vaccinated with DISC HSV-2 It has a protective effect against attacks. The above vaccinations are for live DISC HSV-2 and dead DISC HSV. -2 and w.T.HSV-2 (strain HG52) at various doses. Graph shows ears after attack Shows the average log titer of w.t.HSV-2. Figure 17 shows the construction of a single-stranded plasmid containing the complete HSV-2gH gene. Figure 18 shows the gH gene in parallel with the single letter amino acid symbol. Figure 3 shows the sequence of HSV-2 strain 25766 in the offspring region. Figure 19 compares the DNA sequences of HSV-1 and HSV-2 strain 25766 in the gH gene region. Show. Figure 20 shows the deduced amino acid sequences of the gH proteins of HSV-1 strain 17 and HSV-2 strain 25766. A comparison is shown. Figure 21 shows the level of similarity between the HSV-1 and HSV-2 DNA sequences in the region of the gH gene. The graph is shown by the UWGCG program Plotsimimilarity. Figure 22 shows the level of similarity between the amino acid sequences of the HSV-1 and HSV-2 gH proteins. Shown graphically (according to UWGCG program Plotsimilarity). Figure 23 shows the construction of pIMMB26. Two from the left and right of the HSV2gH gene Fragment was amplified by PCR and cloned into pUC119. Four oligo nucleotides The octides MB57, MB58, MB59 and MB60 are shown. Figure 24 shows the construction of pIMMB45. Figure 25 shows the construction of the first stage recombinant vector pIMMB47 +. FIG. 26 shows the construction of the second stage recombinant vector pIMMB46. Figure 27 shows recombinant HG52-D, TK-minus DISC virus, and TK-plus DISC virus. The result of the restriction map analysis is shown below. Figure 28 shows various viruses probed with sequences flanking the right side as shown in Figure 27. The figure shows a Southern blot of the digested product with BamHI. Lane 5: HG52-D Will Lane 2: TK-minus "first stage" DISC virus; and Lanes 3, 4, 6, 7 and 8: TK-minus "second stage" DISC viruses.Herpes simplex virus lacking glycoprotein H (gH-HSV) Herpes simplex virus (HSV) is a recurrent lesion of the facial and genital organs. Causes a wide range of pathogenic symptoms in humans, including encephalitis, which is often fatal to Rabbits It is a large DNA virus. Type 1 HSV (HSV-1) is generally associated with facial lesions , While type 2 HSV (HSV-2) seems to be particularly associated with genital foci is there. HSV infection is partially protected by chemotherapy with the drug acyclovir Yes, but there are vaccines available to prevent primary infections and the consequences of those infections. Is not yet. Therefore, an excellent therapeutic agent for treating established HSV infections, And preventive agents that prevent the establishment of HSV infections and / or associated medical conditions Both are desired. Vaccination against HSV is difficult because the virus is usually direct from cell to cell. This is because it is diffused in the body by the contact transfer. So humoral immunity , Circulating antibodies can only neutralize extracellular viruses, so they do not seem to be effective It Cellular immunity is more important in protecting against viral infections, and therefore Which can generate both humoral and cellular immunity, but is also safe Chin is very advantageous. A suitable target gene for inactivation within the HSV genome is the inheritance of glycoprotein H. It is a child (gH). This gH protein is a sugar protein present on the surface of the viral coat. It is a pak quality. This protein is responsible for membrane fusion during virus entry into infected cells. Believed to be involved in the process. The reason is that this gene is damaged Temperature-sensitive virus mutants are (Desai et al., J. Gen. Virol., 69, 1147-1156, 1 988). Since this protein is expressed late in infection, it is present In the absence, significant amounts of viral protein synthesis are occurring. All genetic manipulation procedures are edited by Sambrook, Fritsch and Manlatis. Collection “Molecular Cloning” A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator y Press, according to the standard method described in 1989.Method Manufacturing of DISC HSV-1 A.Generation of cell lines expressing the HSV-1 gH gene This is based on International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 (published on April 2, 1992). Incorporated by reference) and using standard methods in the art as well. did. B.Production of DISC HS VI type virus having a truncated gH gene This is based on International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 (published on April 2, 1992). Incorporated by reference) and using standard methods in the art as well. did. C. Related publications (I) Forrester A. et al., J. Virol., 66, 341-348, 1992. (Ii) Farrell H., et al., J. Virol., 68, 927-932, 1994.Manufacturing of DISC HSV-2 A. HSV2 gH gene (A) The herpes simplex type 2 (HSV2) gH gene contains two BamH1 strains of HSV strain 25766. Included in the restriction fragment. pTW49 is an H cloned in pBR322 BamH1R fragment of SV2 strain 25766. pTW54 was cloned into pBR322. BamH1S fragment of HSV2 strain 25766 that was isolated. One containing the complete gH gene The construction of the chain plasmid is shown in FIG. Digest pTW49 with BamHI and SalI, then 870 bases A pair (bp) fragment was isolated from an agarose gel. Similarly, replace pTW54 with BamHI Digested with KpnI and then the 2620 bp fragment was isolated from an agarose gel. This These two fragments together Was ligated to the plasmid pUC119 which had been digested with SalI and KpnI. Got (B) pIMMB24 was digested with SalI and KpnI. In addition, the plasmid was The 3490 bp insert was isolated by digesting with Includes HSV2 sequences This 3490 bp insert with it was purified from an agarose gel. Sonicate it, Both ends were repaired with T4 DNA polymerase and Klenow, then agarose. Size-fractionated on gel. An image containing DNA molecules with a length of approximately 300-600 bP Minutes were bound to SmaI cut M13mp11 (Amersham International UK). So The ligated mixture of E. coli strain TG1 was transformed into individual plasmids. Was collected. Single-stranded DNA is prepared from each plaque and then Klenow Use an enzyme or Sequenase and³⁵By the dideoxy sequencing method using SdATP The sequence was determined. Determine the sequence of M13 using oligonucleotides that prime from within the M13 sequence In addition to the sequence data, Sequencing directly from the pIMMB24 plasmid using cleotid primers Also got by. To obtain the sequence from the region adjacent to the gH gene, several sequences Information was also obtained from plasmid pTW49. Since the G + C ratio of HSV2 DNA is high, the distribution is due to'compression 'on the gel. The problem is that there are multiple interpretations of columns. This problem must be resolved in the future Absent. Therefore, in a few positions, this sequence is comparable to the previously published sequence of HSV1. Based on the comparison, it gives the best guess of what the correct sequence is. (C) The sequence of HSV2 strain 25766 in the region of the gH gene is represented by gH Are shown in parallel in FIG. Figure 19 shows A comparison of the DNA sequences of HSV1 and HSV2 is shown. Figure 20: HSV1 and HSV2 gH protein estimation A comparison of amino acid sequences is shown. 77% overall identity at the DNA level is there. Even at the protein level, the total identity is 77%, 9.7% have similar characteristics. Sequence similarity graphs the level of similarity As can be seen from FIG. 21, it changes to some extent along the length of the gene. Gh gene Is much more significant than the existing changes in the coding and non-coding regions. , The difference in the level of identity between HSV1 and HSV2 at the DNA level. Minutes from Figure 19 As such, the nucleotide sequence identities should be within the coding sequence of the gH gene. Is higher than in the intergenic region. Figure 21 marks the positions of the genes for TK, gH and UL21. The above is shown in the form of a graph. (D) When nucleotide sequence data is obtained from around the HSV-2gH gene, Further construction can be done. For example, if the gene is accurately deleted from the viral genome, Recombinant vectors can be designed that can be deleted. Between HSV1 and HSV2 The differences between these genes can be known only by knowledge of the HSV1 sequence. Was impossible. The oligonucleotides MB57, MB58, MB59 and MB75 flank the HSV2gH gene. A region of the sequence was designed to be isolated and cloned. This is shown in Figure 23. These oligonucleotides were used in the polymerase chain reaction (PCR) to A fragment of DNA from the side was amplified. The restriction sites are these oligonucleotides The resulting fragment contains these sites at both ends. Have these fragments cloned into a properly cleaved plasmid I was able to. The following oligonucleotides based on the HSV2 sequence for the above purposes used. The positions of these nucleotides are shown in FIG. International Patent Application No. PCT / GB91 / 01632 (WO92 / 05263) teachings and general teachings With knowledge, those skilled in the art will have the exact sequence of the gH gene in such a plasmid. A defective HSV-2 virus that lacks can be produced (see below). This These same sequences have a copy of the gH gene deleted from the HSV-2 genome When cloned into a suitable cell, this "complementing cell" Propagation of the defective HSV-2 virus can be maintained by providing the gH protein. These sequences should be such that there is no overlap between the sequences in the cell and the virus. The virus obtains the gene from the cell by recombination The possibilities are virtually gone. B.Construction of gH-deficient type 2 herpes simplex virus (DISC HSV-2) Complementary cell line Cells expressing the HSV-1gH gene (F6 cells, Forrester et al., Journal of Virology , 66, 341-348, 1992) holds the growth of HSV-2 virus lacking the gH gene. It was discovered that it could be done. But two new cell lines have been created. CR1 cells are F It uses the same promoter and gH gene as in 6 cells, but the sequence downstream of that gene is The truncated ends allow for sequence overlap between the final DISC virus and the cell line. There is no duplicate. This indicates that homologous recombination has occurred between the DISC virus and the cell line DNA. It's very useful because it means you can't get overwhelmed. In the Forrester report above In the case of F6 cells and gH-deficient virus, the duplication of wild type gH plus virus 10 by recombination⁶The virus is produced at a ratio of about 1 virus among them. Also HSV-2 bacteria Another cell line, CR2, expressing the gH gene from strain 25766 was also produced. This cell line Also retains DISC HSV-2 growth and there is no overlapping sequence between the virus and the cell. .Polymerase chain reaction (PCR) of adjacent sequences Viral DNA is purified from the virus by standard methods. on both sides of the gH gene The flanking sequences have a lower error rate than the Taq DNA polymerase, the Vent DNA polymerase. Amplification by PCR using a polymerase (New England Biolabs) (see FIG. 24). For PCR Not only a specific viral sequence but also a restriction site There is an array (see below). Make two vectors. That is, the first stage of recombination One for the floor and one for the second stage. For both vectors, adjacent to the right The sequence that begins begins at the same position to the right of the gH gene. The first stage vector is on the left side It has a contiguous sequence, which is in addition to the deletion of the HSV-2 gH gene. The 3'part of the Ils TK gene is also deleted. The second stage vector is the complete TK Restore the gene, and 5'end of the gH gene as desired for the final virus. It has an array adjacent to it on the left, extending to the right. The oligonucleotides used are as follows. Vector construction First stage recombinant vector: pIMM47 + Two PCR flags generated by oligo MB97-MB96 and oligo MB57-MB58 The restriction enzyme that is compatible with the sites contained in these PCR oligonucleotides. Digest with elementary substance. The MB97-MB96 fragment is digested with HindIII and HpaI. MB57-MB5 The 8 fragment is digested with HpaI and EcoRI. These fragments are called HindIII and E It is ligated into the vector pUC119 which was previously digested with coRI. The resulting plasmid is pIMMB4 Called 5 (see Figure 24). Before cytomegalovirus (CMV) for easy detection of first stage recombinants Under the control of the early promoter, the E. coli β-galactosidase gene was transformed into pIMMB4. 5 Insert in. This CMV promoter + β-galactosidase gene is One or more appropriate restriction enzymes from the appropriate plasmid containing the promoter and gene. Cut out with the element. Both ends of it are, if necessary, the DNA polymerase Klenowra. Are filled with cement. This is the method adopted by the applicant. However Alternative methods will be apparent to those of skill in the art. For example, β-gala The cytosidase gene may be under the control of the SV40 promoter, in which case the The gene and promoter used BamHI and TthlIII for plasmid pCH110 (Pharmacia PL Biochemicals) and both ends are DNA polymerase. Filled with Klenow fragment of (Ecob-Prince, M.S. et al., J. Gen. Vir. ol., 74, 985-994, 1993). That fragmen Gel is gel purified. Plasmid pIMMB45 was digested with HpaI and calf intestine alkaline Phosphatase treatment with sphatase (CIAP) to remove self-binding and then gel Purify with. Construction of plasmid pIMMB47 + by ligation of gel-purified fragments (See Figure 25). Second stage recombinant vector: pIMMB46 Two PCR fragments prepared with oligo MB94-MB109 and oligo MB57-MB108 With a restriction enzyme compatible with the sites contained in these PCR oligonucleotides. Digest. The MB94-MB109 fragment is digested with HindIII and HpaI. MB57-MB108 The fragment is digested with HpaI and EcoRI. These fragments are previously Hind II It binds to vector pUC119 digested with I and EcoRI. The obtained plasmid was designated as pIIMB46. (See FIG. 26). The oligonucleotides used are as follows. Construction of recombinant virus a) First stage Viral DNA was produced from strain HG52-D. In addition, this strain is a model of HSV-2 strain HG52. It is an isolated strain that has been purified. Viral DNA (2.5 μg) and pIMMB47 + plasma DNA (0.25 μg), CaPO_FourPrecipitation method (Chen and Okayama, Molecular and Cellu lar Biology, vol. 7, p. 2745) was used to transfect CR1 cells. set Change occurs intracellularly and produces a mixture of recombinant and wild-type virus . This mixture was treated with CR1 in the presence of acyclovir (10 μg / ml). Plaque purification was performed 3 times on the cells and TK-minus virus was selected. Next simple Larks were grown and analyzed. The virus on normal Vero cells and CR1 cells Titrated above. If the virus is a gH-deficient virus, grows only on CR1 cells It should not grow on Vero cells. Table 1 shows that it is There is. The above viruses are found on non-complementing Vero cells even at the highest virus concentrations. It does not grow at all, but grows well on CR1-complementing cell lines, and the latter cell line Express the SV-1gH gene. The virus described above on CR2 cells expressing the HSV-2gH gene Also grows well (data not shown). b) Second stage DNA was produced from this TK-minus DISC virus and recombination was carried out using plasmid pIMMB46. Was performed as above. In this case, the TK plus recombinant was transformed with gH-expressing TK. − On a minus BHK cell line, methotrexate, thymidine, glycine, adenosine And guanosine were selected by growth in medium containing guanosine and guanosine. Hui Ruths are harvested and then re-grown two or more times under selective conditions before final plaque purification Was carried out with CR1. The virus was propagated and analyzed by Southern blotting . From the original HG52-D, TK-minus DISC virus and TK-plus DISC virus Viral DNA was digested with BamHI and then separated on an agarose gel. That DNA van Southern block Transfer to a nylon membrane and then label with radioactivity from the adjacent sequence on the right. Probed with the attached fragment. Figure 27 shows the structure of these viruses, Ba It had the expected band size after digestion with mHI. The probe used is the dashed line It is marked with'R 'underneath. The probes are different sizes for each of these viruses Should form a hybrid with the band. FIG. 28 shows that it is as described above. Lane 5 shows HG52-D virus Lane 2 contains TK-minus "first stage" DISC virus, and lane 2 3, 4, 6, 7 and 8 contain TK-plus "second stage" DISC virus . This confirmed that the DNA structure of each of these viruses was as expected. It The present application cites certain strains of HSV-1 and HSV-2. Included in the application The general teaching does not have to be carried out exactly on the above strains. The present invention can be implemented, HSV-1 and HSV-2 strains with high sequence homology to each other are readily available. For example HSV One source is the American Type culture Collection (ATCC) (20852 Merri, USA). Park Lawn Drive 12301, Rockville, Florida). below Items are available from the ATCC based on the accession number provided. HSV-1 strain F: ATCC accession number VR-733 HSV-1 strain MacIntype: ATCC accession number VR-539 HSV-1 strain MP: ATCC accession number VR-735 HSV-2 strain G: ATCC accession number VR-734 HSV-2 strain MS: ATCC deposit number VR-540In vivo trial of mouse ExaminationDefense test An in vivo mouse ear model was used to test the protective effect. Equal dose Activated wild type HSV-1 (strain SC16, Hill et al., J. Gen. Virol., 28, 341-353, 197). 5 years) and DISC HSV-1 against w.t.HSV-1 replication, w.t.HSV-1 attack Comparison of the ability to protect against and to induce HSV-specific neutralizing antibody did. DISC of various doses was applied to the left ear lobe of BALB / c mice aged 4 to 5 weeks by the scarification method. Vaccinated with HSV-1 or inactivated virus. The virus is β-propiolacto Deactivated by using a computer (other details were published on April 2, 1992) See International Patent Application Publication No. WO 92/05263. This application is incorporated herein by reference. ). Two weeks after the vaccination, these mice received 2 × 10 6 on the opposite ear.⁶p We attacked with fu w.t.HSV-1 (strain SC16). 5 days after the attack, The amount of virus present is determined by plaquing on BHK cells. Was tested (see FIG. 2). 5 x 10^Fivepfu and 5x10⁶Vaccination with DISC HSV-1 of pfu (pfu is D Complete protection against replication of the challenge virus (as measured on the complementing cell line for ISC virus) On the other hand, live vaccination was performed on mice vaccinated with inactivated virus. Ils was present. Five days after the challenge, we tested the virus titer in the ganglia of the vaccinated animals. Around the same time, similar results were obtained (data not shown).Serological response to DISC HSV-1 vaccination In the protection of antibodies given by DISC HSV-1 vaccination I investigated the role. Both the neutralizing antibody titer and the total antibody titer were measured by ELISA. It was measured as described above. 5 x 10 in groups of 6 mice each^Fivepfu DISC HSV-1, dead DISC HSV-1 , W.t.HSV-1 (strain SC16) or PBS vaccination, then 2 weeks after vaccination Serum samples were collected after and 14 weeks later. Neutralizing antibody was measured in the presence of complement and The number of peaks is shown by the reciprocal of the dilution of serum in which the number of sera was reduced by 50%. ELISA antibody titer to HSV-1 Lysates of infected BHK cells were measured on a coated plate and titrated to the end point ( (See FIG. 3). Between animals vaccinated with DISC HSV-1 and the same amount of dead DISC HSV-1, It can be seen from FIG. 3 that no significant difference in physical strength was found.Delayed type hypersensitivity (DTH) response to DISC HSV-1 vaccination It is important that the DTH response is important in protecting against herpes virus infection Well reported. DISC HSV-1, dead DISC HSV-1 and live w.t.HS in groups of mice DISC H that causes DTH response by vaccination of left ear lobe with V-1 The performance of SV-1 was investigated. 4 doses (5 x 10³, 5 × 10^Four, 5 × 10^FiveAnd 5 x 10⁶pfu) vaccine Two weeks after using and vaccination, place the other ear of the animal 10⁶pfu w.t.HSV-1 (Strain SC16). 24 hours after attacking the DTH response at the attack site And the ear thickness was measured and evaluated at 48 hours, and the ear that was attacked and the ear that was not attacked The difference is shown as the difference (see FIG. 4). Low vaccine dose (5 x 10³, 5 × 10^Fourpfu), the dead DISC HSV-1 No DTH was found, but a clear DTH response after DISC HSV-1 vaccination. It can be seen from FIG. 4 that the burrs were pinched. High dose (eg 5 × 10⁶pfu), DISC HSV-1 and dead DISC H Formulations of SV-1 evoked similar DTH responses. DTH response elicited by different doses of various vaccine formulations Correlates with the protective effect of the vaccine against the replication of sucrose. Therefore, low throw Vaccination with a dose of DISC HSV-1 vaccine is effective in inducing T cell-mediated immunity. It is the cause.Demonstration that DISC HSV-1 virus can generate cytotoxic T cells Cytotoxic T cells are involved in protection against primary infection with HSV and recovery from the infection Have already been reported. Therefore, it is necessary to check the vaccination with DISC HSV-1. The mice were tested for the presence of HSV-1 specific cytotoxic T cell activity. Immunization is followed by the production of cytotoxic T cell activity, which can be performed using standard methods, eg rtin, S. et al., J. Virol., 62, 2265-2273, 1988 and Gallichan, W.S. From , J. Infect. Dis., 168, 633-629. It was calibrated. More specifically, a group of female BALB / c mice were treated with 2 x 10⁷ pfu virus (DISC HSV-1; dead DISC HSV-1; MDK thymidine kinase negative HSV -1 strain) is intraperitoneally administered to immunize, and three weeks later, these immunizations (same) Dose and route) was repeated. Control mice were treated with 0.1 ml PBS intraperitoneally at the same time. Was administered. Ten days after the second immunization, the spleens of these mice were removed. , Pooled for each group. In addition, the spleen of non-immunized BALB / c mice was prepared to prepare feeder cells. [16 feeders for 4 groups of 6 effector spleens] -A spleen is sufficient]. All subsequent steps are It was carried out in a laminar flow hood using the bacterial method. Sterilize the spleen RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum. Ground ( Single cell suspensions were produced by the effector medium). Let the debris settle and then The single cell suspension was transferred to a new container at. The single cell suspension is used as an effector Wash twice in medium (1100 rpm, 10 minutes) then pass sterile sterilized gauze to collect all. The lump was removed. Store the resulting effector spleen cell suspension on ice until needed. Stored. Spleen feeder cells were added to effector medium at 1 x 10⁷Resuspend to cells / ml Then, mitomycin C was added to a final concentration of 20 μg / ml. 37 these feeder cells Incubated at 0 ° C for 1 hour. Supporter cells were washed 4 times with PBS supplemented with 1% FCS. Then washed once with PBS without protein. Live virus (MDK) The pellets of feeder cells treated with Syn C were added at a concentration of 3 pfu of virus / spleen cells. Added After incubating at 37 ℃ for 1 hour, the feeder cells were added to the effector cell culture medium. It was washed once with. 5x10 effector cells⁶Suspend again to cells / ml, while supporting cells 2.5x Ten⁶Resuspended to cells / ml. 500 μl effector cell suspension and 500 μl Feeder cells suspension of was added to the wells of a 24-well plate. These plates In a humid atmosphere at 37 ° C (5% CO₂) For 4 days. Effector cells and feeder cells were harvested from 24-well plates. These details The cells were centrifuged once and the pellet was resuspended in effector medium. (5 ml medium / 2 plates). The cell suspension is layered on the lymphocyte separation medium and then Was centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes. The live effector cells were harvested from the interface and then Washed twice. The first wash was 1500 rpm for 15 minutes and the next wash was 1100 rpm for 10 minutes. It was a minute. The effector cells will eventually Resuspended in medium and then stored on ice until needed. Labeled target cells were prepared to assay for cytotoxicity. Uninfected sibling A202J A20 / 2J cells were harvested from tissue culture flasks. Ie 2 × 10⁷Cells of Was added to two vessels (target infected and uninfected). These cells Washed with DMEM (no additives). 10 pfu / cell of live MDK virus in infected cells In addition, an equal volume of EMEM was added to uninfected cells. 1 mCi⁵¹Cr each univer Add to monkeys and incubate cells for 1 hour at 37 ° C (in a water bath) It was Target cells in target medium (DEEM supplemented with 10% FCS) three times (1100 rpm for 10 minutes) Between) and finally resuspended in target cell medium to the required cell concentration. 1x10 both uninfected and infected target cells⁶Cells / ml and 1 x 10^Fivecell/ Resuspend to 100 ml, then 100 μl at a time (ie 1 x 10^FiveTarget / well and 1 × 10^FourTarget / well respectively) in a round bottom 96-well plate. Plated out into L. All experimental points were planned 4 times . 8x10 each effector cell type in effector medium⁶Resuspend up to cells / ml Then, a 2-fold dilution was prepared. Label 100 μl effector cell suspension 8x10 in addition to wells containing cells^FiveEffector cells / well, 4 × 10^Five Effector cells / well, 2x10^FiveEffector cells / well and 1 x 10^FiveD Effector cells / well were obtained. Therefore, 10^FiveFor target cells / well, The effector to target ratio was 8: 1, 4: 1, 2: 1 and 1: 1. Ten^Four Effector to target ratio of 80: 1, 40: 1, 20 to target cells / well : 1 and 10: 1. Maximum chromium release for each target cell type is 100μ l of 20% Triton x-100 contained only the target cells (ie effector Was added) to the wells (not containing). For each target cell type Voluntary For release, 100 μl of effector cell medium was added to the wells containing only the target cells. Obtained by adding to. The plates were incubated for 4 hours at 37 ° C in a humid atmosphere. afterwards Centrifuge these plates for 4 minutes at 1500 rpm and add 100 μl of supernatant to each well. Removed from well. Transfer the supernatant to an LP2 tube and let Radioactivity was counted on a gamma counter for 1 minute. Specific chromium release percentage (% specific c hromium release) was calculated using the following formula. The results are shown in FIG. 5 and Table 1. Vaccination with DISC HSV-1 can be replicated sufficiently to allow infection with the MDK virus. HSV-1 specific CTL activity comparable to that produced was induced. Dead against this Some mice immunized with DISC HSV-1 or treated with PBS contained certain types of Non-specific killing was observed, but HSV-1 specific CTL activity was completely absent. I couldn't stop. The reason for this is not clear, but it is due to high levels of NK cell activity. Is shown. When mice were vaccinated with DISC HSV-1, antibodies against HSV-1 viral antigen , Was shown to induce CTL activity and DTH activity. Wide range of viral proteins Due to its ability to activate both humoral and cellular immune responses to Explain the effectiveness of virus vaccination.Long-term protection The in vivo mouse ear model was used to test the long-term protective effect of DISC HSV-1. 4-5 week old BALB / c mice were divided into groups of 6 animals each. To these groups below Vaccination was performed as follows.group vaccination PBS Pseudo-immunization with PBS Single immunization with 1K inactivated DISC HSV-1 Two immunizations with 2K inactivated DISC HSV-1 Immunization with 1L (live) DISC HSV-1 Two immunizations with 2L (live) DISC HSV-1 Single immunization with 1S w.t.HSV-1 (strain SC16) 2 immunizations with 2S w.t.HSV-1 (strain SC16) 5 × 10 on left ear lobe for all groups^FiveImmunize with pfu on day 0 And then blood samples were taken on days 15, 27, 90, 152 and 218. I took it. PBS, 2K, 2L and 2S groups were PBS or 5 x 10^Fivepfu additional exemption Underwent epidemics. All groups were 5 × 10 on day 223^FiveAttack of w.t.HSV-1 (strain SC16) I was hit. Of the virus present in the attacked ear (right) 5 days after the attack Quantities were calibrated by performing plaques on BHK cells. Results shown in Figure 14 Vaccinated twice with DISC HSV-1 (2L group), it became inactivated DISC HSV-1 (2K group) It has better protection than Show that excellent protection was obtained with w.t.HSV-1 (strain SC16). w.t.HSV The efficacy of vaccination with -1 is, of course, expected. But normal live virus Is generally not desirable for use as a vaccine. Figure 15 shows various vaccinations The titer of neutralizing antibody thus elicited is shown. This means that two doses of DISC HSV-1 Protects against DISC HSV-1 as it produces the same titer as two doses of inactivated DISC HSV-1. It shows that the use is not explained simply by the induction of antibodies.DISC HSV-2 preventive action The in vivo mouse ear model was used to test the protective effect of DISC HSV-2. Six-week-old BALB / c mice were divided into groups. These mice against the left earlobe Immunization was performed as follows by the scarification method.group Vaccination material and dosage 15 x 10²pfu raw DISC HSV-2 25 x 10³pfu raw DISC HSV-2 3 5 x 10^Fourpfu raw DISC HSV-2 45 x 10^Fivepfu raw DISC HSV-2 5 5 x 10²pfu dead disc hsv-2 6 5 x 10³pfu dead disc hsv-2 7 5 x 10^Fourpfu dead disc hsv-2 8 5 x 10^Fivepfu dead disc hsv-2 9 5 x 10^Fourpfu w.t.HSV-2 (strain HG52) 10 5 x 10^Fivepfu w.t.HSV-2 (strain HG52) 11 PBS DISC HSV-2 was a gH deletion mutant of strain HG52. After 3 weeks, all groups were treated with 5 × 10 5 by the right earlobe scissors method.^FourW.t.HSV-2 (strain HG 52) attacked. The amount of virus present in the attacked ear (right) 5 days after the attack was measured by BHK It was assayed by plaque on the cell (see Figure 16). The result shown in FIG. 6 is 5 × 10³, 5 x 10^FourAnd 5 x 10^FiveVaccination with a dose of pfu DISC HSV-2 killed Better protection against w.t.HSV-2 (strain HG52) attack compared to DISC HSV-2 It shows that you do. But as expected, 5x10^FourAnd 5 x 10^Fivepfu throw A good dose of w.t.HSV-2 provided better protection but normal living wild It is not desirable to use type I virus as a vaccine.In vivo guinea pig test As mentioned above, HSV-2 appears to be closely associated with genital foci . The guinea pig is currently the best animal model for human primary and recurrent genital disease. (Stanberry, L.R., et al., J. Inf. Dis., 146, 397-404, 198). 2 years). Accordingly, Applicants have tested the previously described mouse test in human reproductive organ HSV-2. Provide a useful system for assessing the immunogenicity of candidate vaccines against infection Extended to the HSV-2 infected guinea pig vaginal model. By that vaginal model, H Extensive evaluation of the primary clinical manifestations following an intravaginal attack with SV-2, and thereafter The frequency of recurrence of can be analyzed. (1) Introduce non-trauma into the vagina (intraluminal route) or Two doses of DISC HSV-1 vaccine by the ear lobe scarification method (intraepithelial route) ( 2 x 10 at 3 week intervals⁷pfu). A control group consisting of 21 animals was simulated Vaccinated intravaginally with a virus preparation and another group of 14 animals was given a Intraepithelial prophylaxis with two equal doses of w.t.HSV-1 inactivated by ropiolactone I inoculated. 10 vaccinated animals after 3 weeks^5.2pfu w.t.HSV-2 virus (Strain MS) and monitored for symptoms of primary and recurrent disease. (A) Following the w.t.HSV-2 challenge, animals were exposed to primary sensation daily for 2 weeks. The symptoms of dyeing were evaluated. Clinical lesions are scored directly and erythema It was scored on a scale of 1-5. Vaginal area was also measured as an index of edema (data provided. Not). The results obtained are shown in FIGS. 6 and 7. The points on the graph are for one animal Shown is the average erythema score per day (Fig. 6) and total lesions per day per animal. The average score is shown (FIG. 7). The results of these studies were shown to be compatible with intraepithelial and vaginal vaccination with DISC HSV-1. Have been shown to provide a high degree of protection against the primary symptoms of HSV-2 infection. Amazing In particular, when inactivated HSV-1 was administered via the intraepithelial route, the DISC virus Clearly lower than that provided by Kuching, but provided significant protection. (B) Samples were taken from all animals using vaginal swabs daily for 12 days after challenge. And plucking on Vero cells to monitor the growth of the attacking virus in the vagina The virus titer was determined by performing. The test results shown in FIG. The infectious virus titer of the inoculated animal was the highest 3 × 10 2 days after the attack.^FourRise to And shows that detection was possible by day 10. In contrast, vaccination The virus titer of the animals was steadily decreased from the 1st day and was not detected on the 7th day It was Between groups immunized with DISC HSV-1 or a preparation of inactivated virus No disagreement was noticed. (C) Following the HSV-2 challenge, on day 28, there was sufficient recovery from the acute disease Animals were monitored daily for additional 100 days for disease recurrence. The number of animals in each group , DISC / intravaginal 14; DISC / intraepithelial 12; inactivated / intraepithelial 14; sham / intravaginal 12 Met. Clinical lesion is direct It was scored numerically and erythema was scored on a scale of 1-5. The results are shown in Figures 9a and 9b. . The dots in the graph represent the cumulative total value of the average value per day of one animal. The results of these studies are 100 days in animals vaccinated with DISC HSV-1 by the vaginal route. It shows an approximately 50% reduction in the number of recurrent HSV-2 lesions during follow-up. DIS Intraepithelial vaccination with C HSV-1 and inactivated virus also reduced recurrent foci However, the degree was small. (2) In addition, the following experiment was conducted on the genital HSV, which is a candidate for the DISC vaccine based on HSV-1. -2 Designed to assess immunogenicity against infection. This experiment is different Species route (vaginal, oral and nasal, ie various mucosal surfaces) and DISC HSV-1 or Various doses of inactivated HSV-1 were designed for comparison in guinea pigs.Materials and methods Virus (I) Already reported in International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 published on April 2, 1991. Vero cells (F6 transfected with HSV-1gH gene as described) 2.) DISC HSV-1 was propagated on. In summary, confluent monolayers of F6 cells were treated with 0.1 pfu Infected with DISC HSV-1 at a multiplicity of cells / cell and harvested when 90-100% cpe was observed. I caught it. Cells are harvested with a cell scraper, centrifuged to pellet and Pellets were resuspended in a small volume of Eagle's minimal essential medium (EMEM). this The suspension was sonicated for 1 minute, aliquoted and stored at -70 ° C. The virus titer is F6 It was measured on the cell. (Ii) Add β-propiolactone at a concentration of 0.05% to bring DISC HSV-1 to room temperature. And inactivated for 1 hour. Inactivation was achieved by adding the virus to F6 cells. I inspected it. (Iii) The HSV-2 strain MS was produced in the same manner as for the DISC HSV-1 above using the VeV method. Proliferated on ro cells and titrated. animal Female Dunkin-Hartley Guinea Pigs (300-350g), Davis Hall, Darley Oaks Farms, Newcharch, Nr. Obtained from Burton-on-Trent. Experimental design 8 x 10 in groups of 12 animals⁶Inactivation of DISC HSV-1 or the same dose of pfu By administering DISC HSV-1 once on the 1st and 17th days of this experiment, a total of 2 doses And immunized. Immunization can be with 0.05 ml of virus given intravaginally or 0.2 ml of virus By intranasally or 0.2 ml of the virus by mouth Carried out. A control group consisting of 12 animals consisted of sonicated Vero cells. A vaccination was given intravaginally with a pseudo-Illus formulation. All groups on day 34, 10^5.2pfu HSV-2 (Strain MS) was used to attack in the vagina, and this experiment was performed by an independent Were randomly selected and performed in a blinded manner. For the 11 days following the attack, the animal is treated for the primary disease. The condition was monitored. The clinical observations were based on the number of lesions and erythema present in the vaginal area. It was scored as being present (scoring on a scale of 1-5). Furthermore, the increase of attack virus in the vagina All animals were tested with vaginal swabs daily for 12 days post-challenge to monitor breeding. Virus titers were determined by plaques on Vero cells. Statistical method Differences in clinical scores between groups were tested for significance using the Mann-Whitney U test. . Values of p <0.1 were considered significant.Test results Clinical disease status For each immunization group, average lesion score per animal, flatness The effect of vaccination on the spotted spot and the virus replication after challenge, respectively. Shown in Figures 10, 11 and 12. If vaccinated with DISC HSV-1 by vaginal route, Higher degree of protection against primary infections compared to vaccinated animals . In contrast, vaccination with the same dose of inactivated DISC HSV-1 provided significant protection Did not bring. Intranasal immunization with DISC HSV-1 offers much higher protection than vaginal vaccination was gotten. Is this a serious disease defined by a lesion score of 6 or higher? It was particularly clear when the number of days spent was examined (see Table 2). Inactivated DISC HSV -1 provided some protection by the intranasal route, but vaccination with DISC HSV-1 It wasn't effective. Vaccination via the oral route also provided protection, but rather than intranasal or vaginal vaccination Was also a low defense. After all, vaccination with DISC HSV-1 virus is inactivated DI Protected more effectively than vaccination with SC HSV-1. Therefore, we draw the following conclusions from the above experiments with the in vitro guinea pig model. You can A. Vaccination of DISC HSV-1 by the vaginal or intranasal route allows HSV-2 A high degree of protection was provided against the acute disease symptoms that followed the attack. B. Severe disease (defined by the presence of 6 or more lesions) Considering the number of days left, intranasal administration of DISC HSV-1 provided the highest degree of protection. C. Intravaginal vaccination with inactivated virus can cause pseudo-infection in guinea pigs. The clinical disease symptoms were similar to those observed. Inactivated by inactivated DISC HSV-1 Although vaccination provided some protection, DISC HSV by this route Not as high as -1 vaccination. D. Diseases of animals vaccinated orally with mock infection with DISC HSV-1 There was a significant difference between the symptoms. However, the degree of protection in this case is the DISC HSV-1 From the degree of protection observed in animals vaccinated by the intranasal or vaginal route It was low. E. FIG. Symptoms of animals orally vaccinated with inactivated DISC HSV-1 are There was no significant difference with the symptoms of the dyeing group. F. Data about Shed Virus is important. Amazing In particular, the virus that recovers following challenge with the vaginal vaccination route The level of the space has become significantly lower. This may be due to local antibody production. (3) The following experiment was conducted to investigate recurrent disease induced by HSV-2 following therapeutic vaccination. I planned to eat. This means that some recombinant HSV-2 antibodies may be used with adjuvants for treatment. Dosing can reduce the frequency of subsequent relapses Was important as previously reported (Stanberry, L.R., et al., J. In. f.Dis., 157, pp. 156-163, 1988; Stanberry, L.R. Et al., J. Gen. Virol., 70 Volume, 3177-3185, 1989a; Ho, R.J.Y. et al., J.Virol., 63, 2951-2958, 1 989). Therefore, 21 horses who were fully recovered from the primary HSV-2 disease 4 weeks after being attacked Animals are randomly divided into 3 groups and then treated intravaginally with live DISC HSV-1 (10 animals) or treated in situ (11 animals). For preventive vaccination It was used as a control (see (2) above) and was able to fully recover from the primary disease. Groups of 12 animals were treated with the same amount of sham formulation (12 animals). these Animals were further treated identically after 24 and 48 days. The frequency of recurrent disease is Monitored for an additional 100 days from the day of first treatment, cumulative results are shown in Figure 13, It is summarized in Table 3. For each group treated with DISC HSV-1, especially over the 50 days following the second vaccination And the total number of diseases / days and interstitial conditions appears to be moderately reduced (approximately 25%) I understand. Serum was collected from these animals at the end of the 100 day observation period. ELI of that serum SA and NT antibody titers were greater than those recorded post-challenge but before treatment. It wasn't too high. And the titer between the sham-treated group and the group treated with DISC HSV-1 There was no significant difference. The therapeutic administration of DISC HSV-1 virus intravaginally or intraepithelically as described above This clearly reduced the frequency of relapses (20-25%) compared to sham-treated animals. (4) The following experiments were conducted to investigate the therapeutic effect of HSV-2 based DISC virus. Planned to. DISC HSV-2 (strain HG52) deficient in the gH gene was previously described. International Patent Application Publication No. WO92 / 05263 (published on April 2, 1992) Incorporated by reference) and also using standard methods in the art. Manufactured. DISC variants of the above strains were also taught in WO 92/05263. It was then grown in Vero cells transfected with HSV-2gH. This experiment Then, we directly compare DISC HSV-1 and DISC HSV-2 in female guinea pigs weighing 350-400 g. It was Guinea pigs were divided into 3 groups. All guinea pigs 10^5.8pfu HSV-2 strain M Infected with S. At 4 weeks, primary disease developed and then disappeared, and recurrence began. It was. The animal was then treated. The first group of 15 animals was sonicated Intravaginal treatment was performed with a simulated virus preparation consisting of Vero cells. Consisting of 13 animals The second group is 10⁷Intravaginal treatment was performed with DISC HSV-1 of pfu. Third group of 14 animals Is 10⁷Intravaginal treatment was performed with DISC HSV-2 of pfu. Treatment was repeated 14 days later. The results are shown in Table 4. Days 1 to 13 include the period between the two treatments I'm out. Days 14-27 include a 2 week period following the second treatment. One day Days 27-27 include the entire period. As shown in the test results, treatment with DISC HSV-2 was associated with HSV-2 strain MS Clearly, it was effective in reducing the symptoms caused by dyeing. DISC H Treatment with SV-2 was more effective than treatment with DISC HSV-1.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年３月２４日【補正内容】請求の範囲１．病原体によりすでに感染された対象の粘膜表面に医薬を投与することによっての治療処置のための医薬の調製への、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し、次いでその細胞内で複製しかつウイルス抗原遺伝子を発現できるが、しかし正常な感染性ウイルスを産生できない非レトロウイルス性変異ウイルスの使用。２．病原体によりすでに感染された対象の膣内に医薬を投与することによっての治療処置のための医薬の調製への、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し、次いでその細胞内で複製しかつウイルス抗原遺伝子を発現できるが、しかし正常な感染性ウイルスを産生できない非レトロウイルス性変異ウイルスの使用。３．前記欠陥が非感染性ウイルス粒子の細胞から産生及び開放を可能にする請求の範囲第１項又は第２項記載の使用。４．病原体によりすでに感染された対象の粘膜表面に医薬を投与することによっての治療処置のための医薬の調製への、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し、次いでその細胞内で複製し、非感染性ウイルス粒子の細胞からの産生及び開放を生ぜしめる非レトロウイルス性変異ウイルスの使用。５．病原体によりすでに感染された対象の膣内に医薬を投与することによっての治療処置のための医薬の調製への、そのゲノムが感染性ウイルスを産生するのに必須の遺伝子に欠陥があるので、正常細胞に感染し、次いでその細胞内で複製し、非感染性ウイルス粒子の細胞からの産生及び開放を生ぜしめる非レトロウイルス性変異ウイルスの使用。６．前記変異体がヘルペスウイルスからである請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の使用。７．前記変異体がヘルペス単純ウイルス（HSV）からである請求の範囲第６項記載の使用。８．前記変異体がタイプ１ヘルペス単純ウイルス（HSV）からである請求の範囲第７項記載の使用。９．前記変異体がタイプ２ヘルペス単純ウイルス（HSV）からである請求の範囲第７項記載の使用。 10．前記欠陥が前記糖タンパク質gH遺伝子に存在する請求の範囲第８又は９項記載の使用。 11．病原体によりすでに感染されている対象の治療処置のために効果的であり、且つ粘膜表面への投与のために適切である形での医薬であって、請求の範囲１〜10のいづれか１項記載の非レトロウイルス変異ウイルスを含んで成る医薬。 12．病原体によりすでに感染されている対象の治療処置のために効果的であり、且つ膣内投与のために適切である形での医薬であって、請求の範囲第１〜10のいづれか１項記載の非レトロウイルス性変異ウイルスを含んで成る医薬。 13．粘膜表面への医薬の投与により確立された病原体感染を処置するためへの患者への医薬の投与に関して、説明書と共に容器に充填されているか又は容器が付随されている請求の範囲第11項又は第12項記載の医薬を含んで成るアンセブリー。 14．前記説明書が、前記医薬の膣内投与による膣損傷の処置に関する請求の範囲第13項記載のアセンブリー。 15．粘膜表面への医薬の投与により、病原体によりすでに感染されている患者を処置するためへの請求の範囲第11又は第12項記載の医薬の使用。 16．医薬の膣内投与により患者を処置するためへの請求の範囲第15項記載の使用。 17．前記変異ウイルスがHSVからである請求の範囲第15又は第16項記載の使用。 18．前記変異ウイルスがタイプ2HSVからである請求の範囲第17項記載の使用。 19．前記変異ウイルスが糖タンパク質gH遺伝子に関して欠陥性である請求の範囲第17又は第18項記載の使用。[Procedure Amendment] Patent Act Article 184-8 [Submission date] March 24, 1995 [Correction content] The scope of the claims 1. By administering the drug to the mucosal surface of a subject already infected by the pathogen For the preparation of a medicament for therapeutic treatment of Is defective in a gene that is essential for Can replicate and express viral antigen genes, but can Use of non-retroviral mutant viruses that cannot be produced. 2. By administering the drug intravaginally to a subject already infected by the pathogen To the preparation of a medicament for the therapeutic treatment of Has a defect in an essential gene that infects normal cells and then replicates in those cells. And can express viral antigen genes, but produce normal infectious virus Inability to use non-retroviral mutant viruses. 3. The said defect allows the production and release of non-infectious viral particles from the cell. Use in accordance with claim 1 or 2. 4. By administering the drug to the mucosal surface of a subject already infected by the pathogen For the preparation of a medicament for therapeutic treatment of Is defective in a gene that is essential for A non-retro that replicates and causes the production and release of non-infectious viral particles from the cell Use of viral mutant viruses. 5. By administering the drug intravaginally to a subject already infected by the pathogen To the preparation of a medicament for the therapeutic treatment of Has a defect in an essential gene that infects normal cells and then replicates in those cells. Non-retrovirus that causes the production and release of non-infectious viral particles from cells. Russ mutation Use of Ils. 6. Any of claims 1-5, wherein the mutant is from a herpesvirus. Use according to item 1. 7. 7. The method according to claim 6, wherein the mutant is from herpes simplex virus (HSV). Use as stated. 8. Claim that the variant is from a type 1 herpes simplex virus (HSV) The use as described in box 7. 9. The claim in which the variant is from type 2 herpes simplex virus (HSV) The use as described in box 7. Ten. 10. The claim 8 or 9 wherein the defect is present in the glycoprotein gH gene. Use as stated. 11. Effective for therapeutic treatment of subjects already infected by the pathogen And a medicament in a form suitable for administration to a mucosal surface, the method of claim 1 11. A medicament comprising the non-retrovirus mutant virus according to any one of 1 to 10. 12. Effective for therapeutic treatment of subjects already infected by the pathogen And a pharmaceutical in a form suitable for vaginal administration, comprising: A pharmaceutical comprising the non-retroviral mutant virus according to any one of claims 1. 13. To treat established pathogen infections by administration of drugs to mucosal surfaces For administration of the medication to the patient, the container is filled or with instructions Ansebri, comprising the medicament according to claim 11 or claim 12 attached thereto. -. 14. A description of the claims regarding the treatment of vaginal injury by intravaginal administration of the medicament. The assembly according to box 13. 15． Patients already infected by the pathogen due to the administration of the drug to the mucosal surface Claim 11 or 12 for treating Use of medicine. 16. Use according to claim 15 for treating a patient by vaginal administration of a medicament. for. 17． Use according to claim 15 or 16, wherein the mutant virus is from HSV. . 18. 18. Use according to claim 17, wherein the mutant virus is from type 2 HSV. 19. Claims that the mutant virus is defective with respect to the glycoprotein gH gene Use according to paragraph 17 or 18.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボースネル，マイケルエドワードグリフスイギリス国，ケンブリッジシービー１４エヌワイ，ネザーホールウェイ 46 (72)発明者ミンソン，アンソニーチャールズイギリス国，ケンブリッジシービー２５ジェイジェイ，グレートシェルフォード，ケンブリッジロード 113─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G B, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV , MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, UA, US, U Z, VN (72) Inventor Beausner, Michael Edward Gris Husband Cambridge CB 1 England 4 NW, Nether Hall Way 46 (72) Inventor Minson, Anthony Charles Cambridge CB 2 England 5 Jay Jay, Great Shell Four De, Cambridge Road 113

Claims

[Claims] 1. Its genome has a defect in a gene essential for producing an infectious virus Infects normal cells, then replicates in those cells and expresses viral antigen genes Non-retroviral mutant virus that can produce normal infectious virus And prevent the infection by inducing an immune response in patients infected with infectious virus. Medicine used for treatment. 2. The defect allows non-infectious viral particles to be produced and released from cells The medicine according to claim 1. 3. Its genome has a defect in a gene essential for producing an infectious virus , Infecting normal cells and then replicating within the cells to remove non-infectious viral particles. Contains a non-retroviral mutant virus that can be produced and released from cells Medicine. 4. Patients immunized with the vaccine are treated with a non-retroviral virus Claims 1 to 3, which are vaccines that can protect against infection or the consequences of the infection. The drug according to any one of 1. 5. A therapeutic agent that can treat patients with confirmed non-retroviral infections The medicine according to any one of claims 1 to 4. 6. Can protect against infection or the consequences of infection by the corresponding wild-type virus Or a patient capable of being treated for infection by said virus. 5. The medicine according to 5. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, which contains an excipient for intraepithelial administration. For the intraepithelial administration of. 8. 7. The nasal administration vehicle according to any one of claims 1 to 6 containing an excipient. A drug for intranasal administration. 9. 7. Any one of claims 1 to 6 containing an excipient for vaginal administration. The pharmaceutical for vaginal administration according to item 6. Ten. 7. The method according to claim 1, which contains an excipient for oral administration. Oral medication. 11. Any of claims 1 to 10 wherein the mutant is derived from a double-stranded DNA virus The medicine according to any one of them. 12. 12. The medicine according to claim 11, wherein the mutant is a herpesvirus-derived mutant. 13. The mutant is derived from herpes simplex virus (HSV). The described medicine. 14. 14. The medicine according to claim 13, wherein the mutant is HSV type 1. 15． 14. The medicine according to claim 13, wherein the mutant is HSV type 2. 16. The defective portion is in the glycoprotein gH gene according to claim 14 or 15. Medicine. Preventing or treating patients by raising an immune response against HSV infection Its genome is essential for producing infectious HSV-1 for the manufacture of the drug used Because the gene is defective, it infects normal cells and then replicates in those cells and Mutant type 1 HS that can express the ruth antigen gene but cannot produce a normal infectious virus Use of V. 18. The use according to claim 17, wherein the drug is a drug for intraepithelial administration. 19. The use according to claim 17, wherein the drug is a vaginal drug. 20. The use according to claim 17, wherein the drug is a drug for intranasal administration. twenty one. The use according to claim 17, wherein the drug is a drug for oral administration. twenty two. Do you protect against the symptoms of non-retroviral infections? Together with printed instructions on administering the drug to the patient to treat the condition. Any one of claims 1 to 16 in which the container is filled or a container is attached. An assembly containing the medicament according to one. twenty three. Claim 22. The non-retroviral virus is a double-stranded DNA virus. The assembly shown. twenty four. The aceene according to claim 23, wherein the double-stranded DNA virus is a herpes virus. Brie. twenty five. Claim 24, wherein the herpes virus is herpes simplex virus (HSV). The assembly shown. 26. 26. The assembly according to claim 25, wherein the HSV is type 1. 27. 27. The assembly according to claim 26, wherein the HSV is type 2. 28. Printed instructions for protection against facial lesions or treatment of those lesions The assembly of claim 26, wherein: 29. Printed instructions for protection against or treatment of genital lesions The assembly of claim 27 which is a book. 30. Anti-non-retroviral viral immune response in patients for prophylactic or therapeutic purposes Use of the medicament according to any one of claims 1 to 16 for causing: 31. Claim 30. The non-retroviral virus is a double-stranded DNA virus. Use of the listing. 32. Use according to claim 31, wherein the double-stranded DNA virus is a herpes virus. 33. Claim 32 wherein the herpes virus is herpes simplex virus (HSV) Use of the listing. 34. Use according to claim 33, wherein the HSV is type 1. 35. Use according to claim 34, wherein the HSV is type 2. 36. Use according to claim 34 for preventing or treating a facial lesion in a patient. 37. Use according to claim 35 for the prevention or treatment of genital lesions in a patient. for.