JPH08509218A - 修飾されたタンパク質及びペプチド医薬品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ［修飾されたタンパク質及びペプチド医薬品］「部分」及び「完全」ＣＴＰ単位が、生理活性タンパク質及びペプチドのクリアランスのパターンを変えるため、該タンパク質及びペプチドを修飾するのに使用される。「完全」ＣＴＰ単位は、ヒトのコリオゴナドトロピンのβサブユニットの１１２〜１１８番目のうちの１つから１４５番目までの部分に見いだされるアミノ酸配列を持つ。「部分」ＣＴＰ単位は、１１８番目から１４５番目までの領域の中で少なくとも１アミノ酸が欠失しているものである。これらＣＴＰ単位の変異体は、その活性を破壊しないような１〜５個の保存的アミノ酸置換を含む。本方法で修飾される適当なペプチド又はタンパク質は、様々なホルモン及びサイトカインを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の名称］ 修飾されたタンパク質及びペプチド医薬品 ［関連出願の引用］ 本願は、１９９１年１０月４日提出の米国出願０７／７７１，２６２の一部継 続出願である。また、１９８９年２月２１日提出の米国出願０７／３１３，６４ ６の一部継続出願である、１９９０年６月１日提出の米国出願番号０７／５３２ ，２５４の一部継続出願でもある。上記出願の開示は、本願中に引用をもって組 み込まれている。 ［政府の援助に対する確認］ 本発明は、国立衛生研究所により与えられたＮＩＨ契約番号ＮＯ１−ＨＤ−９ −２９２２のもと、政府助成金によってなされたものである。政府は、本発明に おいて一定の権利を有する。 ［属する技術分野］ 本発明は、生理活性のあるペプチド及びタンパク質医薬品の投与の分野に関す る。更に詳しくは、本発明は、ヒトのコリオゴナドトロヒン（絨毛性性腺刺激ホ ルモン）のカルボキシ末端側のペプチド又はそのフラグメントに相当する延長配 列を含む修飾されたペプチド及びタンパク質の使用に関する。 ［従来技術］ １９９０年９月７日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９０／０９８００では、多くの生殖 ホルモンの修飾型について記載されている。同ＰＣＴ出願に記載のように、ホル モン、サイトカイン、ホルモン調節因子等の任意の生理活性タンパク質は、その タンパク質のカルボキシ末端に延長したアミノ酸を与えることによって、該タン パク質のクリアランスの性質が改良されるように修飾することができ、前記延長 は、ヒトのコリオゴナドトロピン又はその変異体のカルボキシ末端のことである 。本願で記載のように、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）に必要とされる部位 は、ヒトのコリオゴナドトロピンのβサブユニットの１１２〜１１８番目の任意 の１つの位置から１４５番目までである。ＰＣＴ出願においてさらに説明されて いるように、ＣＴＰ延長の変異体は、クリアランスの性質を変えることができる ＣＴＰの能力が破壊されることがないように、保存的なアミノ酸の置換によって 得られる。１１２〜１１８番目から１４５番目までにわたる配列より短いフラグ メントについては、特に開示されていないし、Ｃ−末端より他のところからの延 長についても開示されていない。 特にＦＳＨのＣＴＰ延長したβサブユニットについての結果は、本願出願人に よる２つの論文にもまた記載されている。：LaPolt，P.S．et al.;Endocrinolog y（1992）131:2514-2520及びFares，F.A．et al.;Proc Natl Acad Sci USA（199 2）89:4304-4308。両論文は、本願中に引用を持って組み込まれている。 ＣＴＰが修飾されていないペプチドのＣ−末端の代わりに、Ｎ−末端につけら れるか、又は両端につけられるか、もしくはペプチド内の任意の重要でない領域 に置かれたときは、望まれるクリアランスの性質を変更することができることが 分かり、しかしながら少なくとも１つのＯ−グリコシレーション部位を含んでい るはずのＣＴＰの一部分又はそのフラグメントだけを用いても同一効果を与える であろうことも分かってきた。望まれる効果は直列につなげられた延長が用いら れたときに保持されている。 ［発明の開示］ 本発明は、生理活性を持つタンパク質及びペプチドの修飾型を提供し、該修飾 型は、修飾されていないペプチド又はタンパク質よりもクリアランスの性質をよ り望ましいものに変える。この修飾は、Ｎ−末端又はＣ−末端又は両端を含めて 、ペプチド又はタンパク質の重要でない領域中に追加のアミノ酸配列を与えるこ とを含むものであって、延長は少なくとも１つのＣＴＰ由来の配列を含む。ＣＴ Ｐ由来の配列は、天然型のアミノ酸配列１１２〜１１８番目の１つから１４５番 目まで、又は本願中で定義しているようなその変異体 であり、ペプチドのカルボキシ末端だけが延長されているときはこの配列のフラ グメントのみ、もしくは該配列の直列につなげられた型でなければならない。 従って、一つの視点では、本発明は、修飾されたタンパク質又はペプチド医薬 品に関するものであって、該修飾は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列に 延長又は挿入することを含み、前記挿入又は延長は本質的にヒトのコリオゴナド トロピンβサブユニット又はその変異体のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）又 は少なくとも１つのＯ−グリコシレーション部位を含むその一部分に相当する少 なくとも一つの配列からなる。前記一部分とは、前記ＣＴＰの１１８番目から１ ４５番目までのアミノ酸配列よりも少なくとも１アミノ酸少ないようなアミノ酸 配列を含む。もし、生理活性ペプチド又はタンパク質のＣ−末端だけが延長され るとしたら、前記延長は、完全なＣＴＰ単位というよりむしろ本質的に前記一部 分から成っていなければならない。 他の視点では、本発明は、本発明に係る修飾されたタンパク質及びペプチドを 産生するための組換体の材料及び方法に関し、またそれらを含む医薬品組成物に 関する。 ［図面の簡単な説明］ 図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ一つ又は二つのＣＴＰ 単位により延長されたヒトのＦＳＨβサブユニットの構成を示す。図１Ｃは、発 現ベクターｐＭ²への延長ＦＳＨβサブユニットの挿入を示す。 図２は、ヒトのＣＧβの天然型及びトランケート型の発現ベクターを含むＣＨ Ｏ細胞のライゼート及び培地の免疫沈降物について行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥか ら得られたゲルの写真である。 図３は、図１Ａに記載のように、ＦＳＨβのカルボキシ末端に、１１５〜１４ ５番目に相当する１つのＣＴＰ単位を融台させる方法の詳細について示す。 図４は、αサブユニットのアミノ又はカルボキシ末端に、１１８〜１４５番目 に相当するＣＴＰサブユニットを挿入する位置を示す。 図５は、ＣＴＰによりカルボキシ末端のところで延長されたαサブユニット（ αＣ）の構成を示す。 図６は、Ｃαの構成を図示するものであって、ｈＣＧβの１１８〜１４５番目 に相当するＣＴＰ単位がαサブユニットの３番目と４番目のアミノ酸の間に挿入 される。 図７は、天然型のαサブユニット及びαＣの発現ベクターでトランスフェクト されたＣＨＯ細胞のラベルされたライゼート及び培地から得られたＳＤＳ-ＰＡ ＧＥの結果を示す写真である。 図８は、天然型のＦＳＨ及び延長されたβサブユニ ット又はαＣのどちらか又は両方を含むＦＳＨの生体外生理活性を示すグラフで ある。 図９は、天然型のＦＳＨ及びＣα又は両方を含むＦＳＨの生体外生理活性を示 すグラフである。 図１０は、ヒトのＣＧβの１１２〜１４５番目までのアミノ酸配列及びその番 号付けを示す。 ［発明の実施の形態］ ヒトのコリオゴナドトロヒン（ｈＣＧ）は、ろ胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄 体形成ホルモン（ＬＨ）、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をも含むファミリ ーの中の少なくとも４つの「生殖」（reproductive）ホルモンのうちの１つであ る。これらのホルモンは全て、与えられた種において、グループ内でアミノ酸配 列が同一であるαサブユニット及びファミリーのメンバーによってアミノ酸配列 が異なるβサブユニットを含む。ｈＣＧのβサブユニットは、該サブユニットが 本願中でカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）として称されているＣ−末端におよそ３ ４個の追加のアミノ酸を含むという点で、もう一方のβサブユニットよりも実質 上大きく、このＣＴＰが、他のゴナドトロヒンと比較して、ｈＣＧの血清での半 減期を比較的長くしている原因であると考えられている。（Hatzuk，M．et al. ，Endocrinol（1989）126:376）。天然型のホルモンでは、該ＣＴＰ延長は、４ つのムチン様Ｏ−結合型オリゴ糖 を含む。 本願中で使用されているように、ヘテロダイマー型と同様に、ヒトのアルファ サブユニット、及びヒトのＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ及びＣＧベータサブユニットは 、一般的にそれらの従来通りの定義のものであり、それ自体本分野で既知のアミ ノ酸配列を持つタンパク質、又はその対立遺伝子変異体、グリコシレーションの 表現パターンにかかわらず天然型のタンパク質の活性を保持するように意図的に 構成されたその突然変異タンパク質、又は天然型と、少なくとも９０％のホモロ ジー、好ましくは９５％のホモロジーを持つその突然変異型のことである。 これらのペプチドの「天然」型は、ヒト組織より単離されたアミノ酸配列をも つものであり、それ自体既知の配列を持ち、叉はその対立遺伝子変異体（alleli c variants）を有している。 これらのタンパク質の「突然変異タンパク質」型は、例えば部位特異的突然変 異誘発又は他の組換操作により産生された、又は合成により調製されたアミノ酸 配列の意図的変更ないし置換（alterations）がなされたものである。これらの 変更ないし置換により、そのサブユニットの生理活性は保持されたままであり、 及び／又はそのサブユニットは天然型と少なくとも９０％ホモロジー、好ましく は９５％ホモロジーを持つよ うなアミノ酸配列となるようにする。 グリコシレーションのパターンが、質においても量においても両方で活性にか なりの影響を与えることが認められているが、便宜上、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、 及びＣＧベータサブユニットという用語は、「アルファサブユニット」と同様に 、そのペプチドに特徴的なアミノ酸配列のことを意味する。ベータのみを言及す るときは、例えば、それについては、ＦＳＨベータという用語にする。ヘテロダ イマーに言及するときは、単純に「ＦＳＨ］という用語が使用される。グリコシ レーションパターンが、例えば、組換発現宿主又はグリコシレーション部位の変 更によって、どのような影響を受けるかは脈絡（context）から明らかであろう 。特定のグリコシレーションパターンを持つ糖タンパク質の型は、その旨記載さ れる。 本願中で使用されているように、「ペプチド」及び「タンパク質」は、それら の間での長さの区別は任意であるので、お互いに交換して使用される。 ペプチド又はタンパク質の「重要でない（noncritical）」領域は、生理活性 に必要とされない該分子の領域のことである。一般に、これらの領域は、結合部 位、前駆体切断部位、及び触媒部位から除かれたところである。 本願中で使用されているように、「ＣＴＰ」単位は、 Ｃ−末端側の１１２〜１１８番目の１つから１４５番目までにわたるヒトのコリ オゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端側に見いだされるアミノ酸配 列、又はその一部である。従って、それぞれ「完全な（complete）」ＣＴＰ単位 はＣＴＰのＮ−末端に依存して、２８〜３４個のアミノ酸を含む。１１２〜１４ ５番目までの天然型の配列が図１０に示されている。 「部分（partial）」ＣＴＰ単位は、１１２〜１１８番目の１つから１４５番 目までに含まれるアミノ酸配列であるが、最も短い可能な「完全な」ＣＴＰ単位 （つまり、１１８〜１４５番目まで）から少なくとも１アミノ酸が欠失したアミ ノ酸配列である。本発明に係る「部分」ＣＴＰ単位は少なくとも１つのＯ−グリ コシレーション部位を含んでいなければならない。ＣＴＰ単位は、４つの前記部 位を含んでおり、それは、Ｐ２１番目（部位１）、１２７番目（部位２）、１３ ２番目（部位３）、１３８番目（部位４）のセリン残基である。本発明に有用な ＣＴＰの部分型は、天然のＣＴＰ配列中に現れる順に並べられた１以上の前記部 位を含むであろう。従って、本発明に有用な「部分」型ＣＴＰは、全ての４つの グリコシレーション部位を含んでいても良く、或いは部位１、２、及び３；部位 １、２、及び４；部位１、３、及び４；部位２、３、及び４；又は単に部位１及 び２；１及び３；１及び４；２ 及び３；２及び４；又は３及び４；又は単に、部位１、２、３、又は４の１つだ けを含んでいても良い。 「直列」（tandem）長は、挿入又は延長が少なくとも２つの「ＣＴＰ単位」を 含んでいることを意味する。各ＣＴＰ単位は、完全なもの又はフラグメント、及 び天然型又は変異体であっても良い。直列の延長又は挿入の中のＣＴＰ単位は全 て同一であっても良い、もしくはお互いに異なっていても良い。従って、例えば 、直列の延長又は挿入は、一般的に、部分−完全；部分−部分；部分−完全−部 分；完全−完全−部分等であっても良く、前記の部分又は完全ＣＴＰ単位はそれ ぞれ独立して変異体もしくは天然型配列であっても良い。変異体の性質について は、以下で詳説する。 ［変異体］ 「ＣＴＰ単位」は、正確に天然型のＣＴＰ配列に対応するものであっても良く 、又は、該配列中に含まれる１〜５アミノ酸が、その位置で天然のアミノ酸の保 存的アナログにより置換されていて、累積的に行われた前記置換によりＣＴＰ単 位の性質を与える安定性においては実質上変化を生じないような変異体であって も良い。「保存的アナログ」は、従来の意味通り、置換された残基が、置換がな されたアミノ酸と同一の一般的なアミノ酸のカテゴリーに入るようなアナログで ある。アミノ酸は、本分野で理解されているような、 例えば、デイホッフ（Dayhoff，M）らにより、Atlasof Protein Sequences and Structure（1972）5:89-99の中でそのようなグループに分類されている。一般に 、酸性アミノ酸は１つのグループに分類され、塩基性アミノ酸は別のグループに ：中性親水性アミノ酸は更に別のグループに分類される、等という具合である。 更に詳しくは、アミノ酸残基は、一般に以下のような４つの主要な下位分類（ subclass）をすることができる。 酸性：残基は、生理的ｐＨではＨイオンを失うため、マイナスの電荷を帯び、 ペプチドが生理的ｐＨで水性の媒体中にあるとき、残基が含まれているペプチド 中でのコンフォメーションにおける表面位置（surface positions）を求めて水 溶液により引きつけられる。 塩基性：残基は、生理的ｐＨではＨイオンと結合するため、プラスの電荷を帯 び、ペプチドが生理的ｐＨで水性の媒体中にあるとき、残基が含まれているペプ チドの中でのコンフォメーションにおける表面位置を求めて水溶液により引きつ けられる。 中性／無極性：残基は、生理的ｐＨでは帯電しておらず、ペプチドが水性の媒 体中にあるとき、残基が含まれているペプチドのコンフォメーションにおける内 側の位置（inner positions）を求めて水溶液から遠ざけられる。これらの残基 は、本願中では「疎水性」 とも呼ばれる。 中性／極性：残基は、生理的ｐＨでは帯電していないが、ペプチドが水性の媒 体中にあるとき、残基が含まれているペプチドのコンフォメーションにおける外 側の位置（outer positions）を求めて水溶液により引きつけられる。 もちろん、個々の残基分子の統計的集まりでは、帯電している分子もあれば、 そうでない分子もあり、より大きい又は少ない程度の水性の媒体への引力又は水 性の媒体からの斥力があるだろう。「帯電した」の定義に合うように、個々の分 子について有意なパーセンテージ（少なくともおよそ２５％）が、生理的ｐＨで 帯電しているものとする。極性か又は無極性かの分類に必要とされる引力又は斥 力の程度は、任意のものである。従って、本発明により特に意図されるアミノ酸 は一方もしくはもう一方として分類されている。特に示されていないほとんどの アミノ酸は、既知の性質に基づいて分類することができる。 アミノ酸残基は、環状か非環状か、及び芳香族かそうでないか、残基の側鎖置 換基について自明の分類法に従って、及び小さいか大きいかにより、更に下位分 類がなされる。もし、残基がカルボキシル炭素を含めて、全体で４炭素原子以下 しか含んでいないなら、該残基は小さいものと考える。もちろん、小残基は、常 に非芳香族である。 天然に存在しているタンパク質中のアミノ酸に対して、前記スキームに従った 下位分類は以下の通りである。 酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸； 塩基性／非環状：アルギニン、リジン； 塩基性／環状：ヒスチジン； 中性／極性／小：グリシン、セリン、システイン； 中性／無極性／小：アラニン； 中性／極性／大／非芳香族：スレオニン、アスパラギン、グルタミン； 中性／極性／大／芳香族：チロシン； 中性／無極性／大／非芳香族：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン 中性／無極性／大／芳香族：フェニルアラニン、及びトリプトファン。 遺伝子によりコードされる２級アミノ酸プロリンは、専門的には、中性／無極 性／大／環状及び非芳香族のグループに含まれるが、ペプチド鎖の２次コンフォ メーションに既知の影響を与えるため、特別な場合に当たり、従って、上記定義 したグループの中には含められない。 もし、本発明に係る修飾されたペプチドが、遺伝子の修飾により構成されるの なら、ＣＴＰ単位は遺伝子 にコードされたアミノ酸置換だけしか含んでいないだろう。しかしながら、もし 、ＣＴＰ単位が、標準的な、例えば、固相ペプチド合成法により合成され、そし て、例えば、アクセプターであるペプチド又はタンパク質のＣ−末端側に、酵素 的に結合されたとしたら、アミノイソブチリン酸（Aib）、フェニルグリシン（P hg）等のような遺伝子にコードされないアミノ酸が、それらのアナログ相当物に もまた置換することができる。 これらの非コードアミノ酸は、例えば、ベータ−アラニン（beta-Ala）、又は 、3-アミノプロピオン酸、4-アミノブチリン酸等の他のオメガ−アミノ酸、ザル コシン（Sar）、オルニチン（Orn）、シトルリン（Cit）、t-ブチルアラニン（t -BuA）、t-ブチルグリシン（t-BuG）、N-メチルイソロイシン（N-MeIle）、及び シクロヘキシルアラニン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、システイン酸（Cya） 、2-ナフチルアラニン（2-Nal）；1,2,3,4,-テトラハイドロイソキノリン-3-カ ルボン酸（Tic）；メルカプトバレリン酸（Hvl）；β-2-チエニルアラニン（Thi ）；及びメチオニンサルフォキシド（MSO）を含む。これらもまた、便利なこと に特定のカテゴリーに分類される。 上記定義に基づくと、 Sar及びbeta-Ala及びAibは、中性／無極性／小； t-BuA、t-BuG、N-Melle、Nle、Mvl及びChaは、中性／無極性／大／非芳香族； Ornは、塩基性／非環状； Cyaは、酸性； cit、アセチル-Lys、及びMSOは、中性／極性／大／非芳香族；及び Phg、Nal、Thi、及びTicは、中性／無極性／大／芳香族である。 様々なオメガ−アミノ酸は、中性／無極性／小（beta-Ala、つまり、3-アミノ プロピオン酸、4-アミノブチリン酸）又は大（他全て）のように、大きさに従っ て分類される。 従って、遺伝子においてコードされているアミノ酸より他のアミノ酸置換もま た本発明の範囲内でペプチド化合物中に含めることができ、それらの構造に従っ て、この一般的なスキームの中で分類することができる。 ［ＣＴＰ単位の好適な態様］ 本発明に係るＣＴＰ単位に対して使用される表記は以下の通りである。：完全 なＣＴＰ単位の一部分に対して、本願図１１の中で表されているように、該部分 に含まれる位置は、その番号によって表される。置換が存在しているときは、置 換されたアミノ酸が、その位置を示す上付き文字とともに与えられる。従って、 例えば、ＣＴＰ（１２０〜１４３）は、１２０番目から１４３番目までにわたる ＣＴＰ部分に相当する。ＣＴＰ（１２０〜１３０；１３６〜１４３）は、天然型 の配列の１１８〜１１９、１３１〜１３５、及び１４４〜１４５番目が欠失した 融合アミノ酸配列に相当する。ＣＴＰ（Ａｒｇ¹²²）は、１２２番目のリジン残 基がアルギニンにより置換された変異体を意味する。ＣＴＰ（Ｉｌｅ¹³⁴）は、 １３４番目のロイシンがイソロイシンにより置換された変異体を意味する。ＣＴ Ｐ（Ｖａｌ¹²⁸Ｖａｌ¹⁴³）は、２つの置換、１つは１２８番目のロイシン、もう １つは１４２番目のイソロイシンが置換されている変異体を表す。ＣＴＰ（１２ ０〜１４３；Ｉｌｅ¹²⁸Ａｌａ¹³⁰）は、２つの置換が起こっているＣＴＰ単位の 関連部分を表わす。 以下に示す式のＣＴＰ単位が特に好ましい。 ＃1 CTP（116-132） ＃2 CTP（118-128;130-135） ＃3 CTP（117-142） ＃4 CTP（116-130） ＃5 CTP（116-123;137-145） ＃6 CTP（115-133;141-145） ＃7 CTP（117-140，Ser¹²³Gln¹⁴⁰） ＃8 CTP（125-143，Ala¹³⁰） ＃9 CTP（135-145，Glu¹³⁹） ＃10 CTP（131-143，Mvl¹⁴²Cha¹⁴³） ＃11 CTP（118-132） ＃12 CTP（118-127） ＃13 CTP（118-145） ＃14 CTP（115-132） ＃15 CTP（115-127） ＃16 CTP（115-145） ＃17 CTP（112-145） ＃18 CTP（112-132） ＃19 CTP（112-127） ［修飾されたペプチド及びタンパク質］ 生物学的に意味のある任意のペプチド又はタンパク質は、本発明の方法に従っ て修飾をうける。従って、そのβ鎖、インスリン；ヒトの成長ホルモン及び他の 種の成長ホルモン；エンケファリン；ＡＣＴＨ；グルカゴン等を含めて、上記の ４つのヒトの「生殖」ホルモンのようなペプチドホルモンが、修飾を行う候補の 中に含められる。ＩＬ−２、ＩＬ−３及び過剰な追加のインターロイキンタンパ ク質のような様々なサイトカイン；様々なインターフェロン，腫瘍壊死因子等と 同様に、インスリン様成長因子；表皮成長因子；酸性及び塩基性繊維芽細胞成長 因子；血小板由来増殖因子のような様々な成長因子；顆粒球ＣＳＦ、マクロファ ージ−ＣＳＦ等のような様々なコロニー刺激因子が本 発明の修飾対象としてもまた有用である。（半減期の非常に短い）ｔＰＡ、ウロ キナーゼ及びトロンビンのような酵素がまた修飾されても良い。黄体形成ホルモ ン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；ソマトスタチン；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲ Ｆ）；及びエンドルフィンのような短いペプチド配列のものもまた本発明の方法 を行うための候補である。胞肺界面活性化タンパク質；ナトリウム利尿性因子； 接着物質；レセプターペプチド；一般的なレセプター結合リガンド：抗体及びそ のフラグメント；のようなさらなるタンパク質薬剤、及び望ましい生物機能を持 つ任意の他の有用なペプチド又はタンパク質が、本願中に記載の方法により修飾 することができる。 ＣＴＰ単位（unit(s)）が挿入されたペプチド又はタンパク質、又はＣＴＰ単 位（unit(s)）が延長として付加されたペプチド又はタンパク質は、生理活性が 保持されている限り、もちろん通常生物学的に存在している型由来のものの修飾 型でもありうるということは、注目すべきことである。 生殖ホルモンのαサブユニットが、本発明に係るＣＴＰ単位による修飾にとっ て特に好ましい候補である。これは、修飾されたαサブユニットと対応するβサ ブユニットとをカップリングすることにより、生物活性が拡張された、完全セッ トのホルモン（hormones）が 生成されるという利点を持つ。ＣＴＰ単位又は直列でつなげられた単位はαサブ ユニットのカルボキシ末端又はアミノ末端のどちらか一方又は両方で融合されて も良い。しかしながら、アミノ末端が好ましい。入手できる証拠から、アミノ末 端はβサブユニットとのアセンブリーにも関わっておらず、レセプター結合決定 因子とも結合していないことが示される。 上記のように、ＣＴＰ単位（unit(s)）の挿入又は延長は、望まれる生理活性 にとって重要でないようなペプチド又はタンパク質の領域の中で行わなければな らない。従って、適当な折りたたみの誘導、レセプターへの結合、触媒活性等に とって重要な領域は避けられるべきである。同様に、タンパク質の３次元コンフ ォメーションを保証するために重要な領域は、避けられるべきである。重要でな い領域の確認は、その候補となる領域を欠失又は修飾し、そして望まれる活性に ついて適当なアッセイを行うことによって、簡単になされる。修飾により活性が 失われる領域が重要な（critical）領域である。；変更ないし置換によって同一 活性又は類似の活性を有しているような領域は重要でない領域であると考えられ る。 多くの場合、重要な領域の位置は既知である。例えば、α−サブユニットにと って、３３〜５９番目はシグナル伝達に必要な部分であると考えられており、カ ルボキシ末端側の２０アミノ酸の範囲がシグナル伝達／レセプター結合に必要と される。βサブユニットとのアセンブリーに重要な残基には、少なくとも３３〜 ５８番目、特に３７〜４０番目が含まれる。 もし、アプローチング又はペプチド候補が充分に研究されていないなら、上記 のように、重要でない領域は、望まれる活性について適当なアッセイを行う際に その候補となる領域を欠失又は修飾することによって確かめることができる。一 般的なタンパク質にとっての出発点は、ＮＲＣ末端である。；しかしながら、い くつかの特別の場合では、これらの出発点は、必ずしも成功の結果をもたらすの ではない。Ｎ−末端及びＣ−末端自身に加えて、これら末端に近接する領域のと ころへの挿入もまた合理的な出発点を表す。ＣＴＰ単位又はその一部の挿入のた め、ある少数のアミノ酸が重要でない領域から欠失されても良い。本発明に係る 修飾されたタンパク質及びペプチドの好ましい態様には以下のものが含まれる。 CGα（1-3）-CTP#1-（4-92） CGα（1-3）-CTP#11-（4-92） CGα（1-3）-CTP#12-（4-92） CGα（1-92）-CTP#11 CGα（1-92）-CTP#12 CGα（1-3）-CTP#17（4-92） CGα（1-3）-CTP#18（4-92） CGα（1-3）-CTP#19（4-92） FSHβ（1-111）-CTP#11 FSHβ（1-111）-CTP#12 FSHβ（1-111）-CTP#11-CTP#12 proinsulin（1-3）-CTP#5-CTP#6（4-end） FSHβ（1-111）-CTP#13-CTP#13 TSHβ（1-110）-CTP#11 TSHβ（1-110）-CTP#12 LHβ（1-114）-CTP#14 LHβ（1-114）-CTP#15 LHβ（1-114）-CTP#16 LHβ（1-121）-CTP#11 LHβ（1-121）-CTP#12 LHβ（1-121）-CTP#13 tpA（1-2）-CTP#14（3-end） tPA（1-2）-CTP#15（3-end） tpA（1-2）-CTp#16（3-end） hGH（1-4）-CTP#11（5-end） hGH（1-4）-CTP#12（5-end） hGH（1-4）-CTP#13（5-end） IL-3（1-end）-CTP#14 IL-3（1-end）-CTP#15 IL-3（1-end）-CTP#16 ［カップルされた型］ 本発明に係る修飾されたペプチド及びタンパク質は、一般にアミノ酸配列を誘 導すると理解されている方法、例えばリン酸化、グリコシレーション、正常にグ リコシレーションされた型の脱グリコシレーション、アミノ酸側鎖の修飾（例え ば、プロリンからハイドロキシプロリンへの変換）及び一般的に起こることが分 かっているそれらの翻訳後修飾という事象に類似した同様の修飾のような方法に 従って、更にコンジュゲート又は誘導されても良い。 一般的に本分野で既知のように、本発明に係る修飾されたペプチド及びタンパ ク質は、望まれる適用に応じてラベル、薬剤、標的剤、担体、固形支持体等にカ ップルされても良い。修飾された生物製剤のラベルされた型は、それらの代謝過 程における運命を追跡するのに使用されても良い。；本目的に適当なラベルとし ては、特に、ヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１等のラジオア イソトープラベルが含まれる。該ラベルは、アッセイ系において修飾されたタン パク質又はペプチドの検出媒体としてもまた使用されて良い。；前記の場合には 、酵素ラベル、蛍光ラベル、発色性ラベル等と同様にラジオアイソトープがまた 使用されても良い。もし、ペプチド又はタンパク質がそれ自身抗体又はレセプタ ーリガンドのような標的剤で あるなら、そのようなラベルの使用は特に有用である。 逆に、もし、修飾されたペプチド又はタンパク質が主として標的となるリガン ドであり、代謝変更活性を比較的有しないなら、本発明に係る修飾された化合物 は、抗炎症剤、抗生物質、毒素等のような適当な薬剤にコンジュゲートされても 良い。本発明に係る修飾された化合物は、新しい修飾型と特異的に免疫反応性を 示す抗体の調製の際、免疫原性を促進するような担体にまたカップルされても良 い。本目的に適当な担体には、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びジフテリアトキソイド等が含まれる。２価リ ンカーの使用を含めて、本発明に係る修飾されたペプチドを担体に結合させるた めの標準的なカップリング技術か使用される。 同様の結合技術が、他とともに、本発明に係る修飾されたペプチド及びタンパ ク質を固形支持体にカップリングするために使用されても良い。カップルされる と、これらの修飾されたペプチド及びタンパク質は、特定の反応を示すような望 まれる成分の分離のためのアフィニティー試薬として使用することができる。 ［調製方法］ 本発明の修飾されたペプチド及びタンパク質生理活性化合物を構成する方法は 、本分野では良く知られている。前記のように、もし、遺伝子によりコードされ るアミノ酸だけが含まれるとすれば、現在最も実際的なアプローチは、望まれる ペプチドをコードしているＤＮＡを修飾することによって、組換的にこれらの物 質を合成することである。部位特異的ムタゲネシス（site-directed mutagenesi s）、追加の配列の結合、及び適当な発現系の構成のための技術は、全てこれま で本分野では良く知られている。望まれるペプチド又はタンパク質をコードする ＤＮＡに付加されるべきＣＴＰ単位（unit(s)）をコードするＤＮＡは、標準的 な固相法の技術を用いて、好ましくは、リケーションが簡単になるように制限部 位を含むように、最も便利なように合成的に構成され、そして候補ペプチド又は タンパク質をコードする配列にカップルされる。もし、候補ペプチド又はタンパ ク質をコードするＤＮＡが、すでに包含されたコード配列の転写及び翻訳のため の適当な制御要素を含む発現系の一部でないなら、修飾されたＤＮＡコード配列 がこのような特徴を提供してくれる。良く知られているように、発現系はバクテ リアのような原核生物宿主、及び酵母、植物細胞、昆虫細胞、ほ乳類細胞、トリ 細胞等の真核生物宿主を含めた、広範囲の多様な宿主と適合性のあるものが現在 入手することができる。 修飾されていないペプチドがα−サブユニットを含めた生殖ホルモンであると き、該α−サブユニットが 修飾されたものであろうが、修飾されていないものであろうが、その適当なαサ ブユニットの組換体の産生は、好ましくは「ミニ遺伝子」構成を用いて行われる 。 本願中で使用されているように、アルファサブユニット「ミニ遺伝子」は、マ ズック（Hatzuk，H.M.）らにより、Mol Endocrinol（1988）2:95-100の中で開示 されている遺伝子の構成を表しており、これにはpH²/CG alpha又はpM²/alphaの 構成について記載されている。この「ミニ遺伝子」の特徴は、エクソンIIIとエ クソンIVとの間のイントロン配列だけが残っていて、全ての上流にあるイントロ ンは欠失している。記載されている特定の構成では、エクソンII由来のＮ−末端 コード配列及びエクソンIIIの一部がｃＤＮＡから与えられ、XbaIの制限部位を 通して直接エクソンIIIのコード配列に結合され、その結果エクソンIとIIの間及 びエクソンIIとIIIの間のイントロンが欠失したものとなる。しかしながら、コ ード配列のシグナル３’と同様にエクソンIIIとIVの間のイントロンは残ってい る。その結果生じるミニ遺伝子は、都合の良いことに、BamHI/BgIII断片として 挿入することができる。もちろん、匹敵するミニ遺伝子を構成するため他の手段 を取ることも可能であり、同定義は、コード配列がXbaI部位を通して結合される 特定の構成に限定されるものではない。しかしながら、これは、遺伝子の構成に とって便 利な手段であり、遺伝子の合成による調製又は部分的な合成による調製のような 他のアプローチに対して特別の利点はない。同定義には、エクソンIIIとIVの間 のイントロン又は任意の他のイントロンを保持している、かつ好ましくは他のイ ントロンは保持していないアルファサブユニットのコード配列を含む。 組換体産生のため、発現系を使ってトランスフェクトされた宿主細胞が使用さ れ、望まれるタンパク質を産生するように培養される。これらの用語は、本願中 では以下のように使用される。 「トランスフェクトされた」組換体宿主細胞、つまり本発明の組換体発現系で トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション、ウイルス感染等を含め て、それを導入する任意の便利な方法によって、同発現系を含むように変更され た宿主細胞を意味する。「トランスフェクトされた」とは、該発現系を含む細胞 を表し、該系は染色体へ組み込まれるかもしくは染色体外に存在するかのどちら かである。「トランスフェクトされた」細胞は、該発現系の含有に関して、安定 かそうでないかのどちらかである。つまり、本発明の発現系でトランスフェクト された組換体宿主細胞は、細胞が本来発現系を保持していないとき、この取り込 みの様式によらず、該発現系を含むような操作が行われた結果、該発現系を含む ようになった細胞を意味す る。 「発現系」は、発現すべきコード配列及びコード配列の発現を行うのに必要な それらに付随する制御ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を表す。代表的には、これら 制御には、プロモーター、終結調節配列が含まれ、いくつかの場合では、オペレ ーター又は発現を調節するための他のメカニズムが含まれる。制御配列は、特定 の標的組換体宿主細胞において機能的であるようにデザインされ、従って、宿主 細胞は、構成された発現系において制御配列と適合性を持つように選ばれなけれ ばならない。 本願中で使用されているように、「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」 は、意味するところのニュアンスに特別の注意を払うことなく、お互いに交換し て使用される。それらの間の区別が重要なときは、脈絡から明らかであろう。任 意のものを意味することができるときは、全てが含められることを意図している 。 生産されるタンパク質は、もし細胞内で産生されるなら、細胞のライゼートか ら、又は、もし分泌されるなら、培地から回収されるであろう。細胞培養物から の組換体タンパク質の回収のための技術は本分野では良く理解されており、これ らのタンパク質はクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、選択的沈降等の既知の技 術を使用して精製することができる。 代わって、もし候補となる生物製剤が短いペプチドであるなら、もしくはサブ ユニットの酵素的トランスファーが行われ得るなら、本発明のＣＴＰ単位（unit (s)）は、生体外で固相ペプチド合成技術を用いて直接に合成されても良く、ま たもし望まれるなら、これらの条件のもと、ＣＴＰサブユニットは遺伝子により コードされるのでないアナログアミノ酸によって修飾されても良い。 ［抗体］ 本発明に係る修飾されたペプチド及びタンパク質は、これらの新しい化合物と 特異的に免疫反応性を示す抗体を作成するのに使用される。これらの抗体は、修 飾されていないペプチド又はタンパク質の生理活性の性質に依存して多様な診断 及び治療への適用の際に有用である。 該抗体は、ウサギ、マウス、ヒツジ又はラットのようなほ乳類において標準的 な免疫プロトコールを用いて一般に調製され、該抗体は十分な免疫化を保証する ためにポリクローナル抗血清としてタイターが測定される。ポリクローナル抗血 清は、例えばイムノアッセイに使用するために回収することができる。脾臓細胞 又は末梢血白血球のような宿主より得られた抗体分泌細胞は、既知の技術を用い て不死化され、本発明に係る修飾されたペプチドに免疫特異的なモノクローナル 抗体の産生についてスクリーニングすることができる。 「修飾されたペプチドに対して免疫特異的」とは、アフィニティとノンアフィ ニティーを決定するために考慮される一般的なパラメーターの範囲内で、ペプチ ド又はタンパク質のＣＴＰ単位で修飾された型とは免疫反応性を示すが、修飾さ れていない部分とは免疫反応性を示さない抗体を意味する。特異性は相対的な用 語であり、１００倍又はそれより大きい免疫反応性の違いのような任意の限界値 を選ぶことができると理解される。従って、本発明の中に含められる免疫特異的 な抗体は修飾されていない型より修飾されたタンパク質又はペプチドと少なくと も１００倍高い反応性を有するものである。 ［処方］ 本発明に係る修飾されたペプチド又はタンパク質は、該修飾型に対応する修飾 されていないペプチド又はタンパク質に対しての既知の方法に匹敵する方法を用 いて処方され、投与される。従って、処方及び投与方法は、候補となる修飾され ていない型によって多様であろう。しかしながら、修飾されたペプチド又はタン パク質において生物学的半減期が拡張されたことを考慮して、修飾されていない 型と比較して、投与量レベル及び投与回数は減少できよう。 本発明によれば、修飾されたペプチド及びタンパク 質の処方は、レミントンズ・ファルマスーティカル・サイエンス、最新版、マッ クパブリッシングカンパニー、イーストン、ＰＡ（Remington's Pharmaceutical Sciences，latest edition，Mack Publishing Company，Easton，PA）の中で見 いだされるような代表的なタンパク質又はペプチド薬剤の処方である。一般に、 タンパク質又はペプチドは、代表的には、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、又 は腹膜内注射によって、もしくは粘膜を通す又は皮膚を通すデリバリー（transm ucosal or transdermal delivery）のための処方を用いて、投与される。該処方 は、一般に胆汁酸塩やフシジン酸等の界面活性剤又は浸透剤を含む。該処方は、 煙霧剤又は坐剤として、もしくは皮膚を通した投与の場合、皮膚貼付薬の形で投 与される。 もし、該処方が消化系における分解から本発明のペプチドをプロテクトするな らば、経口投与もまた可能である。 投与量及び処方における最適化は、ルーチンマターとして、及び本分野で一般 になされていることとして行われる。 以下の実施例は、本発明を詳しく説明するものであって、本発明を限定するも のではない。 ［実施例１］２つのＣＴＰ単位を直列につなげた延長を持つヒトのβサブユニッ トの調製 図１Ａ及び１Ｂは、発現ベクターの構成を示すものであって、ヒトＦＳＨのβ −鎖は２つのＣＴＰ単位を含むように修飾されている。図１Ｂに示されているよ うに、１つのＣＴＰ単位により延長されているヒトのＦＳＨ−βサブユニットの ３’末端にあるHindIII部位は、ヒトのＨＣＧ−β遺伝子の３’末端からのＣＴ Ｐをカップルするのに使用され、延長されたβサブユニットが得られる。ｈＦＳ Ｈ−β（ＣＴＰ）。遺伝子は、発現ベクターｐＭ²につながれて、ほ乳類細胞で ＦＳＨ−βの延長型を産生することのできる発現系を得る。宿主発現ベクターの 構成については、マズック（Matzuk，H.M.）らにより、Proc Natl Acad Sci USA （1987）84:6354-6358の中で、またマズック（Matzuk，H.M.）らにより、J Cell Biol（1988）106:1049-1059の中で記載されている。 更に詳しくは、ｈＣＧβサブユニットのＯ−結合型末端領域の１単位を持つよ うなｈＦＳＨβキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ））を作成するために、HindIII部 位が、ｈＦＳＨβ遺伝子のコドン１１１番目、及びｈＣＧβ遺伝子のコドン１１ ８番目のストップコドンのところに作成された（図１Ａ）。ｈＦＳＨβ遺伝子よ り得られたHindIII-HindIIIフラグメントは、ＣＧβのＢamHI-HindIIIフラグメ ントにフレームを合わせてつなげられた。該キメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ））は 接合 点においてSer¹¹⁸からAla¹¹⁸への置換を含んでおり、オリゴヌクレオチド−ダイ レクティッドムタケネシス（oligonucleotide-directed mutagenesis）によって 正しくされた。２つの直列につながれたＣＴＰ反復を含むキメラ（ｈＦＳＨβ（ ＣＴＰ）₂）は、ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）キメラのストップコドンに新しいHindIII 部位を作成することによって構成された（図１Ｂ）。HindIII-HindIIIフラグメ ントは、ｈＣＧβから得られたBamHI-HindIIIフラグメントにつなげられた。生 じたalaコドンは前記のようにセリンコドンに再置換することができる。 真核生物発現ベクターｐＭ²にｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）又はｈＦＳＨβ（ＣＴＰ ）₂遺伝子を挿入するために、５’末端のHindIII部位が、クレノー（Klenow）及 びＢamHIオリゴヌタレオチドリンカーを用いてBamHI部位に変換され（図１Ｃ） 、ｈＦＳＨβＣＴＰ又はｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）₂遺伝子を含むBamHI-BamHIフラグ メントが、ｐＭ²のBamHI部位に挿入された。正しい配向は、制限酵素解析により 確認され、エクソンIIIの完全な配列が配列分析されて、突然変異誘発の特異性 が確認された。 ［実施例２］ＣＴＰを直列につながれた延長の効果 前記実施例１のようにして調製された２つのＣＴＰ単位によって延長されたβ サブユニットを含むヒトの ＦＳＨが、ラットに投与された。２４匹のスプラグーダーリィ（Sprague-Dawley ）のメスラットが、本研究では使用された。１２匹のラットは、HEH培地中で処 方された１０IUの修飾されていないＦＳＨをそれぞれ注射された。１２匹のラッ トはMEH培地中で処方されたｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）₂を含む１０IUのＦＳＨを注射 された。血清がすぐに、そして最初の１時間の間に数回、それ以後は２、４及び ８時間後に回収された。該血清は、ＦＳＨホルモンにとって標準的なラジオイム ノアッセイ技術を用いてアッセイされた。その結果から、血清中に存在する修飾 されていないＦＳＨの量は、８時間にわたる間で、およそ０．５IU/mlから０． ０５IU/mlより少ない量にまで減少するが、一方、２つのＣＴＰ単位を含む本発 明の修飾されたＦＳＨは、同期間の間およそ０．８IU/mlからおよそ0.5IU/mlま でと実質上変化がないままで保持されている。 ［実施例３］「部分」単位に相当するＣＴＰ単位の構成 ヒトのコリオゴナドトロビンβサブユニットをコードする遺伝子が、長末端反 復（ＬＴＲ）の下流にあるBamHI部位のところでプラスミドｐＭ²（上記）に挿入 された。BamHI/BgIIIフラグメントが部位特異的ムタケネシス（site-directed m utagenesis）のためにＭ１３にサブクローン化された。ストップコドンが１３ ３番目のアルギニン残基の代わりに、又は１２８番目のロイシン残基の代わりに 与えられる。突然変異のあるフラグメントはｐＭ²の宿主ベクターに再挿入され る。 ヒトのＣＧβのトランケート型をコードするベクターがＣＨＯ細胞にトランス フェクトされ、トランスフェクトされた細胞は、培養され、³⁵Ｓ−システインで ７時間ラベルされた。ライゼート及び培地が調製され、ＣＧβ抗血清で免疫沈降 された。沈降物は、ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動が行われ、その結果 は図２に示されている。図２では、カルボキシ末端によって、ライゼート及び培 地のレーンはラベルされている。大部分のセリン−Ｏ−結合型グリコシレーショ ンは、ちょうど分泌される前に行われるということは十分確立されている。従っ て、それが分泌されるときには、サブユニットの分子量の増加を反映するような 移動度のシフトがある。ここで見られるように、ｈＣＧβの短い型ではライゼー トから培地まで分子量のシフトにおける漸進的減少がみられる。本データにより 、トランケートされたサブユニットの分泌型はより小さい分子量を示すことが示 され、このことから、セリンのグリコシレーション部位が存在しないことが示さ れる。 ［実施例４］修飾されたＦＳＨβ及び他のペプチドの 構成 「完全」型又は「部分」型に相当するＣＴＰ単位が、図１Ａのように、ＦＳＨ βと突然変異の入った又は入っていないｈＣＧβ遺伝子の両方をHindIIIで切断 し、生じたＦＳＨの上流部分とＣＴＰ単位とをつなげることによって、ＦＳＨβ につなげられる。再結合により、ＣＴＰ単位の１１８番目の位置にserからalaへ の置換が起こっている。もし、望まれるなら、これは、図３に示したようにして 、セリンコドンへ再置換することができる。 同様に、ヒトのプロインスリン、成長ホルモン、α−サブユニットのＣ−末端 延長型が完全又は部分型におけるＣＴＰ単位から調製される。 ＣＴＰ単位は、図４に示されているように、α−サブユニットのアミノ末端又 はカルボキシ末端のどちらかに挿入することができる。例証されているように、 ｈＣＧβの１１８〜１４５番目の位置の部分が挿入される。 更に詳しくは、α−サブユニットのカルボキシ末端のところに「完全」又は「 部分」ＣＴＰ単位を含むキメラ（αＣ）を作成するために、アルファサブユニッ トとｈＣＧβ遺伝子を含むBamHI-BglIII及びHindIII-BamHIフラグメントについ てそれぞれポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が行われる。（Horton，R.H．et al .，Gene（1989）77:51-59）。これは、図５に図示されている。 示されているＧＨフラグメント、それはαミニ遺伝子から転写されたものだが （著者）（J Cell Biol（1988）106:1049-1059）、これはαサブユニットについ て完全な翻訳配列を含んでおり、ＣＧβサブユニットから得られたＣＴＰ配列を 含むＩＪフラグメントは、別のＰＣＲ反応において増幅された。ＧＨフラグメン トを増幅するために使用されるプライマ−Ｈの３’末端はＣＴＰ配列の５’末端 に相補的である。同様に、プライマーＩの５’末端は、α配列の３’末端に相補 的であった。従って、オーバーラップする２つの内部プライマーを使用すること によって、ＧＨ及びＩＪフラグメントは、「粘着性末端（sticky ends）」を共 有する。これらのフラグメントが、精製され、互いに混合され、ＰＣＲ用の鋳型 として使用された。オーバーラップ末端により、各フラグメントからの１本鎖が もう一方の鎖に対してプライマーとして働くようになり、Ｇ及びＩプライマーを 加えることによって、α−ＣＴＰキメラ遺伝子の増幅が可能になる。該α−ＣＴ Ｐ遺伝子はｐＭ²のBamHI部位に挿入された。 αＣの構成に使用されたプライマーの配列は、以下の通りである。：（５’→ ３’） オリゴヌクレオチドＧ及びＪはＭ１３ｍｐ１９（New England Biolabs 1992 cat alogue #1201 and #1211）のプライミング用である。オリゴヌクレオチドＧ及び Ｊは、それぞれポリリンカー領域の上流及び下流をプライムする。 αＣを構成するのに使用されるのと類似の方法で、ＣＴＰがαサブユニットの N-末端側のアミノ酸３／４結合の部分にまた挿入された（Ｃα；図５）。ＣＴＰ は、３番目と４番目のアミノ酸の間にあるサブユニットの内部領域に挿入された （図６）。 Ｃαの構成に使用されたオリゴヌクレオチドプライマーの配列は次の通りであ る。； オリゴヌクレオチドＡ及びＤは、Ｍ１３をプライムするのに使用される。 ＡＢフラグメントを増幅するのに使用されるプライマーＢの３−末端は、ＣＴ Ｐ領域の５’−末端に相補的な配列を提供する。同様に、ｃｄフラグメントを増 幅するのに使用されるプライマーＣの５’−末端は、α−サブユニット遺伝子の エタソン２の３’−末端に相補的である。該フラグメントは、ケル精製され、Ｐ ＣＲの鋳型として使用するために混合された。オーバーラップする末端によって 、各フラグメント由来の１本鎖が、もう一方の鎖に対してプライマーとしてはた らくようになる。ａ及びｄプライマーを加えることにより、完全なキメラを増幅 することが可能となる。 配向が正しいかは、制限酵素解析によって確認され、生じた修飾された遺伝子 は、正しい置換であることを証明するために配列分析された。 ［実施例５］修飾されたホルモンの産生 修飾されたα−サブユニット（αＣ）をコードする遺伝子は、ｐＭ²のBamHI部 位に挿入され、チャイニーズハムスターオバリーセルに単独でもしくはＣＧβ遺 伝子とともにトランスフェクトされた。Ｓ³⁵システインで安定クローンを連続的 にラベルすることにより、修飾されたペプチドの分泌型は対応する修飾されてい ない型よりもゆっくりと移動することが示される。図 ７で、レーン１及び３は、それそれ、修飾されていないα−サブユニット及びα Ｃを産生する細胞のライゼートを表す。ここにレーン２及び４は、対応する上清 である。修飾されたαＣの分泌型は、野生型のαと比較するとライゼート型につ いては移動度がかなり大きく変化しているので、分泌されたαＣは、ＣＴＰ延長 によって与えられたＯ-結合型オリゴ糖を含んでいると結論することができる。 ＣＨＯ細胞をＦＳＨβサブユニットとαＣ又はＣαのどちらかとでコトランス フェクションを行うことによって、天然型のＦＳＨに匹敵するくらいの効率で分 泌されるダイマーが生成された。 ［実施例６］生理活性 天然型のＦＳＨ及びαＣ又はＣαを持つＦＳＨダイマーは、ＦＳＨのイムノラ ジオメトリックアッセイ及び二重抗体ＲＩＡ（Diagnostic Products，Los Angel s）を用いて、調製された培地中で定量された。これらのホルモンの生体外生物 活性は、以前記載したように、顆粒膜細胞のアロマターゼバイオアッセイによっ て決定された（著者 J Biol Chem（1989）264:4764-4774;著者 Endocrinology（ 1986）119:1570-1577）。天然型ＦＳＨによる及びαＣ及びＣαＦＳＨによるエ ストロケン産生刺激は、３日間培養した後比較された。 図８では、天然型ＦＳＨ（黒丸）、αＣ−ＦＳＨβ （白四角）、及びＦＳＨβ−ＣＴＰサブユニット／α（白三角）のステロイド合 成の応答の様子を比較している。αサブユニットのカルボキシ末端にＣＴＰが存 在していると、生物応答がより低くなる（２５〜５０倍減少）ことが分かる。 対照的に、αサブユニットのアミノ末端側にＣＴＰが存在して（Ｃα）いても 、ＦＳＨダイマーのレセプター結合又はステロイド合成に影響はなかった（図９ ）。天然型ＦＳＨ（白丸）、天然型αとダイマー化されカルボキシ末端にＣＴＰ 単位を持つ延長されたＦＳＨβ（白三角）、Ｃαとダイマー化したＦＳＨβサブ ユニット（黒丸）、及びＣαとダイマー化したＣＴＰ延長されたβＦＳＨ（黒三 角）、これらは全て類似の活性を示す。最適濃度での修飾型は、天然型より幾分 高い活性を示す。予備結果より、Ｃαダイマーは天然型のホルモンに匹敵するく らいの生物活性を長時間作用アゴニストに与えることが示される。 さらなる結果から、特にＯ-結合型の部位が不足している部分ＣＴＰ配列を含 む修飾されたタンパク質は、完全な長さのＣＴＰを含むダイマーに匹敵するくら いの生物応答を誘導することが示されており、また抗原性がないことが期待され る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．修飾されたタンパク質又はペプチド医薬品であって、前記修飾は「完全な」 又は「部分」ＣＴＰ単位又はその変異体を前記タンパク質又はペプチドの重要で ない領域に挿入することを含み、但し前記重要でない領域がＣ−末端である場合 、前記挿入は部分ＣＴＰ単位で行うことを特徴とする修飾されたタンパク質又は ペプチド医薬品。 ２．請求項１記載の修飾されたペプチド又はタンパク質であって、 前記ＣＴＰ単位は天然型ＣＴＰ単位に見いだされる４つの全てのグリコシレー ション部位（部位１、２、３及び４）を含むか； 前記ＣＴＰ単位中のグリコシレーション部位が、部位１、２及び３；又は部位 １、３及び４；又は部位１、２及び４；又は部位２、３及び４から成るか； 前記ＣＴＰ単位中のグリコシレーション部位が、部位１及び２；又は部位１及 び３；又は部位１及び４；又は部位２及び３；部位２及び４；又は部位３及び４ から成るか；又は 前記ＣＴＰ単位中のグリコシレーション部位が、部位１、又は部位２、又は部 位３、又は部位４から成るか、 であることを特徴とする修飾されたペプチド又はタ ンパタ質。 ３．請求項１記載の修飾されたペプチド又はタンパク質であって、前記部分ＣＴ Ｐ単位がアミノ酸位置が、１１２〜１３２；１１５〜１３２；１１６〜１３２； 又は１１８〜１３２；又は１１２〜１２７；１１５〜１２７；１１６〜１２７； 又は１１８〜１２７から成ることを特徴とする修飾されたペプチド又はタンパク 質。 ４．請求項１記載の修飾されたペプチド又はタンパク質であって、前記重要でな い領域がＣ−末端の近傍にあるか；又は 前記重要でない領域がＮ−末端の近傍にあることを特徴とする修飾されたペプ チド又はタンパク質。 ５．少なくとも２つのＣＴＰ単位を含む請求項１記載の修飾されたペプチド又は タンパク質。 ６．請求項５記載の修飾されたペプチド又はタンパク質であって、前記少なくと も２つのＣＴＰ単位が異なったものであるか；又は 前記少なくとも２つのＣＴＰ単位が同一のものである ことを特徴とする修飾されたペプチド又はタンパク質。 ７．請求項１記載の修飾されたペプチド又はタンパク質であって、前記ペプチド 又はタンパク質がヒトの生殖酵素のαサブユニットであり、前記重要でない領域 がＮ−末端の近傍にあることを特徴とする修飾されたペプチド又はタンパク質。 ８．前記ペプチド又はタンパク質がサイトカインである請求項１記載の修飾され たペプチド又はタンパク質。 ９．前記ペプチド又はタンパク質がＩＬ−３である請求項８記載の修飾されたペ プチド又はタンパク質。 １０．請求項１記載の修飾されたペプチド又はタンパク質であって、前記ペプチ ド又はタンパク質がプロインスリンであるか； 前記ペプチド又はタンパク質がヒトのＦＳＨβであるか； 前記ペプチド又はタンパク質がヒトのＴＳＨβであるか；又は 前記ペプチド又はタンパク質がヒトのＬＨβであることを特徴とする修飾され たペプチド又はタンパク質。 １１．製薬的に受け入れることのできる賦形剤との混合物として請求項１記載の 修飾されたタンパク質又はペプチドを含む医薬品組成物。