JPH08508014A

JPH08508014A - オリゴデンドログリア増殖因子およびその利用法

Info

Publication number: JPH08508014A
Application number: JP6520338A
Authority: JP
Inventors: クレイダー，バーバラ・キュー; プレジャー，デービッド; リー，ヴァージニア・エム−ワイ
Original assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Current assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1996-08-27
Also published as: EP0688334A1; WO1994020522A1; CA2158037A1; AU6364494A

Abstract

(57)【要約】６０キロダルトンのタンパク質（”オリゴデンドログリア増殖因子”、ＯＴＦ）は、脳白質培養中のオリゴデンドログリアの蓄積を誘導する。オリゴデンドログリア増加の半最大値は、オリゴデンドログリア増殖因子２ｎｇ／ｍＬにて得られる。オリゴデンドログリア増殖因子は、オリゴデンドログリアの子孫およびオリゴデンドログリアに対して細胞分裂誘導効果を持つが、星状細胞、シュワン細胞、または神経繊維内鞘繊維に対しては増殖刺激を行わない。モノクローナルなオリゴデンドログリア増殖因子抗体での免疫学的研究は、オリゴデンドログリア増殖因子はＣＮＳおよび背側神経根中の神経によって発現されることを示している。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴデンドログリア増殖因子およびその利用法発明の分野この発明はオリゴデンドログリア（oligodendroglial）増殖因子およびその利用法に関するものである。発明の背景多面硬化症や脳炎のような脱ミエリン症は患者を衰弱させる病気である。多面硬化症の終期では、広範囲の大脳および脊髄の脱ミエリンによる歩行の不安定化、失禁、および麻痺が一般的である。たいていの場合その後、死に至る。多面硬化症の患者はしばしば、長年にわたり再発と緩解を繰り返す。脳炎は、しばしば死に至る単相で急性の過程で特徴づけられる。脱ミエリン症には、一般に主な病理学的過程として、アクソンを覆い絶縁しているミエリン鞘の欠損がみられる。多面硬化症は徹底的な、しかし完結していない研究の題材であった。未だにこれらの疾患に対する効果的な処置法は知られていない。オリゴデンドログリア細胞は、中枢神経系のアクソンを覆うミエリンを産する。オリゴデンドログリアはCNS胚基質の神経外胚葉幹細胞由来である。ゴールドマン（Goldman J.E）ら,J.Neuorolsci 1986,6,52-60;レヴァイン（LeVine S.M. ）およびゴールドマン,J Comp Neurol 1988 277,441-455これらの幹細胞は、オリゴデンドログリア生成過程において、小さく、過程中生き残り、運動能力があり、急速に増殖する中間体となる。ラフ（Raff M.C.）ら,Nature 1983,303,390- 396;スモール（Small R.K.）ら,Nature 1987,328,155-157;レヴァインおよびゴールドマン,J Comp Neurol 1988,277,441-455:ノーブル（Noble M.D.）ら,Natur e1988,333,560-562;グリンスパン（Grinspan J.B.）ら,J Neurosci 1990,10,186 61-18873;ハーディ（Hardy R.）およびレイノルズ（Reynolds R.）,Development 1991,111,1061-1070ラットでは、この中間段階の細胞を、ガングリオシドおよびその他の細胞膜エピトープを認識するモノクローン抗体（mAbs）を用いることによって、またアストログリアに特徴的な抗原（例えばグリア繊維性酸性タンパク質（GFAP））、またはオリゴデンドログリアに特徴的な抗原（例えばガラクトセレブロシド（galC）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、および脂質タンパク質（PLP））の発現の欠失によって免疫組織学的に同定できる。総説はゴールドマン（1992）による。これらの運動性オリゴデンドログリア始源細胞の増殖、移動、分化、および分化したオリゴデンドログリアの生存は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（塩基性FGF）（マッキノン（McKinnon R.D.）ら,Neuron 1990,5,603-614;ボグラー（Bogler O.）ら,Proc Natl Acad Sci USA 1990,87,6368-6372）、血小板由来増殖因子（PDGF ）（リチャードソン（Richardson W.D.）ら,Cell 1988,53,309-319;ノーブルら, Nature 1988,333,560-562;プリングル（Pringle N.）ら,EMBO J 1989,8,1049-10 56;グリンスパンら,J Neurosci 1990,10,18661-18873;バレス（Barres B.A.）ら ,Cell 1992,70,31-46）およびインシュリン様増殖因子-1（IGF-1）（マクモリス（McMorris F.A.）およびデュボイーダルク（Dubois-Dalcq M.）,J Neurosci Re s 1988,21,199-209）を含むパラクライン増殖因子によって制御されている。分子量が16-18kDa、さまざまな神経芽腫細胞系列から培地に放出されるオリゴデンドログリア増殖因子が知られている。ボッテンシュタイン（Bottenstein J. E.）ら,J Neurosci Res,1988,20,291-303;ハンター（Hunter S.F.）およびボットシュタイン,J Neurosci Res 1991,28:574-582;ギウリアン（Giulin D.）ら,J Neurosci1991,11,327-336 CNSニューロンの一次培養から培地に放出されるオリゴデンドログリア系列の細胞に対する増殖促進因子（レヴァイン,Neuron 1989,3 ,103-113;ガード（Gard A.L.）およびフェイファー（Pfeiffer S.E.）,Neuron 1 990,5,615-625）の分子レベルの特徴はまだ報告されていない。組織培養研究によると、オリゴデンドログリアの分化はニューロンがない場合に起きる。ラフ（Raff M.C.）ら,Nature 1978,274,813-816;バーバレズ（Barbar ese E.）およびフィーファー（Pfeiffer S.E.）,Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78,1953-1957;ゼラー（Zeller N.K.）ら,J Neurosci 1985,5,2955-2962;サネト（Saneto R.P.）およびデヴェリス（De Vellis J.）,Proc Natl Acad Sci USA 1 985,82,3509-3513;ナップ（Knapp P.E.）ら,Dev Biol 1987,120,356-365;グリンスパンら,J Neurosci 1990,10,18661-18873;ハーディおよびレイノルズ,Develop ment 1991,111,10 61-1070しかし、オリゴデンドログリアは、適当な太さのアクソンと接触している場合のみミエリンを集合させ、密な状態で維持できる。ウッド（Wood P.M.）およびウイリアムズ（Williams A.K.）,Dev Brain Res 1984,12,225-241;キッド（Kidd G.J.）ら,J.Neurosci Res 1990,26,409-418この接触は、オリゴデンドログリアMAGとまだ特徴付けられていないニューロン原形質膜の成分の接着性相互作用によって安定化される。ジョンソン（Johnson P.W.）ら,Neuron 1989,3,377 -385,オウエンズ（Owens G.C.）ら,J Cell Biol 1990,111,1171-1182;クアーレス（Quarles R.H.）ら,In:Myelin:Biology and Chemistry（マーテンソン（Mart enson RE）編）,pp413-448 Boca-Raton:CRC Press（1992）第二の接触によるオリゴデンドログリア-ニューロン相互作用は、オリゴデンドログリア膜結合表面タンパク質によって誘導されるアクソンの伸長の阻害である。カロニ（Caroni P .）およびシュワッブ（Schwab M.E.）,Dev Biol 1989,136,287-295:ファウセット（Fawcett J.W.）ら,J Cell Sci1989,92,93-100 幾つかの観察によると、オリゴデンドログリア系列の細胞とニューロンの間の第三の接触依存性増殖相互作用、オリゴデンドログリアの有糸分裂の誘導の存在が示唆されている。背根神経節ニューロン（dorsal root ganglion neuron）と共に培養されたオリゴデンドログリアは、アクソレマに富む膜画分と共に培養されたオリゴデンドログリアの場合;チェン（Chen S.J.）およびデヴリエス（DeVr ies G.H.）,J Neurochem 1989,52,325-327;ヴィック（Vick R.S.）およびデヴリエス,J Neurosci Res 1992,33,68-74;と同様に増殖する;ウッドおよびバング（B unge R.P.）,Nature 1986,320,756-758;ウッドおよびバング,Glia 1991,4,225-2 32。アクソレマ関連オリゴデンドログリア増殖促進因子の性質は、ある研究によると酸性繊維芽細胞増殖因子（酸性FGF）またはその関連タンパク質でると示唆されており;ヴィックおよびデヴリエス,J Neurosci Res 1992,33,68-74、別の研究によると、200ng/MLの半最大活性を有する新規の50kDalの外来性膜タンパク質であることが示唆されているがノードランド（Nordlund M.）ら,Glia 1992,5,18 2-192、まだ確立はしていない。この50kDaのタンパク質はまた、シュワン細胞の増殖源でもある。多面硬化症の過程で失われるミエリンに取って交われる、このオリゴデンドログリアの有糸分裂の誘導が非常に望まれている。発明の概要出願人は新規のオリゴデンドログリア増殖因子を同定し単離した。このタンパク質はオリゴデンドログリアの有糸分裂を誘導し、そして多面硬化症や脳炎のような脱ミエリン症の進行中に失われるミエリンの交換を促進することが出願人によって示された。本発明の好ましい一つの態様で、哺乳類脳全体の0.5M塩抽出物を調製し、0.15 MNaCl中でpH7.4でイオン交換マトリックスと抽出物を保温し、5kDaから600kDaの画分領域をもつサイズ排除カラム上で結合しない上清を流し、画分を溶出し、オリゴデンドログリア増殖活性をもつ画分を集め、変成ゲル上で活性画分を溶解する、ことからなるオリゴデンドログリア増殖因子の単離法が提供される。本発明の好ましい一つの態様で、哺乳類脳全体の0.5M塩抽出物を調製し、0.15 M NaCl中でpH7.4でイオン交換マトリックスと抽出物を保温し、5kDaから600kDa の画分領域をもつサイズ排除カラム上で結合しない上清を流し、画分を溶出し、オリゴデンドログリア増殖活性をもつ画分を集め、変成ゲル上で活性画分を溶解し、ゲルから分子量約60kDaのタンパク質を回収し、接触するオリゴデンドログリアの有糸分裂の誘導に有効な量の回収したタンパク質とオリゴデンドログリアとを接触させる、ことからなるオリゴデンドログリアの有糸分裂を誘導させる方法が提供される。本発明の好ましいさらなる態様で、哺乳類脳全体の0.5M塩抽出物を調製し、0. 15M NaCl中でpH7.4でイオン交換マトリックスと抽出物を保温し、5kDaから600kD aの画分領域をもつサイズ排除カラム上で結合しない上清を流し、画分を溶出し、オリゴデンドログリア増殖活性をもつ画分を集め、変成ゲル上で活性画分を溶解し、ゲルから分子量約60kDaのタンパク質を回収し、脱ミエリン症患者のオリゴデンドログリアの有糸分裂を誘導するのに有効な量の回収したタンパク質を患者に投与することからなる脱ミエリン症患者の脱ミエリン症を処置する方法が提供される。本発明のさらなる好ましい態様で、約400units/ugのオリゴデンドログリア増殖活性をもつ分子量約60kDのタンパク質からなる実質的に純粋なオリゴデンドログリア増殖因子が提供される。さらに本発明の好ましい態様で、薬学的に受容できる担体にはいったオリゴデンドログリア増殖因子からなる薬剤が提供される。さらに本発明の好ましい態様で、組換え宿主細胞でのオリゴデンドログリア増殖因子の発現に十分な、オリゴデンドログリア増殖因子をコードするDNAの一部で形質転換した組換え宿主細胞が提供される。別の本発明の好ましい態様で、宿主細胞で形質転換された組換えDNAが、オリゴデンドログリア増殖因子をコードし、かつその宿主細胞でそのコーディング配列の発現に影響を与えられるような適当な制御配列に利用できる形で結び付けられたDNA配列をもつような組換え宿主細胞を培養する、ことからなるオリゴデンドログリア増殖因子の産生法が提供される。ここで述べる発現系と適合できる制御配列と利用できる形で結び付いた、オリゴデンドログリア増殖因子をコードするDNA配列を含む適切な発現系で発現できる組換えベクターも本発明の好ましい態様で提供される。さらに、本発明の好ましい態様で、オリゴデンドログリア増殖因子を特異的に認識するモノクローン抗体を発現するハイブリッドオーマ細胞系列が提供される。本発明の抗体を態様でまた、オリゴデンドログリアの有糸分裂の誘導に有効な量のオリゴデンドログリア増殖因子とオリゴデンドログリアとを接触させることからなるオリゴデンドログリアの有糸分裂を誘導する方法が提供される。さらなる本発明の好ましい態様で、中枢神経系のオリゴデンドログリアの有糸分裂の誘導に有効な量のオリゴデンドログリア増殖因子を脱ミエリン症患者に投与することからなる脱ミエリン症を治療する方法が提供される。出願人は、オリゴデンドログリアの有糸分裂を誘導するオリゴデンドログリア増殖因子を同定した。オリゴデンドログリア増殖因子は、ここではオリゴデンドログリア増殖活性に基づいて哺乳類脳全体から単離された。図面の簡単な説明図１は、新生児ラットCWM培養物を脳の膜のNaCl抽出物で処理した結果の写真である。新生児ラットCWM培養物中のA2B5'細胞（パネルAおよびC）、またはR-mA b'細胞（パネルBおよびD）を同定するのに間接免疫蛍光顕微鏡法を用いた。パネルCおよびDは、脳の膜のNaCl抽出物（20μg/mL）を顕微鏡観察の3日前に加えた培地に保持した培養物の様子を示しており、パネルAおよびBは抽出物を加えていない同様の培養物の様子を示している。サイズ棒=36μm 図2は、CWM培養物のDNA合成に対する脳の膜のNaCl抽出物の影響を示す写真である。CWM培養物を20μg/mLの脳の膜のNaCl抽出物で2日間処理し、このうち２日目にはBrdU（10μM）と保温した。パネルAは、R-mAbがその原形質膜に結合している2つのオリゴデンドログリアを示しており、パネルBは、固定の後、それらの 2つのオリゴデンドログリアの核に抗BrdU mAbが結合していることを示している。同様の結果が、そのような研究でR-mAbの代わりに01 mAbを用いた場合にも得られた（示していない）。図3は、脳の膜のNaCl抽出物を加えた後のオリゴデンドログリアおよび0-2A細胞のDNA合成率を比較する図である。脳の膜のNaCl抽出物（20μgタンパク質/mL ）を日にち0（CWM細胞を単離して4日目）で加え、日にち3および7に新鮮な培地を再び加えた。2重波長間接免疫蛍光顕微鏡法で観察する24時間前（オリゴデンドログリアの観察、パネルA）または6時間前（0-2A細胞の観察、パネルB）にBrd Uを培地に加えた。オリゴデンドログリアは、表面にR-mAbが結合することで同定された。0-2A細胞は、表面にA2b5 mAbが結合することで同定された。データは4 回の独立の実験の平均であり、垂線でSEMsを表している。白棒=非処理培養物;黒棒=NaCl抽出物で処理した培養物図4は、銀染SDS-PAGEゲルの複写である。銀染ゲルのレーン1は2μgのS200セファクリル後のオリゴデンドログリア増殖因子を流したものであり、レーン2は10 μgのDEAE後のオリゴデンドログリア増殖因子を流したものである。S200セファクリル後のオリゴデンドログリア増殖因子の平行な非染色レーンからのタンパク質の溶出は、すべてのgalC⁺細胞集合活性が60kDal（MW_app）の顕著なバンドの領域で回復されることを示した。図5は、オリゴデンドログリア増殖因子で処理したCWM培養物のMAG免疫蛍光顕微鏡観察の画像である。このCWM培養物は、S200セファクリル後のオリゴデンドログリア増殖因子（100ng/mL）で10日間処理し、R-mAb（パネルA）および抗MAG 免疫グロブリン（パネルB）の結合を2重波長間接免疫蛍光顕微鏡法で観察した。サイズ棒=33マイクロメーター図6は、オリゴデンドログリア増殖因子またはPDGFで処理したCWM培養物のMBP 免疫蛍光顕微鏡法の画像である。パネルAおよびCは、ヒトPDGF（2ng/mL）で10日間処理したCWM培養物の領域の位相差像とMBP間接免疫蛍光像を示す;この領域の約半分のオリゴデンドログリアはMBP⁺である。パネルBおよびDは、S200セファクリル後のオリゴデンドログリア増殖因子（100ng/mL）で10日間処理したCWM培養物の領域の位相差像とMBP間接免疫蛍光像を示す。MBP⁺細胞がほんの少しだけ存在している。サイズ棒=26マイクロメーター図7は、オリゴデンドログリア増殖因子、PDGF、または塩基性FGFで処理したCW M培養物中のMBP mRNAのノーザンブロット解析の放射能写真である。CWM培養物を、PDGF（2ng/mL）、塩基性FGF（10ng/mL）、またはS200セファクリル後のオリゴデンドログリア増殖因子（100ng/mL）で7日間処理した。全RNA（塩基性FGFおよびオリゴデンドログリア増殖因子処理培養物は10μg/レーン、PDGF処理培養物は 5μg/レーン）を、MBP cDNAプローブを用いたノーザンブロッティングで調べた。上のパネルは、[³²P]-ラベルMBP cDNAプローブで得られた放射能写真を示している。MBP mRNAのシグナル強度は,PDGFのレーンより塩基性FGFとオリゴデンドログリア増殖因子のレーンのほうがずっと弱い。[³²P]-ラベルPLP cDNAプローブを用いたブロットのリハイブリダイゼイションによって、PDGFのレーンのシグナル強度が塩基性FGFおよびオリゴデンドログリア増殖因子のレーンよりずっと強いことが示された（結果はしめしていない）。下のパネルは、同じ3つのレーンのメチレンブルー染色の28Sのバンドを示しており、bFGFおよびオリゴデンドログリアのレーンにのせたRNAの量がほぼ同じであり、PDGFのレーンにのせた量はそれより少ないことを示している。図8は、オリゴデンドログリア増殖因子の免疫組織学的局在を示す2つのパネルの画像である。パネルAは、オリゴデンドログリア増殖因子mAb,Duと保温した後、ペルオキシダーゼでラベルしたヒト小脳のパラフィン切片を示す;切片はヘマトキリンで対比染色した。パネルBは、Du mAbと保温した後、ペルオキシダーゼでラベルしたP6背根神経節細胞を示す;切片はザイス微分干渉差光学器で見た。発明の詳細な説明本発明のいくつかの具体例に従って、実質的に純粋なオリゴデンドログリア増殖因子（ＯＴＦ）が提供される。 ”オリゴデンドログリア増殖因子”という用語は、オリゴデンドログリア増殖活性をもつタンパク質をさして言う。オリゴデンドログリア増殖活性とはオリゴデンドログリア細胞の体細胞分裂をバックグラウンドレベル以上に誘導することを意味している。体細胞分裂が、細胞の染色体が複製し、分離し、そして細胞が同一の染色体のセットを含む二つの娘細胞に分裂する過程を意味することであることは、もちろん当業者によってよく理解されている。オリゴデンドログリア増殖活性とは、オリゴデンドログリア増殖因子の添加後に生ずる、バックグラウンド以上の付加的なオリゴデンドログリア数/ｍｍ²という表現で言及されるのが好ましい。活性の１ユニットは、バックグラウンドにオリゴデンドログリア細胞１０個/ｍｍ²を追加したものと同等であるものと定義される。オリゴデンドログリア増殖因子はオリゴデンドログリアの体細胞分裂を活性化する一方、オリゴデンドログリアによる、MPBまたはPLPのような、ミエリンがぎっしり詰まった脂質二重膜間の相互作用を安定化し、それによって、これらのオリゴデンドログリアによるアクソンの最初の被覆を促進するのを大部分担っている、ミエリン構築タンパク質の産生は活性化しない。オリゴデンドログリア増殖因子はニューロンと関連している。オリゴデンドログリア増殖因子は、イオンおよびサイズによる分離の組み合わせと、それに続く SDSポリアクリルアミドゲル分解によって脳の全抽出物から単離することができる。ラットの大脳白質の培養組織におけるオリゴデンドログリアの蓄積は、0.5M NaClの膜抽出物からオリゴデンドログリア増殖因子の精製の過程をモニターする分析法として利用することができる。その後、抽出物をDEAEセファデックス（ 0.15M NaCl中、pH7.4）のようなイオン交換樹脂でインキュベートする。結合しない上清物は5kDaからおよそ600kDaまでの分画幅をもつサイズ分画カラムに流すことができる。画分を溶出し、オリゴデンドログリア増殖活性をもつ画分を集める。活性のある画分に含まれるタンパク質は非変性ゲルを用いて分解できる。生理活性のあるオリゴデンドログリア増殖因子は0.15M NaCl中、pH7.4ではDE AEセファデックスに結合せず、S-200セファクリルカラムから球状タンパクでは5 0-70kDaの分子量に相当する画分に溶出される。SDSポリアクリルアミドゲルによる分解では、S-200セファクリルを通した調製物は、還元下において見かけの分子量が約60kDaの主要なバンドを含むことが分かった。オリゴデンドログリア増殖活性はその60kDaのバンドの溶出によって回収された。大脳白質の培養組織におけるR-mAb⁺およびOl⁺オリゴデンドログリアの半最大値の蓄積は、2ngのSDS-PA GE後のオリゴデンドログリア増殖因子タンパク質/mLの濃度で得られる。このように、全般にオリゴデンドログリア増殖因子は最初のNaCl抽出物から4,000倍に精製され、実質的に純粋になった。本発明のいくつかの具体例において、”実質的に純粋”とは85%以上純粋であることを意味している。本発明の他の具体例の中には90%以上純粋であるものが好まれる。最も好ましいのは95%以上の純粋さである。本発明のいくつかの具体例において、オリゴデンドログリア増殖因子は約50kD aから約70kDaの幅の分子量をもっている。本発明の最も好ましい具体例において、オリゴデンドログリア増殖因子は60kDaの分子量をもっている。オリゴデンドログリア増殖因子の前駆体もまた、オリゴデンドログリア増殖因子の生物学的活性のある断片としてこの中に含まれる。本発明のオリゴデンドログリア増殖因子は、懸濁状または溶液中の場合はその環境のｐＨに依存して、あるいは、固体の状態ならば結晶化または沈澱したときの環境のｐＨに依存しており、薬学的に受容できる塩、または中性の状態にあると思われる。もちろん、そのタンパク質の遊離のアミノ基は、例えば塩酸、リン酸、または硫酸のような有機酸、または例えば酢酸、グリコール酸、コハク酸、またはマンデル酸のような有機酸とともに酸性塩を形成することができる。遊離のカルボキシル基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化カルシウムのような無機塩基、およびピペリジン、グルコサミン、トリメチルアミン、コリンまたはカフェインのような有機塩基を含む塩基とともに塩を形成することができる。さらに、そのタンパク質は、脂質および糖質のような他の生物学的物質との組み合わせ、または、アミノ基のアセチル化、水酸基を有する側鎖のリン酸化またはスルフオキシル基の酸化のような側鎖の修飾によって修飾することができる。オリゴデンドログリア増殖因子の修飾は、ここに記載されたオリゴデンドログリア増殖活性が保持されている限り、その定義の範囲に含まれる。最終的に、オリゴデンドログリア増殖因子を僅かに修飾しても、実質的に同等、または昂進した増殖活性をもつタンパク質を生じることが分かっている。これらの修飾は、部位特異的変異導入による作意物であったり、またはオリゴデンドログリア増殖因子を産生する宿主の突然変異のような偶発的派生物であったりする。増殖活性が保持されている限り、これらの修飾はすべて含まれている。本発明のオリゴデンドログリア増殖因子は自然に生ずるか、または組換え体として産生される。オリゴデンドログリア増殖因子は記載通り、哺乳類の脳全体から直接調製できる。オリゴデンドログリア増殖因子は、例えば自動加水分解可能なアミノ酸分析器（Applied Biosystems model 420，ABS，Foster City，CA）を用いたアミノ酸分析のような技術として知られている標準的な技法によるアミノ酸配列の決定および組成分析によって、さらに性格付けられる。配列分析は、例えばパルス液相シークエンサー（Applied Biosystems model 477A，ABS）を用いたエドマン分解法で行うことができる。システイン残基は、配列分析に先立って、M.E.セルステッド、S.S.ハーウィッグら、J．Clin．Inv.，1985，76（4）：1436-1439、によって記載されたように、4-ビニルピリジンとの反応に続くスルフヒドリル基の還元によって同定される。マススペクトル分析は、高速原子衝突によるようなペプチドの分子量の決定に使われる。ポリペプチドは日常的に、例えば商業的に手に入るペプチド合成器のような当該技術分野においてよく知られている標準的な技法によって、実質的に純粋な形で合成することができる。オリゴデンドログリア増殖因子はまた、組換え体として調製できる。例えば、オリゴデンドログリア増殖因子をコードするDNA配列を単離するのにcDNA発現ライブラリーを使うことができる。cDNA発現ライブラリーは商業的に手に入れられ、または、当分野で知られている方法に従って調製することができる。オリゴデンドログリア増殖因子に対するモノクローナル抗体はライブラリーをスクリーニングするのに使用することができ、抗体によって認識されるプラークは配列の決定することができる。オリゴデンドログリア増殖因子を特異的に認識するモノクローナル抗体は、そのようなモノクローナル抗体を産生するのに利用することができるハイブリドーマ細胞株として、本発明で提供される。特異的に認識されるとは、存在する他のタンパク質を除外して抗体がオリゴデンドログリア増殖因子に結合することを意味している。あるいはDNAライブラリーはオリゴデンドログリア増殖因子遺伝子を特異的に認識する核酸プローブを用いてスクリーニングすることができる。そのような核酸プローブはオリゴデンドログリア増殖因子のアミノ酸配列に基づいて調製することができる。オリゴデンドログリア増殖因子のすべてまたは一部分をコードする核酸配列は本発明のいくつかの態様に含まれている。決定した核酸配列に基づいて、オリゴデンドログリア増殖因子またはその断片は、本明細書中で完全に述べられているものとして、参考文献として取り込まれている米国特許第4,677,063号に記載されているような、多くのよく知られた組換え技術のいずれかの変更を用いることによって調製できると考えられている。本明細書中で用いられている”その一部分”とは、望まれる生物学的活性、特にオリゴデンドログリア増殖活性を保持するのに十分なサイズのあらゆるペプチドまたは核酸の部分を意味している。簡単には、細胞をトランスフォームしたり、ベクターを構築したり、メッセンジャーRNAを抽出したり、cDNAライブラリーを調製したり、その他同種類のことに利用する技法の大部分は広く当分野で行われており、大部分の実行者は特異的条件および処置を記載した標準的な方法資料を熟知している。しかしながら、便宜のために、以下の段落でガイドラインとして提供する。原核生物は非常にしばしばE.coliのさまざまな株によって代表される。しかしながら、例えばBacillus subtilisのようなBacilli、Pseudomonasのさまざまな種、あるいは他の細菌株といった細菌のような他の微生物株も利用することができる。そのような原核生物のシステムでは、宿主に和合した種由来の複製点および制御配列を含むプラスミドベクターが利用される。例えば、そのような”発現システム”の一つとして、ボリバーら、Gene２：95（1977）はE.coliの種由来のプラスミドであるpBR322の派生物を用いてE.coliを形質転換した。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリンに耐性の遺伝子を含み、希望のベクターの構築の際に保持されるか、破壊されうる付加マーカーを提供する。一般に使用される原核生物の制御配列は、リボソーム結合部位配列に沿って、随意にオペレーターをもつ転写開始のためのプロモーターを含み、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、およびラクトース（lac）プロモーターシステム（チャンら、Noture 19 8：1056（1977））、およびトリプトファン（trp）プロモーターシステム（ゴーデルら、Nucleic Acid Res８：4057（1980））、およびラムダ由来のＰ_LプロモーターおよびＮ-遺伝子リボソーム結合部位（シマトークら、Nature 292：128（ 1981））のような一般に使用されるプロモーターを含んでいる。バクテリアに加え、酵母のような真核微生物もまた宿主として利用できる。多くの他の株も一般に利用できるが、パン酵母であるSaccharomyces cerevisiaeの実験用の株もよく用いられる。２ミクロンの複製起点を用いたベクターが例証されている一方、J.R.ブローチ、Meth Enz．101：307（1983）、酵母での発現に適した他のプラスミドベクターも知られている（例えば、スタインヒコウムら、Na ture 282：39（1979）、チェンプら、Gene 10：157（1980）、およびL.クラークら、Meth Enz 101：300（1983）。酵母ベクターのための制御配列には解糖関連酵素の合成のためのプロモーターが含まれる（ヘスら、J.Adv Enzyme Req 7：14 9（1968）；ホーランドら、Biochemistry 17：4900（1978））。当分野で知られているさらなるプロモーターとして３-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（ヒッツマンら、J.Biol.Chem 255：2073（1980）、およびグリセルアルデヒド３-リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱カルボキシル酵素、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸基転位酵素、ホスホグルコース転位酵素、およびグルコキナーゼのような他の解糖関連酵素のプロモーターが含まれる。転写が増殖環境によって制御されるという付加的な利点をもつ他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロムＣ、酸脱リン酸化酵素、窒素代謝に関わる分解酵素、並びにマルトースおよびガラクトース利用に関する酵素（ホーランド、同書）などのプロモーター領域である。また、ターミネーター配列がコード配列の３’端にあるのが望ましいと考えられている。そのようなターミネーターは酵母由来遺伝子のコード配列に続く３’非翻訳領域にみられる。例証された多くのベクターには、peno46プラスミドを含むエノラーゼ遺伝子（M.J.ホーランドら、J.Biol Chem 256：1385（1981））由来、またはYEp13から得られたLEU2遺伝子（J.ブローチら、Gene８：121（1978））由来の制御配列が含まれる。しかしながら、酵母に適合したプロモーター、複製起点、および他の制御配列を含むベクターはどれも適当である。多細胞生物由来の真核宿主細胞培養組織でポリペプチドをコードする遺伝子を発現するのももちろん可能である。例えば、Tissue Cultures，Academic Press, クルーズおよびパターソン編（1973）、を参照のこと。有用な宿主細胞株には、 VERO、Hela細胞およびチャイニーズハムスターの子宮（CHO）細胞が含まれる。真核生物の宿主でポリペプチドをコードする遺伝子のin vivoでの発現はまた、胃腸のディフェンシンポリペプチドの便利な調製法である。そのような細胞の発現ベクターは通常、例えばSimianウィルス40（SV40）（ファイアーズら、Nature 273：113（1978））のような一般に使用される早期および後期プロモーター、またはポリオーマ、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス、または鳥類肉腫ウィルスのようなウィルス由来の他のウィルスのプロモーター、等の哺乳類細胞に適合したプロモーター及び制御配列を含んでいる。哺乳類細胞の宿主システムの形質転換の一般概念は、例えばアクセル；米国特許第4,39 9,216号によって記載されている。現在では”エンハンサー”領域が最適な発現に重要であることが明らかになっている；エンハンサーは一般にプロモーター領域の上流または下流の非コードDNA領域に見いだされる配列である。複製起点は必要ならばウィルス源から得られる。しかしながら、真核生物では染色体への挿入がDNA複製の一般的なメカニズムである。現在では宿主として植物細胞が利用可能であり、ノパリン合成酵素プロモーターおよびポリアデニル化配列のような、植物細胞に適合した制御配列も利用可能である（A.デピッカーら、J．Mol App l．Gen１：561（1982））。使用した宿主細胞に依存して、形質転換はそのような細胞に適合した標準的な技法を使用して行われる。実質的な細胞壁のバリアをもつ原核生物や他の細胞には、N.コーエン、Proc Natl Acad Sci （USA）69：2110（1972）、によって記載されたような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、またはMolecular Clonin g：A Laboratory Manual （1988）Cold Springs Harbor Pressに記載されている方法を利用することができる。Agrobacterium tumefaciens（CH.ショウら、Gene 23：315（1983））の感染はある種の植物細胞に有用であると考えられている。そのような細胞壁の無い哺乳類細胞にはグラハムおよびファンデルエブ、Virolo gy52：546（1978）、のリン酸カルシウム沈澱法を利用することができる。細胞はまた、ベクターに取り込まれた遺伝子を例えば、WO 90/11734 1990年10月18日刊行の風船状カテーテルの技術を用いて血管壁内の細胞に直接導入することによって、生体内で形質転換することができる。酵母への形質転換はP.ファンソリンゲンら、Ｊ Bact 130：946（1977）およびC.L.シャオら、Proc Natl Acad Sci（USA）76：3829（1979）の方法に従って行うことができる。 cDNAおよびゲノムライブラリーはコロニーハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニングすることができる。一般的にマイクロタイタープレートは、それぞれニトロセルロースフィルター紙（S&S BA-85型）上に複製することができ、コロニーは50μg/ml Ampを含むＬ寒天上で、37℃で14-16時間増殖させることができる。コロニーは溶菌させ、DNAは500mM NaOH，1.5M NaClで5分間の処理に続いて、5×標準クエン酸塩（SSC）での5分間、二回の洗浄によってフィルターに固定する。フィルターは空気乾燥し、80℃で２時間ベーキングする。複製フィルターはフィルター当たり10mlのDNAハイブリダイゼーションバッファー［5×SSC ，pH7.0 ５×デンハルト溶液（ポリビニルピロリジンにフィコールおよびウシ血清アルブミン；１×=それぞれ0.02%ずつ、を加えたもの）、50mM、pH7.0のリン酸ナトリウムバッファー、0.02% SDS、20μg/ml ポリＵ、および50μg/ml変性サケ精子DNA］で42℃で6-8時間プレハイブリダイゼーションする。試料は希望の強度に依存した条件でリン酸化プローブとハイブリダイゼーションすることができる。代表的な最適強度条件は、フィルター当たりプローブを含むDNAハイブリダイゼーションバッファー1-5mlで42℃で24-36時間のものが用いられる。より激しい強度には高い温度とより短い時間が用いられる。一般的には、フィルターは2×SSC、0.2% SDSおよび50mMリン酸ナトリウム，pH7、で37℃で３０分間ずつ４回洗浄し、それから2×SSCおよび0.2% SDSで２回洗浄して空気乾燥した後、-70℃で２日から３日オートラジオグラムをとる。希望のコード配列および制御配列を含む適当なベクターの構築には当分野でよく理解されている標準的なライゲーションおよび制限化法が用いられる。単離されたプラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドは希望の形に分断され、調整され（tailored）、再連結される。部位特異的なDNAの切断は、当分野で一般的に理解されている条件で適当な制限酵素（または酵素）によってDNAを処理することで行ない、その詳細はこれらの商業的に入手可能な制限酵素の製造業者によって特定されている。例えばNew England Biolabs，製品カタログを参照のこと。一般的には1μgのプラスミドまたはDNA配列を、およそ20μlのバッファー溶液中で１ユニットの酵素で切断する。変法も許容されるが、約37℃で１時間から２時間のインキュベーション時間で実行可能である。それぞれのインキュベーション後、タンパク質をフェノール/ クロロホルム抽出とそれに続くエーテル抽出によって取り除き、セファデックス G-5スピンカラムを通した後に、核酸をエタノール沈澱により水相画分から回収する。望むならば、切断断片のサイズによる分離には、標準的な技法を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルの電気泳動が利用できる。サイズ分離の一般的な記載はMethods in Enzymology（1980）65：499-560にされている。制限切断した断片は、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）の存在下、20℃から25℃で、50mMトリスpH7.6，50mM NaCl，6mM MgCl₂，6mM DTT，および5-10μM dNTPsで約15から25分、E.coliのDNAポリメラーゼＩの大断片（クレノウ）で処理することによって末端平滑化することができる。クレノウフラグメントは５’粘着末端は埋めるが、４種のdNTPsが存在しても突出した３’一本鎖末端を後進する。望むならば、粘着末端の性質で限定した、一つだけまたは選択したdNTPsだけを加えて選択的な修復を行うことが可能である。クレノウで処理した後、混合物はフェノール/クロロホルムと、セファデックスG-50スピンカラムにかけた後のエタノール沈澱によって抽出する。S1ヌクレアーゼを適当な条件で用いて処理すると、一本鎖部分がすべて加水分解される。合成オリゴヌクレオチドはメトイッキら、J Am Chem Soc 103：3185(1981)のトリエステル法、または商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて調製できる。アニーリングに先だったまたは標識のための一本鎖のリン酸化は、過剰量のポリヌクレオチドキナーゼ、例えば50mM トリス，pH7.6，10mM MgC l₂，5mMジチオスレイトール，1-2mM ATP，1.7pmoles γ32P-ATP(2.9mCi/mmole) ，0.1mM スペルミジン，0.1mM EDTA存在下で、0.1nmoleの基質に対して約10ユニット、を用いて行うことができる。ライゲーションは次のような標準的な条件および温度のもとで、15-30μlの容量で行うことができる：20mM Tris-Cl pH7.5，10mM MgCl₂，10mM DTT，33μg/m ｌ GSA，10mM-50mM NaCl，および40μM ATP，0.01-0.02(Weiss)ユニットのT4 DN Aリガーゼ，0℃（”粘着末端”のライゲーションのため）、または1mM ATP 0.3- 0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼ，14℃（平滑末端のライゲーションのため）のどちらか一方。分子内の”粘着末端”のライゲーションは、通常33-100μg/ mlの全DNA濃度（5-100mM全末端濃度）で行われる。分子内の平滑末端のライゲーションは（通常10-30倍を超えるモル数のリンカーを使う）、1μMの全末端濃度で行われる。 ”ベクター断片”を使ったベクターの構築では、５’のリン酸基を除いてベクターの結合を防ぐために、ベクター断片はバクテリアのアルカリ性フォスファターゼ（BAP）で処理できる。BAPによる消化はpH8で、およそ150mM トリス中、Na⁺ およびMg²⁺の存在下でベクター１μg当たり約１ユニットのBAPを用いて、60℃で約１時間反応する。核酸断片を回収するためには、調製試料をフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱し、セファデックスG-50スピンカラムにかけて脱塩する。あるいは不必要な断片を切断する余分な制限酵素で二重に消化することによってベクター内の結合を防ぐことができる。配列の修飾を必要とするcDNAまたはゲノムDNAから生じたベクターの一部分には、部位特異的プライマーによる変異導入が利用できる。これは、望んだ変異を示す定められたミスマッチ以外は、変異導入する一本鎖ファージDNAに相補的であるプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。簡潔には、合成オリゴヌクレオチドはファージに相補的な鎖の直接の合成のためのプライマーとして用い、生じた二本鎖DNAはファージを保持できる宿主バクテリアに形質転換する。形質転換したバクテリアの培養液はファージをもつ一つの細胞に由来してプラークができるよう、トップアガーにまく。理論上、新しいプラークの50%は一本鎖として変異型をもつファージを、残りの50%は元の配列をもつファージを含むと思われる。生じたプラークは、正確な対合はするが、なおかつ、元の配列との不的確な対合は十分防ぐ温度で、リン酸化された合成オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションすることができる。それからプローブにハイブリダイゼーションするプラークをひろって、培養し、 DNAを回収する。プラスミドの構築への正しい連結は、最初にライゲーション混合物で適当な宿主を形質転換することによって確認できる。正しく形質転換された宿主は、アンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質への耐性、または当分野で理解されているように、プラスミドの構築様式に依存した他のマーカーを用いて選別する。それから形質転換体由来のプラスミドはD.B.クレウェルら、Proc Natl Acad Sci（USA）62：1159(1969)の方法、所望により行われるクロラムフェニコールの増幅（D.B.クレウェル、J．Bacteriol 110：6670(1972)）に従って調製できる。単離したDNAは制限化によって解析し、および/またはF.サンガーら、Proc Natl Acad Sci（USA）74：5463(1977)、さらにメッシングら、F.Supp．Nucleic Acids Res 9：309(1981)によって記載されたようなジデオキシ法、または、マキサムら、Methods in Enzymology 65：499(1980)の方法によって配列を決定できる。この発明によって、オリゴデンドログリアを有効な量のオリゴデンドログリア増殖因子に接触させるという、オリゴデンドログリアの分化の誘導法が提供される。オリゴデンドログリアに体細胞分裂を誘導するのには、ｎｇ程度の量のオリゴデンドログリア増殖因子で十分であることが分かった。本発明の他の側面において、脱ミエリン症患者に効果的な量のオリゴデンドログリア増殖因子を投与することを含む、脱ミエリン症患者の治療方法が提供される。当業者は本明細書の開示から、脱ミエリン症の治療に効果的な投薬方法についてよくわかるであろう。例えば、投薬は血管内に、経口的に、直腸から、などといった様々な投与形式で行われる。治療は望まれる治療結果が得られるまで続けられる。当業者は投薬方法、投与量、および間隔が、患者の年齢、体重、および体調に強く依存するということを認識するであろう。オリゴデンドログリア増殖因子は、効果的な量のオリゴデンドログリア増殖因子および通常無害な運搬体を含む薬剤組成物に処方してもよく、そのような運搬体は当業者に知られている。組成物はその形態に適した投与法で与えられる。例えばそのような組成物は、溶液、懸濁液、乳状液、並びに、経口的に、静脈注射で、皮下注射で若しくは筋肉注射で投与できるようなものを含む、通常は液体調製品の形態である。さらに、脱ミエリン症の治療では、細胞内でゲノムからのオリゴデンドログリア増殖因子の発現が誘導される。オリゴデンドログリア増殖因子の発現のために選んだ例として、オリゴデンドログリア増殖因子のcDNAまたはゲノム配列の一部を含むDNAで、in vitroまたはin vivoで形質転換される。in vitroで形質転換した細胞は、例えば細胞移植を行うように、当業者に精通した方法で哺乳類に導入できる。in vivoでの形質転換は以前に記載された組換え体ベクターの導入によって成される。WO 90/117341990年10月18日公開。次に述べる実例は例証とはなるが、本発明の限定を意図するものではない。実施例実施例１細胞培養出生後６日目のスプラグ−ドーレイラットの脳梁および周囲の白質から大脳白質（ＣＷＭ）培養物を樹立し、上記に記載したように無血清培地中で維持した。グリンスパンＪ.Ｂ.,ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１９９０、１０、１８６６１−１８８７３。培養を開始した最初の４日間、細胞をオリゴデンドログリア増殖因子で処理した。培地（さらにオリゴデンドログリア増殖因子を添加したものまたはしないもの）は、３日または４日の間隔で置き換えた。いくつかの実験では（本文および図に示した）、ヒト血小板由来ＰＤＧＦ（大部分はＡＢヘテロダイマー；ボーエン−ホープＤ.Ｆ.,らＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９８９，２６４，２５０２−２５０８；を週に二回（biweekly）、１％の血小板の少ないヒト血漿とともに２ｎｇ／ｍＬ加えた；グリンスパンＪ.Ｂ.,らＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１９９０，１０，１８６６１−１８８７３。他の実験では、ヒトの組換え酸性またはアルカリ性ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステム）１０ｎｇ／ｍＬを４８時間間隔で加えた。新生ラットの座骨神経のシュワン細胞または背側神経節根（dorsal root ganglia）の単一層培養は、ウッドＰ．Ｍ．およびウイリアムスＡ．Ｋ．，ＤｅｖＢｒａｉｎＲｅｓ１９８４，１２，２２５−２４１；およびクレイダーＢ．Ｑ.,ら．，ＢｒａｉｎＲｅｓ１９８１，２０７，４３３−４４４中に既に記載されたように樹立された。実施例２間接蛍光抗体顕微鏡観察糖脂質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）［Ａ２Ｂ５（神経の細胞質抗原）アイゼンバース、ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７９，７６，４９１３−４９１７；抗ＧＤ３抗体（ゴールドマンＪ．Ｅ．，ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１９８６，６，５２−６０；０１抗ガラクトセレブロシド（オリゴデンドログリア表面）；ゾマーＪ．およびシャチュナーＭ．，ＤｅｖＢｉｏｌ１９８０．８３，３１１−３２７；並びにＲ−ｍＡｂ（ガラクトセルブロシド）；ランシットＢ．，ら．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９８２，７９，２７０９−２７１３；バンサルＲ．，ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ１９８９，２４，５４８−５５７，あるいはミエリン関連糖タンパク質の細胞外領域に対して作成したウサギ抗血清；ペドラザＬ．，ら．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１９９０，１１１，２６５１−２７５１；を、１：１００に希釈して使用し、ジェームズサルダー博士、ＮＹＵ医療センターの好意によりいただいた］を、４℃（Ａ２Ｂ５，０１，Ｒ−ｍＡＢ）または２５℃（抗ＭＡＧ）で２５分間固定していない培養液に添加した。ハンクスの緩衝塩溶液で洗浄し、適切な蛍光、ローダミンまたはテキサスレッドが結合した二次抗血清（ノルヂック、オルガノンテクニカ、またはジャクソンＬａｂｓから得た）とともにインキュベートした後、細胞を酸−アルコール（９５％エタノール、５％酢酸、ｖ／ｖ）で−２０℃１０分間固定した。抗ＭＢＰｍＡｂ；ヒッケイ、ら．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈeｍ．Ｃｙｔｏｃｈeｍ.，１９８３，３１，１１２６−１１３５；をアセトン固定の後に加え、抗ＧＦＡＢ（ゲル活性化グリア繊維タンパク質）ｍＡｂ；リーＶＭ−Ｙ、ら．，ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ１９８４，４２，２５−３２；は酸−アルコール固定の後に加えた。様々な抗体に結合した細胞の数は、カバーガラス表面上の１ｍｍ²に相当する６３倍油侵した視野を２１個調べることによって決定した。視野はランダムに選択し、蛍光照射下で走査する前にフェーズコントラスト下で適切な濃度であることを判断した。細胞分裂指数は、酸−アルコール中で固定する前に少なくても４または２４時間チミジンアナログである、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１０μＭ）とともに培養液をインキュベートすることによって見積もった。抗ＢｒｄＵ（アマシャム）を使用した間接蛍光抗体顕微鏡観察を、核内にＢｒｄＵを取り込んだ表現型を示す細胞の数を決定するのに使用した。グリンスピンＪ．Ｂ．，ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１９９０，１０，１８６６１−１８８７３。実施例３ノーザンブロッティングＭＢＰ，ＰＬＰ，またはＭＡＧをコードするｍＲＮＡの定常状態の量を、ノーザンブロッティングによりオリゴデンドログリア増殖因子、ＰＤＧＦ，またはアルカリ性ＦＧＦを添加してまたはしないで維持したＣＷＭ培養液中において調べた。サンブルークＪ，フリスチＥＦ，マニアチスＴＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ。第２版コールドスプリングハーバー出版、１９８９。この目的の為に、チョムジンスキーおよびサッシ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.，１９８７，１６２，１５６−１５９の方法によってＣＷＭ培養から全ＲＮＡを単離し、アガロースホルムアルデヒドゲル上での電気泳動によって分離し、デュラロンメンブレン（ストラタジーン）にトランスファーした。プレハイブリダイゼーションは４２℃で２時間、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（１×＝０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１Ｍリン酸塩および１ｍＭＥＤＴＡ）、１％ＳＤＳ，５×デンハルト溶液（１×＝０．０２％ファイコール、０．０２％ポリビニルピロリジン、０．０２％ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬ変性したサケ精子ＤＮＡ）中で行った。ラットＭＢＰまたはラットＰＬＰｃＤＮＡ全長；デフェラＦ．，ら．，Ｃｅｌｌ１９８５、４３，７２１−７２７；グリンスパンＪ.，ら．，ＪＮｅｕｒｏｃｙｔｏｌ印刷中（１９９２）；カムホルズＪ.，ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉｒｅｓ１９９２、３１、２３１−２４４；またはラットＭＡＧｃＤＮＡ（Ｊ．サルザー博士、ＮＹＵ医学センターより贈呈）によるハイブリダイゼーションは、同様のバッファーで２４時間行った。ブロットは２×ＳＳＣにて室温で１回、２×ＳＳＣにて６５ ℃で１回、および０．２×ＳＳＣにて６５℃で１回洗浄し、コダックＸＡＲ５フィルムに−７０℃で感光させた。実施例４オリゴデンドログリア増殖因子の精製出生後３日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脳全体を、０．２５Ｍスクロース、０．１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．６３ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、および１０ｍＭトリス（ｐＨ７．０）を含む溶液（”懸濁用バッファー”）中で４℃でホモジェナイズした。ホモジェネートを２０００×ｇで１０分、４℃にて遠心した。１３０，０００×ｇの沈澱物から再懸濁によって可溶抽出物を調製し、０．５ＭＮａＣｌ懸濁用バッファー中で６０分４℃にてインキュベーションし、その後１３０，０００×ｇで６０分間４℃にて遠心した。上清をリン酸で緩衝化した１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０（ＰＢＳ）にて４℃ で一晩透析し；ラトナーＮ．，ら．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９８８，８５，６９９２−６９９６；それからＰＢＳであらかじめ平衡化した１０分の１量のＤＥＡＥセファデックス（ファルマシア）とともに一晩撹拌した。懸濁液を遠心した。上清をＳ−２００セファクリルカラム（ファルマシア）に載せ、画分をＰＢＳで溶出した。オリゴデンドログリア増殖因子活性を含む画分を得て、脱イオン水で４℃にて１６時間透析し、親液性にして−８０℃ にて保存した。これらの画分中のペプチドを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し；ラミリ、Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ１９７０，２２７，６８０−６８５；および銀染色で可視化した。ある実験では、ポンソース染色および密度測定をペプチドバンド中のタンパク質量を見積もるのに使用した。オリゴデンドログリア増殖因子を含む染色していないＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンの部分を、移動の方向に対して垂直に切り出し、２５℃で２回各々１０分ずつハムのＦ−１２培地で洗浄し、それから０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むハムのＦ−１２培地で４℃にて一晩振ることによって断片からタンパク質を抽出した。残存したＳＤＳはエクストラチゲル（Pierce）の小さいカラムを通過させることによって上清から除去した。タンパク質をこれらのカラムからハムのＦ−１２培地にて溶出し、−８０℃にて保存した。ラットＣＷＭ培養液中のオリゴデンドログリアの蓄積は、実施例５に記載したように０．５ＭＮａＣｌ膜抽出物由来のオリゴデンドログリア増殖因子の精製過程をモニターするために使用した。生物活性のあるオリゴデンドログリア増殖因子は、ｐＨ７．４で０．１５ＭＮａＣｌではＤＥＡＥセファデックスに結合せず、分子量５０−７０ｋＤ（球状タンパク質として）に相当する画分中にＳ −２００セファクリルカラムより溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後の銀染色は、Ｓ−２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子の調製物は、いくつかのより薄いバンドとともに、還元下で見かけの分子量がおよそ６０ｋＤの主要なタンパク質バンドを含むことを示した（図４）。オリゴデンドログリア増殖因子活性は、６０ｋＤａｌバンドを含むゲル断片を溶出する事によって効率よく回収された。ＣＷＭ培養液中でＲ−ｍＡｂ⁺および０１⁺オリゴデンドログリアの半最大蓄積は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後のオリゴデンドログリア増殖因子タンパク質２ｎｇ／ｍＬの濃度にて得られた。オリゴデンドログリア増殖因子の生物活性は、ゲルの他の部分からの溶出液中には検出されなかった。全精製工程によって、最初のラット脳膜のＮａＣｌ抽出物中に対してオリゴデンドログリア増殖因子の比活性は４,０００倍に増加し、収率は６７％であった。結果を表１にまとめた。実施例５オリゴデンドログリア増殖因子の生物活性ＰＤＧＦまたはＦＧＦを添加していない定められた培地に維持されたＣＷＭ培養液中の表面０１⁺またはＲ−ｍＡｂ⁺のオリゴデンドログリアの増加が最大値の半分になるタンパク質濃度を決定するために、精製の各々の段階に置ける服量− 反応曲線を作成することによってオリゴデンドログリア増殖因子活性を測定した。ｇａｌＣに結合する０１ｍＡｂ，並びにｇａｌＣおよびスルフォリピッドの両方に結合するＲ−ｍＡｂに対する結果は、；バンサルＲ，ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ１９８９，２４，５４８−５５７；区別がつかなかった。活性１ユニットは、オリゴデンドログリア増殖因子がｍｍ²あたりさらに１０個のオリゴデンドログリアを生産する量として定義した。オリゴデンドログリア増殖因子に対する最大反応は、精製の各々の段階に置ける未処理のバックグラウンドレベルの約８倍であった。様々な抗体を、オリゴデンドログリア増殖因子活性の効果を決定するために培地に添加した。ウサギ抗ヒトＰＤＧＦ（コラボレートリサーチ、５０μｇ／ｍＬ）を、オリゴデンドログリア増殖因子とともに剌激するように添加した。ウサギ抗塩基性ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ，６０μｇ／ｍＬ）を、オリゴデンドログリア増殖因子を加える９０分前に添加し、ウサギ抗酸性ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ，５０μｇ／ｍＬ）を、オリゴデンドログリア増殖因子を加える３０分前に添加した。抗オリゴデンドログリア増殖因子ｍＡｂ，Ｄｕ（下記参照）はハイブリドーマ上清として使用した（１：１００、ｖ／ｖ）。実施例６オリゴデンドログリア増殖因子のモノクローナル抗体Ｓ２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子で１８日間に渡ってマウスを免疫し；ブロードスキーＦ.Ｍ.，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１９８５，１０１，２０４７−２０５４；アライら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ.，１９９０，８７，２２４９−２２５３に記載されたようにハイブリドーマを調製した。クローンを単離し、その上清を、Ｓ２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子を標的抗原として、抗オリゴデンドログリア増殖因子への結合をＥＬＩＳＡによって試験した；リーＶＭ−Ｙら．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.，ＵＳＡ１９８８，８５，１９９８−２００２。６つのＥＬＩＳＡ陽性クローンのうち２つ（ＴｄおよびＤｕ）は、オリゴデンドログリア増殖因子によって誘導されるＣＷＭ培養液中のｇａｌＣ⁺細胞の蓄積を阻害した．Ｄｕとのペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）免疫細胞化学を、組織切片および背側神経細胞根（ＤＲＧ）培養中でのオリゴデンドログリア増殖因子の免疫反応性を位置づけるのに使用した。ヒト脳から調製した組織院を、等張アルコールで固定し、６μｍパラフィン切片に切断した。Ｐ６ラットＤＲＧ培養は、酸アルコールで固定し、２％仔ウシ血清（ｖ／ｖ）および０．１Ｍトリス、ｐＨ７．０中の０．２５％（ｗ／ｖ）冷水魚のゼラチン（cold water fish gelatin）で３０分ブロッキングして、それからオリゴデンドログリア増殖因子ｍＡｂとともにインキュベートした。それからパラフィン断片およびＤＲＧカバーガラスについて、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ免疫細胞化学分析を行った。カーデン（１９８７）。実施例７ＣＮＳ膜０．５ＭＮＡＣＬ抽出物の予備的特徴付けオリゴデンドログリア増殖因子活性は、実施例５に記載したように測定した。ＮａＣｌ抽出物を、０日目および３日目に２０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。オリゴデンドログリアの数は、０１ｍＡｂまたはＲ−ｍＡｂに結合する細胞を数えることによって決定した。０−２Ａ細胞の数は、Ａ２Ｂ５ｍＡｂには結合するが、０１ｍＡｂまたはＲ−ｍＡｂ細胞には結合しない細胞の数を数えて決定した。０１ｍＡｂおよびＲ−ｍＡｂの結果は、見分けが付かなかった。抗ＧＦＡＰによる平行した実験では、未処理および処理した培養液の両方においてｍｍ²あたり２型星状細胞が１個より少なかったことが示された。結果は、標準誤差を含む、４回の独立した実験の平均である。粗な新生ラットＣＮＳ膜由来の０ .５ＭＮａＣｌ抽出物による処理によって、新生ラットＣＷＭ培養液中のオリゴデンドログリアから生じた細胞の数が増加し（図１および表２）、またそのような細胞のＢｒｄＵ核ラベル指数が一時的に増加した（図２および３）。ラットＣＷＭ培養液中の１型星状細胞、ミクログリア、および内皮細胞の数および分裂指数は、０.５ＭＮａＣｌ抽出物で処理することによって変化しなかった（データは示さない）。ＮａＣｌ抽出物で仲介されるＣＷＭ培養液中のオリゴデンドログリアの増加は、塩基性ＦＧＦ，酸性ＦＧＦ，またはヒトＰＤＧＦの働きを中和する抗血清によって阻害されなかった（データは示さない）。０.５ＭＮａＣｌ抽出物およびヒトＰＤＧＦによって誘導されるＣＷＭ培養液中のオリゴデンドログリアの数の増加は、相加的である（表３）。脳膜のＮａＣｌ抽出物（２０μｇ／ｍＬ）およびヒトＰＤＧＦ（２ｎｇ／ｍＬ）を、０日および３日目に添加した。各々の結果は、４回の独立な実験±標準誤差の平均である。０.５ＭＮａＣｌ抽出物のオリゴデンドログリアに対する増加活性は、透析膜を通過せず、トリプシンまたは１００℃で５分処理しても不活化されなかった（データは示さない）。Ａ２Ｂ５および抗ＧＦＡＰによる２重にラベルをした間接的な免疫蛍光実験；グリンスパンＪ．Ｂ.，ら．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ.，１９９０，１０，１８６６１−１８８７３；は、１個より少ない数の２型星状細胞／ｍｍ²が；ラフＭ．Ｃ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ１９８３，３０３，３９０ −３９６；未処理および０．５ＭＮａＣｌ抽出物で処理したＣＷＭ培養液の両方に存在したことを示した（データは示さない）。実施例９０−２Ａオリゴデンドログリアの子孫およびオリゴデンドログリアによるオリゴデンドログリア増殖因子によって刺激されたＤＮＡ合成の検出最大の反応を引き出すのに十分な量のＳ２００セファクリルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後のオリゴデンドログリア増殖因子でＣＷＭ培養液を処理し、ＢｒｄＵで１日パルスして１日後に観察した結果、Ａ２Ｂ５⁺オリゴデンドログリアの子孫およびＲ−ｍＡｂ⁺オリゴデンドログリアの両方においてＢｒｄＵラベル指数が４から５倍増加した。オリゴデンドログリア増殖因子は、ＢｒｄＵパルスの間にオリゴデンドログリアに分化する急速に増殖している０−２Ａ細胞の数を多くすることによってオリゴデンドログリアのＢｒｄＵラベル指数を増加させるよりも；フレシナウドＣ. ，ら．，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏl １９９２、１５０、３４−４４、むしろ少なくともＲ−ｍＡｂ⁺分化段階に到達したオリゴデンドログリア系列の細胞に対して直接分裂効果を発揮することを立証するために、２つの実験を考案した。第一の実験は、ＢｒｄＵパルスの時間を２４時間から４時間に減少し、それによってＢｒｄＵでラベルされた０−２Ａ細胞がオリゴデンドログリアに成熟するのに利用できる時間を制限した。ＢｒｄＵでラベルされたＲ−ｍＡｂ⁺細胞の数はこの実験で５分の１に減少したが、Ｒ−ｍＡｂ⁺細胞のＢｒｄＵラベル指数は、コントロールの培養液に比べてオリゴデンドログリア増殖因子で処理したものでは４倍増加した。第２の実験は、０−２Ａ細胞群を増加させるためにＰＤＧＦ（２ｎｇ／ｍＬ）で３日間処理した培養液を使用し；グリンスパンＪ．Ｂ．，ら．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．１９９０，１０，１８６６１−１８８７３；それからＰＤＧＦなしで５日間培養し、その期間に０−２Ａ細胞はオリゴデンドログリアへと成熟した。この時、これらの培養液は０−２Ａ細胞／ｍｍ²は１個より少なかった。オリゴデンドログリアが豊富で０−２Ａ細胞が少ないこれらの培養液を、Ｓ２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子２００ｎｇ／ｍｌで処理すると、Ｒ−ｍＡｂ⁺細胞のＢｒｄＵラベル指数にたいして刺激が５倍になった（オリゴデンドログリア増殖因子を添加してから１日後に開始して、１日パルスした、ｎ＝３）。このような２つの実験の結果は、オリゴデンドログリア増殖因子がＲ−ｍＡｂ⁺オリゴデンドログリアに直接的な細胞分裂誘導効果を発揮することを示唆した。オリゴデンドログリア増殖因子がシュワン細胞または神経繊維内鞘繊維に対しても細胞分裂誘導因子となるかを決定するために、坐骨神経培養を既に記載されたように調製し；クレイダーＢ．Ｑ．，ら．，ＢｒａｉｎＲｅｓ１９８１，２０７，４３３−４４４；および血清を含むまたは含まない培地中で維持した。粗０.５ＭＮａＣｌ抽出物（５０μｇ／ｍＬ）またはＳ２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子（１μｇ／ｍＬ）を、培地中に添加し、２日後にＢｒｄＵで１日間パルスした。血清のない培地中では、粗０.５ＭＮａＣｌ抽出物は、シュワン細胞のＢｒｄＵ核ラベル指数を４倍（ｎ＝５）増加させた。しかし、Ｓ２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子は、血清の無い培地中または血清を含む培地中に置いてＢｒｄＵでラベルされたシュワン細胞または神経繊維内鞘繊維の割合を増加させなかった（データは示さない）。実施例１０オリゴデンドログリア増殖因子によって増加したオリゴデンドログリアはＭＡＧを発現するが、ミエリン基質タンパク質（ＭＢＰ）またはプロテオリピド（ＰＬＰ）の合成または発現は行わないオリゴデンドログリア増殖因子で３日間またはそれ以上処理したＣＷＭ培養液中のＲ−ｍＡｂ⁺オリゴデンドログリアの約３分の１は自身の細胞膜に、抗ＭＡＧ免疫グロブリンを結合した（図５）。ノーザンブロット解析により、オリゴデンドログリア増殖因子で処理した培養物ではＭＡＧ遺伝子が発現していることが確証された（データは示さない）。１０日間ヒトＰＤＧＦ２ｎｇ／ｍＬで処理したＣＷＭ培養液中のＲ−ｍＡｂ⁺ 細胞の４６％（ｎ＝３）は、ＭＢＰ⁺であったが、１０日間オリゴデンドログリア増殖因子で処理したＣＷＭ培養液中のＲ−ｍＡｂ⁺細胞の４％（ｎ＝３）のみがＭＢＰ⁺であり（図６）、この数はさらに１０日間観察しても増加しなかった。オリゴデンドログリア増殖因子で処理したＣＷＭ培養液中の定常状態のＭＢＰおよびＰＬＰｍＲＮＡのレベルを、平行して行ったＰＤＧＦまたは塩基性ＦＧＦで処理した培養液中のものとノーザンブロット解析を用いて比較した。ＰＤＧＦで処理した培養液中のオリゴデンドログリアの数が多く、塩基性ＦＧＦで処理した培養液中には実際に見られないことから予測されるように、ＭＢＰおよびＰＬＰｍＲＮＡの発現はＰＤＧＦで処理した培養物中では強いが、ＦＧＦで処理した培養物中ではほとんど検出されなかった（図７）。オリゴデンドログリア増殖因子で処理した培養液中では、オリゴデンドログリアに特徴的なガラクト脂質を発現する細胞は豊富にあるが、ＭＢＰおよびＰＬＰｍＲＮＡレベルは非常に低かった（図７）。これは、オリゴデンドログリア増殖因子で処理したＣＷＭ培養液中のオリゴデンドログリアにおけるＭＢＰ発現が低いレベルにあることに、翻訳前の機構が少なくとも部分的に関与していることを示している。オリゴデンドログリア増殖因子がＰＤＧＦで処理した培養液中のオリゴデンドログリアによるミエリン構造タンパク質の発現を抑圧するかを決定するために、ＣＷＭ培養液をオリゴデンドログリア増殖因子およびＰＤＧＦで１０日間刺激するように処理した。間接免疫蛍光顕微鏡観察により、ＰＤＧＦのみで処理した培養液と同様に、これらの培養液中のＲ−ｍＡｂ⁺細胞の約半分（４９％、ｎ＝３）がＭＢＰ⁺でもあった。前の観察から、ミエリン脂質およびミエリン構造タンパク質の合成はオリゴデンドログリアの分化に深く関与していることが示唆された。このように、塩基性ＦＧＦを含む培地中で維持された培養物において、オリゴデンドログリア系列にある細胞はミエリンガラクトスフィンゴ脂質（ｇａｌＣおよびサルファチド）およびＭＢＰおよびＰＬＰをコードするｍＲＮＡの両方を発現できない一方、塩基性ＦＧＦを添加しないで維持している培地中では、ｇａｌＣの発現と同時にＭＢＰおよびＰＬＰをコードするｍＲＮＡが出現し、ＭＢＰおよびＰＬＰの免疫反応はその後数日で行うことができるようになる。クナップＰ．Ｅ．、ら．，ＤｅｖＢｉｏｌ１９８７，１２０，３５６−３６５；ガードＡ．Ｌ．およびプフェイファーＳ．Ｅ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１９８９，１１９−１３２；コラリニ，ら．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１９９２，１１６，１９３−２００；グリンスパンＪ．，ら．，ＪＮｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．印刷中（１９９２）。しかし、これらの示唆とは反対に、オリゴデンドログリア増殖因子で処理した培養液中において、ミエリン脂質およびミエリン構造タンパク質合成の共役は見られないようであり；Ｒ−ｍＡｂ⁺および０１⁺細胞は蓄積するが、ＭＡＧを発現するものはあるがＭＢＰおよびＰＬＰは発現しない。よく考えると、新たなオリゴデンドログリアのＰＬＰおよびＭＢＰの発現をオリゴデンドログリア増殖因子が誘導しないということは、小さなミエリンの中の脂質二重膜間の相互作用の安定化に大きく関わっているタンパク質が；キルシュナーＤ．Ａ．およびブラウロックＡ．Ｅ．，ミエリン：生物学および化学（マルテンソンＲＥ、編集）、ｐｐ３− ８０．ボクラートン：ＣＲＣ印刷（１９９２）にある；これらオリゴデンドログリアによるアクソンの最初の包み込みを促進するためであろう。実施例１１オリゴデンドログリア増殖因子に対するモノクローナル抗体を用いた研究は、オリゴデンドログリア増殖因子は神経によって発現されることを示す６つのＥＬＩＳＡ陽性のオリゴデンドログリア増殖因子ｍＡｂのうち２つ（” Ｄｕ”および”Ｔｅ”）は、ＣＷＭ培養液中のオリゴデンドログリア増殖因子によるＡ２Ｂ５⁺およびＲ−ｍＡｂ⁺細胞の増加を阻害した。この２つの各々に関して、Ｓ２００セファクリルを通した後のオリゴデンドログリア増殖因子２００ｎｇ／ｍＬの最大生物活性の半分の阻害は、１：５００に希釈した（ｖ／ｖ）ハイブリドーマ上清から得られた（データは示さない）。ＤｕおよびＴｅはＰＤＧＦまたは塩基性ＦＧＦ処理によって誘導されるオリゴデンドログリア系列細胞の増加を阻害しない（データは示さない）。免疫ペルオキシダーゼ実験により、Ｄｕはヒト脳のパラフィン切片中のペリカルヤおよびペリカルヤ細胞の軸索、並びに新生ラットの背側神経根（dorsal roo t ganglia）の酸アルコール固定培地中の多くの神経に結合することが示された（図８）。ラットＤＲＧ培養中の繊維芽細胞若しくはシュワン細胞、またはラットＣＷＭ培養中のいかなる細胞種に対してもＤｕの結合は検出されなかった（データは示さない）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ 21/08 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニアアメリカ合衆国ペンシルバニア州19104― 3147，フィラデルフィア，マーケット・ストリート 3700，スウィート 300，センター・フォー・テクノロジー・トランスファー (72)発明者クレイダー，バーバラ・キューアメリカ合衆国ニュージャージー州08054, マウント・ローレル，フォックス・ラン・ドライブ２ (72)発明者プレジャー，デービッドアメリカ合衆国ペンシルバニア州19096, ウィニーウッド，ケント・ロード 258 (72)発明者リー，ヴァージニア・エム−ワイアメリカ合衆国ペンシルバニア州19147, フィラデルフィア，フィフス・ストリート，サウス 776

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類の脳全体の０．５Ｍ塩抽出物を調製し；ｐＨ７.４で０.１５ＭＮａＣｌにおいて、抽出物をイオン交換基質とインキュベートし；５ｋＤａから６００ｋＤａの画分範囲を有するサイズ排除カラム上へ結合していない上清を添加し；画分を溶出し；オリゴデンドログリア増殖因子活性のある画分を集め；そして変性ゲルで活性画分中のタンパク質を分離することからなる、オリゴデンドログリア増殖因子を単離するための方法。２．請求項１に記載の方法に従って単離したオリゴデンドログリア増殖因子。３．哺乳類の脳全体の０．５Ｍ塩抽出物を調製し；ｐＨ７.４で０．１５ＭＮａＣｌにおいて、抽出物をイオン交換基質とインキュベートし；５ｋＤａから６００ｋＤａの画分範囲を有するサイズ排除カラム上へ結合していない上清を添加し；画分を溶出し；オリゴデンドログリア増殖因子活性のある画分を集め；変性ゲルで活性画分中のタンパク質を分離し；ゲルから分子量約６０ｋＤａのタンパク質を回収し；そして隣接したオリゴデンドログリアの細胞分裂を誘導するために有効な量の回収したタンパク質をオリゴデンドログリアに接触させることからなる、オリゴデンドログリアの細胞分裂を誘導するための方法。４．哺乳類の脳全体の０．５Ｍ塩抽出物を調製し；ｐＨ７.４で０．１５ＭＮａＣｌにおいて、抽出物をイオン交換基質とインキュベートし；５ｋＤａから６００ｋＤａの画分範囲を有するサイズ排除カラム上へ結合していない上清を添加し；画分を溶出し；オリゴデンドログリア増殖因子活性のある画分を集め；変性ゲルで活性画分中のタンパク質を分離し；ゲルから分子量のタンパク質を回収し；そして脱ミエリン症患者のオリゴデンドログリアの細胞分裂を誘導するのに有効な量の回収したタンパク質を脱ミエリン症に苦しむ患者に投与することからなる脱ミエリン症に苦しむ患者のミエリン脱落症の治療方法。５．脱ミエリン脱落症が多発性硬化症である、請求項４に記載の方法。６．約４００ユニット／μｇのオリゴデンドログリア増殖活性を示し、分子量がおよそ６０ｋＤのタンパク質を含む、実質的に純粋なオリゴデンドログリア増殖因子。７．請求項６に記載のオリゴデンドログリア増殖因子をコードする配列を持つオリゴヌクレオチド。８．オリゴデンドログリア増殖因子タンパク質および薬剤的に受容可能なキャリヤーを含む治療用組成物。９．宿主細胞によるオリゴデンドログリア増殖因子の発現が十分可能なオリゴデンドログリア増殖因子をコードするＤＮＡ部分で形質転換した組換え宿主細胞。１０．請求項９に記載した組換え発現ベクターから生産されるオリゴデンドログリア増殖因子。１１．組換え宿主細胞を培養することを含むオリゴデンドログリア増殖因子の生産方法であって、上述の宿主細胞に形質転換された組換えＤＮＡが、オリゴデンドログリア増殖因子をコードするＤＮＡ配列を有し、形質転換細胞中での当該コード配列の発現を促すことが可能な適切な制御コントロール配列に実施可能につながれているものである、上記生産方法。１２．適切な発現システム中で発現可能な組換えベクターであって、当該発現システムに適合するコントロール配列に実施可能につないだオリゴデンドログリア増殖因子をコードするＤＮＡ配列を含む、上記組換えベクター。１３．オリゴデンドログリア増殖因子を特異的に認識するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系。１４．請求項１３に記載のハイブリドーマ細胞系から生産されたモノクローナル抗体。１５．オリゴデンドログリアを有効量のオリゴデンドログリア増殖因子と接触させることを含む、オリゴデンドログリアの細胞分裂を誘導する方法。１６．約１０μｇ／ｍＬから約２ｎｇ／ｍＬのオリゴデンドログリア増殖因子をオリゴデンドログリアに接触させる、請求項１５に記載の方法。１７．中枢神経系のオリゴデンドログリアの細胞分裂を誘導するのに有効な量のオリゴデンドログリア増殖因子を脱ミエリン症に苦しむ患者に投与することを含む、脱ミエリン症の治療方法。１８．脱ミエリン症が多発性硬化症である、請求項１７に記載の方法。