JPH08509125A

JPH08509125A - エンドヌクレアーゼ▲ｉｖ▼による修正及び汚染防御を伴うリガーゼ連鎖反応

Info

Publication number: JPH08509125A
Application number: JP6523449A
Authority: JP
Inventors: バツクマン，キース・シー; カリーノ，ジヨン・ジエイ; シマー，ジヨージ・エイチ; ヨーカム，ロバート・アール
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-04-19
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 1996-10-01
Anticipated expiration: 2015-08-14
Also published as: EP0695367A4; CA2160784A1; AU6634294A; US5516663A; CA2160784C; JP3076064B2; WO1994024311A1; EP0695367A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プローブを原因とする偽性の結合及びシグナルの発生が著しく減少するように少なくとも１つのプローブ末端を修飾することによってリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ^TM）の増幅スキームを改良する方法に関する。被修飾プローブと正しい標的との特異的ハイブリダイゼーションの後にだけ被修飾末端がエンドヌクレアーゼIVによって標的依存的に「修正」され、プローブが酵素的結合反応に参加し得る。特異的修飾としては、３’リン酸ブロッキング基及び結合点に非塩基性部位を含む核酸オーバーハングを含む。別の具体例としては、増幅産物を破壊して汚染の危険を減らすために増幅後にＲＮアーゼによって開裂され得るリボヌクレオチド部分を含むように修飾されたプローブを含む。

Description

【発明の詳細な説明】エンドヌクレアーゼIVによる修正及び汚染防御を伴うリガーゼ連鎖反応本出願は： −米国特許出願第０７/６３４,７７１号、出願日１９９１年１月９日、係属中、１９９０年１月３１日付け米国特許出願第０７/４７０,６７４号（放棄）の一部継続出願； −米国特許出願第０７/７２２,７９８号、出願日１９９１年６月２８日、係属中； −米国特許出願第０７/８６９,３０６号、出願日１９９２年４月１６日、係属中、１９９２年３月３１日付け米国特許出願第０７/８６０,８６１号（放棄）の一部継続出願； −米国特許出願第０７/９２５,４０２号、出願日１９９２年８月３日、係属中；及び −米国特許出願第０７/８２６,９３２号、出願日１９９２年１月２１日、係属中の一部継続出願である。上記出願のうち、最初の２つの出願は１９９１年７月３１日公開の欧州特許出願ＥＰ-Ａ-０４３９１８２の基礎出願である。上記出願の各々の記載内容全部が参照によって本明細書に含まれるものとする。背景本発明は標的核酸の増幅方法、特に、酵素触媒作用による結合の基質とならないようにプローブの少なくとも１つが結合部位で可逆的に修飾されたリガーゼ連鎖反応の増幅方法に関する。修飾の例としては、反応基の化学的ブロッキング（ blockage）、または、非塩基性部位及び１つまたは複数の核酸塩基の付加による「オーバーハング」の形成がある。被修飾末端は標的非依存性偽性シグナルの発生を阻止または防御し、後で標的依存的に修正されて増幅が可能となる。核酸に基づく診断アッセイにおいては、極めて少数の標的分子から発生するシグナルを増幅する能力がアッセイの成否を左右することがよくある。この問題の解決方法としてはシグナル増幅も１つの選択肢となり得るが、核酸に基づくアッセイでは標的増幅のほうが好ましい。標的増幅とは、標的配列として指定された核酸部分の反復的な複写または複製を意味する。標的増幅の１つのメカニズムはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ^TM）として知られている。ＬＣＲ^TMにおいては、２つの第一プローブ（１番目及び２番目、双方が同方向）と２つの第二プローブ（３番目及び４番目、双方が第一プローブに対して反対方向）とを過剰量で使用する。１番目のプローブは標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、２番目のプローブは標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズし、第１及び第２のセグメントが連続し、「上流」プローブの３’ヒドロキシル端が「下流」プローブの５’リン酸基端に隣接し、リガーゼが２つのプローブを融合結合産物として共有結合させ得る。ＬＣＲ^TMでは上流及び下流の第二プローブも同様にして使用される。３番目のプローブ（下流側の第二プローブ）は１番目のプローブ（上流側の第一プローブ）にハイブリダイズでき、４番目のプローブ（上流側の第二プローブ）は２番目のプローブ（下流側の第一プローブ）に同様の隣接形態でハイブリダイズできる。標的が最初から二重鎖であるときは勿論第二プローブも最初から標的の相補鎖にハイブリダイズできる。第一プローブの融合鎖は標的鎖からいったん分離されると、３番目及び４番目の（第二）プローブとハイブリダイズして結合し相補的な二次融合産物を形成し得る。ＬＣＲ^TM及び本文中に記載されたその改良を理解するためには、融合産物が標的またはその相補鎖に機能的に等価であると認識することが重要である。ハイブリダイゼーション及び結合の反復サイクルによって標的配列が増幅される。この技術は、ＥＰ-Ａ-３２０３０８により完全に記載されており、該特許の記載内容は参照によって本明細書に含まれるものとする。増幅反応のすぐれた効果の１つは、極めて少数の標的分子を検出する能力を有することである。しかしながら、シグナルを伴う非標的配列が増幅されると増幅プロセスの信頼性が損なわれることも予測されるので、増幅プロセスが高度に特異的であることが重要である。リガーゼ連鎖反応に関連して潜在する問題の１つは、プローブの標的非依存性結合によってバックグラウンドシグナルが生じることである。３番目のプローブは１番目のプローブにハイブリダイズし、４番目のプローブは２番目のプローブにハイブリダイズするので、過剰量で添加されたプローブは互いの二重鎖を容易に形成し得る。これらの二重鎖は標的の存在に関わりなく結合し、増幅すべき所望の標的から識別不可能でありしかも以後も増幅を継続する融合産物を形成し得る。これらの二重鎖の標的非依存性結合は比較的稀にしか生じないけれども、高度に増幅される診断用アッセイとしては、不都合な高いバックグラウンドシグナルが生じる機会が少ないとはいえない。ＥＰ-Ａ-４３９１８２（親出願ＵＳ０７／６３４,７７１に対応）は、ＬＣＲ^T ^M 中のこのバックグラウンドまたは偽性シグナルを減少させ得る複数のメカニズムを記載している。このようなメカニズムの１つとしては、標的の存在下に「修正され」て、結合成分である末端、即ち結合に必要な３’ヒドロキシル基質を有する末端、を生じる３’ブロッキング基または非塩基性部位がある。本発明は、特に修正酵素としてエンドヌクレアーゼIVを使用する場合についてこれらのメカニズムを拡張及び発展させたものである。Ｌｅｖｉｎら,“ＤＮＡ修復における金属酵素（Metalloenzymes in DNA Repai r”,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６６（３４）：２２８９３-２２８９８（１９９１）は、天然形態のエンドヌクレアーゼIVが亜鉛を含有すること、及び、（金属非含有バッファ中で精製された）不活性酵素がある種の二価カチオンの付加によって再活性化され得ることを証明した。特に、２００μＭのＣｏ²⁺及びＭｎ²⁺は、失活の方法（ＥＤＴＡまたは１,１０-フェナントロリン）次第では、酵素を再活性化するために有効であった。Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｄｅｍｐｌｅ,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３（３４）：１８００９-１８０１６（１９８８）は、近縁酵素である酵母３’ホスホグリコアルデヒドジエステラーゼの活性が３μＭ〜約３ｍＭまでの濃度のＣｏ²⁺によって増進され、この範囲を上回る濃度のカチオンは阻害性であることを示した。核酸増幅系に関連して潜在する第２の問題は、空気及び持ち越し（carryover ）による汚染の可能性である。標的配列が対数的に増殖するため、これらの分子のうちには、非試験サンプルを汚染してこのサンプルを偽陽性にするものが少なくないと予測される。このような汚染を防御する方法はいくつか開示されている。これらの方法では概して、増幅直後または次の増幅サイクル直前に増幅産物の実質的に全部を破壊する。このような汚染防御方法の１つが、本出願人所有の１９９２年４月３日付けの係属中の米国特許出願第０７／８６３,６２２号に教示されている。別の方法は、ＷａｌｄｅｒらのＥＰ-Ａ-４９６４８３に教示されている。該文献に記載された方法では、リボヌクレオチドをＰＣＲプライマーに組込み、次いで増幅産物をＲＮアーゼまたはアルカリ性加水分解によって破壊する。著者らは、彼らの方法が転写に基づく増幅とリガーゼ連鎖反応に有効であると主張しているが、ＰＣＲ以外で使用するための条件または実例は提示されていない。ＤＮＡリガーゼがリボヌクレオチド標的にハイブリダイズしたＤＮＡプローブを結合させないことは当業界で公知である。しかしながら、ＷＯ９１／１７２７０は、結合点にリボヌクレオチド残基を用いるＬＣＲの変法を記載している。これらの残基は増幅産物を破壊し汚染を防止するために後でアルカリまたは酵素によって開裂され得る。しかしながら、本発明のようなリボ-修飾されたプローブと３’ブロッキング基との併用が教示されたことはない。本発明は、エンドヌクレアーゼIV修正方法を用いてＬＣＲ^TM中の汚染を低減または除去するメカニズムを提供する。３’リン酸ブロッキング基を担う１つのリボヌクレオチドを有するＤＮＡプローブをＬＣＲ^TMに使用し得ることが知見された。このように使用されたとき、プローブは、標的非依存性結合によって生じるバックグラウンドを減少させ同時に汚染を防御するメカニズムを提供する。発明の概要本発明の第１の態様（「塩基性被修飾（basic modified）」方法）は、ＬＣＲを用いて標的核酸配列を増幅するために、（ａ）過剰量の少なくとも２セットのプローブ対を供給し、標的の存在下で上流側プローブの３’端が下流側プローブの５’端に結合して一次結合産物を形成し、第２セットのプローブが一次結合産物にハイブリダイズし且つ互いに結合して二次結合産物を形成し、（ｂ）ハイブリダイズした鎖の変性、付加されたプローブの再アニーリング及びそれらの結合を反復し、（ｃ）結合産物の形成の程度を検出する段階を含む方法において、（ａ）上流側プローブの少なくとも一方に３’端修飾を導入し、その結果として、該プローブはその下流側結合相手に結合できないようになり、該３’端修飾は実質的に被修飾プローブが標的配列にハイブリダイズするときにのみ修正可能となり、（ｂ）標的が存在するならば被修飾プローブが標的にハイブリダイズして被修飾プローブ-鋳型複合体を形成し、（ｃ）エンドヌクレアーゼIV活性の作用で修飾が標的依存的に修正されて３’ ヒドロキシル端が作成され、従って、修正されたプローブがその下流側結合相手に結合できるようになり、（ｄ）修正されたプローブがその下流側結合相手に結合して増幅産物を形成し、（ｅ）増幅産物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、修正及び結合の段階を反復して所望の標的配列を増幅する、ことを包含するよう改良された方法を提供することである。好ましくは、３’修飾がブロッキング部分を含み（「ブロッキング法」）、このブロッキング部分は例えば式：〔式中、Ｚは-Ｈ、-（ＣＨ₂）_n-ＣＨＯ（但しｎは１から約３）、-デオキシリボース及び-ジデオキシリボースから成るグループから選択される〕で示される。このブロッキング部分は単純リン酸基（Ｚ＝Ｈ）でもよい。修正用溶液は好ましくは、少なくとも約０.０５ｍＭの濃度の有効な二価のコバルトイオンまたはマンガンイオンを含む。濃度の上限が１０ｍＭ以上でもよいかもしれないが、より好ましい範囲は０.０５ｍＭ〜約２.０ｍＭ、特に約０.５ｍＭ〜約１.０ｍＭである。ブロッキング法の変法として、上記の被修飾ＬＣＲ法において、少なくとも１つのプローブが少なくとも１つのリボヌクレオチド残基好ましくは３’修飾を有する末端残基を含み、それ以外のプローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドから成る２セットのプローブ対を使用する方法がある。同様に、末端リボヌクレオチド残基の３’位にリン酸基を含むブロッキング修飾も使用し得る。従って、ブロッキング法は、検出段階後に更に、ＲＮアーゼまたはアルカリを用いて結合産物を開裂する段階を含み得る。付加的または代替的に、ブロッキング法が、増幅段階前に更に、ＲＮアーゼを用いて結合産物を開裂する段階を含んでもよい。更に別の態様によれば（「非塩基性（abasic）」法）、ブロッキング部分は、予定結合点に対して３’側に直結した非塩基性残基を有する核酸オーバーハングであってもよい。この場合、修飾は、実質的に被修飾プローブが標的または結合産物にハイブリダイズするときにのみ非塩基性部位の５’側で被修飾プローブが開裂することによって修正される。修正用溶液は同じく、少なくとも約０.０５ｍＭの濃度の有効な二価のコバルトイオンまたはマンガンイオンを含むのが好ましい。濃度の上限は１０ｍＭ以上でもよいかもしれないが、より好ましい範囲は０.０５ｍＭ〜約２.０ｍＭ、特に約０.５ｍＭ〜約１.０ｍＭである。非塩基性法の１つの変法においては、少なくとも１つのプローブが少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を好ましくは非塩基性部位に対して５’側に隣接して含むことを除いて、２セットのプローブ対がオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブから成る。従って、非塩基性法は、検出段階後に更に、ＲＮアーゼまたはアルカリを用いて結合産物を開裂する段階を含み得る。付加的または代替的に、非塩基性法が、増幅段階前に更に、ＲＮアーゼを用いて結合産物を開裂する段階を含んでもよい。上記方法のいずれにおいても、第一プローブ対の上流側プローブと第二プローブ対の下流側プローブとに付着した第１ハプテン（または他の特異的結合因子）と、第一プローブ対の下流側プローブと第二プローブ対の上流側プローブとに付着したリポーター即ち第２ハプテン（または他の特異的結合因子）とを利用して検出を行い得る。いずれの場合にも、ハプテン及びリポーターは、プローブのハイブリダイゼーション及び／または結合に有意な影響を与えない手段によってプローブに付着しなければならない。このためには、例えばプローブの「外端」に付着させてもよい。または、検出可能なラベルを含むブロッキング部分を利用して検出を行ってもよく、この検出は、被修飾プローブから遊離する検出可能なラベルをモニターすることによって行う。本発明の別の態様は、（ａ）ＬＣＲによって結合し得べく標的とハイブリダイズ可能な２対のプローブであって、プローブの少なくとも１つが修飾され、ハイブリダイズしたときにリガーゼがその基質である被修飾プローブに作用することが実質的にできない２対のプローブと、（ｂ）増幅産物を組立てるリガーゼ活性を有する第１の酵素試薬と、（ｃ）プローブ-鋳型複合体にリガーゼ試薬が作用できるように被修飾プローブを標的依存的に修正し得るエンドヌクレアーゼIV活性を有する第２の酵素試薬との組み合わせを１つまたは複数の適当な容器内に含む診断用キットを提供することである。キットは更に、（ａ）０.０５ｍＭ〜約２.０ｍＭの二価コバルトイオンを含有するバッファまたはバッファ調製手段と、（ｂ）ＲＮアーゼ試薬またはアルカリ試薬とのいずれか一方または双方を含有し得る。本発明の最後の目的は、天然発生の核酸フラグメントを実質的に含まない核酸プローブを提供することである。このプローブは、プローブの５’端及び３’端を形成するためにホスホジエステル結合によって共有結合された少なくとも３つのデオキシリボヌクレオチドを有しており、プローブが更に、３’端に１つのリボヌクレオチドを含み、リボヌクレオチドの３’位置に、式：〔式中、Ｚは-Ｈ、-（ＣＨ₂）_nＣＨＯ（但しｎは１〜約３）、-デオキシリボース及び-ジデオキシリボースからグループから選択される〕で示される基が結合している。好ましくは、Ｚが水素であり、オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０のデオキシリボヌクレオチドから成る。図面の簡単な説明図１は、従来技術の平滑端ＬＣＲ^TMの概略図である。第一プローブＡ及びＢは標的にハイブリダイズし且つ結合する。第二プローブＡ’及びＢ’は標的相補鎖にハイブリダイズするかまたは第一プローブの融合産物にハイブリダイズし且つ同様に結合する。図２は、本発明に従って改良されたＬＣＲ^TMの概略図である。上流プローブＡは、結合のために３’ヒドロキシルを要する３’端にリン酸ブロッキング基を含むように修飾されている。修正（プローブＡが標的にハイブリダイズするとエンドヌクレアーゼIVによってリン酸基が除去される）によって３’ヒドロキシルが残り、下流プローブＢとの結合が可能になる。図３は、本発明に従って改良されたＬＣＲ^TMの別の概略図である。この場合、非塩基性部位で修飾された上流プローブＡはその下流側結合相手Ｂに直接結合できないが、修正（プローブＡが標的にハイブリダイズすると非塩基性部位“ｘ” がエンドヌクレアーゼIVによって開裂される）後に３’ヒドロキシルが回復し、Ｂとの結合が可能になる。図４〜６は、実施例５及び１３〜１５から得られたデータを示すゲルである。これらに関しては実施例において詳細に後述する。詳細な説明本発明の説明では標的配列を一本鎖配列として記載した。しかしながら、標的が実際には二重鎖であるがプローブ／プライマーとのハイブリダイゼーションに先立って相補鎖から容易に分離できる場合も包含することを理解されたい。二重鎖標的の場合、第２、第３及び第４プローブも標的相補鎖にハイブリダイズすることによって初期段階に参加するであろう。一本鎖標的の場合、第二プローブは初期ハイブリダイゼーション段階に参加せず、後のハイブリダイゼーション段階に参加するであろう。標的配列はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から成ってもよくまたはリボ核酸（ＲＮＡ）から成ってもよい。「塩基」なる用語は、ＤＮＡに関してはグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を意味し、ＲＮＡに関してはグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を意味することを理解されたい。この用語はまた、上記塩基の類似体及び誘導体が天然塩基に特有の塩基対の水素結合を生じているならばそれらも包含する。代表的な塩基「類似体」は、１１１４ＯｆｆｉｃｉａｌＧａｚｅｔｔｅの４３に見出される。本発明で使用されるプローブに関しては縮重塩基イノシン（Ｉ）を使用できるであろうが、本発明のプローブの被修飾部分の内部にＩを使用することは好ましくない。個々のヌクレオチドまたは塩基は、例えばＣとＧ、ＡとＴまたはＵ、のような標準的な塩基対合となる場合には「相補的（性）」と呼ばれる。本出願において、「プライム（’）」記号は相補的な塩基または配列を示すために使用されている。１つのオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ハイブリダイズした領域に実質的に相補的な塩基対合が得られるならば、前者のオリゴヌクレオチドは後者のオリゴヌクレオチドに「相補的」である。従ってプローブＡがＡ’と共端（coterminal）でない場合であってもプローブＡはＡ’に相補的であり得る。ＢとＢ’との関係についても同様である。この定義の結果として、「相補的」オリゴヌクレオチド配列は、アッセイ条件下にハイブリダイズできるという条件付きでハイブリダイズ可能領域にミスマッチ塩基対を有する配列を包含する。本発明の重要な特徴は、結合可能な平滑端二重鎖を形成し得る相補的プローブ対を使用する代わりに、１方のプローブ対の少なくとも１つのプローブが最初から「被修飾」末端を有し、このため第一プローブまたは第二プローブがリガーゼ触媒融合の適当な基質とならないことである。「被修飾末端」なる用語は、結合点に関する定義であって、相補的プローブに関する定義ではない。「被修飾末端」は、（１）通常のＬＣＲ^TM条件下でリガーゼに触媒される融合に必ず参加する基（例えば５’リン酸基または３’ヒドロキシル）に備えられたブロッキング部分（または付加的塩基残基）（例えば図２のプローブＡ参照）を意味するか、または、（２）１つのプローブ末端と次のプローブ末端との間に「ギャップ」を生じるような塩基の削除を意味する。本出願では、第１のタイプの被修飾末端を「オーバーハング」なる用語で呼ぶことにする。オーバーハングは、標的配列にハイブリダイズしたときに結合点から突出する付加的ブロッキング部分または付加的塩基残基である。「オーバーハング」なる用語を、１つのプローブが相補的プローブよりも長いときの前者の「延長部分」と混同してはならない。このような混同は２つのプローブが共端でなくてもよいことから生じ易い間違いである。第２のタイプの被修飾末端を本文中では「リセス（recess）」と呼ぶことにする。リセスは、標的にハイブリダイズした後の第一対または第二対の２つのプローブ間のギャップを意味する。これらの被修飾末端が存在すると、標的の非存在下で相補的プローブの二重鎖が互いに標的非依存的に結合することがないので、そのような結合に起因する偽陽性シグナルが減少する。プローブを結合可能にするために、後で修飾を「修正」する。本文中で使用された「修正」なる用語は、２つの第一プローブまたは２つの第二プローブまたは双方が夫々の同方向（sense）の結合相手と標的依存的に結合できるようにするプロセスを意味する。即ち、標的、標的相補配列またはそれから生じたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプローブだけが「修正」され得る。本明細書ではエンドヌクレアーゼIV修正を記載したが、使用される被修飾末端のタイプ次第で、「修正」に使用できる手順はいくつか存在する。本文中で使用された「結合点」または「予定結合点」なる用語は、鋳型依存的に結合する予定の互いを結合相手とする２つのプローブ間の特定位置を意味する。この位置は、「修正された」上流プローブが下流の結合相手に対して５’リン酸基-３’ヒドロキシルの関係で隣接する部位である。４つのＬＣＲ^TMプローブのセット毎に２つの「結合点」が存在し、１つは互いを結合相手とする第一プローブ間、１つは互いを結合相手とする第二プローブ間の結合点となる。慣用のＬＣＲ^TMにおいては、典型的には２つの結合点が互いに向き合っており、従って、プローブ対が互いにハイブリダイズすると平滑端二重鎖が形成される。本発明においては、結合点が互いに向き合っていてもよく、または（好ましくは３’延長を伴って）塩基１つ以上ずれていてもよい。（１つまたは複数の）正しい結合点は具体例毎に違っており、従ってこの用語に関しては各具体例毎により詳細に定義する。プローブの各々は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）から成り得る。慣用のヌクレオチドホスホアミダイト化学的手順及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）；ＤｕＰｏｎｔ，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）；またはＭｉｌｌｉｇｅｎ，（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能な器具を用いて所望のプローブを合成することは常套的な処理である。リガーゼによる結合にはプローブの５’端のリン酸化が必要であり、当業界で公知のキナーゼによる酵素的リン酸化、または、公知の任意の化学的合成法による５’端リン酸化を行うとよい。全自動合成に使用できるこのための試薬は市販されている。プローブの３’端にリン酸ブロッキング基をを付加するためにも同様の方法及び試薬を使用し得る。一般に、本発明の方法は、（ａ）被修飾プローブを標的に（及び、二重鎖なので標的相補鎖が存在するときは標的相補鎖に）ハイブリダイズさせ、（ｂ）プローブが結合可能になるように修飾を標的依存的に修正し、（ｃ）修正されたプローブをその結合相手に結合させて融合または結合産物を形成し、（ｄ）融合産物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、修正及び結合の段階を反復して所望の標的配列を増幅する、という反復段階を含む。段階（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）は全部の具体例に関して本質的に同じであり、まとめて説明し得る。これらの段階は、慣用のＬＣＲ^TMで使用される段階とほぼ同じである。段階（ｂ）は、使用される修飾のタイプに従って違っており、本明細書ではエンドヌクレアーゼIV による修正を取り扱う。被修飾プローブと標的（及び場合によっては標的相補鎖）とのハイブリダイゼーションは、従来技術、例えばＥＰ-３２０３０８及びＥＰ４３９１８２に適切に説明されている。プローブの長さ、プローブの濃度、ＧＣ含量及び条件の厳格性などは全てハイブリダイゼーション発生の程度及び速度に影響を与える。所望の特異性を与えるように、即ち、サンプル中のランダムな配列にハイブリダイズしないようにプローブが十分に長いことが好ましい。典型的には、１５〜１００塩基のオーダのプローブがこの目的に適う。現在では、約１５〜約４０塩基の長さを有するプローブが好ましいとされている。プローブは化学量論的に反応すると予想されるので、一般にはほぼ等モルの濃度で添加される。各プローブは、約５ナノモル（ｎＭ）〜約９０ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約８５ｎＭの範囲の濃度で存在する。各反応に使用されるプローブの最適量はまた、必要なサイクル数に従って変更される。最適濃度は通常の知識をもつ当業者によって容易に決定され得る。条件の厳格性が温度、溶媒及びその他のパラメーターに依存することは当業者に周知である。これらのパラメーターのうちで最もコントロールが容易なものは温度であると考えられ、従って、通常はＬＣＲ^TMの実施中の厳格性パラメーターを温度によって調節する。本発明を実施するために必要な厳格性条件は通常のＬＣＲ^TMの条件と違っていないので、より詳細な説明は不要であり、通常の知識をもつ当業者には後出の実施例が指針となる筈である。特異的修正段階に続く段階では汎用方法の処理を用いる。即ち１つのプローブをその隣接の結合相手に結合する。即ち、上流の第一プローブは夫々に対応する下流の第一プローブに結合し、上流の第二プローブは夫々に対応する下流の第二プローブに結合する。「隣接の」プローブは、順方向（contiguous orientation ）で標的とハイブリダイズ可能な２つのプローブのいずれかを意味しており、一方のプローブのリン酸化した５’端が結合相手プローブの３’端のヒドロキシルと接している。互いに「隣接する」プローブは、（１つまたは複数の）被修飾末端が標的依存的に修正されるときに発生する。酵素的結合は互いに隣接する２つのプローブを共有結合させる好ましい方法であるから、本明細書では「結合」なる用語をこの意味で使用する。しかしながら、「結合」は普遍的な用語であり、２つのプローブを共有結合させる任意の方法を包含すると理解されたい。好ましい酵素的結合段階を可能にする条件及び試薬は、通常の知識をもつ当業者に周知であり、発明の背景で引用した文献に開示されている。本発明に有用な結合用試薬としては、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ並びにＥＰ-３２０３０８及びＥＰ-Ａ-３７３９６２に教示された好熱菌Thermus thermophilusのリガーゼ（例えばＡＴＣＣ２７６３４）のような原核生物リガーゼがある。最後に挙げたリガーゼはＬＣＲ^TMの熱サイクル処理中に活性を維持する能力を有するので現在では最も好ましいとされている。適当な熱安定リガーゼは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ.（Ｂｅｖｅｌｙ，ＭＡ）、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ.（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。熱安定リガーゼが存在しないときは、サイクル反復の度毎にリガーゼを再度添加しなければならない。Ｒａｂｉｎら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６１：１０６３７-１０６４７（１９８６）に記載されているショウジョウバエ属（Drosophila）のＤＮＡリガーゼのような真核生物リガーゼも有用であると考えられる。一旦結合した融合プローブを標的から解離（例えば融解）させ、慣用のＬＣＲ^TM と同様に、プロセスを数サイクル反復する。サイクル反復回数は１〜約１００回の範囲であるが、現在では約１５〜約７０回が好ましいとされている。夫々の相補的（第二）プローブにハイブリダイズしたときに、予定結合点から遠い末端（即ち「外側」末端）が不要な他の望ましくない結合反応に自由に参加しないようにプローブを設計するのが望ましい。従って、外側末端は結合可能な付着末端または平滑末端であってはならない。このような付着末端または平滑末端をどうしても使用する必要があるときは、自由な５’末端リン酸基を存在させないかまたは除去しなければならない。このためには、（通常は５’末端リン酸基を有していない）オリゴヌクレオチドプローブを合成するか、または、（例えばＤＮＡの制限消化物から作製されるオリゴヌクレオチドから）末端リン酸基を除去するホスファターゼ酵素を使用する。または、少なくとも一方のプローブの末端を後述するような「フック」またはその他のリポーター分子またはマーカー部分でブロッキングすることによってプローブの外側末端の結合を阻止し得る。更に、汚染の危険を少なくするために、得られた増幅産物の実質的に全部が選択的に失活しているかまたは破壊されているようにプローブを設計するのが望ましい。有効な効果を得るためにはこのような失活が実質的に全部の増幅産物を破壊する必要があり、このような失活をプロセス中の種々の時点で生じさせてもよい。失活は通常、増幅の直後、検出後または次のＬＣＲ^TM反応の直前に生じ得る。便宜上、本文中ではこれらを夫々、「増幅後」、「検出後」及び「増幅前」と呼ぶ。増幅前に行われる失活方法は、反応体であるプローブ及び試薬を破壊することなく増幅産物を選択的に破壊しなければならない。検出後に行われる失活方法にはこのような制約がない。例えば、リボヌクレオチド残基を他のデオキシリボ-オリゴヌクレオチドに取込ませ、得られた産物をＲＮアーゼまたはアルカリ性加水分解条件によって開裂し得る。文献に報告されたＲＮアーゼのうちで特に有用なものは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖及び一本鎖ＲＮＡ中のリボヌクレオチドを開裂するＲＮアーゼＨである。大腸菌ＲＮアーゼは有効な切断のために通常は約４リボヌクレオチドの鎖を好むが、Ｗａｌｄｅｒらは、ＲＮアーゼＨＩと命名されたＫ５６２赤白血病細胞中のヒトＲＮアーゼＨ活性を報告しており（ＥＰ−Ａ−４９６４８３参照）、この活性は、単一のリボ残基が存在するときにのみ混合Ｒ／ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を開裂すると言われている。これを達成する手順はＥＰ-Ａ-４９６４８３及びＷＯ９１／１７２７０により詳細に記載されている。また、リボ-修飾された産物をアルカリ性条件を用いて開裂することも可能である。本願明細書中の「アルカリ性条件」なる用語は、リボヌクレオチド部分に隣接のホスホジエステル結合の加水分解を生じさせるに十分なｐＨ７.０以上の条件を意味する。通常は、約１０を上回るｐＨに加熱を伴って０.５〜２時間維持すると加水分解が生じるであろう。典型的な条件は当業界で公知であり、非限定例としては、０.６ＮのＮａＯＨと共に９０℃に３０分間〜１時間維持するか、または、３０〜４０ｍＭのＫＯＨまたはＮａＯＨと共に１〜１.５時間維持する処理がある。ＫＯＨの３６ｍＭ溶液は、ｐＨ約１１を生じる。結合後に破壊を許容する他のプローブ修飾も本発明の範囲内に包含される。エンドヌクレアーゼIVによって修正可能な被修飾末端上述のように、第一の具体例は、ブロッキング部分または追加の塩基が少なくとも１つの上流プローブの３’端の予定結合点から突出するように付加された修飾末端を含む。ブロッキング部分または追加の塩基は、「オーバーハング」を形成し、適正な平滑端結合が可能でない。被修飾プローブ試薬図２に概略図で示し実施例５〜７に説明した第１の変形例においては、オーバーハングが化学的ブロッキング因子Ｒから成る。標準ＤＮＡ結合反応が結合点に３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する基質鎖を要することは公知である。特に３’ヒドロキシル基における修飾のいくつかの場合には、被修飾末端が結合反応に参加することができないようにするが被修飾鎖が二重鎖構造の一部となるときに除去され得るＲ基を導入することが知られている。このような修飾においては、式：〔式中、Ｚは-Ｈ、-（ＣＨ₂）_nＣＨＯ（ここでｎは１〜約３、好ましくは１または２）、-デオキシリボース及び-ジデオキシリボースを示す〕で示される代表的なＲ基が水素原子の代わりに３’酸素に結合している。Ｒ基によって適正に修飾された末端を有するプローブの合成は当業界で公知である。例えば、３’リン酸基を含むオリゴヌクレオチドの化学的合成は、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ及びＷｙｒｚｙｋｉｅｗｉｃｚ,Ｎｕｃｌ. ＡｃｉｄｓＲｅｓ .１７：７１４９-７１５８（１９８９）によって記載されている。より大きいブロッキング基はいくつかのサンプル中に存在し得る非特異的ホスファターゼから３’リン酸基を匿う利点を有しているが、このようなブロッキング基を作成するためには、末端トランスフェラーゼ及びｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰによってオリゴヌクレオチドプローブを作製し、次いでウラシルグリコシラーゼで処理するのが便利である。ウラシルグリコシラーゼの精製は、Ｌｉｎｄａｈｌら，Ｊ.Ｂ.Ｃ.２５２：３２８６〜３９２４（１９７７）によって教示されている。ｄＵＴＰ付加の場合、ウラシルグリコシラーゼ処理後に、強アルカリ処理を使用してグリコアルデヒド誘導体を調製する。これらのＲ基の例は単なる代表例であり、通常の知識をもつ当業者は同等の作用を発揮する多くの変形体を合成し得ることが理解されよう。更に、実施例１６は、３’末端リン酸基を有するプローブの便利な全自動合成を記載している。別の変形例では、プローブが３’リボヌクレオチド部分と３’リン酸ブロッキング部分との双方を含むように修飾されている。このようなプローブの合成は、実施例１４〜１７に記載されている。これらのプローブは二重の利点を有している。即ち、これらのプローブは、３’リン酸ブロッキングによって標的非依存性結合の問題を解決する。更に、これらのプローブは、増幅産物を種々のＲＮアーゼまたはアルカリ性条件によってリボヌクレオチド残基で開裂及び破壊できるので汚染の問題を解決する。増幅産物を開裂する汚染防御方法は検出後に使用し得る。反応が完了した後で結合産物をリボヌクレオチドで開裂するためにＲＮアーゼまたはアルカリ性条件を使用し得る。しかしながら、増幅前の汚染防御のためには、ＲＮアーゼが好ましい。アルカリ性条件は結合産物を開裂して５’ヒドロキシルを残すであろうが、非結合のリボ-修飾されたプローブ試薬に作用して３’リン酸基を２’リン酸基に変換させる傾向も示す。２’リン酸化プローブの結合の有無または結合の効率に関してはまだ判っていない。対照的に、好ましいＲＮアーゼは結合産物を切断して５’ヒドロキシル及び３’リン酸基を残す。言い換えると、ＲＮアーゼはリボ残基の３’即ち下流側のホスホジエステル結合、即ち非結合の被修飾試薬中には存在することもない結合を開裂する。従って、ＲＮアーゼは以後も作用することが必要な増幅試薬を損傷することなく増幅前の汚染防御に使用され得る。ＲＮアーゼはＬＣＲ^TM開始後に活性を維持してはならないので不耐熱性でよく、むしろ不耐熱性であるのが好ましい。オーバーハング末端の更に別の変形例では、プローブが標的にハイブリダイズした後で開裂によって除去され得る付加的な核酸塩基からオーバーハングが構成される。この変形例は、図３に概略的に図示し実施例３〜４及び８〜９に記載されている。オーバーハングはその嵩高さ（bulk）によって予定結合点での結合を阻止し、（ブロックされた末端に関して上述したように）リガーゼ反応に必ず参加する（１つまたは複数の）基を化学量論的にブロックまたは遮蔽する。オーバーハングと上述の単純な化学的ブロックとの違いは、ブロッキング基（即ちオーバーハング）の性質及び大きさにある。この基は本来はプローブ分子と共直線性（colinear）の核酸残基から成る。しかしながら、基の寸法は、標的にハイブリダイズしたときに分子の被修飾末端が結合点の近傍に残存できないほど大きい。数種類のオーバーハングが可能であるが（親出願には３種類が記載されている）、本願では更に、リン酸基でブロックされたオーバーハング及び非塩基性部位オーバーハングについて述べる。一般にオーバーハングは、後述するような標的依存性除去が得られるように標的に相補性でなければならない。オーバーハングは１〜１０塩基、好ましくは１〜５塩基の長さでよい。非塩基性部位をもつオリゴヌクレオチドの合成は文献に記載されている。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６２：１０１７１-１０１７９（１９８７）及びＥｒｉｔｊａら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ６（４）：８０３-８１４（１９８７）参照。被修飾オリゴヌクレオチドプローブは、３ ’端を付与すべきプローブの結合点の３’側に直結して非塩基性部位を付加するように合成され得る。プローブがブロックされ且つ非塩基性修飾されている場合、プローブが相補的プローブにハイブリダイズしたときには（真の標的にハイブリダイズしたときの修正と対照的に）最低限の修正が生じるようにプローブが設計されるノが好ましい。例えば図２に基づいて説明すると、３’リン酸基でブロックされたプローブＡとＡ’の５’末端とが共端であるとき、エンドヌクレアーゼIVはこれを二重鎖基質として認識し、標的が存在しないときであってもＡから３’リン酸基を開裂する傾向をある程度示すであろう。同様に、図３においては、Ａ’の５’末端塩基がプローブＡの非塩基性部位ｘに向き合っているとき、及びプローブＡ中の非塩基性残基の５’側の最初の残基に向き合っているとき、エンドヌクレアーゼIVがこれをその二重鎖基質として認識し、標的が存在しないときであっても非塩基性部位でオーバーハングをＡから開裂する傾向をある程度示すであろう。これらの不都合な状況はいずれも、被修飾プローブＡ（及び／またはＢ’）の末端を食い違わせたりずらしたりして夫々の相補的プローブの末端から突出した一本鎖として延長させることによって最小に抑えられる。更に非塩基性修飾の場合、非塩基性部位自体が相補的プローブの５’端から突出した１つ以上の塩基として存在するのが好ましい。言い換えると、相補的プローブＡ’の５’末端残基は、被修飾部位に対して５’側の少なくとも１残基に相当する上流プローブＡ中のヌクレオチド残基に向き合った位置に存在する。リン酸基によってブロックされた状態は、実施例７にＡＡ１２３-３（１８）に相補的なプローブＡＡ１２３−１Ｐ（２０）及びＡＡ１２３-２（２０ｍｅｒ）に相補的なプローブＡＡ１２３-４Ｐ（２２）を用いて示されている。同様に非塩基性部位の状態は、実施例８にＡＡ１２３-３（１８）に相補的なプローブＡＡ１２３-１Ｅ１及びＡＡ１２３-２（２０ｍｅｒ）に相補的なプローブＡＡ１２３-４Ｅ１を用いて示されている。これらの各場合に、３ ’修飾は相補的プローブの５’端から突出し、エンドヌクレアーゼIVがこの二重鎖を真の基質、即ち完全標的鎖上の被修飾プローブと取り違えないことが実質的に保証される。酵素学的考察酵素エンドヌクレアーゼIV（Ｓｉｗｅｋら,Ｎｕｃｌ.ＡｃｉｄｓＲｅｓ.１６：５０３１-５０３８（１９８８）、本文中でときには「Ｅｎｄｏ IV」と呼ぶ）、及び、種々の他の天然発生酵素は、ブロッキング基を含む鎖が相補鎖にハイブリダイズしたとき、実質的にはハイブリダイズしたときにのみ、種々のブロッキング基を除去して、３’ヒドロキシル基を露出させ得る。例えば、Ｄｏｅｔｓｃｈ＆Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ,ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，２３６：１７３-２０１（１９９０）は、エンドヌクレアーゼの酵素学及び複数の異なる反応性非塩基性部位の化学を詳細に記載している。また、ポリヌクレオチドが相補鎖にハイブリダイズしたときにこの酵素が非塩基性部位でポリヌクレオチドを開裂することも知られていた。エンドヌクレアーゼ IVはクラスIIのＡＰエンドヌクレアーゼであり、これは、非塩基性部位を５’側で切断し、ポリヌクレオチドに３’ヒドロキシル端を残す作用を有している。その結果、ポリヌクレオチドはその位置及びその化学的性質の双方によってリガーゼの作用で隣接プローブに接合できることになる。本文中で言及したエンドヌクレアーゼIVの使用が本発明の範囲に包含されることは明らかであるが、他の多くの等価の修正用試薬が使用され得ることも理解されよう。例えば、実質的には被修飾プローブが標的にハイブリダイズするときにのみ修飾を修正する同様の能力を示す他の酵素を見出すこともできよう。また、必ずしも全酵素でなくてもよく、酵素の何らかのフラグメントまたは消化物が所望の活性を有することが判明するかもしれない。最後に、天然型タンパク質の全長の一部分だけを有する組換え産生されたポリペプチドによって所望の活性が得られることもあり得る。このようなすべての変形体は本発明の目的に対してエンドヌクレアーゼIV と等価であると考えられる。エンドヌクレアーゼIV酵素が熱安定性でないときは、ＬＣＲ^TMの各サイクルで酵素を再添加しなければならない。しかしながら、夫々１９９２年３月３１日及び同年４月１６日に出願された本出願人所有の係属中の米国特許出願第０７／８６０,８６１号及び第０７／８６９,３０６号に記載されているように、好熱菌T. thermophilusのＥｎｄｏIVのような熱安定性種から単離されたかまたは組換え操作されたエンドヌクレアーゼを使用するのが好ましい。これらの特許出願の記載内容全体が参照によって本明細書に含まれるものとする。この酵素をコードするインサートを含むプラスミドｐＴＴ７を担う大腸菌ＣＳ１株は、１９９２年４月９日に寄託され、受託番号６８９５０を与えられた。本出願の文脈において、「熱安定性」なる用語は、約７０℃を上回る温度、好ましくは約８０℃を上回る温度で酵素試薬がその活性の実質的な部分を維持していることを意味する。Ｌｅｖｉｎらは、“ＤＮＡ修復における金属酵素（Metalloenzymes in DNA Re pair）”,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６６（３４）：２２８９３-２２８９８（１９９１）において、天然形態のエンドヌクレアーゼIVが亜鉛を含有することを示した。これらの研究者らはまた、金属非含有バッファ中で精製されたエンドヌクレアーゼIVは不活性であるが、ある種の二価カチオンの添加によって再活性化され得ることを証明した。特に、２００μ ＭのＣｏ²⁺及びＭｎ²⁺は、不活化の方法（ＥＤＴＡまたは１，１０-フェナントロリン）次第では酵素を再活性化するために有効であった。他の研究者らは、近縁酵素である酵母の３’ホスホグリコアルデヒドジエステラーゼの活性が３μＭ〜約３ｍＭの濃度のＣｏ²⁺によって増進され、それ以上の濃度ではカチオンが阻害性になることを証明した。しかしながら、意外にも、Ｃｏ²⁺がリガーゼ及びＬＣＲ^TMの性能に対して概して阻害性であることが判明した。例えば、後出の実施例１２及び１３では、約２ｍＭを上回る濃度で１０⁶の標的の増幅を完全に阻止したことが示されている。従って、ＬＣＲ^TM（明らかにリガーゼ自体）を失活させずにエンドヌクレアーゼ IVを活性化するＣｏ²⁺の濃度の範囲（window）を知ることが必要であった。Ｃｏ²⁺ はＥＤＴＡのようなキレート化剤と極めて緊密に結合する。サンプルの調製にしばしば使用されるＥＤＴＡを完全に除去することは難しいので、実際にはＣｏ²⁺の濃度を「有効」コバルトイオンとして示したほうがよく、これは存在し得るキレート化剤と結合した後の余剰量を意味する。キレート化剤の導入を阻止するかまたはキレート化剤を完全に除去するために慎重な措置を講じた場合には、「有効」コバルトイオンの濃度は実際の濃度の近似値である。有効Ｃｏ²⁺濃度は、約０.０５〜約２.０ｍＭ、通常は約０.１〜約１.５ｍＭ、好ましくは約０.５〜約１ｍＭでなければならないと考えられる。コバルトイオンは二塩化物塩のような常用の任意の塩として適宜供給され得る。出願人はまた意外にも、エンドヌクレアーゼIVが関与するＬＣＲ^TM中で二価Ｍｎ²⁺カチオンはＣｏ²⁺カチオンに代替できるがＭｇ²⁺カチオンに代替できないことを知見した。文献の報告では、Ｍｎ²⁺がリガーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ IV活性を維持する唯一の二価カチオンであると明言されていたので、これは意外な結果である。しかしながら、Ｍｎ²⁺単独ではＬＣＲまたはＥｎｄｏ IVで修飾されたＬＣＲを十分に支持することはできない。Ｍｇ²⁺の存在は増幅反応の必要条件である。Ｍｇ²⁺濃度は、好ましくは少なくとも約０.５ｍＭ、理想的には約５〜約２０ｍＭである。検出増幅後に当業界で公知の多数の慣用技術を用いて結合産物の形成をモニターすることによって増幅された配列を検出し得る。１つの好ましい方法においては、同じ方向の１番目及び２番目のプローブ間に新しい共有結合が形成されるという事実を用いて結合産物の形成をモニターする。即ち、増幅産物は個々のプローブよりも長いので、長さに基づいて未結合プローブから分離し得る。分離は、ゲルまたはアフィニティ因子即ち「フック」によって容易に得られる。「フック」は特異的リガンド-レセプターアフィニティを有する任意の部分である。これは例えばハプテンまたはポリヌクレオチドのセグメントでよい。フックは一方のプローブに付着し、ラベルは同じ方向の他方のプローブに付着し得る。結合の際にラベルがアフィニティ部分に接合する。分離後に、固相上の分離ラベルを測定し得る。または、少なくとも２つのプローブの自由外端（融合産物の対向両端）、好ましくは４つのプローブ全部の外端にフックを配備してもよい。典型的には、融合産物の一端（例えばＡの５’端及びＡ’の３’端）に備えられた１つまたは複数のフックは、固相にコートされた試薬（例えば抗体またはアビジン）によって固定され得る第１ハプテンから成る。他端（例えばＢの３’端及びＢ’の５ ’端）に備えられた１つまたは複数のフックは、ラベルまたは抗体-酵素コンジュゲートのようなラベル系によって認識され得る別の抗原またはハプテンを含む。酵素コンジュゲートの場合には、酵素によって検出可能産物に変換される基質を次に添加する。代表的なハプテンフックとしては、多くの薬剤（例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、サリチレート、など）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ダンシル、２,４-ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、及び、ブロモウラシルのような修飾ヌクレオチド、Ｎ-アセチル-７-ヨード- ２-フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基の組込みによって修飾された塩基、その他多数がある。いくつかのハプテンは、いずれも１９９１年１２月１７日出願の本出願人所有の係属中の米国特許出願第０７／８０８,５０８号（アダマンタン酢酸）及び第０７／８０８,８３９号（カルバゾール及びジベンゾフラン）、並びに、いずれも１９９２年３月２７日出願の第０７／８５８,９２９号（アクリジン）及び第０７／８５８,８２０号（キノリン）（集合的に「ハプテン出願」と呼ばれる）に開示されている。上記のハプテン出願の各々の記載内容全部が参照によって本明細書に含まれるものとする。実質的に任意のハプテンを本発明に使用し得る。本発明では、特異的結合相手が既知であるかまたは調製できること（「ハプテン」の明らかな特性）、及び、ハプテンがハイブリダイゼーションまたは結合を妨害することなくプローブに結合できることだけが必要である。ハプテンをプローブに付加する多くの方法が文献で知られている。ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ｎｅｗＹｏｒｋ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ）はいずれも、プローブ標識技術を記載し商品化した。例えば、３’-Ａｍｉｎｅ-ＯＮＣＰＧ^TM（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ, ＰａｌｏＡｌｔｏ,ＣＡ）を用いて第一アミンを３’オリゴ末端に結合し得る。同様に、ＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒII（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて第一アミンを５’オリゴに結合し得る。アミンは慣用の活性化及び結合の化学的手順を用いて種々のハプテンに反応し得る。１９９２年６月２５日公開の国際特許出願公開ＷＯ９２／１０５０５及び１９９２年７月９日公開の国際特許出願公開ＷＯ９２／１１３８８は、５’端及び３’端の夫々をプローブで標識する方法を教示している。公知のオリゴヌクレオチド標識方法の１つでは、ラベル-ホスホアミダイト試薬を調製し、オリゴヌクレオチドの合成中にオリゴヌクレオチドにラベルを付加するために使用する。例えば、Ｔｈｕｏｎｇ,Ｎ.Ｔ.ら,Ｔｅｔ.Ｌｅｔｔｅｒｓ,２９（４６）：５９０５-５９０８（１９８８）またはＣｏｈｅｎ,Ｊ.Ｓ．ら,米国特許出願第０７／２４６,６８８号（ＮＴＩＳＯＲＤＥＲＮｏ．ＰＡＴ-ＡＰＰＬ-７-２４６,６８８（１９８９）を参照するとよい。本発明の別の具体例では、結合産物の形成を直接測定することによって検出するのでなく、ブロッキング部分またはオーバーハングの遊離を測定することによって検出する。ブロッキング部分またはオーバーハングが検出可能ラベルを含むときには検出がいっそう容易である。この場合、固相関連シグナルの減少が標的存在の指標となる。好ましい変形例では、ラベルが、プローブに結合したときに特徴的な第１のスピン特性を有し、プローブから遊離したときに識別可能な第２のスピン特性を有しているフルオロフォア（発蛍光剤）から成る。このようなラベルは蛍光偏光アッセイの分野でよく知られている。例えば、ＥＰ-Ａ-３８２４３３（ＩＣＩ）を参照するとよい。これらのラベルは常用の化学的手順でブロッキング部分または核酸オーバーハングに結合できる。実施例本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。実施例は本発明の代表例であって本発明はこれらの実施例に全く限定されない。以下の実施例１及び２は、エンドヌクレアーゼIVによって修正される被修飾末端を有するプローブを用いた増進ＬＣＲ^TMを示す。リン酸ブロッキング基及び非塩基性部位オーバーハングの双方の例を示す。プローブ配列は後出の表Ｉ-IVに与える。プローブはアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Actino bacillus actinomycetemcomitans）中の標的ＤＮＡ配列の１２３位または２５０位に特異的であり、従って「ＡＡ１２３」または「ＡＡ２５０」と命名されている。（ダッシュ記号に）続く数字は１セットとして使用される４つのプローブの位置を示す。-１及び-２の番号のプローブは同じ５’-３’方向を有し、-３及び -４の番号のプローブは反対方向を有している。-１と-３との番号のプローブがハイブリダイズし、-２と-４との番号のプローブがハイブリダイズする。 “Ｐ”及び“ｐ”はリン酸基を示す。リン酸基は通常は５’末端に必要な基であるが、３’末端では結合ブロッキング修飾として機能する。全自動ＤＮＡシンセサイザーを使用し、論文（Ａｓｈｅｌｙ,ＧＷ＆Ｋｕｓｈｌａｎｄ,ＤＭＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：２９２７-２９３３（１９９１））に記載されているように、２-〔〔２-〔（４,４’ -ジメトキシトリチル）オキシ〕エチル〕スルホニル］エチル−２-シアノ-エチルＮ,Ｎ-イソプロピルホスホアミダイト（Ｈｏｒｎ,Ｔ＆Ｕｒｄｅａ,Ｍ.,Ｔｅｔ.Ｌｅｔｔ .２７４７０５＋（１９８６））と共に全自動合成を開始し、次いで、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドシアノエチルホスホアミダイトを順次付加することによって３’リン酸化したプローブを合成した。 “Ｅ”及び“ｘ”は非塩基性部位（より詳細に後述する）を示す。“Ｅ”の後の数字（１、３または５）は非塩基性部位から突出する相補的塩基（オーバーハング）の長さを示す。括弧内の数字はプローブの長さを表す。全自動機器を使用し、被修飾ホスホアミダイト試薬を用い、Ｅｒｉｔｊａら,Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ６（４）：８０３-８１４（１９８７）の方法に従って、非塩基性プローブを合成した。特に注釈がなければ全部のプローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである。実施例１〜１２及び１４〜１７に使用した標的ＤＮＡは、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）から単離された８９８塩基対のインサートを含むプラスミドであった（ＡＴＣＣＡｃｃ.Ｎｏ.５３２１９）。プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化して約１０００塩基対のフラグメントを遊離した。Ｏ.Ｄ.値＝１.０がＤＮＡ濃度＝５０μ ｇ／ｍｌに対応すると仮定してプラスミド濃度を分光光度法で測定した。消化したプラスミドを５ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.８と０.１ｍＭのＥＤＴＡと３００ｐｇ／ｍｌのヒト胎盤ＤＮＡとを用いて連続希釈することによって標的ＤＮＡ溶液を調製した。特に注釈がなければ、すべての反応は、アセチル化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＬＣＲバッファ（４５ｍＭのＥＰＰＳ,ｐＨ７.８と８０ｍＭのＫＣｌと１０ｍＭのＭｇＣｌ₂と１０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌと０.５ｍＭのＮＡＤ⁺）中で行い、ＣＯＹモデル５０の温度サイクラーで温度サイクル処理した。アリコートを停止バッファ（８０％のホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ：ｖ）のキシレンシアノール及び０.０５％のブロモフェノールブルー）に移して反応を終了させた。結合産物及び未結合産物を、８０ｍＭのＴｒｉｓ、８０ｍＭのホウ酸,ｐＨ８.０及び１.０ｍＭのＥＤＴＡ中に８.３Ｍの尿素を含む１６×２０×０．０４ｃｍの１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルをオートラジオグラフにかけ、オートラジオグラフを鋳型として用いて結合プローブと未結合プローブとを切除し、各バンド中の放射能の量を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。結合産物中の放射能の％を各レーン中の合計カウント数の関数として算出した。特に注釈がなければ、略号は以下の意味を有している。ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＥＤＴＡ：金属キレート化剤、エチレンジアミン四酢酸ＥＰＰＳ：Ｎ-（２-ヒドロキシエチル）ピペラジン-Ｎ’-（３−プロパンスルホン酸）から成るバッファＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィーＮＡＤまたはＮＡＤ⁺：ニコチンアデニンジヌクレオチドＴｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから成るバッファＴＴｈ：好熱菌Thermus thermophilus 実施例１：平滑端ＬＣＲ^TM １０μｇ／ｍｌのＢＳＡと３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌ反応容量中で、ＡＡ１２３-１（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（２０）及びＡＡ１２３-４（２０）から成る平滑端プローブセット（表Ｉ参照）を用いてＬＣＲ^TMを実施した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ２の約５％を〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、好熱菌Thermus thermophilus（Ｔｔｈ）のＤＮＡリガーゼの最終濃度を０.１５μｇ／ｍｌにした。標的ＤＮＡ分子数を０または１０⁶にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９０℃で３０秒間のインキュベーションと５０℃で３０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-１参照）で、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-１は、重複反応の平均結合％及び（＋）／（−）標的比を示す。しかし、他のデータは、未修飾プローブを使用して１０⁵未満の検出は十分に再現性のないことを示す。実施例２：結合に対する非塩基性修飾のブロッキング効果の証明３’〔α-³²Ｐ〕-コルディセピンで標識したＡＡ１２３-２を、ＡＡ１２３-１Ｅ１、ＡＡ１２３-１Ｅ３またはＡＡ１２３−１Ｅ５（表Ｉ参照）と、相補的配列ＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）（表III）及びＴｔｈＤＮＡリガーゼと共に、ＴｔｈエンドヌクレアーゼIVの存在下（＋）または非存在下（−）に５０℃で４０分間インキュベートした。ＡＡ１２３-４Ｅ１、ＡＡ１２３-４Ｅ３及びＡＡ１２３-４Ｅ５（表Ｉ）を、ＡＡ１２３ＴＡＲ（３／４）（表III）及び３’〔α-³ ² Ｐ〕-コルディセピン標識ＡＡ１２３-３（１８）と共に用いた同様の反応セットも実施した。結合産物と未結合産物とを、８０ｍＭのＴｒｉｓと８０ｍＭのホウ酸,ｐＨ８.０と１.０ｍＭのＥＤＴＡ中に８.３Ｍの尿素を含む２０×４０×０.０４ｃｍの１２.５％のポリアクリルアミドゲル上で分析した。図４は、非塩基性延長部を有する非塩基性プローブがＤＮＡリガーゼの適当な基質でないことを示すオートラジオグラフである。また、ブロッキング延長部がエンドヌクレアーゼIVによって除去されるとプローブ-１及び-４が夫々プローブ-２及び-３に結合可能になることを示す。他のデータ（図示せず）は、３’-ＰＯ₄ブロッキング基で同じ結果が得られることを追認し、更に、エンドヌクレアーゼIV及び／またはＤＮＡリガーゼによるプローブの修正及び／または結合は正しい相補鎖配列が存在するときにのみ生じることを示す。実施例３〜４及び８〜９は、延長部の付いた非塩基性部位を有するように修飾したプローブを用いたＬＣＲ反応に関する。実施例５〜７は３’リン酸ブロッキング基を含むように修飾したプローブを用いたＬＣＲ反応に関する。実施例３：１つの非塩基性部位を有するプローブを用いたＬＣＲ表ＩのプローブＡＡ１２３-１（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３-４Ｅ５を用い、９５℃で３０秒間、５５ ℃で１１０秒間に順次設定したＣｏｙモデル５０サーモサイクラーでＬＣＲを実施した。４５ｍＭのＥＰＰＳ,ｐＨ７.８と８０ｍＭのＫＣｌと１０ｍＭのＭｇＣｌ₂と０.５ｍＭのＮＡＤ⁺と１ｍＭのＣｏＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを含む２０μｌ容量中で反応を実施した。他に注釈がなければ、プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブＡＡ１２３-２の約５％を放射性〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、Ｔｔｈリガーゼは種々の量で存在した（表Ｅ-３のデータ参照）。標的としては、同じ表に示すようにＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化したＡＡＤＮＡを分子数０、１０²、１０³または１０⁴で使用した。データを以下の表Ｅ-３にシグナル対バックグラウンド比として示す。通常はバックグラウンドの少なくとも３〜４倍を終始維持するシグナルがあればバックグラウンドから標的を十分に識別できる。実施例４：種々の非塩基性部位をもつプローブの比較５０μｌの反応容量中のプローブの濃度を１７ｎＭに減らし、第４プローブとしてＡＡ１２３-４Ｅ５またはＡＡ１２３-４Ｅ３を用いる以外は実施例３と同様に処理した。得られたデータをシグナル対バックグラウンド比として以下に示す。実施例５：３’リン酸基でブロックされた１つのプローブを用いたＬＣＲ上記実施例３の条件下に表ＩのプローブＡＡ１２３-１（２０）、ＡＡ１２３- ２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３-４Ｐ（２２）を用いてＬＣＲを実施した。得られたデータをシグナル対バックグラウンド比として以下の表Ｅ-５に示す。実施例６：３’リン酸基でブロックされた平滑端プローブを用いたＬＣＲＡＡ１２３-１Ｐ（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（２０）及びＡＡ１２３-４Ｐ（２０）から成る３’リン酸化した平滑端プローブセット（表Ｉ参照）を用い、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡと０.５ｍＭのＣｏＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌの反応容量中でＬＣＲを実施した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ２の約５％を〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、ＴｔｈＤＮＡリガーゼ及びＴｔｈエンドヌクレアーゼIVは夫々０.１５ μｇ／ｍｌ及び４.１μｇ／ｍｌの濃度で存在した。標的ＤＮＡの分子数を０、１０²及び１０³にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと５５℃で１１０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-６参照）で、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-６は、重複反応の平均結合％及び（＋）／（−）標的比を示す。標的数１０³が標的数０から識別可能であることが観察される。実施例７：３’リン酸基でブロックされた非平滑端プローブを用いたＬＣＲＡＡ１２３-１Ｐ（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３-４Ｐ（２２）から成る非平滑プローブセット（表Ｉ参照）を用いて、１０μｇ／ｍｌのＢＳＡと０.５ｍＭのＣｏＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌの反応容量中でＬＣＲを実施した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ２の約５％を〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、酵素ＴｔｈＤＮＡリガーゼ及びＴｔｈエンドヌクレアーゼ IVは夫々０.１５μｇ／ｍｌ及び４.１μｇ／ｍｌの濃度で存在した。標的ＤＮＡ分子数を０、１０²及び１０³にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと、５５℃で１１０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-５参照）で、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-７は、重複反応の平均結合％及び（＋）／（−）標的比を示す。標的数１０³ が標的数０から識別可能であることが観察される。実施例８：非塩基性部位及び１塩基の延長部によって修飾されたプローブを用いたＬＣＲＡＡ１２３-１Ｅ１、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３- ４Ｅ１から成る非平滑プローブセット（表Ｉ参照）を用いて、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡと０.５ｍＭのＣｏＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌの反応容量中でＬＣＲを実施した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ２の約５％を〔α-³²Ｐ〕- コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、酵素ＴｔｈＤＮＡリガーゼ及びＴｔｈエンドヌクレアーゼIVは夫々０.１５μｇ／ｍｌ及び４.１μｇ／ｍｌの濃度で存在した。標的ＤＮＡ分子数を０、１０³及び１０⁴にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと５５℃で２４０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-８参照）で、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-８は、重複反応の平均結合％及び（＋）／（−）標的比を示す。標的数１０³が標的数０から識別可能であることが観察される。実施例９：イオウ代謝細菌Sulfolobus solfataricusから単離したエンドヌクレアーゼIV活性を用いたＬＣＲ部分Ａ：酵素単離：ＡＴＣＣによって示唆された方法でイオウ代謝細菌Sulfol obus solfataricus（ＡＴＣＣ３５０９１）を増殖させた。培地中で冷凍した２０ｇの細胞を解凍し、１０ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.４と５％（ｗ：ｖ）のグリセロールと０.５ｍＭのジチオトレイトールとに混合して７０ｍｌの容量とした。３.０ｍｌの１.０ＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.４を添加し、１４,０００ｐｓｉのフレンチプレスに２回通して細胞を粉砕した。混合物を４０,０００ｇで３０分間遠心した。約６６ｍｌの上清を収集し、０.５容量のグリセロールで希釈し、−２０℃で保存した。２０ｍｌの溶菌液を５０ｍｌの２０ｍＭのリン酸カリウム, ｐＨ７.０、１.０ｍＭのジチオトレイトール、５％のグリセロール（ｖ：ｖ）（「バッファＡ」）で希釈し、バッファＡで平衡させた１.６×９.５ｃｍのＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。カラムを１５ｍｌのバッファＡで洗浄し、バッファＡ中に０.１Ｍから０.７４ＭのＮａＣｌの直線勾配で展開した。３.２ｍｌの分画を収集し、収集した４５分画の各々に１.２５ｍｌのグリセロールを添加した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって〔α-³²Ｐ〕コルディセピンで標識したオリゴヌクレオチドＥ４ＳＵＢ１（表III参照）を用い、変性ポリアクリルアミドゲル上で切断オリゴ及び非切断オリゴを分析することによって分画のエンドヌクレアーゼIV 活性を試験した。分画２７〜４４をプールし、ＣｏＣｌ₂中で０.１５ｍＭにし、８０℃で２.５分間加熱して、最終容量５９ｍｌとした。サンプルを濃縮するために、２８,０００ｇで１５分間遠心し、上清を０.２μＭのフィルターに通し、最後にＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０フィルターで３倍に濃縮することによって破片を除去する必要があった。３.０ｍｌの濃縮タンパク質溶液を３０.０ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.４と１. ０ｍＭのＭｇＳＯ₄と５０μＭのＣｏＣｌ₂と５％（ｖ：ｖ）のグリセロール（「バッファＢ」）とによって希釈し、バッファＢで平衡させた４.０ｍｌのヘパリン-アガロースカラムに負荷した。バッファＢ中に０.２５Ｍから０.５ＭのＫＣｌの勾配を用いてカラムを展開させ、１.０ｍｌの分画を収集した。分画の非塩基性ヌクレアーゼ活性を検定し、分画９〜１１をプールした。３.０ｍｌのサンプルを２５ｍＭのＥＰＰＳ,ｐＨ７.７、０.１ＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０μＭのＣｏＣｌ₂及び５％（ｖ：ｖ）のグリセロール（「バッファＣ」）に移すために、バッファＣで平衡させたＢｉｏＲａｄ１０ＤＧカラムにサンプルを通した。４.０ｍｌを収集し、ＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０中で約１００μｌに濃縮した。このサンプルを９０℃で５分間加熱し、オリゴデオキシリボヌクレオチドＡＡ２５０-１及びＡＡ２５０-３を基質として用いると、一本鎖及び二重鎖の双方がヌクレアーゼ活性をもたないことが観察された。部分Ｂ：ＬＣＲ反応：１０μｇ／ｍｌのＢＳＡと２.０ｍＭのＣｏＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌ反応容量中で、ＡＡ２５０-１、ＡＡ２５０-２、ＡＡ２５０-３（２４）及びＡＡ２５０-４（１９）から成る平滑端プローブセットを、ＡＡ２５０-１Ｅ５、ＡＡ２５０-２、ＡＡ２５０-３（２２）及びＡＡ２５０-４（２１）から成る１つの非塩基性プローブを含む非平滑プローブセットと比較するＬＣＲを実施した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ２の約５％を〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、酵素ＴｔｈＤＮＡリガーゼは０.１５μｇ／ｍｌの濃度で存在した。精製したイオウ代謝細菌Sulfolobus so lfataricusのエンドヌクレアーゼIV活性を最終希釈度１：１０で使用した。平滑及び非平滑の双方のプローブセットについて標的ＤＮＡ分子数を０及び１０⁶にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと５５℃で６０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-９参照）で、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-９は、各場合の重複反応の平均結合％及び標的数１０⁶／０の比を示す。標的数１０6／０の比は、非塩基性延長部で修飾された非平滑プローブセットのほうが優れていることを示す。標的分子数１０⁶を含む反応中の結合パーセントは双方のプローブセットで同様であるから、この改良は標的分子数０の反応中に生じるシグナル減少に起因する。実施例１０〜１３は、ＬＣＲ及びエンドヌクレアーゼIV修飾ＬＣＲに対する二価カチオンの効果に関する。実施例１０：ＬＣＲ及びエンドヌクレアーゼIV改良ＬＣＲに対するＭｎＣｌ₂の効果ＡＡ１２３-１Ｐ（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３-４Ｐ（２２）から成る非平滑プローブセット（表Ｉ参照）を用い、１０μｇ／ｍｌのＢＳＡと０.１ｍＭのＭｎＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌの反応容量中でＬＣＲを実施した。この実験では、実験に関係させないために、プローブＡＡ１２３-１Ｐ（２０）の５’末端をビオチンでハプテン化し、ＡＡ１２３-２（２０）の３’末端をジゴキシゲニンでハプテン化した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ３の約５％を〔α-³ ² Ｐ〕-コルディセピン三リン酸で３’端標識しておく）、酵素ＴｔｈＤＮＡリガーゼ及びＴｔｈエンドヌクレアーゼIVは夫々０.１５μｇ／ｍｌ及び４.１μｇ／ｍｌの濃度で存在した。標的ＤＮＡ分子数を０及び１０³にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと５５℃で１１０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-１０参照）で、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-１０は、重複反応の平均結合％及び（＋）／（−）標的比を示す。標的数１０³が標的数０から識別可能でないことが観察される。実施例１１：非修飾非平滑プローブによるＬＣＲに対するＣｏＣｌ₂濃度の効果ＡＡ１２３-１（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３-４（２２）から成る非修飾非平滑プローブセット（表Ｉ参照）を用いて、表Ｅ-１１に示す種々の量のＣｏＣｌ₂と１０μｇ／ｍｌのＢＳＡと３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含む２０μｌの反応容量中でＬＣＲを実施した。この実験では、プローブＡＡ１２３-１Ｐ（２０）の５’末端をビオチンでハプテン化し、ＡＡ１２３-２（２０）の３’末端をジゴキシゲニンでハプテン化した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ３の約５％を〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’端標識しておく）、ＴｔｈＤＮＡリガーゼの最終濃度は０.１５μｇ／ｍｌであった。標的ＤＮＡ分子数を０及び１０⁶にして重複反応を実施した。サンプルを１０μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと５５℃で１１０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。２０または３０サイクルで、１.４μｌのアリコートを取出し、２.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-１１は、重複反応の平均結合％及び（＋）／（−）標的比を示す。標的ＤＮＡの存在下及び非存在下の双方の反応中にＣｏＣｌ₂が増幅の程度に阻害効果を有することが観察される。これはＣｏＣｌ₂がＴｔｈＤＮＡリガーゼに対して阻害効果を有することを意味する。実施例１２：ＭｇＣｌ₂及びＣｏＣｌ₂の非存在下の修飾プローブ及び非修飾プローブによるＬＣＲ４７ｍＭのＥＰＰＳ,ｐＨ７.８と８０ｍＭのＫＣｌと１０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌと５ｍＭのＭｎＣｌ₂と１０μｇ／ｍｌのＢＳＡと１５μｇ／ｍｌのヒト胎盤ＤＮＡとを含有しＭｇＣ１₂またはＣｏＣｌ₂非含有のバッファ中でＬＣＲを実施した。この実験では、３’-リン酸化末端、３または５塩基の延長を伴う非塩基性部位及び非修飾を夫々代表する以下の４組のプローブセットを使用した（表Ｉ参照）。非修飾非平滑セット： AA123-1（20）,AA123-2,AA123-3（18）,AA123-4（22）３’-リン酸化セット： AA123-1P（20）,AA123-2,AA123-3（18）,AA123-4P（22）非塩基性延長セット： AA123-1E3,AA123-2,AA123-3（18）,AA123-4E3 非塩基性延長セット： AA123-1E5,AA123-2,AA123-3（18）,AA123-4E5 標的ＤＮＡ分子数を０または１０⁴にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと５５℃で１１０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。６０サイクル後に、３.０μｌのアリコートを取出し、３.０μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。どのプローブセットでも増幅は発生せず、これは、５ｍＭのＭｎＣｌ₂が、低濃度のＣｏＣｌ₂ またはＭｎＣｌ₂を補充した１０ｍＭのＭｇＣｌ₂に代替できないことを示す。１０ｍＭのＭｎＣｌ₂を加えた以外は上記と同じバッファを使用し、ＡＡ１２３-１（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（１８）及びＡＡ１２３-４（２２）から成る非修飾プローブセットを用いた同様のＬＣＲアッセイでも４４サイクルまで増幅は観察されなかった。実施例１３：種々のコバルト濃度を用いたＬＣＲ及びＥｎｄｏIV ＬＣＲ５０ｍＭのＥＰＰＳ,ｐＨ７.８と５ｍＭのＭｇＣｌ₂と２０μｇ／ｍｌのＢＳＡと１×１０¹²の以下の表IVのオリゴと２１５単位の好熱菌Thermus thermophil us ＤＮＡリガーゼと１.５×１０^-4希釈度のT.thermophilusエンドヌクレアーゼIVと５００ μＭ〜２ｍＭの範囲の種々の濃度のＣｏＣｌ₂とから成る反応ミックスを最終反応容量２０μｌ中で用いて、ＥｎｄｏIV-ＬＣＲアッセイを実施した。オリゴは、Ｈａｔｔ,Ｃ.ら,Ｎｕｃ.ＡｃｉｄｓＲｅｓ.１６：４０５３-４０６７（１９８８）によって与えられるようなChlamydia trachomatis潜在プラスミドの６６９３-６７３９位に特異的である。オリゴ＃１及び＃４は以下のような３’リン酸ブロッキング基を含む。ＥｎｄｏIV-ＬＣＲのサイクル処理条件としては、９５ ℃で３０秒間、次いで５５℃で１１０秒間をＣｏｙサーモサイクラー内で３０回反復した。ｄＨ₂Ｏ中の３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡを用いて陰性反応物を調製した。陽性反応物は、３００ｎｇの胎盤ＤＮＡのバックグラウンド中にC.tracho matisプラスミド配列のマップ位置６６９３-６７３９に対応する合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを１０⁴または１０⁶の分子数で含んでいた。増幅後に、反応物をＩＭｘ希釈バッファで１：１に希釈し、ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）全自動イムノアッセイシステムを用いたサンドイッチイムノアッセイによってＬＣＲ増幅産物を検出した。結果を以下の表Ｅ-１３に示す。１.０ｍＭ以下のコバルト濃度で、標的数１０⁶が標的数０から識別可能であることが観察される。しかしながらそれよりも高いコバルト濃度では標的が識別可能でなかった。実施例１４〜１７は、リボヌクレオチド残基も含みエンドヌクレアーゼIVで修正可能な被修飾プローブを用いたＬＣＲ反応の使用に関する。慣用のＬＣＲ反応物に関してＷＯ９１／１７２７０に教示されているように、リボヌクレオチド残基は、不時の汚染を防除する手段としてＲＮアーゼまたはアルカリを用いて増幅産物を選択的に破壊し得る。これらの実施例で使用したプローブを以下の表Ｖに示す。実施例１４：３’リン酸ブロッキング基を有する混合リボ-及びデオキシリボ-オリゴヌクレオチドの調製アデノシンリボヌクレオチドを担う固相支持体上で合成を開始することによって、混合リボ-及びデオキシリボ-オリゴヌクレオチドＡＡ１２３-１Ｒ及びＡＡ１２３-４Ｒ（表Ｖ参照）を調製した。全自動ＤＮＡシンセサイザーを使用し、デオキシリボヌクレオチドホスホアミダイトを順次付加することによって合成を継続した。得られた混合オリゴヌクレオチド（「リボ-修飾」プローブ）を支持体から切り離し、３７％のＮＨ₄ＯＨに５５℃で１２時間接触させて脱保護し、Ｃ１８カラムで逆相ＨＰＬＣによって精製した。３’末端残基に２’-ＯＨ及び３’-³²ＰＯ₄基を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成するために放射性リン酸基部分を２段階で付加した。まず、リボ-修飾プローブＡＡ１２３-１ＲまたはＡＡ１２３-４Ｒを、２０ｐｍｏｌの〔 α-³²Ｐ〕-コルディセピン５’-三リン酸（５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と１０単位のデオキシヌクレオチジルターミナルトランスフェラーゼと共に、１４０ｍＭのカコジル酸ナトリウム，ｐＨ７. ２と１ｍＭのＣｏＣｌ₂と０.１ｍＭのジチオトレイトールとによって緩衝化した１５μｌの反応総量中で３７℃で１.５時間インキュベートした。５ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０と０.１ｍＭのＥＤＴＡとによって平衡させた１.０ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘＧ-５０カラム上で未反応のコルディセピンをオリゴヌクレオチドから分離した。２滴の分画（約７５μｌ）を収集し、４.０ｍｌの液体シンチレーションカクテル中で１.０μｌの各分画をカウントすることによって溶出プロフィルをモニターした。オリゴヌクレオチドを含有する分画をプールした。得られたオリゴヌクレオチドは、３’末端に単一の２’-ＯＨ基に隣接した単一の³² Ｐ-標識３’-ホスホジエステル結合を含む。次に、オリゴヌクレオチドとコルディセピンとの間のホスホジエステル結合をＴ２ＲＮアーゼによって開裂して、３’をアデノシン残基まで切断し、コルディセピンデオキシリボヌクレオシドと所望のリボ-修飾プローブとを遊離させた。約０.２ｐｍｏｌの³²Ｐ標識ＡＡ１２３-１ＲまたはＡＡ１２３-４Ｒを、２.５単位のＴ２ＲＮアーゼと共に、５０ｍＭの酢酸カリウム,ｐＨ５.２で緩衝化した４.０μｌの反応総量中で３７℃で１時間インキュベートした。５.０μｌの停止バッファを添加して反応を終了させ、１.０μｌの５’ＬＣＲバッファを２０×４０×０.０４ｃｍの変性１２.５％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、３０Ｗで１.７５時間電気泳動させた。図５（レーン３及び１１）から明らかなように、〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン標識ＡＡ１２３-１Ｒ及びＡＡ１２３-４ＲのＲＮアーゼ消化から得られた産物ＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）及びＡＡ１２３-４ＲＰ（２０）は、未消化のオリゴヌクレオチド（レーン２及び１０）よりも速やかに泳動する。Ｔ２ＲＮアーゼによる消化産物は１塩基の長さだけ短縮していると予想されるが、未消化物よりも２塩基短い軽度の欠陥配列と同様のＲｆ値で泳動することが観察される。この観察は予想通りであり、その理由は、ＤＮＡフラグメントの長さとＲｆ値との間の相関関係は同じ質量対電荷比を有する全てのＤＮＡフラグメントに基づくものであるが、３’-リン酸化オリゴヌクレオチドに関連した付加的な負電荷が電荷対質量比を増加させＲｆ値を増加させると考えられるからである。実施例１５：リボ-修飾プローブに対するエンドヌクレアーゼIVの活性リボヌクレオシドに付着した３’−ＰＯ₄基がＴｔｈエンドヌクレアーゼIVによって除去できるか、及び、酵素的除去のためにはＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）及びＡＡ１２３-４ＲＰ（２０）が相補的合成標的オリゴヌクレオチドＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）またはＡＡ１２３ＴＡＲ（３／４）の夫々（表III参照）にハイブリダイズしその結果として３’-ＰＯ₄が二重鎖領域中に存在することが必要であったか、を判断するために、３’-リン酸化オリゴヌクレオチドＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）及びＡＡ１２３-４ＲＰ（２０）を更に分析した。このために、〔α-³²Ｐ〕-コルディセピンで標識したＡＡ１２３-１Ｒ及びＡＡ１２３-４Ｒのアリコートを実施例１４に示すようにＴ２ＲＮアーゼで消化し、次いで、ＬＣＲバッファ中でＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）またはＡＡ１２３ＴＡＲ（３／４）の存在下または非存在下にＴｔｈエンドヌクレアーゼIVによる第２の消化を実施した。必要に応じて、１.７ｐｍｏｌのＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）またはＡＡＩ２３ＴＡＲ（３／４）とＴｔｈエンドヌクレアーゼIVとを４.１μｇ／ｍｌに等しい最終濃度に添加し、水を加えて容量を１０μｌに調整した。サンプルを５５℃で１時間インキュベートし、５.０μｌのアリコートを５.０μｌの停止バッファに取出し、次に、上記のごとき変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。図５（レーン４及び１２）に示すように、オリゴヌクレオチドからの３’-³² ＰＯ₄の除去は、Ｔ２ＲＮアーゼとＴｔｈエンドヌクレアーゼIVと標識オリゴヌクレオチドの相補的鎖との全部が存在するときにのみ生じる。これらの３種の材料のいずれか１つでも欠如していると、³²ＰラベルはＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）及びＡＡ１２３-４ＲＰ（２０）から除去されない。また、標的ＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）は存在するがＴｔｈエンドヌクレアーゼIVは存在しないときにＴ２ＲＮアーゼによってＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）が開裂すると、相補的標的の非存在下のＴ２ＲＮアーゼによって観察される産物と同じサイズの産物が生じることが観察された（データ示さず）。これらの結果は、〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン標識オリゴヌクレオチドのＴ２ＲＮアーゼ処理で得られる３’-ＰＯ₄基と考えられる反応産物が、確かにエンドヌクレアーゼIVの適正な基質であり、エンドヌクレアーゼIVに対して前述のＤＮＡ基質と同じ二重鎖基質特異性に従うことを示す。実施例１６：エンドヌクレアーゼIV産物の結合の証明部分Ａ．全自動ＤＮＡシンセサイザーを使用し、２-〔〔２-〔４，４’-ジメトキシトリチル）オキシ〕エチル〕スルホニル〕エチル２-シアノ-エチルＮ,Ｎ ’-ジイソプロピルホスホアミダイト（Ｈｏｒｎ,Ｔ＆Ｕｒｄｅａ,ＭＴｅｔ.Ｌｅｔｔ .２７４７０５＋（１９８６））と共に、論文（Ａｓｈｅｌｙ,ＧＷ＆Ｋｕｓｈｌａｎｄ,ＤＭＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：２９２７- ２９３３（１９９１））に記載された手順で全自動合成を開始し、次いで、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドシアノエチルホスホアミダイトを順次付加することによって、３’リン酸化プローブを合成した。オリゴヌクレオチドを支持体から切り離し、３７％のＮＨ₄ＯＨと共に５５℃に１２時間維持して脱保護し、Ｃ１８カラムの逆相ＨＰＬＣによって精製した。部分Ｂ．次に、３’-リン酸基をＴｔｈエンドヌクレアーゼIVによって（実施例１５と同様にして）除去すると、得られたリボ-修飾オリゴヌクレオチドがＴｔｈＤＮＡリガーゼによる結合の適正な基質であることが証明された。２. ０ｍＭのＣｏＣｌ₂と１０μｇ／ｍｌのＢＳＡとを補充したＬＣＲバッファ中の８３ｎＭの実施例１４で得られたＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）と、１６ｎＭのＡＡ１２３−２（約２５％を〔α-³²Ｐ〕-コルディセピン三リン酸によって３’- 標識しておく）と、６６ｎＭのＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）とを含む重複反応物を、０.１５μｇ／ｍｌのＴｔｈＤＮＡリガーゼ及び／または４.１μｇ／ｍｌのＴｔｈエンドヌクレアーゼIVの存在下または非存在下で５５℃で１時間インキュベートした。また、３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡを含有しＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）非含有の同様のアッセイを実施した。図６（レーン３及び４）から観察されるように、ＴｔｈエンドヌクレアーゼIVとＴｔｈＤＮＡリガーゼとＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）との全部が存在するときにのみＡＡ１２３-２のほぼ全部が結合産物に変換された。また、ＡＡ１２３ＴＡＲ（１／２）及びリガーゼが存在するがＴｔｈエンドヌクレアーゼIV存在しないときには少量の結合産物が形成されることも観察された（図６、レーン１及び２）。ＴｔｈエンドヌクレアーゼIVの非存在下の結合産物の形成は、ＡＡ１２３-１ＲＰの３’位置が３’-Ｐ０₄基によって完全にはブロックされていないことを意味する。３’-ＯＨ基は合成中の不完全な３’-リン酸化または合成後の強アルカリ処理中の２’-ＯＨ基による３’-ＰＯ₄基の除去及び／または置換によって生じるであろう。ブロックされない３’-ＯＨ基を生じる原因が交換反応であるとすれば、ＴｔｈＤＮＡリガーゼは２−ＰＯ₄,３’-ＯＨリボヌクレオシドを基質として使用することができるに違いない。実施例１７：３’リン酸基を担う３’リボヌクレオチドを含む被修飾プローブを用いたＬＣＲＡＡ１２３-１ＲＰ（２０）、ＡＡ１２３-２、ＡＡ１２３-３（２０）及びＡＡ１２３-４ＲＰ（２０）から成る平滑端プローブセット（表Ｖ参照）を用いて、１０μｇ／ｍｌのＢＳＡと０.５ｍＭのＣｏＣｌ₂と３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡとを補充したＬＣＲバッファを含有する２０μｌの反応容量中でＬＣＲを実施した。各プローブは８３ｎＭの濃度で存在し（検出可能にするためにプローブ２の約５％を〔γ-³²Ｐ〕-アデノシン三リン酸によって５’端標識した）、酵素ＴｔｈＤＮＡリガーゼ及びＴｔｈエンドヌクレアーゼIVは夫々０.１５μｇ／ｍｌ及び４.１μｇ／ｍｌの濃度で存在した。標的ＤＮＡ分子数を０、１０³及び１０⁴にして重複反応を実施した。サンプルを１５μｌの鉱油で覆い、９５℃で３０秒間のインキュベーションと、５５℃で１１０秒間のインキュベーションとの継続から成る温度サイクルで処理した。特定サイクル数（表Ｅ-１７参照）で、１.７μｌのアリコートを取出し、２.５μｌの停止バッファと混合し、９０℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに加えた。表Ｅ-１７は、重複反応の平均結合％及び括弧内は（＋）／（−）標的比を示す。標的数１０³が標的数０から識別可能であることが観察される。実施例１８及び１９では、標的としてプラスミドｐＵＣ１９を使用しており、以下の表VIには“ｐＵＣ”という名称で示す。（ダッシュ記号に）続く数字は同一セット中の４つのプローブの位置を示す。-１及び-２の番号のプローブは同じ５’-３’方向を有し、-３及び-４の番号のプローブは反対方向を有している。-１及び-３の番号のプローブがハイブリダイズし、同様に-２及び-４の番号のプローブがハイブリダイズする。“Ｐ”及び“ｐ”はリン酸基を示す。これは通常は５’末端に必要とされる基であるが、３’末端では結合ブロッキング修飾として機能する。“Ｅ ”及び“ｘ”は（後述するような）非塩基性部位を示す。“Ｅ”の後の数字“１ ”は非塩基性部位から突出する相補的塩基（オーバーハング）の長さを示す。実施例１８：３’-リン酸基でブロックされたプローブと共にｐＵＣ１９標的を用いたＬＣＲｐＵＣ１９標的配列をＬＣＲによって低いバックグラウンドレベルで検出するようにプローブセットを設計する。プローブセットは（表VI参照）、２つの正常プローブ（ｐＵＣ-２及びｐＵＣ-３）と、末端３’リン酸ブロッキング基を含む２つのプローブ（ｐＵＣ−１Ｐ及びｐＵＣ−４Ｐ）とから成る。種々の量の標的（ｐＵＣ１９）を使用し、（実質的に本文中に記載の手順によって）ＬＣＲ反応を実施する。各サイクルのハイブリダイゼーション段階後、大腸菌から精製されたエンドヌクレアーゼIVを反応に加える。大腸菌エンドヌクレアーゼIVがある程度熱安定性なので標準ＬＣＲ条件下に反応させる。または、好熱菌Thermus thermophilusのような熱安定種に由来のエンドヌクレアーゼIVを使用し得る。対照として、エンドヌクレアーゼIV不添加で同数の標的を用いてＬＣＲを行う。これらの対照中で使用されるプローブセットは、プローブ-１及び-４が（３’リン酸基を含む）３’末端ヌクレオチドを含まないことだけを除いて上記プローブセットと同じものである。実験反応及び対照反応の双方で、結合産物の出現速度は添加した標的分子の初期数と相関関係を有している。２つのプロトコルの違いは、対照の場合には、標的分子非含有の「ブランク」管が１０００個の標的分子含有の管とほぼ同じ速度のシグナルを生じたが、被修飾プローブとエンドヌクレアーゼIVとを使用した場合には、標的分子非含有の「ブランク」管が１０００個の標的分子含有の管よりも有意に遅いシグナルを生じたことである。このようなバックグラウンドの抑制はアッセイ感度の有効範囲を拡大するという利点を与える。ＬＣＲ及びＰＣＲの夫々において高度に熱安定性のリガーゼ及びポリメラーゼが有用であり望ましいのと同じ理由で、高度に熱安定性のエンドヌクレアーゼIV の使用が望ましいことは当業者に容易に理解されよう。また、ＤＮＡ鎖の５’または３’端の修飾を鋳型依存的に除去してそれまでブロックされていた５’リン酸基または３’ヒドロキシルをインタクトで残す既知または未知の他の酵素が上述のようなエンドヌクレアーゼIVと全く同様に使用できることも当業者に容易に理解されよう。実施例１９：非塩基性プローブと共にｐＵＣ１９標的を用いたＬＣＲｐＵＣ１９標的配列をＬＣＲによって低いバックグラウンドレベルで検出するプローブセットを設計する。プローブセット（表VI参照）は、２つの正常プローブ（ｐＵＣ-２及びｐＵＣ-３）と、標的に相補的な１つの正常残基が付加された３’端非塩基性部位を有する２つの被修飾プローブ（ｐＵＣ-１Ｅ１及びｐＵＣ-４Ｅ１）とから成る。実施例１８と同様の手順でＬＣＲ反応を実施する。結果及び解釈は実施例１８と同様であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者シマー，ジヨージ・エイチアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02172、ウオータータウン、アースナル・ストリート・4751、ボツクス・12 (72)発明者ヨーカム，ロバート・アールアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02173、レキシントン、オーチヤード・レーン・４

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）過剰量の少なくとも２セットのプローブ対を供給し、標的の存在下で上流側プローブの３’端が下流側プローブの５’端に結合して一次結合産物を形成し、第２セットのプローブが一次結合産物にハイブリダイズし且つ互いに結合して二次結合産物を形成し、（ｂ）ハイブリダイズした鎖の変性、付加されたプローブの再アニーリング及びそれらの結合を反復し、（ｃ）結合産物の形成の程度を検出する段階を含む標的核酸配列を増幅するリガーゼ連鎖反応方法において、（ａ）上流側プローブの少なくとも一方に３’端修飾を導入し、その結果として、該プローブはその下流側結合相手に結合できないようになり、前記３’端修飾は実質的に被修飾プローブが標的配列にハイブリダイズするときにのみ修正可能となり、（ｂ）標的が存在するならば被修飾プローブが標的にハイブリダイズして被修飾プローブ-鋳型複合体を形成し、（ｃ）エンドヌクレアーゼIV活性の作用で修飾が標的依存的に修正されて３’ヒドロキシル端が作成され、従って、修正されたプローブがその下流側結合相手に結合できるようになり、（ｄ）修正されたプローブがその下流側結合相手に結合して増幅産物を形成し、（ｅ）増幅産物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、修正及び結合の段階を反復して所望の標的配列を増幅するように改良されていることを特徴とする方法。２．前記３’修飾が、結合段階に必要な化学基をブロックするように前記プローブに付着したブロッキング部分から成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．ブロッキング部分が、式：〔式中、Ｚは-Ｈ、-（ＣＨ₂）_nＣＨＯ（但し、ｎは１から約３）、-デオキシリボース及び-ジデオキシリボースから成るグループから選択される〕で示されることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記ブロッキング部分がリン酸基であることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．少なくとも前記修正段階が、コバルト及びマンガンから選択された少なくとも約０.０５ｍＭの濃度の有効二価カチオンの存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記二価カチオンが約０.１〜約２.０ｍＭの濃度であることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記二価イオンが約０.５ｍＭ〜約１.０ｍＭの濃度のコバルトであることを特徴とする請求項５に記載の方法。８．前記二価イオンが約０.５ｍＭ〜約１.０ｍＭの濃度のマンガンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。９．１つまたはそれ以上の段階が、約０.５〜約２０ｍＭの濃度の二価マグネシウムの存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。１０．前記２セットのプローブ対は、前記プローブの少なくとも１つが少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む以外は、オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。１１．前記少なくとも１つのリボヌクレオチド残基が３’修飾に対して５’側に直結して存在することを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．更に３’端ブロッキング部分を有する前記プローブが更に少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含み、ブロッキング部分が前記リボヌクレオチドの３ ’位置に付着していることを特徴とする請求項３に記載の方法。１３．更に検出段階後に、ＲＮアーゼまたはアルカリを用いて結合産物を開裂する段階を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。１４．更に増幅段階前に、ＲＮアーゼを用いて結合産物を開裂する段階を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。１５．ブロッキング部分が、式：〔式中、Ｚは-Ｈ、-（ＣＨ₂）_nＣＨＯ（但し、ｎは１から約３）、-デオキシリボース及び-ジデオキシリボースから成るグループから選択される〕で示されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．前記ブロッキング部分が、予定結合点に対して３’ 側に直結した非塩基性残基を含む核酸オーバーハングであることを特徴とする請求項２に記載の方法。１７．修飾の前記修正は、実質的に前記被修飾プローブが標的または結合産物にハイブリダイズするときにだけ前記被修飾プローブが前記非塩基性部位の５’側で開裂されることによって生じることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．前記修正段階が、約０.０５ｍＭ〜約２.０ｍＭの濃度の有効二価コバルトイオンの存在下で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１９．前記ハイブリダイゼーション、修正及び結合の段階が、約０.５〜約１.０ｍＭの濃度の有効コバルトイオンの存在下で行われることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．前記二価マンガンイオンの濃度が少なくとも約０.０５ｍＭであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２１．前記修正段階が濃度約０.５ｍＭ〜約２０ｍＭの二価マグネシウムイオンの存在下で行われることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２２．前記２セットのプローブ対は、前記プローブの少なくとも１つが少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む以外は、オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。２３．更に検出段階後に、ＲＮアーゼまたはアルカリを用いて結合産物を開裂する段階を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。２４．更に増幅段階前に、ＲＮアーゼを用いて結合産物を開裂する段階を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。２５．前記検出が、上流側の第一プローブ及び下流側の第二プローブの外側端に付着したハプテンマーカーと、下流側の第一プローブ及び上流側の第二プローブの外側端に付着したリポーターまたは異なるハプテンとを利用して行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。２６．リポーターが放射性、蛍光性または化学発光性化合物であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２７．ブロッキング部分が検出可能ラベルを含み、前記検出が、被修飾プローブから遊離される検出可能ラベルをモニターすることによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。２８．３’修飾を含む前記上流側プローブとその相補的プローブとは、２つのプローブが互いにハイブリダイズすると、相補的プローブの５’末端残基と、修飾部位に対して５’側の少なくとも１つの残基である上流プローブ中のヌクレオチド残基とが向き合うように選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。２９．３’非塩基性部位を含む前記上流側プローブとその相補的プローブとは、２つのプローブが互いにハイブリダイズすると、相補的プローブの５’末端残基と、非塩基性部位に対して５’側の少なくとも１つの残基である上流プローブ中のヌクレオチド残基とが向き合うように選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。３０．（ａ）リガーゼ連鎖反応によって結合し得べく標的とハイブリダイズ可能な２対のプローブであって、プローブの少なくとも１つが修飾され、その結果としてハイブリダイズしたときにリガーゼはその基質である被修飾プローブに作用することが実質的にできない２対のプローブと、（ｂ）増幅産物を組立てるリガーゼ活性を有する第１の酵素試薬と、（ｃ）プローブ-鋳型複合体にリガーゼ試薬が作用できるように被修飾プローブを標的依存的に修正し得るエンドヌクレアーゼIV活性を有する第２の酵素試薬との組み合わせから成る診断用キット。３１．更に、０.０５ｍＭ〜約２.０ｍＭの二価コバルトイオンを含むバッファまたはバッファ調製手段を含む請求項３０に記載のキット。３２．更に、ＲＮアーゼ試薬またはアルカリ性試薬を含む請求項３０に記載のキット。３３．第１の酵素試薬、第２の酵素試薬または双方が熱安定性であることを特徴とする請求項３０に記載のキット。３４．第２の酵素試薬がエンドヌクレアーゼIVから成ることを特徴とする請求項３０に記載のキット。３５．天然発生の核酸フラグメントを実質的に含まない核酸プローブであって、前記プローブが、プローブの５’端及び３’端を形成するためにホスホジエステル結合によって共有結合される少なくとも３つのデオキシリボヌクレオチドを有し、プローブが更に、３’端に１つのリボヌクレオチドを含み、リボヌクレオチドの３’位置に、式：〔式中、Ｚは-Ｈ、-（ＣＨ₂）_nＣＨＯ（但しｎは１〜約３）、-デオキシリボース及び-ジデオキシリボースから成るグループから選択される〕で示される基が付着していることを特徴とする核酸プローブ。３６．Ｚが水素であることを特徴とする請求項３５に記載のプローブ。３７．約１２〜約５０個のデオキシリボヌクレオチドを有することを特徴とする請求項３５に記載のプローブ。