JPH08508397A

JPH08508397A - 新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ‐ベータ

Info

Publication number: JPH08508397A
Application number: JP6518364A
Authority: JP
Inventors: シュレシンガー，ジョセフ
Original assignee: ニューヨークユニバーシティー
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1996-09-10
Also published as: EP0684989A4; US5604094A; EP0684989A1; US5925536A; WO1994018308A1; CA2155545A1; AU6174294A

Abstract

(57)【要約】新規なレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼーβ（ＲＰＴＰβ）タンパク質または糖タンパク質、これをコードするＤＮＡを開示する。このタンパク質は脳および神経細胞系で天然に発現する。ＲＰＴＰβタンパク質または糖タンパク質は組換え法で生産できる。該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の定量法、ならびに該タンパク質と結合してそのホスファターゼ酵素活性を阻害または剌激することのできる医薬などの化合物のスクリーニング法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ-ベータ本発明は１９９０年７月１１日出願で現在放棄されている米国特許出願第０７／５５１，２７０号の一部継続出願である１９９１年２月２６日出願の米国特許出願第０７／６５４，１８８号の一部継続出願である。上記２つの特許出願の全内容を参照としてここに包含する。１．序生化学、細胞および分子生物学の分野における本発明は、ＲＰＴＰα、βおよびγと呼ばれる新規なレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼタンパク質または糖タンパク質、これをコードするＤＮＡ、該タンパク質の生産および同定法、ならびにＰＴＰアーゼ酵素活性と結合してこれを阻害または剌激することのできる化合物のスクリーニング法に関する。２．発明の背景チロシン特異的タンパク質キナーゼとしていくつかの成長因子レセプターおよびレトロウイルス癌遺伝子が同定されたことにより、チロシン残基上のタンパク質リン酸化が細胞の増殖制御に重要な役割を果たすことが示唆された。この考えは最近になって、シグナル導入に重要な役割を果たすと考えられる酵素（ホスホリパーゼＣなど）のチロシンリン酸化レベルが成長因子剌激の活性増強と相関するという観察によって支持され、チロシンリン酸化の機能的役割を確立した（Ullrich，A.，et al.，Cell 61:203-212，1990）。細胞タンパク質におけるチロシン残基のリン酸化の程度とパターンは、タンパク質−チロシンキナーゼ（ＰＴＫアーゼ；ＡＴＰ：タンパク質−チロシンＯ−ホスホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１．１１２）およびタンパク質−チロシン−ホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ；タンパク質−チロシン−ホスフェートホスホヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．３．４８）の反対の活性によって制御されている。ＰＴＫアーゼの構造特性および進化ならびに細胞増殖におけるその役割に関する総説がある（Hunter，T.，et al.，Annu．Rev．Biochem．54:897-930，1985； Ullrich，A.，etal.，前出）。２．１．ＰＴＫアーゼチロシンキナーゼはセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼと共通の先祖をもつが、これとは大きく異なる別個のファミリーをなす（Hanks，S.K．et a l.，Science 241:42-52，1988）。チロシンキナーゼの活性変化を導くメカニズムは、膜貫通トポロジーをもつレセプター型チロシンキナーゼでよく理解されている（Ullrich，A．et al.，前出）。このようなキナーゼでは、これらの酵素の細胞外ドメインへの特異的リガンドの結合がそのオリゴマー化を誘導し、チロシンキナーゼの活性を増強し、シグナル導入経路を活性化すると考えられている（ Ullrich，A．et al.，前出）。この活性の重要性は、突然変異や過発現によるキナーゼ活性の制御障害が癌遺伝子転換のメカニズムであるという知見によって支持されている（Hunter，T.，et al.，前出；Ullrich，A．，et al.，1990,前出）。２．２．ＰＴＰアーゼタンパク質ホスファターゼは少なくとも２つの別個の異なるファミリー：タンパク質セリン／スレオニンホスファターゼ、およびタンパク質チロシンホスファターゼからなる（Hunter，T．Cell，58:1013-1016，1989）。セリン／スレオニン特異的酵素とチロシン特異的酵素との間にはっきりした配列類似性が見られるタンパク質キナーゼとこの点において対照的である。ＰＴＰアーゼ分子には２種類あると思われる。第１の群は１つの保存されたホスファターゼ触媒ドメインを含む小さい可溶性酵素からなり、（１）胎盤ＰＴＰアーゼ１Ｂ（Charbonneau，H．etal.，Proc．Natl．Acad．Sci．86:5252-5256， 1989；Chernoff，J．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2735-2789，1990 ）、（２）Ｔ細胞ＰＴＰアーゼ（Cool，D.E．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． 86:5257-5261，1989）、および（３）ラット脳ＰＴＰアーゼ（Guan，K.，et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1501-1505，1990）を含む。第２の群はＲＰＴＰと呼ばれるより複雑なレセプター結合ＰＴＰアーゼからなり、高分子量であって５６−５７アミノ酸で隔てられた２つの縦列繰り返し保存ドメインを含む。ＲＰＴＰの１例としては、白血球共通抗原（ＬＣＡ）（Ralph ，S.J.，EMBO J．6:1251-1257，1987；Charbonneau，H.，et al.，Proc．Natl． Acad．Sci．USA，85:7182-7186，1988）が挙げられる。ＣＤ４５、Ｔ２００およびＬｙ−５としても知られるＬＣＡ（Thomas，M.L..，Ann．Rev．Immunol．7:33 9-369，1989に総説）は、造血細胞（後期赤血球を除く）のみで発現する１群の膜糖タンパク質からなり、これらは共通の遺伝子がタンパク質のアミノ末端を含む種々のスプライシングによって生じたものである。ＣＤ４５の正確な機能は未知であるが、この抗原が細胞毒性Ｔリンパ球とナチュラルキラー細胞の活性、ＩＬ−２レセプター発現、Ｂ細胞分化、ならびにＴリンパ球増殖を含む多くのプロセスに関与することが多くの研究により示された（Pingel，J.T．et al.，Cell 58:1055-1065，1989）。ＲＰＴＰの他の例としては、ＬＣＡ関連タンパク質、ＬＡＲ（Streuli，M.，e t al.，J．Exp．Med.，168:1523-1530，1988）、およびＬＡＲ関連ショウジョウバエタンパク質ＤＬＡＲおよびＤＰＴＰ（Streuli，M.，et al.，Proc．Natl．A cad．Sci．USA，86:8698-8702，1989）が挙げられる。Ｊｉｒｉｋらはヒト肝芽細胞腫細胞系ＨｅｐＧ２由来のｃＤＮＡライブラリーをＬＣＡの２つのＰＴＰアーゼドメインをコードするプローブでスクリーニングし（FASEB J．4:A2082，19 90，abstr．2253）、Ｈｅ−ＰＴＰと呼ばれる新規ＲＰＴＰをコードするｃＤＮＡクローンを見いだした。Ｈｅ−ＰＴＰ遺伝子は各種のヒトおよびネズミ細胞系と組織において発現するように思われる。我々はＰＴＰアーゼの構造と多様性について理解し始めてはいるが、その細胞機能については未だ未知のことが多い。小さい可溶性ＰＴＰアーゼ酵素は“ハウスキーピング”機能をもつことが示唆されてきた（Tonks，N.K.，et al.，Bioch emistry，27:8695-8701，1988）。一方、ＲＰＴＰは細胞膜に位置して細胞外リガンドによる制御を受ける可能性のためにより限定された活性をもつことが期待される。Ｔ細胞におけるＬＣＡ（ＣＤ４５）の役割に関して、ＬＣＡの発現が不十分なＴ細胞クローンは、特定抗原またはＣＤ３の架橋によって剌激されたときに増殖できないことが見いだされた（Pingel，J.T.，et al.，前出）。ＰＴＰアーゼ架橋はヒトＴ細胞におけるＴ細胞レセプターＣＤ３媒介性活性を阻害する（Kiener，P.A．et al.，J．Immunol．143:23-28，1989）。ＬＣＡのＰＴＰアーゼ活性はリンパ球特異的ＰＴＫアーゼであるｐｐ５６^lckの活性化に関与する（Mustelin，T.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6302-6306 ，1989；Ostergaard，H.L.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:8959-89 63，1989）。これらの著者は、ＬＣＡのホスファターゼ活性がＣ末端チロシン残基の脱リン酸化によってｐｐ５６^lckを活性化し、これが次いでＴ細胞活性化に関与するとの仮説を提唱した。人工基質に対する酵素活性にＬＣＡ中の４つの保存システイン（ホスファターゼドメイン１個当たり２つ）のうちのどれが必要なのかを決定するために、部位特異的突然変異誘発を用いることにより、Ｓｔｒｅｕｌｉら（1989、前出）はＬＣＡの１つのシステイン残基（ＬＣＡホスファターゼドメイン１の残基１７７）のみが活性に必須であることを見いだし、最初のホスファターゼドメインのみが酵素活性をもつらしいと示唆した。しかしながら、第２のドメインが異なる基質を脱リン酸化する可能性を排除することはできなかった。さらに最近になって、Ｓｔｒｅｕｌｉら（EMBO J.，9:2399-2407，1990）はＬＣＡ（およびＬＡＲ）の第２の保存ドメインは検出しうるホスファターゼ活性を欠いているが、該ドメイン内の配列が基質特異性に影響しうることを決定した。ホスホチロシン代謝をよりよく理解し、制御するためには、キナーゼ活性の役割のみでなく、ホスファターゼ酵素の作用も理解しなければならない。細胞性ホスホチロシンの上昇はチロシンキナーゼ自体の活性化を伴わないメカニズムによって起こるのかも知れない。例えば、チロシンキナーゼ自体ではなく、ｖ−ｃｒｋ癌遺伝子の発現がよく理解されていないメカニズムによってチロシン残基のリン酸化を誘導する（Mayer，B.J．et al.，Nature 332:272-275，1988）。このような結果は突然変異または細胞性ホスファターゼ活性の一般的低下、特に細胞性チロシンホスフェートの通常は高い代謝回転速度の低下によるものである可能性がある（Sefteon，B.M．et al.，Cell 20:807-816，1980）。チロシンホスファターゼ阻害剤が細胞を“可逆的にトランスフォーム”できることが示されたことによって後者の可能性が示唆される（Klarlund，J.K.，Cell 41:707-717，1985 ）。したがって、ＰＴＰアーゼは劣性癌遺伝子と見なすことができる。チロシンの脱リン酸化がそれ自体重要な制御メカニズムとして機能しうることが明らかとなりつつある。Ｃ末端チロシン残基の脱リン酸化はｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼにおけるチロシンキナーゼ活性を剌激する（Hunter，T.，Ce ll 49:1-4，1987）。チロシン脱リン酸化がＭＰＦ（成熟促進因子）キナーゼの分裂活性化に必須のステップであることが示唆されてきた（Morla，A.O．et al. ，Cell 58:193-203，1989）。最後に、下等真核生物の突然変異分析により、細胞生理学におけるセリンホスファターゼの決定的役割が確認された（Cyert，M.S ．et al.，Cell 5 7:891-893，1989）。これらの観察はチロシンホスファターゼ活性を制御するメカニズムの理解を深める必要性を指摘する。細胞増殖、分化および発癌のメカニズムを十分理解するために、これらの膜レセプターの構造と機能の相関をさらに分析する必要のあることは明瞭である。３．発明の概略本発明者は、抗癌遺伝子の可能性としての、また膜貫通シグナリングの新しく発見されたメカニズムにおける作動体としての、細胞制御メカニズムにおけるＲＰＴＰの役割を考え、このようなプロセスに関与すると思われる個々のＲＰＴＰ遺伝子およびタンパク質を研究し、ここに膜貫通トポロジーを有するＲＰＴＰファミリーメンバーの１つである新規ＲＰＴＰβの同定を記載する。このＲＰＴＰファミリーメンバーの細胞外ドメインは従来報告されている他のいずれのＲＰＴＰとも無関係である。レセプターチロシンキナーゼとある程度類似する新規ＲＰＴＰβは、細胞外部分に結合する細胞外リガンドによって直接制御される。したがって本発明は、ヒトレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ− β（ＲＰＴＰβ）タンパク質または糖タンパク質分子、ヒトＲＰＴＰβまたは他の哺乳動物種におけるヒトＲＰＴＰβの相同体の機能的誘導体を提供する。ＲＰＴＰβ分子が天然由来のものである場合には、それが生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない。ＲＰＴＰβは天然では哺乳動物の脳で発現し、発生学的かつ解剖学的に制御されている。本発明のＲＰＴＰβ分子は天然由来でなくともよく、化学的方法または組換え法で製造できる。したがって、本発明の実質的に純粋なＲＰＴＰβタンパク質または糖タンパク質は天然由来のタンパク質または糖タンパク質の生物学的精製によって製造することができるし、あるいはＲＰＴＰβは原核または真核宿主中で組換え法によって製造できる。特に、本発明は図１および２に示すヒトＲＰＴＰβのアミノ酸配列番号１を有するＲＰＴＰβ、またはその機能的誘導体に関する。本発明はさらに，好ましくはヒト由来のＲＰＴＰβをコードし、あるいはその機能的誘導体をコードするヌクレオチド配列から実質的になる核酸分子、好ましくはＤＮＡに関する。核酸分子は好ましくは配列番号２（図１参照）からなる。ＤＮＡ分子は好ましくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。本発明はさらに、発現ベクターの形における該ＤＮＡ分子、ならびに該ＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクションされた原核および真核宿主に関する。また、本発明はＲＰＴＰβタンパク質または糖タンパク質、あるいはその機能的誘導体の製造法を含み、該方法は、（ａ）タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を培養条件下で発現することができる宿主を培養し；（ｂ）タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を発現させ；そして（ｃ）培養物からタンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を回収する、ことからなる。本発明は、ＲＰＴＰβタンパク質または糖タンパク質に特異的なポリクローナル、モノクローナルまたはキメラの抗体に関する。本発明はまた、被験者中における正常または突然変異ＲＰＴＰβをコードする核酸の存在を検出する方法に関し、該方法は、（ａ）被験者からの細胞またはその抽出物を、正常または突然変異ＲＰＴＰβの少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下に接触させ；そして（ｂ）細胞中の核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを測定し、これによって核酸の存在を検出する、ことからなる。アッセイ前にポリメラーゼチェインリアクションによってＤＮＡを選択的に増幅することができる。本発明はさらに、１または複数の細胞中のＲＰＴＰβの存在を検出し、あるいはこれを定量する方法に関し、該方法は、（ａ）細胞またはその抽出物をＲＰＴＰβのエピトープに特異的な抗体と接触させ；そして（ｂ）細胞またはその抽出物への抗体の結合を検出し、あるいは結合抗体を定量し、これによってＲＰＴＰβの存在を検出し、あるいはこれを定量する、ことからなる。本発明はまた、化学的または生物学的調製物からＲＰＴＰβと結合しうる化合物を同定および単離する方法に関し、該方法は、（ａ）ＲＰＴＰβまたはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させ；（ｂ）化学的または生物学的調製物を固相マトリックスと接触させて化合物を結合させ、次いで未結合物質を洗い流し；（ｃ）固相に結合した化合物の存在を検出し；そして単離を目的とするときは（ｄ）結合化合物を溶出して化合物を単離する、ことからなる。最後に、本発明はＲＰＴＰβのホスファターゼ酵素活性を剌激または阻害することのできる薬剤を同定する方法を含み、該方法は、（ａ）純粋形、膜調製物、または全生細胞または固定細胞の形のＲＰＴＰβと薬剤とを接触させ；（ｂ）工程（ａ）の混合物を十分な時間インキュベートし；（ｃ）ＲＰＴＰβの酵素活性を測定し；（ｄ）該酵素活性を薬剤なしでインキュベートしたＲＰＴＰβの酵素活性と比較し、これによって薬剤が活性を刺激または阻害するかを決定する、ことからなる。４．図面の説明図１は、ヒトＲＰＴＰβのヌクレオチド配列（配列番号２）および予想されるアミノ酸配列（配列番号１）を示す。図２は、ＲＰＴＰβのアミノ酸配列を示す。疎水性シグナルペプチドと推定されるものは下線で示し、膜貫通ペプチドを太字で示す。２１個のＮ−グリコシル化の可能性のある部位を黒矢印で示す。ＣＡＨ関連ドメインおよび２つのホスファターゼドメインＤＩおよびＤＩＩを箱で囲んで示す。白矢印は変種ＲＰＴＰβ クローンにおける欠失境界を表す。図３は、ＲＰＴＰβの細胞外領域におけるＣＡＨ関連ドメインの同定を示す。図３Ａは、ＲＰＴＰβのＣＡＨ関連ドメインのアミノ酸配列を、ＲＰＴＰγおよび６つの異なるＣＡＨのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）（Ｉ−ＶＩＩ）の対応するドメインと並べて示したものである。黒で囲んだアミノ酸配列はＣＡＨの６つのイソ型すべてに同じものである。灰色線影で囲んだ配列は、ＲＰＴＰβとＲＰＴＰ γのＣＡＨ関連ドメインで同一のものである。図３Ｂは、ＲＰＴＰβ、ＲＰＴＰ γ、およびＣＡＨの６つのイソ型のＣＡＨ関連ドメインの間における類似率（保存性アミノ酸置換を考慮に入れた場合）を示す表である。図４は、ヒトＲＰＴＰβの染色体分布を示す。完全に点描した箱は左欄に示すハイブリッドが上欄に示す染色体を含むことを示し；右下部の点描は上欄に示す染色体の長腕（または長腕の一部で、この場合は点描の一部で示す）の存在を示し；左上部の点描は上欄に示す染色体の短腕（または短腕の一部）の存在を示し；白い箱は上欄に示す染色体の不在を示し；染色体７の欄を太字で囲んで点描し、この染色体の存在とＲＰＴＰβ遺伝子の存在を関連させた。ハイブリッド中のＲＰＴＰβの保持パターンを右側に示し、ここで遺伝子の存在は点描した箱に“ ＋”印で、遺伝子の不在は白い箱に“−”印で示す。図４Ｂは染色体７の模式図であり、ＲＰＴＰβが７ｑ３１−ｑ３３にマップされることを示す。正常ヒト中期染色体に対する１．８ｋｂのＲＰＴβ ｃＤＮＡの染色体インサイチュハイブリダイゼーションによって、遺伝子の７ｑへの分布が確認され、粒子ピークが図に示すように７ｑ３１．３−ｑ３２領域に集中していることが明らかとなった。右側の各点はオートラジオグラフ粒子を表す。図５は、ノーザンブロット分析による種々のヒト細胞系およびネズミ組織におけるＲＰＴＰβ ｍＲＮＡの発現を示す。図５Ａでは、種々のグリオブラストーマおよび神経芽細胞腫細胞系から単離した全細胞ＲＮＡ２０μｇ（レーン１−５）またはポリ−Ａ⁺ＲＮＡ（レーン６）１μｇを１％アガロース／２．２ＭホルムアルデヒドＲＮＡゲル上にのせて、膜貫通領域をコードする領域のちょうど５ ’側配列から開始して伸びホスファターゼドメインＩのすべての配列を含むヒト脳幹ｃＤＮＡクローンから単離したＤＮＡ断片をプローブとして用いた。図５Ｂでは、図示するネズミ組織からのポリ−Ａ⁺ＲＮＡ（１μｇ／試料）をＲＮＡゲルにのせて、ＰＣＲ増幅したネズミＤＮＡ断片ｐＢＳＭＢＤＩＩをプローブとして用いた。図５Ｃは、プローブから切り出し、³²Ｐ標識ラットアクチンプローブと再ハイブリダイゼーションした図５Ｂからのブロットを示す。図６は、Ｌａｎ５細胞で発現させた内因性ＲＰＴＰβタンパク質の同定を示すゲルパターンである。ツニカマイシンの不在（レーン１および２）または存在（レーン３）下に、ＲＰＴＰβを正常ウサギ血清（ＮＲＳ、レーン１）または［³² Ｐ］メチオニン標識Ｌａｎ５細胞溶菌物からの免疫抗ＲＰＴＰβ抗血清（αＰＴＰβ、レーン２および３）で免疫沈降した。ツニカマイシンの不在（レーン４）または存在（レーン５）下に標識した［³²Ｐ］メチオニン標識Ｌａｎ５細胞溶菌物からのＲＫ２抗体（αＥＧＦＲ、レーン４および５）でＥＧＦレセプターを免疫沈降した。図７（図６）は、ノーザンブロットを用いた変種ＲＰＴＰβの同定を示す。図７Ａは、全長ＲＰＴＰβ ｃＤＮＡでコードされるタンパク質と、タンパク質の細胞外領域にある２５７７ｂｐを同様に欠失した独立に単離した２つのｃＤＮＡクローンでコードされる推定タンパク質を比較した模式図である。欠失部位を点線で示し、欠失部位の５’および３’末端に残るアミノ酸の番号を付す。ノーザン分析に用いた２つのプローブ（プローブ１および２）の位置を示す。ＴＭ：膜貫通ペプチド；ＤＩ：ホスファターゼドメインＩ；ＤＩＩ：ホスファターゼドメインＩＩ。図７Ｂは、ノーザン分析の結果を示す。Ｌａｎ５神経芽細胞腫細胞系から単離したポリ−Ａ⁺（１μｇ）をＲＮＡホルムアルデヒドゲルで分離し、ｃＤＮＡクローンの５’末端由来の１．３ｋｂの配列を含むヒトプローブ１（Ｐ１）、および変種ｃＤＮＡクローン中で欠失した全長ｃＤＮＡクローンの一部由来の１．６ｋｂの配列を含むヒトプローブ２（Ｐ２）をプローブに用いた。図８は、発生期および成体マウス脳中におけるＲＰＴＰβの発現を示すインサイチュハイブリダイゼーション分析である。図８Ａは２０日胚（Ｅ２）マウスの縦断面であり、ＲＰＴＰβが発生期の神経系で発現していることを示す。脳室および脳室下部領域（ＶＺ）で最高レベルの発現が観察される。図８Ｂは、成体マウス脳の縦断面であり、小脳のプルキニエ細胞（ＰＫ）、歯状回（ＤＧ）、および側脳室前角の上衣下部（ＡＨ）にはっきりした発現バンドが観察される。５．発明の詳細な説明組換えＤＮＡ法を用いることにより、本発明者は新規な哺乳動物レセプター型（膜貫通）タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ；ＥＣ３．１．３．４８）を同定した。そのレセプター様の構造、ならびにこれらが１つのファミリーの一部であるらしいことから、本発明者はこれらのタンパク質をＲＰＴＰα 、ＲＰＴＰβ、ＲＰＴＰγなど（レセプタータンパク質チロシンホスファターゼ：ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−α、β、γなど）と命名した。このファミリーをここでは“ＲＰＴＰ類” （Ｒ−ＰＴＰアーゼとも呼ぶ）と呼ぶ。ヒトＲＰＴＰβは２３０７アミノ酸をもつタンパク質または糖タンパク質である。これとは対照的に、ヒトＲＰＴＰαは８０２アミノ酸、ヒトＲＰＴＰγは１４４５アミノ酸をもつ。ＲＰＴＰβは細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および縦列した２つの触媒性ホスファターゼドメインを有する細胞質部分をもつ。細胞外ドメインは、亜鉛含有酵素である炭酸脱水酵素（ＣＡＨ）と高い相同性をもつ２６６アミノ酸を含み、ＲＰＴＰβがＲＰＴＰγ（ＨＰＴＰζ）とともにＲＰＴＰのサブファミリーであることを示唆する。ＲＰＴＰβ（またはＰＴＰζ）と称する、ＲＰＴＰβをコードする遺伝子は本発明者によってヒト染色体７_q３１−_q３３にマップされ、これはＲＰＴＰγがマップされた部位（３_p１４．２−_p２１）とは異なる部位である。ヒトＲＰＴＰβのｃＤＮＡクローニング、ならびにヒトＲＰＴＰβの完全ＤＮＡおよびアミノ酸配列をここに記載する。各種細胞および組織中におけるタンパク質の天然発現を同定するためにノーザン分析を用いた。ＲＰＴＰγはラット脳の解剖学的に異なる複数の領域で発現しており、この発現は発生学的に制御されていることが見いだされた。驚くべきことに、酵素活性をもつ細胞内ドメインを含むことに加えて、ＲＰＴＰ類が属するレセプターファミリーは、チロシンキナーゼ酵素ファミリーと類似のＮ末端細胞外ドメインをもつ膜貫通タンパク質を含む（Tonks，N.K．et al.， Biochemistry 27:8695-8701，1988；Charbonneau，H．et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 85:7182-7186，1988；Streuli，M．et al.，J．Exp．Med．168:152 3-2530，1988；Streuli，M．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:8698-870 2，1989）。したがって本発明者は、細胞外環境におけるリガンドがこのＰＴＰアーゼの膜関連サブクラスの活性を制御していると結論した。本発明者はさらに、担体と結合させた１５アミノ酸からなるＲＰＴＰβの合成ペプチドでウサギを免疫することにより、ＲＰＴＰβに対するポリクローナル抗体を生産した。ＲＰＴＰβは、ＰＴＰアーゼ酵素活性を活性化または阻害することができ、これによって細胞代謝の主要経路に影響を及ぼすことのできる医薬およびその他の薬剤をスクリーニングするのに有用である。完全なＲＰＴＰβまたはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させることによりアフィニティープローブを作り出し、これはその結合活性に基づいてレセプターと相互作用する能力を用いて生物学的産物または化学薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。次いで結合物質をアフィニティープローブから精製形で溶出することができる。固相へのタンパク質およびペプチドの結合法、これらの方法に使用できる固相物質、ならびに溶出法は当業者に公知である。ＲＰＴＰβタンパク質または酵素活性をもつその誘導体を、ホスファターゼ活性を増強または阻害できる化合物の試験に使用することができる。試験すべき化合物のホスファターゼ活性を修飾する能力は、精製ＲＰＴＰβタンパク質、または酵素的に活性なその誘導体に試験化合物を添加するインビトロ系で試験することができ、酵素活性に及ぼす影響を当業者に公知の酵素学的標準法を用いて測定できる。あるいは、ＲＰＴＰβの酵素活性に及ぼす化合物の作用は、生細胞または固定細胞を用いる全細胞調製物中で、または生細胞または固定細胞由来の膜分画中で測定することができる。この方法は、タンパク質の細胞外レセプター部分を介して作用する化合物およびタンパク質の酵素部分に直接作用する化合物をスクリーニングするのに有用である。試験化合物を、大量のＲＰＴＰβを発現する細胞、またはそれに由来する膜調製物、例えばトランスフェクションしたＣＯＳまたはＮＩＨ−３Ｔ３細胞とともにインキュベートする。次に当業界で公知の方法（Ho negger，A.M．et al.，Cell 51:199-209，1987；Margolis，B．et al.，Cell 57 :1101-1107，1989）を用いて細胞性ホスホチロシンの量を測定する。結果を試験化合物不在下で得られる結果、あるいは既知のＲＰＴＰβ酵素活性剤の不在または存在下で得られる結果と比較する。このような研究において、チロシンキナーゼ活性剤の存在下に試験化合物の作用を測定することもできる。ＲＰＴＰβ酵素活性を剌激する化合物はホスホチロシン量を正味で減少させ、一方ＲＰＴＰβ酵素活性を阻害する化合物はホスホチロシン量を正味で増加させる。上皮増殖因子（ＥＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のレセプターのようにチロシンキナーゼである成長因子レセプターの場合には、チロシンリン酸化が細胞増殖や癌遺伝子トランスフォーメーションと関連する。脱リン酸化を導くＰＴＰアーゼの活性化は増殖を防止または阻害する逆制御メカニズムとして作用し、癌に対する内因性制御メカニズムとして作用するのかも知れない。したがって、このレセプター／酵素系の突然変異または制御障害は癌への感受性を促進するであろう。インスリンレセプターもチロシンキナーゼであり、インスリンレセプターをもつ細胞中におけるチロシンリン酸化が正常な生理学的機能と関連する。細胞増殖や癌の場合とは対照的に、ＲＰＴＰ活性化はインスリン効果を妨害する。正常以下のＲＰＴＰレベルまたは酵素活性は正常な逆制御メカニズムを除去する作用を及ぼす。しかし、さらに重要なことは、ＲＰＴＰβなどのＲＰＴＰの過剰活性または不適当な活性化は、細胞でのインスリンの作用を部分的または全体的に阻害し（インスリン依存性の）糖尿病に至らせることが予期されることである。したがって、糖尿病への感受性はＲＰＴＰβの制御障害と関連するのかも知れない。よって、本発明の正常または突然変異ＲＰＴＰβ遺伝子を同定する方法、あるいは細胞または組織と関連するＲＰＴＰβの量または活性を測定する方法は、癌、糖尿病、または細胞性ホスホチロシン代謝の変化と関連する他の疾患への感受性を同定する方法として用いることができる。本発明は、細胞または被験体中の正常または突然変異ＲＰＴＰβの存在またはレベルを評価する方法を提供する。個体中におけるＲＰＴＰβの不在またはより典型的にはＲＰＴＰβの低発現、あるいは突然変異ＲＰＴＰβの存在は、癌遺伝子トランスフォーメーションへの感受性および癌発生の重要な予告として用いることができる。あるいは、おそらくは負の制御に鈍感な突然変異レセプター／酵素系によるか、または体内の剌激性リガンドの過剰によるＲＰＴＰβの過剰発現は、糖尿病への感受性の重要な予告として用いることができる。ＲＰＴＰβ配列の一部（以下参照）をコードするオリゴヌクレオチドプローブを用いて、被験者の細胞中におけるＲＰＴＰβをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在を試験することができる。好ましいプローブはＲＰＴＰβの少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸残基をコードする核酸配列に対するものである。このようなプローブを用いて定性または定量アッセイを実施できる。例えば、細胞または組織調製物中におけるＲＰＴＰβ ｍＲＮＡの発現を測定するためにノーザン分析を用いる（下記のセクション８および１０参照）。個体からごく少量のＤＮＡを得た場合でも選択的増幅法を用いることにより上記方法を使用できる。精製核酸断片を増幅することのできる組換えＤＮＡ法がすでに公知である。典型的には、このような方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸断片の導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を含む。このような方法の例としては、Ｃｏｈｅｎら（米国特許第４，２３７，２２４号）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning：A Labor atory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb or，NY，1989）に開示されており、これら文献をここに参照として包含する。このような所望の核酸分子の濃度を増加することのできるインビトロの酵素的方法は“ポリメラーゼチェインリアクション”または“ＰＣＲ”と呼ばれる（Mu llis，K．et al.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．51:263-273，1986 ；Erlich，H．et al.，欧州特許第５０，４２４号；欧州特許第８４，７９６号；欧州特許第２５８，０１７号；欧州特許第２３７，３６２号；Mullis，K.，欧州特許第２０１，１８４号；Mullis，K．et al.，米国特許第４，６８３，２０２号；Erlich，H.，米国特許第４，５８２，７８８号；およびSaiki，R．et al. ，米国特許第４，６８３，１９４号）。ＰＣＲは、特定核酸配列がそれ以前に精製されていなくても、また特定試料中に１コピーしか存在しなくても、該特定配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。この方法は１本鎖または２本鎖ＤＮＡを増幅するのに使用できる。この方法の特徴は、所望の核酸分子の鋳型依存的ポリメラーゼ媒介性複製に２つのオリゴヌクレオチドプローブをプライマーとして用いることである。この方法を成功させるには、ＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチドプローブの厳密な性質が必須である。核酸分子の５’ヌクレオチド３リン酸から３’ヒドロキシ末端までを添加することによってポリメラーゼ依存的増幅が進行する。したがって、ポリメラーゼの作用は核酸分子の３’まで伸長する。これらの固有の性質をＰＣＲのオリゴヌクレオチドプローブの選択に利用する。ＰＣＲ法のプローブのオリゴヌクレオチド配列は、増幅を所望する特定核酸配列に隣接する配列と同一またはこれと相補的な配列を含むように選択する。さらに特定すると、“第１ ”プローブのオリゴヌクレオチド配列は、所望配列の３’に位置するオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできるように選択し、また“第２”プローブのオリゴヌクレオチド配列は所望領域の５’に存在する配列と同一のオリゴヌクレオチド配列を含むように選択される。どちらのプローブも３’ヒドロキシ基をもっており、核酸合成のプライマーとして使用できる。ＰＣＲ反応条件は（ａ）ハイブリダイゼーションと核酸ポリメライゼーションを行う条件、と（ｂ）２本鎖分子の変性を起こす条件とを繰り返す。反応の第１段階では、存在するすべての２本鎖分子を変性するために試料の核酸を短時間加熱し、次いで冷却する。次いで所望の核酸分子の濃度よりも大過剰濃度の“第１ ”および“第２”プローブを加える。ハイブリダイゼーションとポリメライゼーションを行う条件下で試料をインキュベートすると、増幅すべき配列の３’位で、“第１”プローブが試料の核酸分子とハイブリダイズする。もしも試料の核酸分子が最初２本鎖であるときには、増幅しようと配列と相補的な配列の３’位で、“第２”プローブが核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする。ポリメラーゼを添加すると、“第１”プローブと（もしも核酸分子が２本鎖であるならば）“第２”プローブの３’末端が伸長される。“第１”プローブの伸長は所望の核酸と同一の配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす。“第２”プローブの伸長は所望の核酸と相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす。ＰＣＲ反応では、“第１”プローブの伸長産物が必然的に“第２”プローブの配列と相補的な配列を含み、したがって“第２”プローブの伸長産物のための鋳型として作用しうるので、特定核酸配列の指数的増幅が可能である。同様に、“ 第２”プローブの伸長産物は必然的に“第１”プローブの配列と相補的な配列を含み、したがって“第１”プローブの伸長産物のための鋳型として作用しうる。よって、ポリメライゼーションと変性の繰り返しを実施することにより所望の核酸分子の濃度が幾何学的に増加する。ＰＣＲの総説はMullis，K.B.，Cold Sprin g Harbor Symp．Quant．Biol．51:263-273，1986；Saiki，R.K.，et al.，Bio/T echnology 3:1008-1012，1985;およびMullis，K.B.，et al.，Meth．Enzymol．1 55:335-350，1987に記載されている。ある態様においては、本発明は天然由来の哺乳動物ＲＰＴＰβに関する。別の態様においては、本発明は組換えの哺乳動物ＲＰＴＰβに関する。本発明の好ましい哺乳動物ＲＰＴＰβはヒト由来である。本発明は、それが生来関連するその他のタンパク質を実質的に含まない天然由来の分子を提供する。“他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない”とは、それが生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質の少なくとも９０％（重量基準で）を含まないように、そして所望する場合には少なくとも９５％を含まないようにタンパク質が精製されており、したがって実質的にこれらを含まないということを意味する。ＲＰＴＰβを含む細胞、組織または液体を該タンパク質に特異的な抗体を保持する免疫吸着カラムなどの標準的タンパク質精製法に付すことによってこれを達成できる。別のアフィニティー精製ではＰＴＰアーゼドメインと結合できる固相基質またはレセプタードメインと結合するリガンドを用いることができる。あるいは、硫酸アンモニウム沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーなどの標準法を組み合わせて精製できる。本発明のＲＰＴＰβは種々の細胞または組織源から生化学的に精製しうることが理解できよう。天然由来のＲＰＴＰβを調製するには哺乳動物の脳などの組織、特にヒト由来のものが好ましい。あるいは、ＲＰＴＰβ遺伝子は単離または合成しうるので、原核生物中または所望する場合には非哺乳動物真核生物中で、哺乳動物由来の他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まないポリペプチドを合成できる。本発明で示すように、例えばトランスフェクションされたＣＯＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３、またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞中で産生される組換えＲＰＴＰβ分子は天然のアミノ酸配列をもつタンパク質であるか、あるいはその機能的誘導体である。天然のタンパク質または糖タンパク質を組換え法で生産する場合には、それが生来関連する他のタンパク質および糖タンパク質を実質的に含まない。あるいは、固相支持体上で所望の配列をもつポリペプチドを合成し、次いで支持体から分離する方法が公知である。さらに別の態様では、本発明はＲＰＴＰβの“機能的誘導体”を提供する。“ 機能的誘導体”とはＲＰＴＰβの“断片”、“変種”、“類似体”、または“化学誘導体”を意味し、これらの用語は以下に定義する。機能的誘導体は（ａ）特定抗体への結合、（ｂ）ホスファターゼ酵素活性、または（ｃ）細胞外“レセプター”ドメインのリガンドへの結合などのＲＰＴＰβの機能の少なくとも一部を保持しており、本発明で使用しうる。ＲＰＴＰβの“断片”とは分子のすべてのサブセット、すなわちより短いペプチドをいう。ＲＰＴＰβの“変種”とは全ペプチドまたはその断片のいずれかと実質的に類似の分子をいう。変種ペプチドは当業界で公知の方法を用いて変種ペプチドの直接的化学合成により簡便に調製できる。あるいは、ペプチドのアミノ酸配列変種は合成ペプチドをコードするＤＮＡの突然変異によって調製できる。このような変種は例えばアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終構築物が所望の活性を有する限り、欠失、挿入および置換のいかなる組み合わせも最終構築物の達成に用い得る。変種ペプチドをコードするＤＮＡ中に作製される突然変異はリーディングフレームを変更してはならず、また好ましくは第２のｍＲＮＡ構造をもたらす相補的領域を作り出さないものであることは自明である（欧州特許出願公開ＥＰ７５，４４４参照のこと）。遺伝子レベルでは、これらの変種は通常ペプチド分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発（例えばAdelman et al.，DNA 2:183，1 983参照）を行い、これによって変種をコードするＤＮＡを作り出し、その後該ＤＮＡを組換え細胞培養で発現させることにより調製できる。変種は典型的には非変種ペプチドと同じ性質の生物学的活性を示す。ＲＰＴＰβの“類似体”とは全分子またはその断片のいずれかと実質的に類似の非天然分子をいう。ＲＰＴＰβの“化学誘導体”には通常ペプチドの一部ではない付加的化学部分を含む。ペプチドの共有結合修飾が本発明の範囲に含まれる。ペプチド中の標的とするアミノ酸残基と、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導化剤とを反応させることによってこのような修飾を分子中に導入できる。システイン残基は最も普通にはクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα −ハロ酢酸（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ −１，３−ジアゾールと反応させて誘導体とすることもできる。ヒスチジン残基はジエチルピロカルボネートとｐＨ５．５−７．０で反応させることによって誘導体とすることができ、この薬剤はヒスチジン側鎖に比較的特異的である。ｐ−ブロモフェナチルブロミドも有用であり、反応は好ましくはｐＨ６．０で０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施する。リシンおよびアミノ末端残基はコハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いる誘導体化はリシン残基の電荷を逆にする効果をもつ。α−アミノ含有残基の誘導体化に用いるその他の適当な試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサル；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジエン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。アルギニン残基は１または複数の慣用試薬との反応により修飾でき、これにはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む。グアニジン官能基の高いｐＫ_aのために、アルギニン残基の誘導体化はアルカリ条件下で実施することが必要である。さらに、これらの試薬はアルギニンのε−アミノ基と同様にリシンの基とも反応する。チロシン残基自体の特異的修飾、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基へのスペクトル標識の導入はよく研究されている。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンがＯ−アセチルチロシン種および３−ニトロ誘導体の作製にそれぞれ用いられる。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は１−シクロヘキシル− ３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３− （４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。グルタミンおよびアスパラギン残基は温和な酸性条件下で対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にアミド分解される。これら残基のいずれの形も本発明の範囲に包含される。タンパク質またはペプチドの水不溶性支持体マトリックスまたはその他の高分子担体への架橋には二官能性薬剤による誘導体化が有用である。通常用いられる架橋剤には例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス −Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル −３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導化剤は光の存在下に架橋を形成しうる光活性化中間体を生成する。あるいは、臭化シアン−活性化炭化水素などの反応性水不溶性マトリックスや米国特許第３，９６９，２８７号；３，６９１，０１６号；４，１９５，１２８号；４，２４７，６４２号；４，２２９，５３７号；および４，３３０４４０号に記載の反応基質をタンパク質の固定化に使用できる。その他の修飾にはプロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のＸ−アミノ基のメチル化（T.E．Creighton，Proteins：Structure and Molecule Properties，M.H．Freemem & Co.，San Francisco，pp.79-86，1983）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および時にはＣ−末端カルボキシル基のアミノ化を含む。このような誘導化部分は溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善する。あるいはこのような部分はタンパク質の好ましくない副作用を排除または軽減する。このような効果をもたらすことのできる部分については例えばRemington’s Pha rmaceutical Sciences，16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1980に開示されている。本発明はまた、ＲＰＴＰβ、好ましくはヒトＲＰＴＰβのエピトープに特異的な抗体、ならびに細胞、細胞または組織抽出物、あるいは生物学的液体中におけるＲＰＴＰβの存在を検出し、あるいはその量または濃度を測定するために該抗体を使用することに関する。 “抗体”という用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体を含む。ポリクローナル抗体は抗原で免疫感作した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。モノクローナル抗体は特異抗原に対する抗体の実質的に同種集団である。当業界で公知の方法によりｍＡｂが得られる。例えばKohler and Milstein，Nature 256:495-497，1975および米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびそのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスのいずれかである。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養できる。高力価のｍＡｂをインビボ生産することが本発明の好ましい生産法である。簡単に述べると、個々のハイブリドーマから得た細胞をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して所望のｍＡｂを高濃度で含む腹水を産生させる。当業界で公知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、イソタイプＩｇＭやＩｇＧのｍＡｂを腹水から精製できる。キメラ抗体とは、分子中の異なる部分が異なる動物種由来の分子をいい、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とをもつものである。キメラ抗体およびその生産法は当業界で公知である（Cabilly et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3273 -3277，1984；Morrison et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6851-6855，1 984；Boulianne et al.，Nature 312:643-646，1984；Neuberger et al.，Natur e 314:268-270，1985；Taniguchi et al.，欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；Morrison et al.，欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Neuberger et al.，ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Kubo et al.，欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Morrison et al.，欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Sahagan et al.，Immunol．137:1066-10 74，1986；Robinson et al.，国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Liu et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3439-3 443，1987；Sun et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:214-218，1987；Bett er et al.，Science 240:1041-1043，1988）。これらの文献は参照としてここに包含される。抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に関連する特有の抗原決定基を認識する抗体である。抗−Ｉｄ抗体は、抗−Ｉｄを調製しようとするｍＡｂで、ｍＡｂを得たのと同じ種かつ遺伝子型（例えばマウス株）の動物を免疫感作すすることによって調製できる。免疫した動物は、これらのイディオタイプ抗原決定基に対する抗体（抗−Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫抗体のイディオタイプ抗原決定基を認識し応答する。抗−Ｉｄ抗体はさらに別の動物における免疫応答を誘導していわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を産生するための“免疫源”として使用できる。抗 −抗−Ｉｄ抗体は抗−Ｉｄを誘導するもとのｍＡｂとエピトープ的に同じである。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ抗原決定基に対する抗体を用いることにより、同じ特異性の抗体を発現する他のハイブリッドクローンを同定することが可能である。したがって、ＲＰＴＰβに対するｍＡｂはＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適当な動物中で抗−Ｉｄ抗体を誘導するのに使用できる。このような免疫マウスからの脾臓細胞を用いて抗−ＩｄｍＡｂを分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを作製する。さらに、抗−ＩｄｍＡｂはスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体と結合させて別のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するのに使用できる。これらのマウスから得た血清は、ＲＰＴＰβエピトープに特異的なもとのｍＡｂの結合性をもつ抗 −抗−Ｉｄ抗体を含む。したがって、抗−ＩｄｍＡｂはそれ自体のイディオタイプエピトープ、あるいはＲＰＴＰβのエピトープなどの評価すべきエピトープと構造的に類似の“イディオトープ”をもつ。 “抗体”という用語は完全分子ならびに抗原と結合しうるＦａｂやＦ（ａｂ’ ）₂などのその断片を含む。ＦａｂやＦ（ａｂ’）₂断片は完全抗体のＦｃ断片を欠いており、循環系から迅速に浄化され、完全抗体よりも少ない非特異的組織結合性をもつ（Wahl et al.，J．Nucl．Med．24:316-325，1983）。ＦａｂやＦ（ａｂ’）₂ならびに本発明で有用な抗体の他の断片は、完全抗体分子で開示した方法を用いるＲＰＴＰβの検出および定量に使用できる。このような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片の生産に）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂断片の生産に）などの酵素を用いるタンパク質分解によって典型的には生産される。抗体がある分子と特異的に反応して該分子を抗体に結合させることができるならば、抗体は該分子と“結合しうる”という。 “エピトープ”という用語は、ある抗体によって結合され、かつ該抗体によって認識される分子の一部をいう。エピトープまたは“抗原決定基”は、通常アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、特異的三次元構造と特異的電荷をもつ。“抗原”とは、抗体によって結合されうる分子または分子の一部であって、さらに該抗原のエピトープと結合しうる抗体産生を動物に誘導できるものをいう。抗原は１または２以上のエピトープをもつ。抗体は抗原と極めて選択的に反応し、構造が異なる複数の他の抗原とは反応しないので、抗原特異的であると言われている。本発明で使用する抗体または抗体断片は、ＲＰＴＰβタンパク質を発現する細胞の存在を定量的または定性的に検出するのに使用しうる。蛍光標識抗体（下記参照）および光学顕微鏡、フローサイトメーター、または蛍光光度検出を用いる免疫蛍光法によってこれを実施できる。このような方法では、抗体は好ましくはＲＰＴＰβの細胞外エピトープに特異的である。本発明で使用する抗体（またはその断片）は、ＲＰＴＰをインサイチュ検出するために免疫蛍光または免疫電子顕微鏡で組織学的に使用できる。インサイチュ検出は組織学的試料を患者から除去し、本発明の標識抗体をこのような試料に供給することにより実施できる。好ましくは、抗体（または断片）を生物学的試料に適用または標識抗体（または断片）に重ねて供給する。このような方法を用いると、ＲＰＴＰβの存在のみでなく、試験組織中におけるその分布も決定できる。本発明を用いて、当業者は容易にインサイチュ検出の実施に種々の多様な組織学的方法（染色法など）を用いて修飾を行うことができる。ＲＰＴＰβのためのかかるアッセイは典型的には、生物学的液体、組織抽出物、リンパ球や白血球などの新たに採取した細胞、または組織培養でインキュベートした細胞のような生物学的試料を、検出しうるように標識したＲＰＴＰβに特異的な抗体の存在下にインキュベートし、当業界で公知の多数の方法によって抗体を検出することからなる。生物学的試料を固相支持体またはニトロセルロースなどの担体、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定できる他の固体支持体で処理できる。次いで支持体を適当な緩衝液で洗浄し、検出しうるように標識したＲＰＴＰβ特異抗体で処理する。次いで固相支持体を緩衝液で２度目に洗浄して未結合抗体を除去する。固相支持体上の結合標識量を慣用法で検出する。 “固相支持体”は抗原または抗体を結合しうるいかなる支持体でもよい。公知の支持体または担体にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩、およびマグネタイトを含む。本発明の目的にとっては担体の性質はいくらか可溶性であるか、あるいは不溶性である。支持体部材は結合分子が抗原または抗体と結合しうる限り実際にどのような構造形態をとってもよい。したがって、支持体の形態はビーズのような球状、試験管の内側表面のような円筒形、またはロッドの外側表面でありうる。あるいは、表面はシート、試験細片のような平面であってもよい。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。当業者には抗体または抗原結合のためのその他多くの適当な担体が公知であり、また日常の実験によりこれを確認できる。一定ロットの抗−ＲＰＴＰβ抗体の結合活性は公知の方法により決定できる。当業者であれば日常の実験により各測定のための実施可能なまた最適のアッセイ条件を決定できる。ＲＰＴＰβ特異的抗体を検出しうるように標識する方法の１つは、抗体を酵素と結合させるか、あるいは抗−ＲＰＴＰγ抗体と結合する第２抗体を酵素と結合させてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いることである。この酵素は後に適当な基質にさらすと基質と反応して、例えば分光光学的、蛍光光学的または目視手段で検出しうる化学的部分を生成する。抗体を検出しうるように標識するのに用いられる酵素には、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、イーストアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。検出は酵素の色原体基質を用いる比色法で実施できる。検出は基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準品と比較する目視比較によっても実施できる。その他の各種イムノアッセイによっても検出できる。例えば、抗体または抗体断片を放射線標識することによりラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によりＲ−ＰＴＰアーゼを検出できる（例えば、Work，T.S．et al.，Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company ，New York，1978参照：その内容をここに参照として包含する）。放射線同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーなどの手段で検出できる。抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識した抗体を適当な波長の光にあててその存在を蛍光により検出できる。最もよく用いられる蛍光標識化合物にはフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフロレスカミンがある。抗体は、¹⁵²Ｅｕやその他のランタニド種などの蛍光発射金属を用いて検出しうるように標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート剤を用いて抗体に結合できる。抗体は化学発光化合物と結合させることにより検出しうるように標識することもできる。次いで化学発光標識抗体の存在を化学反応により生じる発光の存在を検出することにより決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例としてはルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルが挙げられる。同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体を標識することもできる。生物発光とは、生物系で見いだされた化学発光の１種であり、触媒タンパク質が化学発光反応の有効性を増加する。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより決定される。標識目的用の重要な生物発光化合物はルシフェラーゼおよびエクオリンである。本発明の抗体分子は、“２部位”または“サンドイッチ”アッセイとしても知られる免疫アッセイに使用できる。典型的な免疫アッセイでは、一定量の非標識抗体（または抗体断片）を固体支持体に結合させ、一定量の検出しうるように標識された可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原、および標識抗体の間に形成される三元複合体を検出および／または定量する。典型的かつ好ましい免疫アッセイには“フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）”アッセイを含み、これは固相と結合した抗体をまず試験すべき試料と接触させて、二元の固相抗体−抗原複合体を形成することにより試料から抗原を抽出する。適当なインキュベーション期間の後、固体支持体を洗浄して未反応抗原があればこれを含む液体試料の残りを除去し、次いで未知量の標識抗体（これは“レポーター分子”として機能する）を含む溶液と接触させる。２度目のインキュベーションにより非標識抗体を介して固体支持体に結合した抗原と標識抗体との複合体を形成させた後、固体支持体を２度目に洗浄して未反応標識抗体を除去する。本発明の抗原を使用しうる別の型の“サンドイッチ”アッセイでは、いわゆる “同時”および“逆”アッセイを用いる。同時アッセイでは、固体支持体に結合した抗体と標識抗体とを試験すべき試料に同時に添加して１度インキュベーションする段階を含む。インキュベーション終了後、固体支持体を洗浄して液体試料および複合体を形成しなかった標識抗体を除去する。次いで固体支持体と結合した標識抗体の存在を慣用の“フォワード”サンドイッチアッセイと同様に測定する。 “逆”アッセイでは、液体試料に標識抗体溶液をまず添加し、次いで適当なインキュベーション期間の後に固体支持体に結合した非標識抗体を添加するという段階的添加を用いる。２度目のインキュベーションの後、慣用法で固相を洗浄して試験すべき試料残渣および未反応標識抗体溶液を除去する。固相支持体に結合した標識抗体の測定を“同時”および“フォワード”アッセイで測定したように実施する。チロシンホスファターゼ活性のための、被験者中における正常に機能するＲＰＴＰβの存在も直接酵素アッセイによって試験できる。このような生物学的測定は、正確な酵素活性を測定できる精製酵素を用いるか、あるいは膜調製物、または全細胞を用いて正味のリン酸化レベルを測定することによりインビトロで実施できる。本発明の別の態様においては、RPTPβタンパク質分子をコードする配列を含む核酸分子、好ましくはDNA、及び該DNA配列を発現する方法が提供される。当業者であれば、過度の実験をすることなく本発明の遺伝子配列とオリゴヌクレオチドを使用して、本明細書中に記載したRPTPβ分子と配列相同性を有する、ヒトあるいはその他の哺乳動物種の追加的なPTPアーゼ分子をどのようにして同定しクローン化するか理解するであろう。さらに、本発明の遺伝子構築物を操作することにより、特定のリガンド結合レセプタードメインを、RPTPβのトランスメンブラン部分及び触媒部分にグラフトすることによりキメラ分子を生じることができる。そのようなキメラ分子の非限定的な例としては、レセプターが表皮成長因子レセプター、繊維芽細胞成長因子レセプター等であるRPTPβが挙げられる。遺伝子工学的に製造されたキメラレセプターは当分野において知られている（例えば、 Riedel，H．et al.，Nature 324:628-670参照）。 RPTPβをコードする遺伝子構築物、その機能的誘導体、及び上記したもののようなキメラ分子は遺伝子治療に使用することができる。疾患を引き起こす異常あるいは機能不全RPTPβを、正常なRPTPβをコードするDNAでトランスフェクトした所望の系統の細胞（例えば造血細胞、ニューロン等）の注入により置換することができる。あるいは、もしくは追加的に、選択されたリガンド（例えばEGF）に対するレセプターを有するキメラRPTPβを含む細胞をそのような遺伝子治療に使用することもできる。本発明の組換えDNA分子は種々の手段の任意のもので製造することができ、例えばDNAもしくはRNA合成、あるいはより好ましくは組換えDNA技術を使用することにより製造できる。そのような分子を合成する技術は、例えば、Wu，R.，et al（Prog．Nucl．Acid．Res．Molec．Biol．21: 101-141（1978））により開示されている。上記した方法により組換え体分子を構築するための手順はSambrook et al.（上出）により開示されている。 RPTPβの部分を示すオリゴヌクレオチドは、そのようなタンパク質をコードする遺伝子の存在についてのスクリーニング及びRPTPβ遺伝子のクローニングに有用である。そのようなオリゴヌクレオチドの合成のための技術は、例えばWu et al.（上出）により開示されている。タンパク質分子はシアノゲンブロミド、あるいは例えばパパイン、キモトリプシン、トリプシン等のプロテアーゼによりフラグメント化することができる（Oi ke，Y.，et al.，J．Biol．Chem．257:9751-9758（1982）；Liu，C.，et al.，I nt．J．Pept．Protein Res．21:209-215（1983））。遺伝子コードは縮退しているので、特定のアミノ酸をコードするのに１より多いコドンが使用され得る（Wa tson，J.D.，In：Molecular Biology of the Gene，4th Ed.，Benjamin/Cumming s Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA（1987））。遺伝子コードを使用して１以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができ、これらのそれぞれはアミノ酸をコードできる。実際、特定のオリゴヌクレオチドが実際のXXX-コード配列を構成する可能性は、異常塩基対の関係及び特定のコドンが真核生物細胞中において（特定のアミノ酸をコードするのに）実際に使用される頻度を考慮することにより見積もることができる。そのような「コドン使用のルール」はLathe ，R.，et al.，J． Molec．Biol．183:1-12（1985）により開示されている。そのような「コドン使用のルール」を用いて、RPTPβをコードすることができる理論的に「最も可能性のある」ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドのセットが同定される。アミノ酸配列がただ１つのオリゴヌクレオチドによりコードされる場合もあるが、多くの場合アミノ酸配列は類似のオリゴヌクレオチドの任意のセットによってコードされ得る。重要なことは、このセットのメンバーの全てはペプチドフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチドを含んでおり、従ってペプチドフラグメントをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含む可能性があるが、そのセットの１つのメンバーのみが当該遺伝子のヌクレオチド配列に同一のヌクレオチド配列を含むことである。このメンバーはセット中に存在し、セットのその他のメンバーの存在下においてもDNAにハイブリダイズすることができるので、RPTPβをコードする遺伝子をクローン化するのに単一のオリゴヌクレオチドを使用する、同じ方法でオリゴヌクレオチドの分画化されていないセットを使用することができる。 RPTPβフラグメントをコードできる理論的に「最も可能性のある」配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドのセットを使用して、「最も可能性のある」配列または配列のセットにハイブリダイズすることができる相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットが同定される。そのような相補的配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして使用してRPTPβ遺伝子を同定し単離することができる（Sambrook et a l.、上出）。 RPTPβ遺伝子のフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドのセット（あるいはそのようなオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド）は、当分野において周知の方法を使用して上記のように同定され、合成される（Belagaje，R.，et al.，J．Biol．Chem．254:5765-5780（1979）；Maniatis，T.，et al.，In：Molecular Mechanism in the Control of Gene E xpression，Nierlich，D.P.，et al.，Eds.，Acad．Press，NY（1976）；Wu，R. ，et al.，Prog．Nucl．Acid Res．Molec．Biol．21:101-141（1978）；Khorana ，R.G.，Science 203:614-625（1979））。DNA合成は自動化された合成機を使用して行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブあるいはセットは、RPTPβ 遺伝子を発現することができる細胞から誘導されたDNA、あるいはより好ましくはcDNA調製物に対して当分野で周知の手段によりハイブリダイズされる。核酸ハイブリダイゼーションの技術はSambrook et al.（上出）及びHaymes，B.D.，et al．（In：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，W ashington，DC（1985））により開示されており、これらの引用文献は引用により本明細書の一部とする。上記のような技術あるいはそれらに類似のものは、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（Hsu，L.C.，et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 82:3771-3775（1985））、フィブロネクチンの遺伝子（Suzuki，S. ，etal.，EMBO J．4:2519-2524（1985））、ヒトエストロゲンレセプター遺伝子（Walter，P.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:7889-7893（1985））、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（P ennica，D.，et al.，Nature 301:214-221（1983））及びヒト分娩日胎盤アルカリホスファターゼ相補的DNA（Kam，W.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 2:（715-8719（1985））のクローニングを成功裏に可能としている。 RPTPβ遺伝子をクローニングする別の方法においては、（RPTPβを発現できる細胞からの）DNA、あるいはより好ましくはcDNAを発現ベクター中にクローン化することにより、発現ベクターのライブラリーを作製する。次にそのライブラリーを、抗RPTPβ抗体に結合するタンパク質を発現することができ、RPTPβの全体あるいは部分と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を有するメンバーについてスクリーニングする。この態様においては、DNA、あるいはより好ましくはcDNAをRPTPβタンパク質を発現できる細胞から抽出し精製する。精製されたcDNAをフラグメント化し（剪断、エンドヌクレアーゼ消化等により）、DNAまたはcDNAフラグメントのプールを生成する。このプールからのDNAまたはcDNAフラグメントを次に発現ベクター中にクローン化し、そのメンバーのそれぞれがユニークなクローン化DNAまたはcDNAフラグメントを含む発現ベクターのゲノムライブラリーを生成する。「発現ベクター」は、（適当な転写及び／または翻訳制御配列の存在により）ベクター中にクローン化されたDNA分子を発現することができ、それによりペプチドまたはタンパク質を生成できるベクターである。クローン化された配列の発現は、発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入されたときに起こる。原核生物発現ベクターを使用した場合には、適当な宿主細胞はクローン化された配列を発現できる任意の原核生物細胞である。真核生物発現ベクターを使用した場合には、適当な宿主細胞はクローン化された配列を発現できる任意の真核生物細胞である。重要なことは、真核生物DNAは介在配列を含み得、そのような配列は原核生物細胞中で正確にプロセシングされ得ないので、RPTPγを発現し得る細胞からのcDNAを使用して原核生物ゲノム発現ベクターライブラリーを生成することが好ましい。cDNAの調製方法及びゲノムライブラリーを生成するため方法は Sambrook et al.（上出）により開示されている。本発明のRPTPβまたはその機能的誘導体をコードするDNA配列は、結合のための平滑末端化あるいは付着末端化された末端、適当な末端を与えるための制限酵素消化、適当な接着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理及び適当なリガーゼによる結合を含む慣用の技術によりベクターDNAと組換えることができる。そのような操作のための技術はSambrook et al. （上出）により開示されており、当分野で周知のものである。例えばDNAのような核酸分子は、転写及び翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含み、そのような配列がポリペプチドコード配列に「作用可能なように結合されている」ときに、ポリペプチドを「発現することができる」といわれる。作用可能な結合とは、制御DNA配列及びコード配列が遺伝子発現を可能とするような形で連結されている結合である。遺伝子発現に必要とされる制御領域の正確な性質は生物によって異なるが、一般的にはプロモーター領域を含み、これは原核生物においてはプロモーター（これは RNA転写の開始の指示を出す）と、RNAに転写されたときにタンパク質合成の信号を発するDNA配列の両方を含んでいる。そのような領域は通常、転写と翻訳の開始に関連する5'-非コード配列、例えばTATAボックス、キャップ配列、CAAT配列等を含んでいる。所望の場合には、非コード領域3'からコード配列は上記の方法により得られる。この領域はその転写終結制御配列のために保持され得、例えば終結及びポリアデニル化のために保持され得る。即ち、DNAコード配列に通常隣接する3'-領域を保持することにより、転写終結シグナルを与えることができる。所望の宿主細胞中で転写終結シグナルが十分に機能的でない場合は、宿主細胞中の3'領域機能を置き換えることができる。２つのDNA配列（例えばプロモーター領域配列及びRPTPβコード配列）は、これらの２つのDNA配列の間の結合の性質が、（1）フレームシフト変異の導入を起こさず、（2）RPTPβコード配列の転写の指示を制御するプロモーターの能力を妨害しない場合に、作用可能なように結合されているといわれる。プロモーター領域は、プロモーターがコード配列の転写を行うことができるならばDNAコード配列に作用可能なように結合されている。即ち、タンパク質を発現するためには、適当な宿主により認識される転写及び翻訳シグナルが必要である。「作用可能なように結合する」ためには、２つの配列が互いに直接隣接している必要はない。プロモーターは、RNAポリメラーゼに結合し、「作用可能なように結合した」核酸コード配列の転写を促進することができる２本鎖DNA（またはRNA）分子である。本明細書で使用するように、「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼにより転写されたDN A（またはRNA）のその鎖に見られるプロモーターの配列である。「プロモーター配列相補物」は、「プロモーター配列」の相補物である配列を有する。従って、１本鎖「プロモーター配列相補物」に隣接したプライマーDNAもしくはRNA、または「プロモーター配列」の延長時に、その延長が「プロモーター配列」または「プロモーター配列相補物」に向かって進行する場合、機能的なプロモーターを含むことになる２本鎖分子が形成される。この機能的なプロモーターは、「プロモーター配列」を含む２本鎖分子のその鎖（「プロモーター配列相補物」を含む分子のその鎖ではなく）に作用可能なように結合した核酸分子の転写の指示を与える。ある種のRNAポリメラーゼはそのようなプロモーターについて高い特異性を示す。バクテリオファージT7、T3及びSP-6のRNAポリメラーゼは特によく特性化されており、高いプロモーター特異性を示す。これらのRNAポリメラーゼのそれぞれについて特異的なプロモーター配列はまたポリメラーゼに２重DNA鋳型の１つの鎖だけから転写を行うように指示を出す。鎖の選択はプロモーター配列の向きによって決定され、転写の向きを決定するものであり、これはRNAは3'ヒドロキシル末端へのヌクレオチド5'リン酸の付加によってのみ酵素的に重合されるからである。本発明のプロモーター配列は、原核生物のもの、真核生物のもの、あるいはウィルスのものであってもよい。適するプロモーターは抑制可能なものであり、あるいはより好ましくは構造的なものである。適する原核生物プロモーターの例としては、T4ポリメラーゼを認識できるプロモーター（Malik，S．et al.，J．Bio l． Chem．263:1174-1181（1984）；Rosenberg，A.H．et al.，Gene 59:191-200（19 87）；Shinedling，S．et al.，J．Molec．Biol．195:471-480（1987）；Hu，M ．et al.，Gene 42:21-30（1986））、T3、Sp6及びT7ポリメラーゼを認識するプロモーター（Chamberlin，M．et al.，Nature 228:227-231（1970）；Bailey，J .N．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）80:2814-2818（1983）；Davanloo ，P．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）81:2035-2039（1984））；バクテリオファージλのＰ_R及びＰ_Lプロモーター（The Bacteriophage Lambda，Hers hey，A.D.，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1973）；Lambda II，Hendrix，R.W.，Ed，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Ha rbor，NY（1980））；大腸菌のtrp、recA、熱ショック及びlacZプロモーター；バチラスズブチリスのα‐アミラーゼ（Ulmanen，I.，et al.，J．Bacteriol．1 62:176-182（1985））及びσ-28-特異的プロモーター（Gilman，M.Z.，et al.， Gene 32:11-20（1984））；バチラスのバクテリオファージのプロモーター（Gry czan，T.J.，In：The Molecular Biology of the Bacilli，Academic Press，In c.，NY（1982））；ストレプトマイセスプロモーター（Ward，J.M.，et al.，Mo l．Gen．Genet．203:468-478（1986））；バクテリオファージλのintプロモーター；pBR322のβ‐ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター及びpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーター等が挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick B.R．（J．Ind．Microbiol．1:277-28 2（1987））；Cenatiempo，Y．（Biochimie 68:505-516（1986））；Watson，J. D．et al．（In：Molecular Biology of the Ge ne，Fourth Edition，Benjamin Cummings，Menlo Park，CA（1987）及びGottesm an，S．（Ann．Rev．Genet．18:415-442（1984））により記載されている。好ましい真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Hamer，D.，etal.，J．Mol．Appl．Gen．1:273-288（1982））；ヘルペスウィルスのTKプロモーター（McKnight，S.，Cell 31:355-365（1982））；SV4 0初期プロモーター（Benoist，C.，et al.，Nature（London）290:304-310（198 1））及び酵母gal4遺伝子プロモーター（Johnston，S.A.，et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．（USA）79:6971-6975（1982）；Silver，P.A．et al.，Proc．Nat l．Acad．Sci．（USA）81:5951-5955（1984））等が挙げられる。上記に挙げた引用文献の全ては引用により本明細書の一部とする。強力なプロモーターが好ましい。そのような好ましいプロモーターの例は、T3 、Sp6及びT7ポリメラーゼを認識するもの、バクテリオファージλのＰ_Lプロモーター、recAプロモーター及びマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーターである。RPTPの真核生物発現に最も好ましいプロモーターは、pLSVベクター中の転写を誘導するようなSV40プロモーターである（Livneh，E.，et al.，（1986）J ．Biol．Chem．261，12490-12497）。そのようなポリメラーゼ認識部位の配列は、Watson J.D．et al．（In：Molecular Biology of the Gene，Fourth Edition ，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA（1987））により開示されている。本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明をより容易に理解することができるであろう。以下の実施例は説明のために示すものであり、特に記載しない限り本発明を限定することを意図するものではない。６．実施例：ヒトRPTPβcDNAの単離及び特性化６.１材料制限エンドヌクレアーゼ及び修飾酵素はBoehringer-MannheimまたはNew Engla nd Biolabsから購入した。Taq DNAポリメラーゼはPerkin-Elmer/Cetusからのものである。ポリメラーゼ連鎖反応において使用したλgt11フォワード及びリバースプライマー（24-マー）、並びに配列決定プライマーは、自動DNA合成機（Appl ied Biosystems，model 380A）において、メトキシまたはβ‐シアノエチルホスホルアミダイト（House，C.，et al.，J．Biol．Chem.，262:772-777（1987））を使用して合成した。λgt11ヒト脳幹cDNAライブラリーはAmerican Type Cultur e Collection（No．37432）から得た。ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用したLCA（CD45）クローンはE.H．Fischer（University of Washington，Seattle）から受領した。全ての配列決定反応は、Sequenaseキット（United States Biochemical）を使用して行った。６.２方法低いストリンジェンシーの条件下で、両方のホスファターゼ領域を含むニックトランスレーションしたLCAプローブによりλgt11ヒト幼児脳幹cDNAライブラリーをスクリーニングした後、RPTPβのコード配列の部分を含むcDNAクローンを単離した（Kaplan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:7000-7004（1990）。この遺伝子の5'末端は当初のクローンに存在しないので、当初のクローンの5'末端から生成されたDN Aフラグメントにより再スクリーニングした。ランダムプライム法（USB）を使用してプローブを³²P-dCTPで標識し、50％ホルムアミド、5XSSC、20 mMトリス-HCl pH 7.6、1Xデンハート溶液、0.1％SDS及び100 μg/mlの剪断された変性サケ精液 DNAを含むバッファー中で、42℃において中程度のストリンジェンシーの条件下にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、0.1XSSC/0. 1％SDSを含むバッファー中で50℃において20分間、ファージフィルターを３回洗浄し、その後オートラジオグラフィーのために処理した。脳幹ライブラリーを全部で３回再スクリーニングしてRPTPβの全コード配列を含むオーバーラップcDNA クローンを単離した。陽性組換え体プラーク精製ファージからのcDNAインサートを、プラスミドベクター、BlueScript（Stratagene，La Jolla，CA）中にサブクローン化し、Sequen ase Version 2.0キット（USB）を使用してジデオキシチェーンターミネーション法により配列決定を行った。６.３結果本発明者らは、先にRPTPβと指称する新規なRPTPの部分を単離した（同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第07/654,188号、1991年２月26日出願、本願はこの出願に基づいて優先権を主張している；Kaplan et al.，1990,上出）。同様なホスファターゼが別のグループにより独立してクローン化されており、 PTPζと称されている（Krueger et al.，1990，上出；Krueger et al.，1992，上出）。本明細書に開示したRPTPβとPTPζとの間の配列の相違の理由はまだ明らかでない。RPTPβの全コード配列を含む４つのオーバーラップcDNAクローンをヒト脳幹ライブラリーから単離した。推定アミノ酸配列により2307アミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかになった（図２）。RPTPβは、PTPアーゼの高分子量トランスメンブラン種に属する。該配列は、シグナルペプチド（図２で下線を付した）とそれに続く21の潜在的なN-グリコシル化部位を含む1611アミノ酸の長い細胞外ドメイン（図２において矢印で示した）を含む。疎水性トランスメンブランペプチド（図２の太字の配列）が前記タンパク質の細胞外部分を２つのタンデムに反復する保存されたホスファターゼドメイン（DI及びDIIと指称する）に結合している。このホスファターゼの１つの顕著な特徴は、タンパク質の先端のアミノ末端に位置する283アミノ酸の範囲（図２でCAHと示した）にわたるカルボニックアンヒドラーゼ（CAH）の種々のアイソフォームと共有される相同性である。RPTPβに加えて、関連するRPTP、RPTPγの細胞外ドメインはCAHと相同性を共有する（同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第07/6 54,188号、1991年２月26日出願、本願はこの出願に基づいて優先権を主張している；同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第号、1993 年５月10日出願、「新規なレセプタータイプホスホチロシンホスファターゼγ」と題する）。 RPTPβ及びRPTPγのCAH関連ドメインの整列をCAHの公知の６つのアイソフォームとともに図3Aに示す。図3Bは、保存アミノ酸置換を考慮した、RPTPβのCAH関連ドメイン、RPTPβの対応するドメイン及び６つのCAH酵素の間のパーセント類似性を示す。RPTPβのCAH関連ドメインの６つの CAHアイソフォームに対するアミノ酸配列類似性は45〜50％の範囲である。最も高い類似性（58％）はRPTPβとRPTPγのCAH関連配列の間に存在する。従って、R PTPβ及びRPTPγは、その細胞外ドメインのアミノ末端部分中のCAH関連領域の存在により特徴付けられるRPTPの新しいサブグループを代表するものである。７．実施例：ヒトRPTPβ遺伝子のクロモソーム位置決定７.１方法この実験に使用した親及び体細胞ハイブリッドの単離、増殖及び特性化はこれまでに記載されたものである（Durst et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 1070-1074（1987）；Huebner et al.，Am．J．Hum．Genet．48:726-740（1991））。特異的ヒトクロモソームまたはクロモソームの領域の存在は、特異的クロモソーム領域に割り当てられた遺伝子に対するプローブを使用してDNAハイブリダイゼーションにより確認した。図4Aは、使用したハイブリッドの殆どに保持されたクロモームまたは部分クロモソームを図で示したものである。クロモソームインサイチュハイブリダイゼーションはこれまでに記載されたように行った（Cannizzarro et al.，Cancer Res．51:3818-3820（1991））。正常男性（46XY）末梢血リンパ球からの分裂中期クロモソームを含むスライドを４℃ で７〜10日間熟成させ、リボヌクレアーゼＡ（Sigma）により37℃で１時間前処理した。クロモソームDNAは、50％ホルムアミド、2X SSC及び10％硫酸デキストラン（pH 7. 0）を含むハイブリダイゼーション混合物中で変性した。ハイブリダイゼーションは37℃で一晩行った。50％ホルムアミド及び2X SSCを３回交換し、2X SSCを５回交換して39℃でリンスした後、スライドから水を切り、風乾し、オートラジオグラフィーにかけ、pH 9.2ほう酸バッファーの１〜３部と混合したライト・ギムザ染色溶液によりバンド化した（Cannizzaro et al.，上出）。７.２結果ヒトRPTPβ遺伝子のクロモーム位置決定は、最初に、定義されたヒトクロモソームまたはクロモソーム領域を有する齧歯動物−ヒトハイブリッドのパネルを使用して行った。図4Aにまとめた齧歯動物−ヒトハイブリッドのスクリーニングからの結果は、ハイブリッド細胞におけるヒトRPTPβ遺伝子座の存在をヒトクロモソーム７と関連付けるものである。RPTPβｆ遺伝子のより正確な位置決定は、正常ヒトリンパ球の分裂中期クロモソームに対するクロモソームインサイチュハイブリダイゼーションにより行った。この方法によればRPTPβ遺伝子は7q31-33に位置するものとされ、もっとも可能性の高い位置は7q31.3-q32であり、これは図 4Bのクロモソーム略図の右に図で示した。８．実施例：RPTPα RNAの発現８.１．ヒトRPTPβに相同なマウス配列の単離保存ホスファターゼドメインII中の２つのオリゴヌクレオチドをヒトRPTPβのヌクレオチド配列に従って合成した。これらのオリゴヌクレオチドをマウス脳cDNAライブラリー（Clonetech，PaloAlto，CA）からのファージDNA とともに、Taqポリメラーゼ（Perkin-Elmer）によるPCRに使用し、相同マウスRP TPβ配列を増幅した。増幅生成物を精製し、BlueScriptプラスミドベクター（St ratagene，La Jolla，CA）中にクローン化した。上記したようなDNA配列分析により相同性を確認した。このサブクローン化フラグメントはpBSMBDIIと称する。８.２．ノーザン分析 Stratagene RNA単離キットを使用して全細胞RNAを調製した。オリゴdTセルロースクロマトグラフィー（Stratagene）を利用してポリＡ⁺RNAをさらに選択した。ノーザン分析のために、1.0％アガロース/2.2Mホルムアルデヒドゲル上でRNA を分離し、毛管作用によりNytranメンブラン（Schleicher and Schuell）に移した。0.5Mリン酸ナトリウム、pH 7.2、7％SDS、１mM EDTA、100μg/mlサケ精液DN A中で膜をプレハイブリダイズ及びハイブリダイズさせ、次に40mMリン酸ナトリウム、pH 7.2、1％SDS、１mM EDTA中、65℃で洗浄した。種々のマウス組織から単離したRNAを含むブロットについて、PBSMBSIIを鋳型として使用して、ランダムプライマー標識化反応（US Biochemicals）において³²P-標識プローブを製造した。ヒトグリア芽細胞腫及び神経芽細胞腫RNAブロットを、ヒトRPTPβcDNAクローンの種々の部分から単離した標識制限フラグメントによりプロービングした。８.３．抗体ヒトRPTPβのカルボキシ末端15アミノ酸から誘導したペプチドを合成し、標準的な手順によりキーホールリンペットヘモシアニンに結合した。２匹のウサギに接種しRPTPγに対するポリクローナル抗血清を製造した。EGFレセプターを認識するRK2抗体により抗-EGFレセプター免疫沈降を行った（Kris et al.，Cell 40: 619-625（1985））。８.４．細胞標識及び免疫沈降ヒト神経芽細胞腫細胞系、Lan５を、10％胎児ウシ血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で維持した。培養細胞を、［³⁵S］-メチオニン標識の前に10μg/mlのツニカマイシン（Sigma Chemical Co.）とともに１時間インキュベートした。処理細胞及び非処理細胞をメチオニンを含まないDMEMで２回洗浄し、メチオニンを欠き、１%の透析されたFBSを補充したDMEM中の0.15mCi/ml［³⁵ S］-メチオニン（NEN，DuPont）で４時間標識した。標識期間の間に、10μg/m lツニカマイシンを処理細胞の培地に加えた。次いで細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）により洗浄し、50mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES，pH7.5）、150mM NaCl、1.0％Triton X-100、10％グリセロール、1.5mM MgCl₂、１mMエチレングリコールビス［B--アミノエチルエーテル］-N,N,N',N'-テトラ酢酸（EGTA）、１mlあたり10μｇのロイペプチン、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、及び１mlあたり10μｇのアプロチニンを含む溶解バッファー中で可溶化した。細胞溶解物を清澄化させ、正常ウサギ血清、ウサギ抗RPTPβ抗血清またはRK2抗血清で、４℃において２時間、免疫沈降させた。免疫結合体をタンパク質A-Sepharose（Sigma Chemical Co.）により４℃において4 5分間沈降させ、RIPAバッファー（20mMトリス-HCl pH 7.6、300mM NaCl、２mM E DTA、1.0％Triton X-100、1.0％デオキシコール酸ナトリウム及び0.1％SDS）により10回洗浄した。免疫沈降物質を7.5％SDS-ポリアクリルアミドゲル上でフルオログラフィーにより分析した。８.５．結果：ヒト神経芽細胞腫細胞系、Lan５における RPTPβ発現の検出 RPTPβについて全配列をコードするクローンの全てはヒト脳幹ライブラリーから単離したので、RPTPβmRNAの発現は、異なるヒトグリア芽細胞腫細胞系及び神経芽細胞腫細胞系、Lan５において調べた（Sonnenfield et al.，J．Neurosci． Res．8:375-391（1982））。ヒトRPTPβプローブは8.8、7.5及び6.4kbの３種の主要な転写物にそれぞれハイブリダイズした（図5A）。これらの転写物はLan５神経芽細胞腫細胞系から単離されたRNAにおいてのみ検出され、28S及び18SリボソームRNAのエチジウムブロミド染色により明らかにされるように同様な量の全細胞RNAを使用したにもかかわらず、４種のグリア芽細胞腫細胞系から単離されたRNAには存在しなかった。上記３種のRPTPβ転写物の性質をさらに観察するため、RPTPβの細胞外ドメイン中の非保存配列から誘導されたプローブによりLan５細胞から単離されたRNAについて別のノーザン分析を行った。これらのプローブを使用して、転写物の同一のパターンが明らかになった。 Lan５神経芽細胞腫細胞系を使用して、RPTPβタンパク質の内因的発現を調べた。［³⁵S］メチオニンにより４時間標識した培養物から調製した細胞溶解物を、正常ウサギ血清または抗RPTPβ抗血清で免疫沈降させた（図６）。約300kDaのみかけ分子量を有するタンパク質が抗RPTPβ抗血清により認識されたが、正常ウサギ血清によっては認識されなかった（レーン１及び２）。21の可能性のあるN- グリコシル化部位が存在するので、ツニカマイシンを使用して抗RPTPβ抗血清により免疫沈降した300kDaタンパク質がRPTPβのグリコシル化形態である可能性を調べた。［³⁵S］メチオニン標識細胞から免疫沈降したRPTPβの移動度に対するツニカマイシン処理の効果を、やはりこの細胞系において発現されるEGFレセプターのグリコシル化を阻害するその能力と比較した。非処理細胞溶解物及びツニカマイシンで処理した細胞から調製した溶解物を、EGFレセプターの170kDaグリコシル化形態と135kDa非グリコシル化形態とを認識する抗EGFレセプター抗体（R K２）により免疫沈降させた（Kris et al.，上出）。これらの結果も図６に示した（レーン４及び５）。ツニカマイシンの存在下に代謝的に標識された、Lan５細胞から抗RPTPβ抗血清により免疫沈降されたタンパク質（図６、レーン３）は、250kDaのみかけ分子量で移動した。この結果は、RPTPβのアミノ酸配列から推定した254kDaの予測分子量と一致する。９．実施例：RPTPβの変異形態の同定オーバーラップヒトcDNAクローンは約8.1kbのコード及び非コード配列を集合的に含み、8.8kb長の最も大きい転写物を表しているようであった。ヒト脳幹ライブラリー及びヒト尾状葉ライブラリー（Stratagene，La Jolla ，CA）のスクリーニングにおいて、本発明者らはそれぞれがRPTPβの細胞外ドメインからの2577ヌクレオチドの同一の欠失を含む２種の独立したcDNAを単離した。このフレーム内欠失はアミノ酸754をアミノ酸1614に結合し（図２及び図7Aにおいて白抜矢印で示した）、これによりトランスメンブランドメインと２つのホスファターゼドメインを維持している。このサイズの欠失は、Lan５神経芽細胞腫細胞系により発現された8.8kbと6.4kb転写物の差異の原因となり得る（図5A）。そこで、Lan５細胞系から単離されたRNAから２つのブロットを調製した。１つのブロットを、RPTPγの完全長の形態及び欠失形態の両方とハイブリダイズするプローブ（P1）により分析した。もう１つのブロットは完全長の形態のみとハイブリダイズするプローブ（P2）により分析した。完全長のRPTPβcDNA中のプローブ１及び２の位置を図7Aに示す。図7Bに示した２つのプローブによるノーザン分析により、プローブ１は３種の別々の転写物とハイブリダイズしたが（P1）、プローブ２は7.5kb及び8.8kbの転写物のみとハイブリダイズした（P2）。この結果は、6.4kb転写物が、mRNAの別のスプライシングの結果であり得るRPTPβの欠失変異形態を表していたことを示唆している。しかし、RPTPβの高分子量形態のみが、抗RPTPβ抗体による免疫沈降及びSDS-PAGE分析の後に検出された（図６）。 Lan５細胞中のRPTPβからの溶解物中に低分子量形態を検出できない理由は明らかでない。 10．実施例：RPTPβの組織特異的発現 10.1．方法：インサイチュハイブリダイゼーション分析新鮮な凍結組織をクリオスタット上で20μmの厚さの切片に切断し、ゼラチン被覆スライド上に溶解載置した。0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH 7.4）中の４％パラホルムアルデヒド中で30分間切片を固定し、0.1Ｍリン酸ナトリウムでそれぞれ５分間３回、2X SSC中で１回10分間洗浄した。２種のプローブ、（1）ホスファターゼドメインIIに相補的な49塩基オリゴヌクレオチド、及び（2）カルボニックアンヒドラーゼ様ドメインに相補的な50塩基オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション分析において使用した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim）を使用して［（α-³⁵S］dATP（NEN，Du Pont）でオリゴヌクレオチドを標識し、Sephadex G25高速回転カラム（Boehring er Mannheim）を使用して精製した。標識プローブの比活性は５ｘ10⁸〜１ｘ10⁹c pm/μgであった。50％脱イオンホルムアミド、4XSSC、1Xデンハート、500μg/ml 変性サケ精液DNA、250μg/ml酵母tRNA及び10％硫酸デキストランを含むバッファー中でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った。標識プローブ（１ｘ10⁶cpm／切片）及び10mMジチオトレイトール（DTT）を含むハイブリダイゼーション溶液中で、45℃において12時間組織をインキュベートした。特異性についてのコントロールは、標識オリゴヌクレオチドを30倍濃度の適当な非標識オリゴヌクレオチドで希釈し、センスプローブとのハイブリダイゼーションにより、隣接する切片上で行った。ハイブリダイゼーションの後、2X SCCを２回交換して室温で１時間、1X SCCにより55℃で 30分、0.5X SSCにより55℃で30分、0.5X SSCにより室温で15分洗浄し、60％、80 ％及び100％エタノール中で脱水した。風乾した後、切片を5-10 dでX-線フィルムに露出した。 10.2．結果 10.2.1．RPTPβの組織特異的発現種々の組織RNAのノーザン分析を行い、RPTPβの組織特異的発現を調べた。この分析に使用したプローブは、PCR（上述）で増幅された、ドメインIIの135アミノ酸をコードする405ヌクレオチドを含むRPTPβのマウス相同体の部分であった。ヒトcDNAクローンの等価領域に対するヌクレオチド配列の比較に基づくと、RP TPβのドメインIIのこの領域においてマウス及びヒトクローンはヌクレオチドレベルで88％同一であった。このノーザン分析の結果（図5B）はそれぞれ8.8kb及び6.4kbの２つの主要な転写物の存在を示していた。これらの２種の転写物はLan ５RNAにおいて見られた最も大きい転写物及び最も小さい転写物とサイズにおいて同様である（図5A参照）。しかし、7.5kb転写物に対応するバンドは検出されなかった。約9.4kbの重要ではない転写物はマウス脳組織から調製したRNAにおいてときとして観察され、高度に関連するホスファターゼに対する交差反応を示すものかもしれない。 RPTPβ転写物は、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、精巣、及び胸腺においては検出されなかった。種々の組織から単離されたRNAの特質を、同じブロットのアクチンプローブとの平行したハイブリダイゼーションにより比較した（図5C ）。従って、ノーザンハイブリダイゼーション分析はRPTPβmRNAは成体マウスの脳において限定的に発現されることを示すものである。 10.2.2．脳におけるRPTPβ発現の位置決定脳におけるRPTPβの発現のより詳細な位置決定のために、成体及び胎児マウスからの脳組織においてインサイチュハイブリダイゼーションを行った。この分析の結果により、RPTPβは中枢神経系で発現されたことが確認された。20日胎児マウス（E20）においては、脳の脳室及び亜脳室領域（図8A）、及び脊髄において高いレベルの発現が見られた。成体の脳における発現のレベルはより低いものであり、小脳のプルキンエ細胞層、歯状回、及び側脳室の前角の上衣下層に位置していた（図8B）。両方のプローブ（CAH様ドメイン及び第２ホスファターゼドメインに相補的なもの）が同じ結果を与えた。30倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドの添加により、全ての領域における標識化が完全にブロックされた。さらに、センスプローブとハイブリダイズした隣接する切片においてはシグナルは観察されず、プローブが配列特異的な形でmRNAにハイブリダイズすることを示している。これらの結果は、RPTPβが神経系の特異的な領域に対して制限された組織特異性を有することを示している。 11．６〜11の項についての一般的考察本発明者は、中枢神経系において発現され、他のマウス組織において検出できないヒトRPTPをクローン化し、特性化した。アミノ酸配列分析により、RPTPβはそのN-末端において、283アミノ酸の範囲にわたって酵素CAHの種々のアイソフォームと顕著な度合いの配列相同性を有することが判った。RPTPγも、細胞外ドメインのアミノ末端近くのCAH関連配列を含むことが判明した。従って、RPTPβとRPTPγは、その細胞外ドメインのアミノ末端領域に存在するCAH関連ドメインに基づいて分類できるトランスメンブランホスファターゼの新しいサブグループのメンバーであると結論される。 CAHの既知の結晶構造に基づいたRPTPγのCAH関連ドメインの３次元モデル及びこのモデルの詳細な説明は本発明者らの研究室により別に開示されている（例えば、1993年５月10日出願された「新規なレセプタータイプホスホチロシンホスファターゼγ」と題する、同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第号を参照）。CAHの触媒活性に参加することが知られている鍵となる残基はRPTPβ（並びにRPTPγ）の両方に見られないので、これらの２つのホスファターゼのCAHドメインは古くから知られるカルボニックアンヒドラーゼ活性を有していないようである。 PTPアーゼの不十分な発現あるいは不活化は、腫瘍形成を招くかもしれないと仮定すると、PTPアーゼは腫瘍抑制剤として機能し得ることが示唆される。これは、RPTPγがヒトクロモソーム領域3p21に位置し、腎臓細胞及び肺癌において領域が欠失することが多いという本発明者の研究室からの発見（LaForgia et al. ，上出）にその裏付けが見出されるものである。ヒトRPTPβ遺伝子がヒトクロモソーム7q31.3-q32に存在していると現在報告されている位置決定は、ある種の腫瘍種、特に7qの欠失を示すものにおけるRPTPβ遺伝子の喪失あるいはそれにおける変異を研究することに重要性を与えるものである。 CD45と称されるPTPアーゼの場合、別のmRNAスプライシングが、細胞外ドメインの３つのエキソンコード配列の異なった使用の結果として、６種の異なるアイソフォームを形成することが示されている（Streuli et al.，J．Exp．Med．166 :1548-1566（1987）；Streuli et al.，EMBO J．8:787-796（1989））。RPTPα の第１の触媒ドメイン内の別のスプライシングも記載されている（Matthews et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:4444-4448（1990）。ノーザンブロット分析の結果により、マウス脳及びヒト神経芽細胞腫細胞系Lan５の両方における複数のRPTPβ転写物の存在が明らかになり、これは別な形でスプライシングされた転写物からの結果であるか、あるいは高度に関連した遺伝子からの結果であるようである。ノーザンブロット分析は8.8kb及び6.4kb転写物が脳において限定的に発現されることを示している。図５に示したノーザンブロット分析は独立して単離された２つのcDNAクローンの分析と合わせて、6.4kbの最も小さい転写物が、R PTPβの細胞外ドメインの大きな部分をコードする約2.6kbの欠失からの結果であり得ることを示唆している。特異的ニューロンプロセスの制御及び調節におけるチロシンリン酸化の重要性については集中的な研究が行われている。チロシンリン酸化は発生の間のシナプス形成時に増強され（Cudmore et al.，J．Neorochem．57:1240-1248（1991）； Girault et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2769-2773（1992）；Qu et a l.，Neuron 2:367-378（1990））、成体におけるシナプス形成性において役割を果していることがあり得ることが示されている（Girault et al.，J．N eurochem．58:518-528（1992））。さらに、NFG及びその他の神経向性因子が、レセプターに結合しチロシンキナーゼ活性により活性化することによって、ニューロン生存に対するその効果を媒介する（Cordon-Cardo et al.，Cell 66:l-20 （1991）；Kaplan et al.，Science 252:554-557（1991）；Klein et al.，Cell 65:189-197（1991）；Schlessinger，J．et al.，Neuron 9:383-391（1992）。他の成長因子レセプターのチロシンキナーゼ活性による剌激は、培養ニューロンの生存と分化に対して大きな影響を有しており（Aizenman et al.，Brain Res． 406:32-42（1987）；Morrisonet al.，Science 238:72-75（1987））、正常なニューロン発生における潜在的な役割を示唆している。さらに、癌原遺伝子c-src 及びc-yesの生成物を含むいくつかの細胞質チロシンキナーゼが成体脳のニューロンの特異的領域において高いレベルで発現される（Pang et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85:762-766 1988a；Pang et al.，Soc．Neurosci．Abstr．14 :44.6（1988）；Maness et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5001-5005（1 988）；Sudol et al.，Molec．Cell．Biol．9:4545-4549（1989））。 RPTPβは、その組織特異的発現が神経系に限定された、最初のクローン化哺乳類PTPアーゼを代表するものである。いくつかのショウジョウバエRPTPが、胚において中枢神経系軸索で選択的に発現されるものとして同定されている（Tian e t al.，Cell 67:675-685（1991）；Yanget al.，Cell 67:661-673 1991）。脳特異的PTPアーゼ、例えばRPTPβの同定は、哺乳類神経組織中でのPTP アーゼによるチロシンリン酸化の調整の理解に対する重要な最初のステップである。胎児中枢神経系CNSにおけるRPTPβの比較的高いレベル発現は、それが神経系発生において役割を果していることを示唆している。脳室及び亜脳室領域は発生中の脳において細胞分裂の主要な部位であることは重要である（Altman et al .，Exp．Neurol．107:23-35（1990））。興味深いことに、RPTPβは例えば歯状回、及び側脳室の前角の上衣下層のような有糸分裂活性を示し続ける成体脳のわずかな領域で発現される。免疫細胞化学技術を適用して、RPTPβタンパク質の正確な細胞分布が測定され、特異的な発生及びニューロンのプロセスの調整におけるその役割の解明に役立てられている。上記に詳細に説明したヒトRPTPβの保存ホスファターゼドメインの配列を下記表Ｉにおいて、RPTPα及びRPTPγと、そしてLCA、LAR及び２種の可溶性PTPアーゼ、胎盤ホスファターゼ1B及びT-細胞PTPアーゼの配列と比較する。２種の可溶性酵素は70％の配列同一性を有するが、それぞれをRPTP（上記でPDI及びPDIIとして言及したホスファターゼドメインPD1及びPD2）と比較すると、この数字は29 〜42％に落ちる。全ての場合において、可溶性PTPアーゼはRPTPのPD2よりもPD1 とより高い同一性を示した。そのPD1配列は56％同一であり、PD2配列は52％同一であることから、RPTPαはLARに最も関連していると思われる。RPTPβ及びRPTP γの保存ドメインは互いに最も関連しており、２種の可溶性PTPアーゼよりもそうであり、β及びγはPD1及びPD2の両方において75％同一である。一般に、あらゆるRPTPにおいてPD1及びPD2の間の配列の関連性は、ファミリーの異なるメンバーの間に見られるものよりも近くないように見えること、即ち、PD1及びPD2の間の同一性は高い場合のLARについての47％から低い場合のRPTPγについての29％までの範囲にあることは興味深い。 RPTPα、β及びγの細胞質ドメインは高度に保存されているが、これらのレセプターの細胞外ドメインは互いに、あるいはLAR及びLCAのものと関連していない。これは、これらのレセプターのそれぞれがその特異的なリガンドを有することを示唆している。そのようなリガンドのRPTPに対する結合は、シグナル変換に関与する標的タンパク質のチロシンリン酸化のレベルの調整において、PTKアーゼ活性を示す成長因子レセプターとともに、重要な役割を果たすと考えられる。本明細書に記載したRPTPの多様性は複数遺伝子ファミリーの存在を明らかにするものである。これらの膜レセプターにおける構造−機能の関係をより深く理解することにより、細胞増殖、分化、及び腫瘍形成に関与するメカニズムについて重要な洞察が得られるであろう。本発明者は、いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、種々のRPTPの触媒ドメインの高度な種間保存は、これらのレセプターの細胞増殖制御における重要な役割を示すものである。上記に引用した引用文献は、具体的に本明細書の一部とするとしたかどうかにかかわらず、すべて引用により本明細書の一部とする。これまで本発明を充分に説明したが、当業者によれば、本発明の概念及び範囲を逸脱することなく、また過度の実験をすることもなく、等価のパラメーター、濃度及び条件の広い範囲内で本発明を実施できることが理解されるであろう。本発明をその特異的な態様について説明したが、さらに改変できることは理解されるであろう。本願は、一般的に本発明の原理に従い、本明細書の開示から出発して本発明が属する分野において知られこれまで実施されている範囲で到達され、添付の請求の範囲に以下のように記載される本明細書中の必須の特徴に適用し得る、本発明のあらゆる変形、使用及び適合を包含することを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ 21/08 21/08 6807−4ＢＣ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｑ 1/42 9453−4Ｂ 1/68 Ａ 1/68 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ 33/573 Ａ 33/573 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｅ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＴ 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質または糖タンパク質分子、その機能的誘導体、または他の哺乳動物種におけるその相同体であって、該分子が天然由来のものである場合には、該分子が生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない上記分子。２．天然由来でない請求項１に記載の分子。３．天然由来であって、該分子が生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない請求項１に記載の分子。４．配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項１に記載の分子またはその機能的誘導体。５．請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質をコードするか、あるいはその機能的誘導体をコードする核酸分子であって、該タンパク質または機能的誘導体が天然由来のものである場合には、該核酸分子は該タンパク質または機能性誘導体が生来関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を実質的に含まない上記核酸分子。６．ｃＤＮＡ分子である請求項５に記載の核酸分子。７．ゲノムＤＮＡ分子である請求項５に記載の核酸分子。８．配列番号２のヌクレオチド配列をもつＤＮＡ分子である請求項５に記載の核酸分子。９．発現ベクターである請求項５に記載の核酸分子。１０．発現ベクターがプラスミドである請求項９に記載の核酸分子。１１．請求項１０のプラスミドで形質転換された原核宿主。１２．請求項９の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた真核宿主。１３．請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質または糖タンパク質、あるいはその機能的誘導体の製造法であって、（ａ）該タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を培養条件下で発現することができる宿主を培養し；（ｂ）該タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を発現させ；そして（ｃ）培養物から該タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を回収する、ことを含む該方法。１４．宿主が原核生物である請求項１３に記載の方法。１５．宿主が真核生物である請求項１３に記載の方法。１６．請求項１に記載のタンパク質または糖タンパク質に特異的な抗体。１７．モノクローナルである請求項１６に記載の抗体。１８．被験者中における請求項５に記載の核酸分子またはその突然変異体の存在を検出する方法であって、該方法は、（ａ）該被験者からの細胞またはその抽出物を、該正常または該突然変異レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βの少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下に接触させ；そして（ｂ）該細胞中の核酸への該プローブのハイブリダイゼーションを測定し、これによって該核酸配列の存在を検出する、ことを含む該方法。１９．工程（ａ）の前に以下の工程：（ｃ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βをコードする細胞中のＤＮＡの量を選択的に増幅する、ことをさらに含む請求項１８に記載の方法。２０．レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質または糖タンパク質の存在を細胞中で検出し、あるいはこれを定量する方法であって、（ａ）該細胞またはその抽出物を請求項１６に記載の抗体と接触させ；そして（ｂ）該細胞またはその抽出物への該抗体の結合を検出し、あるいは結合抗体を定量し、これによって該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質または糖タンパク質の存在を検出し、あるいはこれを定量する、ことを含む該方法。２１．化学的または生物学的調製物中における請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質、糖タンパク質または誘導体と結合しうる化合物を同定する方法であって、（ａ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質、糖タンパク質または誘導体またはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させ；（ｂ）該化学的または生物学的調製物を固相マトリックスと接触させて化合物を結合させ、次いで未結合物質を洗い流し；そして（ｃ）該固相に結合した該化合物の存在を検出する、ことを含む該方法。２２．請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体と結合しうる化合物を複合混合物から単離する方法であって、（ａ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βタンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体またはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させ；（ｂ）複合混合物を該固相マトリックスと接触させて該化合物を結合させ、次いで未結合物質を洗い流し；そして（ｃ）該結合化合物を溶出する、ことを含む該方法。２３．レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βの酵素活性を剌激または阻害することのできる薬剤を同定する方法であって、該方法は、（ａ）該薬剤を、純粋形、膜調製物、または全細胞の形の該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βと接触させ；（ｂ）工程（ａ）の該混合物を十分な時間インキュベートし；（ｃ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βの酵素活性を測定し；（ｄ）該酵素活性を薬剤なしでインキュベートした該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−βの酵素活性と比較し、これによって該薬剤が該活性を剌激または阻害するかを決定する、ことを含む該方法。