JPH08509467A

JPH08509467A - 細菌接着のインヒビターとしてのオリゴ糖グリコシドの使用

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Publication number: JPH08509467A
Application number: JP6518792A
Authority: JP
Inventors: ノルマーク，ヤーン・スタツフアン; フアールク，ペル; ボレーン，トーマス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1996-10-08
Also published as: NO953281D0; CN1121311A; AU6042594A; HU9502497D0; WO1994018986A1; EP0690717A1; CA2157049A1; NO953281L

Abstract

(57)【要約】ヘリコバクター・ピロリは、急性（Ｂ型）胃炎、胃および十二指腸潰瘍、胃腺癌ならびに胃リンパ腫を包含する多くの病的状態における寄与因子として関連づけられてきた。本発明は、少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を含むジまたはオリゴ糖グリコシドのヒト胃粘膜におけるヘリコバクター・ピロリによる感染が関与する状態のヒトにおける処置および予防用の医薬組成物の製造のための使用ならびに少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位からなるジまたはオリゴ糖グリコシドの有効量をそれを必要とする患者に投与することによるジまたはオリゴ糖グリコシドを用いる上述の状態の処置方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】細菌接着のインヒビターとしてのオリゴ糖グリコシドの使用発明の分野本発明は少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を含むジまたはオリゴ糖グリコシドのヒト胃粘膜におけるヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）による感染が関与する状態のヒトにおける処置および予防用の医薬組成物の製造のための使用、ならびにこのような状態のジまたはオリゴ糖グリコシドを用いる処置方法に関する。発明の背景 Helicobacter pyloriは、微好気性らせん状微生物であり〔最初はキャンピロバクター（Campylobacter）属に分類された〕、この細菌は、胃内に見出され、一般的にはヒト胃腸管粘膜に唯一の生息場所があるように思われる。この細菌は 60歳に達するまでに60％以上のヒト成人の胃粘膜に感染すると予測されている。しかも、Helicobacter pyloriは急性（Ｂ型）胃炎、胃および十二指腸潰瘍ならびに胃腺癌を含む多くの病的状態に寄与因子として関与するとされてきた。細菌の組織向性は、一部は、その特異的生息場所における局所的化学的環境に順応するその細菌株の能力によって支配される．さらに、新たな生息場所からのたとえば胃腸管の蠕動による排除を防止するためのコロニー形成には接着が必須の前提条件である。哺乳動物においては、細菌は上皮細胞の表面（粘液）付近の上部または内部のタンパク質もしくは糖接合体（糖スフィンゴ脂質、糖タンパク質）に接着し、多くの特異的な細菌アドヘシン-タンパク質およびアドヘシン-炭水化物の相互作用が文献に報告されている。 Helicobacter pyloriに関しては、マウス副腎Ｙ-１細胞のようなモデル系における研究〔D.G．Evans，D.J.Jr．Evans & D.Y.Graham(1989)，Infect．Immun．5 7：2272-2278参照〕により、この細菌を取り囲む表面結合可撓性小線維構造がアドヘシンまたはコロニー形成因子抗原として機能し、Helicobacter pyloriの細胞性シアル酸含有糖タンパク質受容体への結合を仲介することが示唆されている。発明の概要 Helicobacter pyloriとヒト胃粘膜上皮細胞の間の相互作用の研究を通して、驚くべきことにまず第一に、Helicobacter pyloriは胃単位を構成する腺上皮中のある種の分化した上皮細胞にのみ接着もしくは結合することが見出されたのである。腺上皮内の胃単位は様々な機能を行うように分化した細胞で内張りされている。すなわち、胃単位の上方小窩領域（胃窩）は粘液産生表面上皮細胞で被覆され、一方、胃単位の狭窄中央部分（その峡部）は増殖性および非増殖性未成熟細胞、粘液頚細胞ならびに壁細胞から構成され、胃単位の下方部分（腺）は内因子およびペプシノーゲン産生主細胞、酸産生壁細胞、粘液頚および腺細胞ならびに各種の腸内分泌細胞種を含有する。本研究では、Helicobacter pyloriが上方小窩領域における粘液産生表面上皮細胞、すなわち表面粘液細胞にのみ結合することが明らかにされた。第二に、これらの研究により、Helicobacter pyloriの粘液産生表面上皮細胞への結合には細菌アドヘシンとシアル酸含有受容体の間の相互作用は関与せず、Ｌ-フコース（６-デオキシ-Ｌ-ガラクトースとしても知られている）の末端単位を含有する炭水化物構造との相互作用が関与することが明らかにされた。したがって、本発明は一態様において、少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドの、ヒト胃粘膜におけるHelicobacter p yloriによる感染が関与する状態のヒトにおける処置および予防用の医薬組成物の製造のための使用に関する。さらに、本発明は、Helicobacter pyloriによる感染によって起こるヒトでの疾患の、少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位からなるジまたはオリゴ糖グリコシドの有効量をそれを必要とする患者に投与することによる処置および／または予防方法に関する。発明の詳細な説明本発明においては「末端Ｌ-フコース単位」の語は、１-位置を介して結合する問題のＬ-フコース単位（単数または複数）がそれ自体他の炭水化物単位または基によってグリコシル化されていないことを意味する。しかしながらこれは、Ｌ -フコース単位によってグリコシル化される炭水化物単位がそれ自体、他の炭水化物単位または基によりグリコシル化されることを排除するものではない。本発明においては「オリゴ糖」の語は、グリコシドの糖部分が３個もしくはそれ以上の炭水化物単位、たとえば３〜10個の炭水化物単位からなることを意味する。本発明に用いられる少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドは、Helicobacter pyloriの表面上に存在するアドヘシンに結合できることが好ましい。少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドの、Helicobacter pylori細胞の胃上皮細胞への結合を阻害する能力を測定するのに現時点で最も有用なモデル系は、胃上皮細胞を含有するヒト胃組織の組織学的切片の使用を包含するインビトロ組織学的モデルである。したがって、本発明の使用または方法の好ましい実施態様は、末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドがヒト胃粘膜の組織学的切片における上皮細胞へのHelicobacter pylori細胞の接着を阻害するかまたは実質的に減少させることができるグリコシドである使用または方法である。さらに好ましくは、本発明の使用または方法に用いられるジまたはオリゴ糖グリコシドは、Helicobacter pyloriの細胞を濃度500μg／mlまでのジまたはオリゴ糖グリコシドとプレインキュベートした場合、上記細菌細胞のヒト胃粘膜の組織学的切片上皮細胞への接着を相当する非プレインキュベーション細菌細胞の接着に比べて少なくとも50％まで阻害できるグリコシドである。現時点で好ましい組織学的モデル系においてはヒト胃粘膜の組織学的切片は、非疾患ヒト胃粘膜組織のサンプルをフォルマリンで固定し、サンプルをパラフィン中に包埋し、包埋サンプルの約５μm切片を作成し、この切片をガラススライド上に載せ、キシレンおよびイソプロパノールによって洗浄して切片を脱パラフィンし、その切片をリン酸緩衝食塩溶液中好ましくはそれぞれ約0.2％および0.0 5％濃度のウシ血清アルブミンおよび非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤（たとえばTween-20）とからなる緩衝液とインキュベートすることによって調製される（実施例も参照のこと）。 Helicobacter pylori細胞の胃粘膜切片への接着の程度を測定する目的では、切片上の特定部位における細菌細胞の検出を可能にするある様式で、細菌細胞を標識することが有利である。標識は、生存細菌細胞もしくは顕微鏡サンプル上に置かれた細菌細胞の標識については、たとえば色素（たとえばグラム陰性菌に特異的な色素）による染色ついで顕微鏡による観察、放射性同位元素またはこのような同位元素を含有する化合物による標識ついでマイクロオートラジオグラフィー、H．pyloriを認識する標識（酵素標識、放射標識または他の標識）抗体による処置（上皮細胞への接着前または後）ついで接着した抗体の二次抗体酵素接合体もしくはELISA型検出またはマイクロオートラジオグラフィーによる検出もしくは可視化等、任意のよく知られた方法に従って実施することが考えられる。しかしながら、現時点で好ましい標識原理は、蛍光標識とくにフルオレセインイソチオシアネートによる標識である。これは食塩および炭酸ナトリウムをそれぞれ好ましくは約0.15Ｍおよび0.1Ｍの濃度で含有するpH約9.0の緩衝液中Helico bacter pylori細胞の懸濁液を約0.1mg／mlの濃度のフルオレセインイソチオシアネートで処理し、この細菌細胞懸濁液を室温で１時間インキュベートし、細菌細胞を遠心分離により分離し、ついで細菌細胞を非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤を好ましくは約0.05％濃度で含有するpH約7. 5のリン酸緩衝食塩溶液で洗浄することによって実施するのが有利である。少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドがヒト上皮胃腸細胞へのHelicobacter pyloriの接着を阻害する能力を測定するためには、細菌を組織切片と接触させ、上皮細胞の表面に接着させる前に通常、グリコシドとのプレインキュベーションに付す。細菌細胞のプレインキュベーションを実施するのに有利な方法の一つは、pH約7.5のリン酸緩衝食塩溶液中好ましくはそれぞれ約0.2％および0.05％濃度のウシ血清アルブミンおよび非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤からなる緩衝液中細菌細胞懸濁液に濃度500μg／ mlまでのジまたはオリゴ糖グリコシドを室温において約２時間を要して添加し、細菌細胞を遠心分離し、ついで細胞を同一の緩衝液中で洗浄する方法である。 Helicobacter pyloriの細胞（プレインキュベーションを実施したか否か、また標識されているか否かにかかわらず）について、ヒト胃腸粘膜中の上皮細胞に接着する能力を試験する場合には、１mlあたり細菌細胞約10⁶〜10⁸個を含有する希釈Helicobacter pylori細胞懸濁液を組織学的切片に適用し、この切片を細菌細胞懸濁液とともに加湿チャンバー内において室温で１時間インキュベートし、スライドをリン酸緩衝食塩溶液中で洗浄し、切片の上皮細胞への接着程度を確認することによって実施される。細菌が蛍光標識たとえばフルオレセインイソチオシアネートで標識されている実施態様においては、接着の程度の確認は、切片を蛍光顕微鏡下に検討し、切片内の表面上皮細胞に接着した蛍光性細菌の数から接着の程度を評価することによって行うのが通例であり便利である。実施例とくにそこに例示された図面も参照されたい。接着試験はHelicobacter pylori株NCTC 11637、NCTC 11638、WV229またはP466 の細胞を用いて実施することができる（以下の実施例参照）。本発明を使用して調製される医薬組成物がその処置および予防に用いられ、また本発明の処置方法が使用される、Helicobacter pyloriの胃腸感染が関与する状態としては、たとえば慢性活動型（Ｂ型）胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌および胃リンパ腫がある。好ましい実施態様においては、オリゴ糖は上述のように、２個の末端フコース単位を含有する。好ましい実施態様においては、用いられるジまたはオリゴ糖グリコシドは糖タンパク質である。用いられる化合物の興味ある例には、ヒトκ-カゼイン、ヒト初乳IgA、およびウシ顎下腺ムチンがある。さらに好ましい実施態様においては、オリゴ糖鎖の非還元末端における末端四糖は、ルイスｂ-四糖、すなわちFucα１−２Galβ１−３（Fucα１−４）GlcNAc β１−である。ジまたはオリゴ糖は医薬組成物中に任意の適当量を含有させることができる。一般的には、組成物の総重量に対して0.01％〜99重量％、または0.1％〜99重量％を含有させる。活性成分を含有する医薬組成物は、単回投与量単位または多重投与量単位としてこれらの範囲内で適宜処方することができる。本発明に用いられる活性ジまたはオリゴ糖グリコシドおよびそれらのグリコシドを含む組成物は通常、活性グリコシド成分約１mg／日〜約50ｇ／日、好ましくは約10mg／日〜約５ｇ／日に相当する量でヒト患者に投与される。ジまたはオリゴ糖グリコシドの投与量は一般的には、投与経路の選択、とくに処置される疾患およびその重篤度、また疾患の処置もしくは予防のいずれに用いられるか、ならびに患者の年齢および体重に依存する。医薬組成物は、好ましくは経口経路、非経口経路または直腸経路によって投与される。本発明を以下の非限定的実施例によってさらに詳細に説明する。例１生物学的実験材料および方法ヒト乳汁からのκ-カゼインの精製ヒト乳汁は使用時まで−20℃で凍結保存した．乳汁を解凍し15,000×ｇで45分間遠心分離してスキムミルクを得た。試験管の最頂部の脂肪層を注意深く除去し、一方、可溶性分画およびペレットをプールした。このプールをHClでpH4.3の酸性とし、CaCl₂を60mMの濃度に添加した。室温で１時間インキュベートしたのち、沈澱したカゼイン分画を18,000×ｇで90分間遠心分離して集めた。カゼイン分画を20mMエタノールアミン、６M尿素、pH9.5中に溶解した。残存する脂肪があれば除去するため、この水性分画を４倍容量のヘキサンで３回抽出した。ついで水相を蒸留水で透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥されたタンパク質を、50mMイミダゾール塩酸塩、0.5％SDS、0.5％２-メルカプトエタノール、pH7.0 に溶解しこれを50mMイミダゾール塩酸塩、0.5％SDS、0.5％２-メルカプトエタノール、pH7.0に温度37℃において平衡化したSephadex G-200カラム（1.6×120cm 、Pharmacia-LKB，Uppsala，Sweden）上クロマトグラフィーに付した。シッフ染色により検出されたκ-カゼイン含有分画をプールし、蒸留水中40％メタノールで３時間透析し、凍結乾燥して容量を減少させた。タンパク質を50mMイミダゾール塩酸塩、 0.5％SDS、0.5％２-メルカプトエタノール、pH7.0中に再溶解し上述の場合と同じ条件下、Sephadex G-200カラムに２回目の適用を行った。β-カゼインを全く含まないヒトκ-カゼイン含有分画を集め、40％メタノールで透析し、凍結乾燥した。ウシ成熟乳汁および初乳κ-カゼインの精製ウシ成熟乳汁ならびに出産から24時間以内に採集した初乳は、Agrisera AB（T varaback，Sweden）から入手した。いずれも脱脂し、ヘキサンによる脱脂を必要としなかったことを除きヒト乳汁の精製について上述したようにして、各カゼイン分画を調製した。カゼインペレットを10mMイミダゾール塩酸塩、3.3Ｍ尿素、1 0mM ２-メルカプトエタノール、pH7.0に溶解しQ-Sepharoseカラム（2.6×15cm,P harmacia-LKB，Sweden）に適用した。洗浄後、カラムを同じ緩衝液中0.1〜0.5Ｍ NaClの直線勾配で溶出した。ウシκ-カゼイン含有分画を水で透析し、凍結乾燥した。ウシカゼインの同一性はキモシン切断によって確認した。 H．pyloriのインシトゥ接着アッセイヒト成人の食道、胃、十二指腸、結腸、腎臓、子宮頚部、子宮内膜、および中脳の多重非疾患組織サンプルは、Washington大学病理部門の外科病理および解剖ファイルから入手した。250ｇのSpragueDawleyラットおよび６〜12週齢のFVB／Ｎマウスを頚椎脱臼によって屠殺後、胃腸管を摘出し、Sweetser，D．A.，Birke nmeier,E．H.，Hoppe，P．C.，McKeel，D．W.，& Gordon，J．I.，GenesDevel． 2(1988)，1318-1332の記載に従って領域ごとに切り分けた。成犬からの胃はSt． Louis大学医療センター外科部門から入手した。組織はすべて10％フォルマリン中もしくはピクリン酸／フォルムアルデヒド／氷酢酸の溶液（15：５：１；ブーアン液）中で固定して、ついで、パラフィン中に包埋した（Sweetser，D．A.，Birkenmeier，E．H.，Hoppe，P．C. ，McKeel，D.W．& Gordon，J．I.：GenesDevel．２(1988)，1318-1332参照）。ガラススライド上に載せた厚さ５μmの切片を調製して、ヘマトキシリンおよびエオジン染色（胃単位中に存在する細胞種の同定および組織サンプルに病理学的変化がないことの確認のため）ならびに／または以後の接着、組織化学的および／もしくは免疫細胞化学的アッセイに使用した。 H．pyloriは、以前に性質が明らかにされている５つの臨床単離株を使用した。NCTC 11637およびNCTC 11638は1982年に活動型慢性胃炎患者から単離された対照株である〔Warren，J．R．& Marshall，B.：Lancet１(1983)，1273-1275参照〕。WV229株は胃潰瘍の患者から回収され〔Westblom，T．U.，Madan，E.，Subik ，M．A.，Buriex，D.E．& Midkiff，B．R．:Scand．J．Gastroenterol．27(1992 )，249-252参照〕、Ｐ466株（Johns Hopkins大学医学部、Baltimoreから入手）は急性胃炎の患者から得られた。M019株は、無症候性のキャリアーから単離された〔Barthel，J．S.，Westblom，T．U.，Havey，A．D.，Gonzalez，F．& Everet t，E．D．:Arch．Intern．Med．148(1988)，1149-1151〕。H．pyloriの株は10％ウシ血液および１％IsoVitalex（Becton Dickinson Microbiology Systems，Coc keyville，MD）を補充したブルセラ寒天培地上、微好気条件下（５％O₂、10％CO₂ 、85％N₂）、湿度98％において37℃で増殖させた。接種５日後にプレートから細菌約１μlを滅菌ループによって採取し、pH9.0の0.15Ｍ NaCl／0.1Ｍ炭酸ナトリウム１ml中に、ピペットで穏やかに再懸濁した。ジメチルスルホキシド中フルオレセインイソチオシアネート（FITC，Sigma Chemical Co.）10mg／ml溶液を新たに調製し、その10μlを上記懸濁液に加え、これをついで室温、暗所で１時間インキュベートした．細菌細胞を５分間、3,000×ｇで遠心分離して回収し、ついで0.2％ウシ血清アルブミンおよび0.05％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート含有リン酸緩衝食塩溶液、pH7.4（ブロック緩衝液１、BB１）１ml中にピペットで穏やかに再懸濁し、上述のように遠心分離してペレット化した。洗浄操作は３回繰り返した．すべての細菌株のFITC標識の強度は、相当数の生物体の蛍光顕微鏡による検査で判定して同様であった。Ａ_600nmで測定して光学密度1.00 O.D.／mlの最終懸濁液から100μlのアリコートを採取し、そのまま使用するか、または使用時まで−20℃に保存した。標識してそのまま使用した細菌と凍結して使用前に再び解凍した細菌の間で結合パターンの差は認められなかった。スライドに載せた組織切片をキシレンおよびイソプロパノール中で脱パラフィンし（キシレン、１０分；キシレン、３分；イソプロパノール、３分；イソプロパノール、３分；イソプロパノール、３分）、水、ついでPBS中で３回すすいだのち、ブロック緩衝液１（PBS中0.2％ウシ血清アルブミンおよび0.05％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）中で30〜60分間インキュベートした。FI TC標識細菌懸濁液をブロック緩衝液１で20倍に希釈し、そのアリコート200μlでスライド上に載せた組織切片を被覆し、ついで、加湿チャンバー中室温で１時間インキュベートした。ついで、処理した組織切片が置かれたスライドをPBSで４〜６回洗浄したのち、蛍光顕微鏡で検査した。各種糖タンパク質または遊離オリゴ糖の結合阻害能を解析するため、FITC標識細菌懸濁液のアリコート200μlを、ウシ顎下腺ムチン（Sigma、最終濃度500μg／ml、PBS、pH７に溶解）、フェチュイン（Sigma、100μg／ml、PB S、pH７に溶解）、アシアロフェチュイン（Sigma、100μg／ml、PBS、pH７に溶解）、ヒトシアリルラクトース（NeuAcα２→６Ga1β１→４Glc）（Sigma、５μ g／ml、PBS、pH７に溶解）、ウシシアリルラクトース（NeuAcα２→３Galβ１→ ４Glc）（Sigma、５μg／ml、PBS、pH７に溶解）、精製ヒトκ-カゼイン（濃度1 000、500、250、50、10および１μg／ml、PBS、pH７に溶解）または精製ウシ成熟もしくは初乳κ-カゼイン（濃度1,000μg／ml、PBS、pH７に溶解）と２時間、ヒト血清IgA（Cappel Research Products，500μg／ml、PBS、pH７に溶解）、またはヒト初乳分泌IgA（Cappel Research Products，15μg／ml，PBS、pH７に溶解）と室温で２時間プレインキュベートした。細菌は、混合物を組織切片に添加する前に、ブロック緩衝液１で１回洗浄した。ヒトκ-カゼインまたはヒト初乳分泌IgAはついでMr＝10,000カットオフCentri conフィルター（Amicon）を用いてPBSで洗浄した。ヒトκ-カゼインとヒト初乳分泌IgAはまた、細菌とインキュベートする前に100mUのウシ腎臓α-Ｌ-フコシダーゼまたはVibriocoleraeノイラミニダーゼ（Boehringer-Mannheim，Germany）と37℃で２時間インキュベートした。リン酸緩衝食塩溶液、pH7.4中でインキュベートしたκ-カゼインを対照とした。グリコシダーゼ処理サンプルおよび対照はすべて80℃で20分間インキュベートしてκ-カゼインを細菌とインキュベートする前に酵素を不活性化した。PBS中でインキュベートしたIgAを対照とした。グリコシダーゼ処理したサンプルおよび対照はすべて80℃で20分間インキュベートして IgAを細菌とインキュベートする前に酵素を不活性化した。ヒトκ-カゼインおよびヒト初乳分泌IgAそれぞれの受容体活性ドメインの性質をさらに明らかにするため、以下に記述するように、過ヨード酸酸化を実施した。組織切片中の細菌受容体の性質を確認するため他の２実験を実施した。第一に脂肪族および／または芳香族アミノ酸の-COOH部位へのペプチド結合の加水分解を触媒できるセリンプロテアーゼである、Trichiratum albusからのプロテイナーゼ〔Ebelingら、Eur．J．Biochem．4(1974)，91-97；Boehringer-Mannheim，G ermany〕をPBS中１mg／mlの保存溶液として調製し、その200mUによって脱パラフィン切片を37℃で２時間処理した。ついでそれらをPBS中で３回洗浄し、ブロック緩衝液１で処理し、次にFITC標識H．pylori株Ｐ466またはWV229の懸濁液を上述のようにして被覆した。第二に、脱パラフィン切片を10mM過ヨード酸ナトリウム／50mM酢酸ナトリウム、pH4.5により０℃で10分間処理して末端シアル酸の非置換側鎖の炭素原子位置８および９を選択的に切断するか〔Manz，A．E.，Dell ，A.，Azadi，A．& Varki，A．:J．Biol．Chem．265(1990)，8094-8107〕、または10mM過ヨード酸ナトリウム／50mM酢酸ナトリウム、pH4.5により室温で１時間処理して３位に遊離ヒドロキシル基を有する大部分の炭水化物の隣接ヒドロキシル基間の炭素-炭素結合を切断した〔これにより単糖の環構造は破壊され、その結果、炭水化物のエピトープは消失するが、一方、ペプチドは無傷のまま残る。 Woodward，M．P.，Young，W．W．Jr．& Bloodgood，R．A．:J．Immunol．Meth． 78(1985)，143-153参照〕。対照切片は50mM酢酸ナトリウム緩衝液単独とインキュベートした。PBSで２回洗浄後、pH 7.6のPBS中に調製した50mM水素化ホウ素ナトリウムを加えて切片を還元した。PB Sでさらに数回洗浄したのち、FITC標識株WV229、P466またはM019の懸濁液を適用し、スライドを前述のように処理した。対照実験は、胃上皮細胞系列中に存在するタンパク質の抗原性がpH4.5における「苛酷な」過ヨード酸酸化下にも保存されたことを確認するために使用された。すなわちラット胃の過ヨード酸処理切片を内因子（ＩＦ）に対して産生されたウサギポリクローナル抗血清とインキュベートし（10μgタンパク質／ml、４℃ 、一夜）、ついで抗原-抗体複合体をTexas Rad接合ロバ抗-ウサギIgGで検出した〔使用した染色プロトコールおよびこの血清の特異性の詳細については、Roth， K．A.，Cohn，S．M.，Rubin，D．C.，Trahair，J．F.，Neutra，M．R．& Gordon ，J．I．:Am．J．Physiol.（Gastrointest．Liver Physiol.）263（1992），G18 6-G187およびLee，E．Y.，Seetharam，B.，Alpers，D．H．& DeSchryver-Kecske meti，K．:Gastroenterol．97(1989)，1171-1180〕。過ヨード酸処理切片における主細胞のIF染色の強度は緩衝液単独とインキュベートした切片での主細胞の染色強度と同様であったが、表面粘液細胞に対するα-Ｌ-フコース特異的Ulex eur opaeus１型レクチンの結合は同一条件下に完全に消失した。免疫組織化学的研究シアリル化オリゴ糖の細胞内分布は、酵素原腺を含むヒト胃の脱パラフィン切片において、（ｉ）ガラクトースに連結した内部配列NeuAcα２→３残基を認識するフルオレセイン、ローダミン（LISTBiological Laboratories Inc.）あるいはペオキシダーゼ（Sigma）接合コレラ毒素Ｂサブユニット〔Holmgren，J.，Loe nnroth，I.， Mansson，J．E.，& Svennerholm，L.：Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72（1975），2520-2524参照。ブロック緩衝液１中、最終濃度５μgタンパク質／mlに溶解した〕、（ii）NeuAcα２→６Gal／GalNAcを認識するジゴキシゲニン（DIG）接合 Sambucus nigraレクチン（SNA）〔Knibbs，R．N.，Goldstein，I．J.，Ratcliff e，R．M．& Shibuya，N．：J．Biol．Chem．266(1991)，83-88参照。ブロック緩衝液１中、最終濃度10μgタンパク質／mlに溶解〕、およびNeuAcα２→３Galβ １→４GlcNAcと反応するDIG接合Maackia amurensisレクチン（MAA）〔Knibbs，R ．N.，Goldstein，I．J.，Ratcliffe，R．M．& Shibuya，N．：J．Biol．Chem． 266(1991)，83-88参照。ブロック緩衝液１中、最終濃度10μgタンパク質／mlに溶解〕とのインキュベーションによって調べた。DIG接合レクチンはペルオキシダーゼ接合モノクローナルマウス抗DIG抗体（ブロック緩衝液１中500mUペルオキシダーゼ／mlに溶解した）により、組織をPBS中で３回洗浄し、組織上に二次抗体を室温で２時間被覆し、ついで標準H₂O₂／DAB検出を用いて検出した。フコシル化血液型抗原は、まず、組織血液型抗原Ａ、ＢおよびＨ（Dakopatts A/S，Glostrup，Denmark）（ブロック緩衝液１中最終濃度１μgタンパク質／ml に溶解）またはLe^a およびLe^b（Immucor，Norcross，GA）（ブロック緩衝液１中最終濃度10μgタンパク質／mlに溶解）に対するマウスモノクローナル抗体で切片を処理して検出した。抗原-抗体複合体は、FITC、TRITCあるいはHRP接合（フルオレセイン、ローダミンあるいはペルオキシダーゼ接合）ウサギ抗-マウス免疫グロブリン（Dakopatts A/S，Glostrup，Denmark）（ブロック緩衝液１中最終濃度30μgタンパク質／mlに溶解）の二次被覆によって可視化し、切片を蛍光顕微鏡下に検査して検出した。さらに。フコシル化糖接合体の分布はα-Ｌ-フコース基を認識してそれに結合するFITC接合Ulex e ropaenus１型レクチン（UEA１、ブロック緩衝液１中５μgタンパク質／mlに溶解）で切片を同様に処理し可視化することにより評価した。結果および考察インシトゥ接着アッセイを用いるH．pyloriの細胞系統特異的結合の解析 Helicobacter pyloriの５つの臨床単離株をフルオレセインイソチオシアネートで標識したのち、濃厚寒天培地上にて５日間微好気条件下に増殖させ、ついでフォルマリン固定ヒト胃切片上に被覆した。すべて消化不良症状の患者から回収された株NCTC 11637、NCTC11638、WV229およびP466は、上方小窩および管腔表面に位置する表面粘液細胞に結合した（図２ＡおよびＢ参照）。特記すべきは、胃単位の腺セグメントの上方部分に位置する粘液頚細胞は陰性で、これはこれらの細菌が胃に存在する２種の分化された粘液産生細胞系統を識別できることを示している〔Ota，H.，Katsuyama，T.，Ishii，K．Nakayama，J.，Shiozawa，T．& T sukahara，Y.：Histochem．J．23(1991)，22-28〕。酵母原腺においては、壁または主細胞への結合は認められなかった。無症候性（「健康」）キャリアーから回収された唯一の単離株、MO 19の試験では、ヒト胃上皮細胞系統のいずれにも検知可能なレベルでの結合はみられなかった（図２Ｃ参照）。株WV229およびP466はヒト食道の鱗屑様上皮細胞には接着しなかったが、採用した反応条件下で、食道粘膜下腺およびそれらの管、ならびに十二指腸の絨毛結合腸細胞には接着した（図２Ｄ参照）。小腸絨毛の結腸同族体に位置する腸細胞から各陰窩口を囲む表面上皮細胞カフ（図２Ｅ参照）に弱い結合が観察された。染色の強度したがって接着生物の濃度は胃上皮の場合よりも腸の頭尾軸を通してかなり低下した（腸方向への低下勾配）。対照実験ではHelicobacter pylori P466およびWV229は、近位もしくは遠位ネフロン、子宮頚部または子宮内膜に現れるいずれの上皮細胞集団にも結合しなかった。中脳を含む中枢神経系の検査でも、バックグランド以上のシグナルを生成することはなかった。インシトゥ接着アッセイはヒト胃腸で認められた細胞系統に特異的な結合およびHelicobacter pylori株に特異的な結合が他の哺乳動物種でも起こるか否かを確認するために用いられた。上述のようにして増殖させ、FITCで標識した株WV22 9、P466およびMO19を、ラットおよびマウスの胃腸管の切片ならびにイヌの胃とインキュベートした。MO19株はこれらの３種のいずれかから調製された組織切片にも検知できる量の結合を示さなかった。ヒト胃の場合と同様、WV229およびP46 6株はラットで胃粘膜小窩領域に結合したが、酵素原もしくは純粋粘液領域に位置する他のいずれの分化上皮細胞集団にも結合しなかった（図２Ｆ参照）。類似のヒトプレパレーションの場合とは異なり、ラット食道および前胃の層状鱗屑様上皮細胞はインシトゥ接着アッセイにおいて陽性の結果を生じたが、小腸上皮細胞はブルンネル腺を除いて陰性であった。マウスの前胃は接着性細菌との高密度の結合を示したが、一方、胃の残部、すなわち酵素原、粘液壁および純粋粘液領域〔Lee，E．R.，Trasler，J.，Dwivedi，S．& leBlond，C．P.：Am．J．Anat． 164(1982)，187-207〕、ならびに腸の上皮細胞および間葉成分にはFITC標識株WV 229 およびP466によるシグナルを生じなかった。最後に、イヌ胃ではこの２株のいずれの結合も認められなかった。 Helicobacter pyloriと胃上皮細胞系統の間の相互作用の生化学的研究 Helicobacter pyloriと表面粘液細胞の間の相互作用の性質を特徴づけるために、一連の化合物の、FITC標識株P466およびWV229のヒト胃および近位小腸の切片への結合を阻害する能力を試験した。ウシ血清フェチュイン、アシアロフェチュイン、ウシ乳汁から調製した可溶性シアリルラクトース（85％のシアル酸はα２→３結合、15％はα２→６結合を介してガラクトースに連結している。すなわちNeuAcα２→３／６Galβ１→４Glc ）またはヒト乳汁シアリルラクトース（15％NeuAcα２→３；85％NeuAcα２→６）を上述の２つのHelicobacter pylori株とプレインキュベートした場合、以後の接着の低下はインシトゥアッセイで判定して認められなかった。これ Blaser，M．J.：Microb．Pathog．9(1990)，427-439の結果と一致する。しかしながら、細菌を、フコシル化およびシアリル化炭水化物の両者に富む材料である0.5％ウシ顎下腺ムチン〔Savage，A.V.，D'Arcy，S．M．T．& Donoghue ，C．M.：Biochem．J．279（1991），95-103および33〕とプレインキュベートすると、表面粘液細胞（図１ＡおよびＢ参照）および十二指腸絨毛連結上皮細胞への細菌の結合は完全に阻止された。ヒトκ-カゼインおよびヒト初乳分泌IgAも強力なインヒビターであり、ヒトκ-カゼイン250μg／ml（図３Ａ参照）およびヒト初乳分泌IgA、15μg／mlはそれぞれ、Helicobacter pyloriの接着を完全に阻害した。ヒトκ-カゼインオリゴ糖はＮ-アセチルグルコサミンへのα１→４結合を介してフコシル化され、この点でウシκ-カゼインとは異なっている。ヒト初乳分泌I gAは高度に変動するＮ-およびＯ-連結オリゴ糖のセットをもっている。したがって、ヒトκ-カゼインとヒト初乳分泌IgAのみが、ヒト胃表面粘液細胞へのHelicobacter pyloriの細胞系統特異的付着を防止できることは興味がある。いくつかの観察は、Helicobacter pyloriの結合のヒト初乳分泌IgAによるこの阻害が、Fabフラグメントの可変性低下の関与する細菌のFc受容体または古典的免疫グロブリン認識作用によって仲介されなかったことを示唆している。すなわち、（ｉ）ヒトκ-カゼインまたはヒト初乳分泌IgAをメタ過ヨード酸で前処置した場合には阻害は消失したこと、（ii）PBS中85℃における30分のプレインキュベーションは２種の糖タンパク質の阻害活性には影響しなかったこと、（iii）ヒトκ-カゼイン（図３Ｃ参照）またはヒト初乳分泌IgAのα-Ｌ-フコシダーゼ処置は阻害活性を著しく低下させたが、ノイラミニダーゼ処理がヒトκ-カゼインの阻害活性に及ぼす影響はそれ程ではなく、ヒト初乳分泌IgAの阻害活性には検知可能な作用は示さなかったことが観察されている。これに対してウシ成熟乳汁および初乳からのκ-カゼイン（図３Ｂ参照）では1 000μg／mlまでの濃度でHelicobacter pyloriの結合の阻害は認められず、ヒト血清IgAは100μg／mlまでの濃度でその結合を阻害しなかった。ヒト胃切片をプロテイナーゼＫで前処置しても２種のHelicobacter pylori株P466およびWV229の結合に著しい低下を生じた。これらの結果を考え合わせると、結合は表面粘液細胞上に発現するシアリル化糖タンパク質受容体よりもむしろフコシル化糖タンパク質受容体に仲介されていることが強く示唆される。ヒト胃の表面粘液細胞集団へのHelicobacter pyloriアドヘシンの結合が細胞受容体中のシアル酸エピトープに依存しないことの指摘は、さらに他の２つの実験結果によって支持される。第一に、ヒト胃粘膜におけるシアル酸含有複合炭水化物の分布はインシトゥアッセイにおいて観察された接着の細胞パターンと相関しない。この分布の測定は NeuAcα２→３Galβ１→４GlcNAcエピトープ（シアリル化Ｎ／Ｏ−グリカンおよび糖スフィンゴ脂質上）に特異的なMaackia amurensisアグルチニン（MAA）〔Kn ibbs，R．N.，Goldstein，I．J.，Ratcliffe，R．M．& Shibuya，N.：J．Biol． Chem．266(1991)，83-88参照〕およびNeuAcα２→６Gal／GalNAc構造を認識する Sambucus nigraアグルチニン〔Shibuya，N.，Goldstein，I．J.，Broekaert，W ．F.，Nsimba-Lubaki，M.，Peeters，B．& Peumans，W．J．：J．Biol．Chem．2 62(1987)，1596-1602参照〕を用いる実験で実施した。MAAおよびSNAレクチンの結合はヒト胃の粘膜下組織コンパートメントに限定されることが明らかにされた。すなわち、それらは胃上皮細胞系統のいずれのメンバーとも反応しなかった（図１Ｃおよび１Ｄ参照）。同様に、コレラ毒素Ｂサブユニットは糖タンパク質および糖スフィンゴ脂質、とくにGalNAcβ１→４（NeuAcα２→３）Gal-β-構造中の内部結合シアル酸を認識する〔Holmgren，J.，Loennroth，I.，Mansson，J．E.，& Sven-nerholm，L．：Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72(1975)，2520-2524参照〕。このレクチンは表面粘液細胞には結合せず、むしろその結合は胃単位の上方腺ドメインに位置する粘膜頚細胞に限定されることが明らかにされた（図１Ｅ参照）。イヌ胃による対照実験では、（ｉ）MAAは表面粘液細胞に結合すること、（ii）SNAは表面粘液細胞および壁部細胞に結合すること、ならびに（iii）コレラ毒素Ｂサブユニットはこの種ではいずれの胃上皮細胞系統にも結合しないことが示された。これは、これらのレクチンが、イヌとヒトの間の表面粘膜細胞系統の分化プログラムにおける基本的な差、すなわちHelicobacter pyloriへの明らかな結合能の差を解明するために使用できることを示唆している。第二に、組織切片を10mMメタ過ヨード酸／酢酸ナトリウム、pH5.5と０℃でインキュベートした場合、イヌ胃における表面粘液細胞へのSNAの結合の喪失により明らかであったように、末端シアル酸の非置換側鎖の炭素８と９の間の選択的切断が達成できる〔Manzi，A．E.，Dell，A.，Azadi，P．& Varki，A．：J．Bio l．Chem．265(1990)，8094-8107参照〕。これらの過ヨード酸酸化条件を用いても、酢酸ナトリウム緩衝液単独で処理した対照切片と比較して、いずれの結合株にもヒト胃または小腸上皮細胞集団への接着の低下は認められなかった。他の観察が、ヒト胃における表面粘液上皮細胞へのHelicobacter pyloriの結合を仲介する糖タンパク質（単数または複数）におけるフコシル化エピトープの役割を支持している。３種の血液型抗原のいずれかに特異的なモノクローナル抗体とプレインキュベートした酵素原腺を含むヒト胃切片では、細菌の結合が低下した（図１Ｆ〜Ｈ参照）。α-Ｌ-フコースに特異的なUlex europaeus１型アグルチニン（UEAl）も、Helicobacter pyloriアドヘシンの受容体を含む同一細胞に結合した（図１Ｉ参照）。上に使用した「緩和な」メタ過ヨード酸酸化反応条件は、UEA１の結合には影響を与えなかった（図１Ｊ参照）。この処置はまた、Helicobacter pyloriの結合にも影響しなかった（図１ＫおよびＬ）。ヒト表面粘液細胞へのUEA１の結合およびモノクローナル血液型Ｈ抗体の結合を排除するためには、より苛酷な切断条件（すなわち、pHを4.5に低下させ、インキュベーション時間を１時間に延長し、インキュベーション温度を20℃に上昇させる）が要求された。これらの条件はまた、コレラ毒素Ｂサブユニットの結合の喪失、ならびにHelicobacter pylori株WV229およびP466の接着の喪失を生じた。上述の多重標識免疫組織化学的研究により、FITC標識株P466ならびにWV229の受容体部位がフコシル化組織血液型抗原Ｈ、ＢおよびLe^bとともに、この上皮細胞系統のメンバー中に共発現されることが示された（図１Ｆ〜１Ｈ参照）。これらの結果を考え合わせると、ヒト胃におけるUEA１−陽性、フコシル化血液型抗原-陽性、表面粘液細胞へのHelicobacter pyloriの結合が末端非置換シアル酸残基に依存しないことが強く暗示される。さらに、MAAおよびSNAレクチンならびにコレラ毒素Ｂサブユニット結合部位の分布、さらにフェチュインおよび可溶性シアリルラクトースが結合を阻害し得ないことは、これまでの研究〔Evans ，D．G.，Evans，D．J．Jr．& Graham，D．Y．：Infect．Immun．57(1989)，227 2-2278；Evans，D．G.，Evans，D．J．Jr.，Moulds，J．J.，& Graham，D．Y．：Infect．Immun．56(1988)，2896-2906；およびSaitoh，T.，Natomi，H.，Zhao ，W.，Okuzumi，K.，Sugano，K.，Iwamort，M．& Nagai，Y．：FEBS Lett．282 (1991)，385-387参照〕、インビボにおいて生体に対し未知の標的である細胞を使用した研究〔Evans，D．G.，Evans，D．J．Jr．& Graham，D．Y．：Infect．I mmun．57(1989)，2272-2278；およびEvans，D．G.，Evans，D．J．Jr.，Moulds ，J．J．& Graham，D．Y．：Infect．Immun．56(1988)，2896-2906参照〕において喚起されてきたα２→３連結シアル酸の関与を強く否定するものである。図１は、シアリルラクトースを欠く糖タンパク質としての推定Helicobacter p yloriアドヘシン受容体の特性を示す。図１Ａおよび１Ｂ：酵素原腺を有する胃単位を含むヒト胃切片を、FITC標識He licobacter pylori株WV229（１Ａ）またはウシ顎下腺ムチンの0.5％溶液で処理した細菌（１Ｂ）とインキュベートした。ムチンプレパレーションは結合の著しい低下を生じる。図１Ｃおよび１Ｄ：表面粘液、粘液頚、壁部および主上皮細胞系統のメンバーを含有するヒト胃の切片を、ジゴキシゲニン標識Maackia amurensisアグルチニン（MAA，１Ｃ）またはSambucus nigraアグルチニン（SNA，１Ｄ）とインキュベートした。DIG接合レクチンは、ペルオキシダーゼ接合モノクローナルマウス抗- DIG抗体プレパレーションで検出した。シアル酸含有炭水化物エピトープを認識するこれらレクチンとインキュベートした場合、いずれの上皮細胞系統もバックグランドを越えるシグナルを生成することはない。モノクローナル抗体単独を用いた対照実験では染色は生じなかった（データは示していない）。図１Ｅ：ヒト胃の隣接切片をローダミン接合コレラ毒素Ｂサブユニットとインキュベートした。胃単位の峡部または腺ドメインの上方部分に位置する粘液産生細胞は、糖タンパク質および糖スフィンゴ脂質中の内部連結シアル酸を認識するこの毒素と反応する。サブユニットは、小窩内に位置する表面粘液細胞に結合しない。図１Ｆ〜１Ｈ：ヒト胃切片を、FITC標識Helicobacter pylori株P466（１Ｆ）およびフコシル化血液型抗原Ｈに対するマウスモノクローナル抗体とインキュベートした（図１Ｇではローダミン接合ウサギ抗-マウスIgGで可視化した）。図１Ｈは，表面粘液細胞が細菌アドヘシン受容体ならびに血液型抗原を共発現することを示す二重暴露である。このモノクローナル抗体で処理しなかった切片（たとえば図１Ａ）と比較した場合、表面粘液細胞への細菌の接着の著しい低下が認められた（１Ｆ）。類似の結合低下が，フコシル化血液型抗原ＢおよびLe^bに対するマウスモノクローナル抗体を用いた場合にも得られた（データは示していない）。非免疫マウスIgGではこの作用は生じなかった（データは示していない）。図１Ｉ：ヒト胃切片をα-Ｌ-フコースを認識するFITC接合Ulex europaeusアグルチニン（UEA１）とインキュベートした。レクチンは表面粘液細胞に結合する。図１Ｊ：ヒト胃切片をメタ過ヨード酸ナトリウム、pH5.5によって０℃で10分間前処置しても、UEA１の結合に感知できる低下は生じない。図１Ｋおよび１Ｌ：Helicobacter pyloriの小窩粘液細胞への結合（１Ｋ）もメタ過ヨード酸ナトリウム前処置で影響されなかった（１Ｌ）。図２は、Helicobacter pyloriの胃腸上皮細胞系統への結合のインシトゥアッセイを示す。図２Ａ：ヘマトキシリンおよびエオジン染色したヒト胃切片。酵素原領域における胃単位の最上部を示す。表面粘液細胞（Ｍ）および壁細胞（Ｐ）が示されている。図２Ｂおよび２Ｃ：微好気条件下に血液寒天培地上で５日間増殖させたのちの FITC標識Helicobacter pylori株、WV229（２Ｂ）およびMO19（２Ｃ）とともにヒト成人の胃切片をインキュベートした。胃潰瘍疾患患者から回収された株WV229 は胃単位の上方小窩内に位置する表面粘液細胞およびそれらに伴う管腔表面に結合している。健康なキャリアーから単離された株MO19はいずれの細胞系統にも結合しない。図２Ｄおよび２Ｅ：株WV229を、ヒト成人の十二指腸（２Ｄ）および結腸（２Ｅ）の切片とインキュベートした。胃の切片の染色に使用したFITC標識細菌プレパレーションはまた、絨毛結合上皮細胞（腸細胞を含む）も染色し、結腸陰窩の上方部分およびそれらの表面上皮カフに位置する結腸細胞をきわめて弱く染色した。小腸および大腸陰窩に位置する分化程度の低い増殖性および非増殖性細胞には接着細菌は含まれていなかった。間葉コンパートメント内に位置する細胞集団も陰性であった。ヒト胃、腸および結腸切片を株NCTC11637、NCTC11638およびP4 66とインキュベートすると図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｅに示した結果に匹敵する結果が生じた（データは示していない）。図２Ｆ：成熟Sprague Dawleyラットからの胃の酵素原領域の切片を、微好気条件下に血液寒天培地上で５日間増殖させたFITC標識WV229株とインキュベートした。Helicobacter pyloriはラット表面粘液細胞に結合したが、ラット胃単位の峡部または腺ドメイン関連細胞系統には結合しなかった。図３は、インシトゥでのヒト胃粘膜へのHelicobacter pyloriの付着に対する各種κ-カゼインの阻害活性の評価を示す。図３Ａ：Helicobacter pylori株Ｐ466は，ヒト胃切片上に被覆する前に、ヒト κ-カゼイン（250μg／ml）とプレインキュベートした。図３Ｂ：Helicobacter pylori株Ｐ466は、ヒト胃切片上に被覆する前に、ウシ初乳κ-カゼイン（1000μg／ml）とプレインキュベートした。図３Ｃ：ヒトκ-カゼインを、ヒト胃切片上に被覆する前にα-Ｌ-フコースで前処置。被覆は同一のパラフィン包埋組織からの隣接切片上に行った。例２糖タンパク質のSDS-PAGE 細菌の標識は例１の記載と同様に実施し、細菌株としてはH．pylori株P466を使用した。H．pyloriのインシトゥ接着アッセイおよび免疫組織化学的試験は例１に記載の操作によって行った。ヒト初乳サンプル、ヤギおよびウシ乳汁、ヒト初乳の硫酸アンモニウム沈澱分画、およびネオ複合糖質のSDS−PAGEは４〜20％または12％プレキャストゲル（B io-Rad，Meiville，NY）で実施した。タンパク質はSDS-２-メルカプトエタノール中100℃で３分間変性させた。ゲルはクーマッシーブリリアントブルーで染色した。分子量標準はSigma，St．Louis，MOから入手した。イムノブロット解析 SDS-PAGE上で分離されたタンパク質を、半乾燥Multiphore Nova Blotシステムによって1.5時間を要してニトロセルロース上に移した。タンパク質はPonceau Ｓ溶液（Sigma，St．Louis，MO）で染色し、ついでブロットを１〜３時間、１％Tris緩衝食塩溶液（TBS）、１％ブロック試剤（Boehringer Mannhe im，Indianapolis，IN）、１mM MnCl₂、１mM MgCl₂、１mM CaCl₂、0.05％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、0.1％NaN₃からなるブロック緩衝液２（BB2）中でインキュベートした。以下の血液型特異的モノクローナル抗体を使用した。すなわち抗-Le^a（CBM-LA1）および抗-Le^b（CBM-LB1）（Immucor，Norcr oss，GAより）;抗−Le^x（630／7H1）、抗−Le^y（672／7E3）、抗−Le^b,y（64／4 D8）、抗−H-2（92FR A2）（これらはAccurat Chemical & Scientific Corporat ion，Westbury，NYより入手した）；抗-１型鎖（LNT）（Ｋ21）、抗-H-1（17-20 6）、および抗-Le^b（Ｔ218）（Signet Laboraories，Dedham，MAより入手）である。レクチンには、ビオチン標識Ulex europaeus１型、Lotustetragonolobus、ならびにＨ-抗原を認識するAnguilla anguilla（Sigma，St．Louis，MO）；複合糖質中の分岐Fucα１−６GlcNAcを認識するジゴキシゲニン（DIG）標識Aleuria aurantia（Boehringer Mann-heim）を使用した。ブロットはBB2中５〜10μg／ml 濃度の抗体またはレクチンと６時間インキュベートし、ついでTBS中で７回洗浄した。モノクローナル抗体はアルカリホスファターゼ（AP）接合ヤギ抗-マウス抗体（Boehringer Mannheim）によって検出した。ジゴキシゲニンもしくはビオチン標識レクチンはAP接合ヒツジ抗-DIGもしくは抗-ビオチンFabフラグメント（ Boehringer Mannheim）でそれぞれ検出した。ブロットはTBS中で５回、0.1Ｍ Tr is-HCl、pH9.5、0.1Ｍ NaCl、５mM MgCl₂（APBIII）中で１回洗浄し、BCIP／ NBTで展開した。レクチンのビオチン標識 Anguilla anguillaレクチンはCalbiochem Immunochemicals，La Jolla，CA製のビオチン-NHSキットを用いてビオチン標識した。ビオチン化の程度（ｎ＝７）はSDS-PAGE上での分子量シフトによって測定した。ヒト分泌IgAプレパレーションのサイズ分画化プールしたヒト初乳から500μgのヒト分泌IgA（Cappel Laboratories，West C hester，PA）をSuperose 6HR 10／30に適用し、PBS、pH6.8により0.2ml／分で溶出した。400μlのサンプルを集め、各UV−吸収分画のアリコート20μlをSDS-PAG Eに付した。分泌IgAおよび120〜150kDaの糖タンパク質それぞれに相当する大ピークおよび小ピークの分画を別個にプールし、インシトゥ接着アッセイによって細菌接着の阻害性について試験した（下記参照）。ヒト分泌IgAプレパレーションのPNGアーゼＦ消化 50μgの分泌IgAを100μlの0.1Ｍリン酸緩衝液、pH8.0、10mM β-MSH、20mM ED TAおよび６単位のPNGアーゼＦ（Boehringer Mann-heim）中でインキュベートするか（天然条件）、または50μgの分泌IgAを最初0.2％SDS、10mMβ-MSH中100℃ で３分間インキュベートし、ついで0.1Ｍリン酸緩衝液、pH8.0で100μlに希釈した（変性条件）。変性サンプルにｎ-オクチルグルコシド（0.5％）を加えてPNG アーゼＦ酵素のSDSとの干渉を減弱させた。インキュベーションは37℃で行い、サンプルは０時間、1.5時間、４時間、７時間、18時間後に採取し、SDS-PAGEおよびイムノブロットで解析した。ヒト初乳および乳汁サンプルの調製ヒト初乳サンプルはChildren's Hospital，St．Louis，MOから入手した。初乳、ヤギおよびウシ乳汁は脱脂し、Sorvall SS-34ローター中20krpmで30分間遠心分離して細胞屑を除去したのちの材料を、阻害実験またはSDS-PAGE上での解析に使用した。複合糖質の阻害試験複合糖質がインシトゥにおいてヒト胃への細菌の接着を阻害する能力は、BB１中標識細菌懸濁液200μlを室温において1.5時間、以下に掲げる複合糖質とプレインキュベートして解析した。細菌は１回洗浄し、200μlのBB１中に再懸濁し、切片に添加した。接着は非阻害性細菌とインキュベートした切片と比較した。以下の複合糖質を使用した。（ｎ）は、総炭水化物アントローンアッセイによって測定された、ネオ糖タンパク質に化学的に結合した炭水化物鎖の数を示す。すなわち、分泌IgA、ラクト-Ｎ-テトラオース（LNT）-ヒト血清アルブミン（HSA）（ｎ＝26）、ラクト-Ｎ-ネオテトラオース（LNnT）-HSA（ｎ＝26）、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＩ（H-1）-HSA（ｎ＝35）、ラクト-Ｎ-フコペンタオースII（Lea ）-HAS（ｎ＝30）、ラクト-Ｎ-フコペンタオースIII（Le^x）-HSA（ｎ＝30）、ラクト-Ｎ-ジフコヘキサオースＩ（Le^b）-HSA（ｎ＝32）、Le^y-四糖（Le^y）-HSA（ｎ＝26）、ラクト-Ｎ-ネオフコペンタオースＩ（H-2）-ウシ血清アルブミン（BS A）（ｎ＝29）、GlcNAcβ１−４（Fucα１−６）GlcNAcβ-BSA（すべてIsoSep A B，Tullinge，Swedenから）である。H1-HSAはまたAccurate Chemical & Scienti fic Corporationから入手した。ネオ複合糖質プレパレーション用のオリゴ糖はすべてHPLCによって精製され，構造的に同定され特性づけられ、NMRスペクトルにより純度95％以上であることが製造業者によって示されていた。ネオ糖タンパク質の同一性は、LNT（非フコシル化前駆体鎖）を認識するモノクローナル抗体Ｋ21、抗-H-1（17-206）（ラクト系の１型鎖にＨ-抗原）、抗-H-2（92FR A2）（ラクト系２型鎖上にＨ-抗原）、抗-Le^a（CBM-LA1）（モノフコシル化１型鎖）、（抗−Le^b CBM-LB1）（ジフコシル化１型鎖）、抗−Le^b （Ｔ218）（入手できた交差反応性のより低いクローン）、抗−Le^x（630／7H1）（モノフコシル化２型鎖）、抗−Le^y（672／7E3）（ジフコシル化２型鎖）、抗- Le^b,y（64／4D8）（ジフコシル化１および２型鎖を認識）ならびにＨ-抗原特異的レクチンUlex europaeus１型およAnguillaanguillaを用いるイムノブロットにより確認した。オリゴ糖阻害試験複合糖質がインシトゥにおいて細菌の接着を阻害する能力は標識細菌をBB1中に希釈した以下のオリゴ糖と室温で3.5時間プレインキュベートすることによって解析した。すなわち、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＩ（H-1）、ラクト-Ｎ-フコペンタオースII（Le^a）、ラクト-Ｎ-ジフコヘキサオースＩ（Le^b）、ラクト- Ｎ-フコペンタオースIII（Le^x）、ラクト-ジフコテトラオース、2'-フコシルラクトース、３-フコシルラクトース（以上すべてIsoSep ABから）、Ｈ-ジ糖（Acc urate Chemical & Scientific Corporation）、Fucα１-４-GlcNAcβO-TMSE（Sy mbicom AB，Umea，Sweden）、およびＬ-フコース（Sigma，St．Louis，MO）である。インシトゥ接着アッセイにおける細菌結合の抗体阻害抗-Le^bおよび抗-H-2モノクローナル抗体の２倍逐次希釈物をBB１中ヒト胃粘膜の別個の切片に適用し、室温で一夜インキュベートした。切片をPBS中で５回洗浄し、結合した抗体はBB１中に１： 100に希釈し、室温で１時間インキュベートしたFITC接合ウサギ抗マウス免疫グロブリンで検出した。同じ蛍光強度を生じる抗体希釈物を細菌阻害実験に選択した（それぞれ１：2000および１：5000）。切片は上述のように、モノクローナル抗体とプレインキュベートし、ついで上述のように細菌を被覆した。細菌のウエスタンブロット被覆アッセイ SDS-PAGEは、それぞれ20μgの未分画ヒト初乳、ヤギ乳汁、ウシ乳汁または各種ネオ複合糖質それぞれ１μgについて実施した。ニトロセルロースに移したのち、フィルターをBB2と一夜インキュベートし、TBS中で２回洗浄した。細菌懸濁液（0.1 OD₆₀₀）を加え（BB2中0.2ml／cm²）、回転ボトル中室温で一夜インキュベートした。フィルターをTBS中で６×５分間洗浄し、ウサギ抗血清１：100を加え、１時間インキュベートした。ブロットをTBSで５回洗浄した。細菌の結合物はついで、１：200×に希釈したAP接合抗体と１時間インキュベートし、BB2中で５回、APBIII中で１回洗浄し、BCIP／NBTで展開するか、または金-標識抗体とインキュベートし、BB2中で５回、ddH₂O中で洗浄し、ついで銀増強IntenSE BL（Am ersham，Arlington Heights，IL）で展開した。糖脂質プレパレーション免疫染色および細菌のHPTLC被覆解析モノクローナル抗体、抗Le^a（CBM-LA1）ならびに抗−Le^b（CBM-LB1）を用い、糖脂質中の相当する抗原の存在を、イムノブロット解析と題した項の材料および方法の欄に記載のように、二次抗体と展開で検出した。結果および考察レクチンおよびモノクローナル抗体によるヒト分泌IgAおよび血清IgA中のフコシル化血液型抗原の解析Ｈ-抗原を認識するレクチンUlex europaeus１型およびAnguillaanguillaを用いたイムノブロットにより、分泌IgAおよび血清IgAの両者の重鎖および軽鎖中にＨ-抗原の存在することが明らかにされた。複合糖質中の分岐Fucα１−６GlcNAc を認識するAleuriaaurantiaでも、共通のフコシル化構造が同定された。これらの観察を考え合わせると、Ｈ-抗原中に提示される末端α-1.2連結フコースまたはα-1.6連結フコースはそれだけではH．pylori受容体が構成されないことを示している。ルイス血液型抗原Le^a、Le^b、Le^xおよびLe^yに対するモノクローナル抗体は、両IgA型の重鎖中におけるLe^XおよびLe^yの存在を認識したが、Le^bは分泌Ig Aの分泌成分に限定された。Le^aは２つのIgA型のいずれにも見出されなかったが、分泌IgAと共精製された120〜150kD糖タンパク質中に検出された。この糖タンパク質はさらに10倍高いLe^b／タンパク質比に相当する分泌成分に等しい強度のL e^b抗原を提示する。分泌IgAプレパレーションのサイズ分画化ヒト分泌IgAをFPLC-Superose６のカラムに適用し、優位の分泌IgA成分をわずかな成分120〜150kD糖タンパク質から分離した。ピークはSDS-PAGEによって同定して、別個にプールした。ついで精製された分画について、H．pylori阻害性を分析した。２μg／mlの120〜150kDタンパク質に匹敵する前述のような（PNAS）効率的細菌阻害には15μg／mlの分泌IgAを必要としたことから、２つの成分はそれらの各タンパク質含量に関連した接着阻害活性は仲介せず、むしろLe^b含量を反映した。Ｎ-およびＯ-連結炭水化物鎖中のLe^b抗原の分布の解析未分画分泌IgAプレパレーションを、Ｎ-鎖放出酵素PNGアーゼＦによって、変性および天然条件下に消化した。天然条件時には、消化はきわめて限定され、炭水化物含量の微少部分のみが除去されたが、SDS変性後には分泌成分のオリゴ糖鎖は容易に放出され、これはSDS-PAGEでの分子量低下、およびイムノブロットにより検出されるLe^b抗原の不存在によって可視化された。しかしながら、120〜15 0kD糖タンパク質のLe^aまたはLe^b含量はいずれもPNGアーゼＦ処理によって影響されず、これはこのタンパク質のＯ-連結炭水化物鎖におけるこれらの血液型抗原の呈示を示すものである。ヒト初乳サンプルによるH．pylori接着の阻害ヒト脱脂初乳サンプルについて、Le^aおよびLe^-モノクローナル抗体を用いSDS- PAGE移送イムノブロットで、ルイス血液型活性をスクリーニングした。低レベル Le^a、高レベルLe^bの初乳糖タンパク質を発現するLe^a-Le^b+の個体（Ａ）が見出された。さらに、Le^a高レベル、Le^bレベルは検出不能のLe^a+Le^b-の個体（Ｂ）も同定された。これらの個体はいずれも、Ulex europaeus１型およびAleuriaauranti aレクチンで認識されるように、それぞれＨ-抗原およびFucα1-6GlcNAcを発現した。初乳タンパク質の阻害レベルの滴定により、Le^a-Le^b+初乳タンパク質は、10 μgタンパク質／mlにおいて細菌の接着を完全に排除することが明らかにされた（図）。これに反して、Le^a+Le^b-初乳タンパク質では100μg／mlでも細菌の結合にはわずかな低下を生じたのみであった。ヤギおよびウシ乳汁抗原によるH．pylori接着の阻害脱脂ヤギおよびウシ乳汁中には、Le^aまたはLe^b抗原活性は検出されなかった。これらの非ヒト乳汁サンプルはいずれも100μg／mlの濃度で、阻害活性を示さなかった。フコシル化ネオ糖タンパク質の接着阻害性の解析天然のHPLC精製または合成炭水化物鎖を有しNMRスペクトルによって血清アルブミンへの化学的結合の特徴を示す以下のネオ糖タンパク質が得られた。すなわち、ラクト-Ｎ-テトラオース（LNT）-HSA、ラクト-Ｎ-ネオテトラオース（LNnT ）-HSA、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＩ（H-1）-HSA、ラクト-Ｎ-フコペンタオースII（Le^a）-HSA、ラクト-Ｎ-フコペンタオースIII（Le^x）-HSA、ラクト-Ｎ- ジフコヘキサオースＩ（Le^b）-HSA、Le^y-四糖（Le^y）-HSA、ラクト-Ｎ-ネオフコペンタオースＩ-（H-2）-BSA、GlcNAcβ１−４（Fucα１−６）GlcNAcβ-BSAである。ネオ糖タンパク質の同一性はモノクローナル抗体を用いるイムノブロットによって確認した。抗-Le^bモノクローナル抗体を除きすべての抗体が相当するネオ複合糖質を選択的に染色したことから、結果はネオ糖タンパク質のオリゴ糖鎖の高い純度を確認するものであった。抗-Le^b（CBM-LB1）クローンは、Ｈ-１-HSA と、また程度は低いがLe^y-HSAと交差反応した。同一の感度でLe^b-HSAを認識する抗-Le^b（T218）クローンは、Le^y-HSAとは交差反応しなかったが、H-1-HSAを弱く認識した。結果としてこれは、Le^y-HSAとの反応性はCBM-LB１クローンの真の交差反応性であることを指示している。これはまた、Le^y-オリゴ糖が化学的に合成され、したがってLe^bを夾雑する可能性はほとんどないので、IsoSep ABからの情報によっても確認された。しかしながら、H-1-HSA接合体との残りの反応性は、L e^b-オリゴ糖の低レベル（５％未満）での夾雑として解釈できるものと考えられる。フコシル化ネオ糖タンパク質の接着阻害性の解析のためには、細菌を20μg／m lのネオ複合糖質と上述のようにしてプレインキュベートし、阻害活性は前述の分泌IgAの20μg／mlと比較した。分泌IgAに加えて、Le^bネオ糖タンパク質はこの濃度で、H．pyloriの結合を完全に排除できた唯一の複合糖質であったが、結合の低下はH-1-ネオ複合糖質でも観察できた。しかしながら、これは前述のように、H-1-ネオ複合糖質における低レベルのLe^bの夾雑による低下としての解釈が可能であろう。複合糖質の濃度を100μg／mlに上昇させてもH-2-BSA、Le^a-HSA、Le^x -HSA、Le^y-HSAまたはGlcNAcβ１−４（Fucα１−６）GlcNAcβ-BSAによる阻害は生じなかった（データは示していない）。細菌結合のほとんど完全な低下を生じたLe^b−複合糖質および分泌IgAのレベルはそれぞれ５μg／mlおよび20μg／ml と評価された。なお、前者では１μg／ml未満の濃度で部分的な阻害作用を認めることができた。フコシル化オリゴ糖の接着阻害性の解析フコシル化オリゴ糖の細菌阻害の分析のためには、細菌を一連の濃度のH-1、L ea、Le^b、Le^xおよびLe^yオリゴ糖、0.25mM、2.5mMおよび25mM濃度のものと一緒にプレインキュベートした。H-1、Le^bおよびLeyオリゴ糖は2.5mMの濃度で細菌の結合を低下させ、25mMの濃度では結合はほとんど消失した。Le^aおよびLe^xオリゴ糖は25mMの濃度でも結合の阻害は示さなかった。Ｈ-ジ糖および2'-フコシルラクトースは20mMの濃度で細菌の結合を50〜75％低下させた。Fucα１−４GlcNAcβＯ- TMSEおよび３-フコシルラクトースプレパレーションは50mMの濃度で細菌の結合を低下させた。単糖α-Ｌ-フコースは175mMの濃度でも不活性であった。乳汁タンパク質へのH．pyloriのウエスタンブロット被覆ヒト初乳、ヤギ乳汁およびウシ乳汁をSDS-PAGE上で分離し、ニトロセルロース上に移し、フィルターを細菌と共にインキュベートした。固定化糖タンパク質への結合はヒト初乳の場合90kDタンパク質に検出されたが、一方、ヤギおよびウシ乳汁サンプルは全く結合を示さなかった。ネオ糖タンパク質へのH．pyloriのウエスタンブロット被覆一連のネオ糖タンパク質をSDS-PAGEに付して、ニトロセルロース上に移した。フィルターを細菌とインキュベートし、固定化した糖タンパク質への結合を金接合抗体で検出した。金接合抗体シグナルは銀増強によって増幅した。H．pylori のLe^b-HSAへの特異的結合およびH-1-HSAへの弱い結合が証明された。糖脂質へのH．pyloriのHPTLC被覆一連の糖脂質をHPTLC−プレート上クロマトグラフィーに付して、細菌とインキュベートし、固定化された糖脂質への結合をAP接合抗体で検出した。クロマトグラムを限界まで展開したのちにも、H．pyloriの結合はどの糖脂質にも検出できなかった。Le^aおよびLe^b抗原は相当するモノクローナル抗体により、それぞれの糖脂質中に検出された。比較のためすべての５つの初乳サンプルおよび精製分泌IgAならびに50％および80％AmSO₄分画へのmabおよび細菌の被覆（計８個のサンプルとLe^b接合体および分子量対照）の実施ヒト胃上皮細胞へのHelicobacter pyloriの付着は、インシトゥ接着アッセイを用いて、ヒト初乳分泌IgA、Ｎ-およびＯ-連結オリゴ糖のきわめて可変性のセットを有する分子によって阻害されること、一方、血清IgAにはこのような阻害性はないことを例１に示した。分泌IgAのこの阻害活性は、分泌IgAのα-Ｌ-フコシダーゼ処理によって著しく低下させることができた。H．pyloriのフコシダーゼ感受性受容体の構造を解明する努力は、分泌IgA分子中のフコース残基の分布に集中された。モノクローナル抗体およびレクチンでのイムノブロットにより、両IgA型は共通して、Ｈ-抗原、分岐Fucα1-6GlcNAc、ならびにLe^xおよびLe^y血液型抗原のようなフコシル化炭水化物構造を有することが明らかにされた。これらの観察は、Ｈ-抗原に提示されるような末端のα-１、２-連結フコース、分岐α-１、６-連結フコース、または２型鎖上の血液型抗原（Galβ１、３GlcNAcを含有）は、それらだけではH．pylori受容体を構成しないことを指示している。Le^b血液型抗原は分泌IgAの分泌成分に限定された炭水化物構造であることが見出された。遊離の分泌成分はLe^x-抗原およびGlcNAcβ１−４（Fucα１−６）GlcNAcβ（Mizoguchi／Kobata、1982）ならびにFucα１−３Fuc およびGalβ14（Fuc1-6）GlcNAcのような稀なフコシル化炭水化物構造（Purkaya stha／Lamm、1979）を示すことが以前に記載されている。しかし、Le^a-血液型抗原は２種類のIgA型のいずれにも見出されず、120〜150kD糖タンパク質中に分泌I gAと共精製されて検出された。分泌IgAプレパレーションのサイズ分画化クロマトグラフィーでは120〜150kD タンパク質から分泌IgAが分離された。この高分子量糖タンパク質はさらに、分泌成分と等しい強度の、10倍高いLe^a対タンパク質比に相当するLe^b-抗原を示す。分離されたタンパク質分画をついでインシトゥ接着アッセイに付したところ、120〜150kDタンパク質はそのLe^b-抗原含量を反映する阻害力価を有するHelicobacter pyloriの結合の有効なインヒビターとして明らかにされた。この観察から指摘されるのは、分泌IgA分子およびH．pylori接着阻害活性をもつ分画の両方に独特な唯一のフコシル化炭水化物構造としてのLe^b-抗原であった。分泌成分の炭水化物鎖はもっぱらＮ-連結鎖であると報告されてきた。その後の分泌IgAおよび120〜150kDタンパク質のLe^b-抗原分布の解析では、分泌成分のL e^b-提示炭水化物鎖のみが、グリコシダーゼの最大処理活性のための糖タンパク質のSDS変性後にも、PNGアーゼＦによって放出されたことから、これらの抗原はＮ-およびＯ-連結炭水化物鎖の両者に提示可能であることが明らかにされた。これはLe^b−血液型抗原が、糖脂質に加えて、糖タンパク質中の多数の複合炭水化物鎖上に存在し得て、受容体の表現における変動が多分、ヒト胃上皮細胞における機能性受容体としてのそれらの効率に影響できるものと思われる（G1，PANS）。 Le^b-陽性およびLe^b-陰性糖タンパク質の天然源として、ヒト初乳サンプルについて細菌接着阻害性を解析した。イムノブロットによって証明されたようにLe^a- 抗原に富むがLe^b-抗原を欠く糖タンパク質を有する初乳の細菌結合阻害は弱いが、一方、Le^b-抗原に富みLe^a-抗原含量は低い初乳は、インシトゥ接着アッセイにおいて、細菌接着の強力なインヒビターであった。これに対して、プールされたヤギ乳汁およびウシ乳汁はいずれもインシトゥ接着アッセイにおいて陰性であり、これは、イムノブロットにより証明されたようにそれらがLe^a-およびLe^b-抗原を欠くことと相関関係があった。特定のフコシル化構造をもつ糖タンパク質の詳細な阻害性を解析するために、ネオ糖タンパク質のライブラリーについてそれらの阻害作用をインシトゥ接着アッセイで解析した。もっぱらLe^b-血液型抗原をもつネオ糖タンパク質接合体が１ μg／mlの濃度で細菌の接着を妨害できる唯一の構造であることが見出され、一方、Le^a-、Le^x-およびLe^y-ネオ糖タンパク質は100μg／mlの濃度でも何ら阻害活性を発揮しなかった。これは、１型鎖上に提示される末端フコースに加えて更なるフコース残基の存在を、H．pyloriに対する受容体類似体の重要な性質として示すものである。H．pyloriの受容体特異性が無傷のジフコシル化糖鎖であるが、Le^y-（ジフコシル化２型鎖）が四糖として合成されていることから、無傷の２型鎖に比較して、H．pyloriの相互作用においてその結合性に影響する可能性が考えられるGlcNAcβ１−３Galβ１−４Glcの配列を欠いている場合には別の説明を考えることもできる。このきわめて高度な特異性は、糖接合体中におけるオリゴ糖の提示によって説明できるし、これを検討するために、一連の遊離フコシル化オリゴ糖についてインシトゥ接着アッセイにより接着阻害性を解析した。興味あることに、H．pyloriはモノフコシル化H-1ならびにジフコシル化Le^b-およびLe^y -オリゴ糖の両者を20mMの濃度で有効な細菌接着のインヒビターとして受け入れている。複合糖質に比較して遊離オリゴ糖に対する受容体特異性が緩和されることは、立体的自由度により分岐フコース残基の重要性が減少することを示している。この観察は、糖の特異性が複合糖質に比較して遊離オリゴ糖に対してはしばしば識別性が低いというレクチンの挙動に類似している。２型鎖由来の２-フコシルアミンおよびFucα１−２Gal（Ｈ）-ジ糖もわずかに高い濃度でではあるが同じく有効であった。これは２型鎖に比較して１型鎖が好ましいことを指摘するものであり、および／または炭水化物鎖の長さが上述のように重要なパラメーターであることをさらに指示すると考えられる。２-フコシルラクトースがわずかに低い受容体活性を示すと思われることから、ジフコシル化Le^y中の分岐フコース残基には受容体-アドヘシンの相互作用への何らかの寄与がある可能性も考えられる。Fucα１−４GlcNAcβＯ−TMSEオリゴ糖鎖が驚くべきことにある程度高い濃度で阻害性を示し、特定の結合は重要ではないかもしれず、さらに、 Fucα１−３末端をもつモノフコシル化３-フコシルラクトース（短いLex）が高い濃度で細菌の結合を低下させるものの、末端フコース残基の重要性が強調される。これは、遊離オリゴ糖においては、好ましくは完全長１型鎖上の末端Fucα １−２Gal結合がH．pyloriの受容体類似体の最も効率的な構造であることを示すものであるが、このコンフィギュレーションは阻害活性を保持しながらもＨ-ジ糖まで最小化することが可能である。 Le^a-抗原は多かれ少なかれ複雑な構造の多くの複合糖質中に存在しうるので、 Le^b-エピトープに対するモノクローナル抗体がヒト胃上皮細胞への細菌の接着を阻害できるか否かを調べることはきわめて興味があった。適当な陰性対照としては２型鎖上のＨ-抗原を認識するモノクローナル抗体を使用した。胃上皮細胞の切片にFITC-接合抗-マウス抗体により検出された量と同量のモノクローナル抗体を添加することにより、細菌の被覆前に切片をLe^b-モノクローナル抗体とプレインキュベートした場合には、H-2モノクローナル抗体に比較して、結合の実質的な低下が認められた。これは天然の可溶性受容体の類縁体またはクリアランス因子たとえば初乳の受容体構造に加えて、Le^b -抗原はまた、宿主標的組織のH．pylori受容体構造であり得ることを示すものである。しかしながら、可溶性Le^b−含有糖タンパク質とH．pyloriの相互作用は、それが細胞表面上に提示された固定化受容体の場合とは異なる可能性がある。固定化された糖受容体との相互作用の詳細な特異性を検討するために、２つの固相アッセイ系を使用した。すなわちウエスタンブロット上で分離されたネオ糖タンパク質への細菌の被覆およびHPTLCプレート上で分離した糖脂質への細菌の被覆である。細菌のウエスタンブロット被覆によりLe^b-ネオ糖タンパク質との特異的相互作用とさらに１型鎖上のＨ-抗原への一部の弱い結合が証明された（LNF1 ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フアールク，ペルアメリカ合衆国ミズーリ州 63105．クレイトン．デマン 911 (72)発明者ボレーン，トーマスアメリカ合衆国ミズーリ州 63105．セントルイス．サウスウツドアベニユー6300

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位からなるジまたはオリゴ糖グリコシドの、ヒト胃粘膜のヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）による感染が関与する状態のヒトにおける処置および予防用の医薬組成物の製造のための使用。２．グリコシドがヘリコバクター・ピロリの表面上に存在するアドヘシンに結合することができる請求項１に記載の使用。３．少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドはヒト胃粘膜の組織学的切片の上皮細胞へのヘリコバクター・ピロリの細胞の接着を阻害または実質的に低下できる、請求項１または２に記載の使用。４．少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドはヘリコバクター・ピロリの細胞のヒト胃粘膜の組織学的切片の上皮細胞への接着を阻害することが可能で、この場合細菌細胞は500μg／mlまでの濃度でグリコシドとプレインキュベートされ、阻害は相当する非プレインキュベート細菌細胞の接着に比較して少なくとも50％である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。５．ヒト胃粘膜の組織学的切片が非疾患ヒト胃粘膜組織のサンプルをフォルマリンで固定し、該サンプルをパラフィン中に包埋し、包埋サンプルの約５μm切片を作成し、この切片をガラススライド上に載せ、キシレンおよびイソプロパノールによって洗浄して切片を脱パラフィンし、その切片をリン酸緩衝食塩溶液中好ましくはそれぞれ約0.2％および0.05％濃度のウシ血清アルブミンおよび非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤からなる緩衝液とインキュベートすることによって調製される、請求項３または４のいずれかに記載の使用。６．ヘリコバクター・ピロリの細胞が標識され、好ましくは蛍光色素によって標識され、とくにフルオレセインイソチオシアネートによって標識される、請求項３〜５のいずれかに記載の使用。７．細菌細胞は、食塩および炭酸ナトリウムをそれぞれ好ましくは約0.15Ｍおよび0.1Ｍ濃度で含有するpH約9.0の緩衝液中の細菌細胞懸濁液を約0.1mg／ml濃度のフルオレセインイソチオシアネートで処理し、室温で１時間インキュベートし、細菌細胞を遠心分離により分離し、ついで細菌細胞を非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤を好ましくは約0.05％の濃度で含有するリン酸緩衝食塩溶液で洗浄することによって標識される、請求項６に記載の使用。８．細菌細胞のグリコシドとのプレインキュベーションは、リン酸緩衝食塩溶液中好ましくはそれぞれ約0.2％および0.05％濃度のウシ血清アルブミンおよび非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤からなる緩衝液中細菌細胞懸濁液に500μg／mlまでの濃度のグリコシドを好ましくは室温において約２時間かけて添加し、細菌細胞を遠心分離によって分離し、ついで細胞を同一の緩衝液中で洗浄することによって行う、請求項４〜７のいずれかに記載の使用。９．プレインキュベートしたまたはしない細菌細胞の接着は、１mlあたり細菌細胞約10⁶〜10⁸個を含有する希釈細菌細胞懸濁液を組織学的切片に適用し、この切片を細菌細胞の懸濁液と加湿チャンバー内において室温で１時間インキュベートし、スライドをリン酸緩衝食塩溶液中で洗浄し、切片の上皮細胞への接着度を確立することにより測定される、請求項４〜８のいずれかに記載の使用。 10．用いられる細菌細胞は請求項７に記載のようにして調製され、切片の上皮細胞への接着度は蛍光顕微鏡下の検査により確立される、請求項９に記載の使用。 11．用いられる細菌細胞は、ヘリコバクター・ピロリ株NCTC11637、NCTC11638、 WV229およびP466の細胞から選択される、請求項１〜10のいずれかに記載の使用。 12．ヘリコバクター・ピロリによる胃腸感染が関与する状態は慢性活動型（Ｂ型）胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌および胃リンパ腫からなる、請求項１〜 11のいずれかに記載の使用。 13．ジまたはオリゴ糖グリコシドは糖タンパク質である、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。 14．糖タンパク質はヒトκ-カゼイン、ヒト初乳IgA、およびウシ顎下腺ムチンから選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。 15．オリゴ糖グリコシドが、２個の末端Ｌ-フコース単位を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。 16．オリゴ糖グリコシドの糖鎖の非還元末端の末端四糖が、ルイスｂ−四糖、Fu cα１−２Galβ１−３（Fucα１−４）GlcNAcβ１-である、請求項15に記載の使用。 17．ヒト胃粘膜のヘリコバクター・ピロリによる感染によって起こるヒト疾患の処置および／または予防方法において、少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位からなるジまたはオリゴ糖グリコシドの有効量をそれを必要とするヒト患者に投与することからなる方法。 18．少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位からなるジまたはオリゴ糖グリコシドはヘリコバクター・ピロリの表面上に存在するアドヘシンに結合できる、請求項17に記載の方法。 19．少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドはヘリコバクター・ピロリ細胞のヒト胃粘膜の組織学的切片の上皮細胞への接着を阻害または実質的に低下させうる、請求項17または18に記載の方法。 20．少なくとも１個の末端Ｌ-フコース単位を有するジまたはオリゴ糖グリコシドはヒト胃粘膜の組織学的切片の上皮細胞へのヘリコバクター・ピロリの細胞の接着を阻害することができ、細菌細胞は、500μg／mlまでの濃度でグリコシドとプレインキュベートし、阻害は相当する非プレインキュベート細菌細胞の接着に比較して少なくとも50％である、請求項17〜19のいずれかに記載の方法。 21．ヒト胃粘膜の組織学的切片は非疾患ヒト胃粘膜組織のサンプルをフォルマリンで固定し、このサンプルをパラフィン中に包埋し、包埋サンプルの約５μm切片を作成し、この切片をガラススライド上に載せて、キシレンおよびイソプロパノールによって洗浄して切片を脱パラフィンし、その切片をリン酸緩衝食塩溶液中好ましくはそれぞれ約0.2％および0.05％濃度のウシ血清アルブミンおよび非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤からなる緩衝液とインキュベートすることによって調製される、請求項19または20のいずれかに記載の方法。 22．ヘリコバクター・ピロリの細胞が標識され、好ましくは蛍光色素によって標識され、とくにフルオレセインイソチオシアネートによって標識される、請求項 19〜21のいずれかに記載の方法。 23．細菌細胞は食塩および炭酸ナトリウムをそれぞれ好ましくは約0.15Ｍおよび 0.1Ｍ濃度で含有するpH約9.0の緩衝液中の細菌細胞懸濁液を約0.1mg／ml濃度のフルオレセインイソチオシアネートで処理し、室温で１時間インキュベートし、細菌細胞を遠心分離により分離し、ついで細菌細胞を非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤を好ましくは約0.05％の濃度で含有するリン酸緩衝食塩溶液で洗浄することによって標識される、請求項22に記載の使用。 24．細菌細胞のグリコシドとのプレインキュベーションは、リン酸緩衝食塩溶液中好ましくはそれぞれ約0.2％および0.05％濃度のウシ血清アルブミンおよび非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤からなる緩衝液中細菌細胞懸濁液に500μg／mlまでの濃度のグリコシドを室温において約２時間かけて添加し、細菌細胞を遠心分離によって分離して、ついで細菌細胞を同一の緩衝液中で洗浄することによって行う、請求項20〜23のいずれかに記載の方法。 25．プレインキュベートしたまたはしない細菌細胞の接着は１mlあたり細菌細胞約10⁶〜10⁸個を含む希釈細菌細胞懸濁液を組織学的切片に適用し、この切片を細菌細胞の懸濁液と加湿チャンバー内において室温で１時間インキュベートし、スライドをリン酸緩衝食塩溶液中で洗浄し、切片の上皮細胞への接着度を確立することにより測定する、請求項20〜24のいずれかに記載の方法。 26．用いられる細菌細胞は請求項23に記載のようにして調製され、切片の上皮細胞への接着度は蛍光顕微鏡下の検査により確立される、請求項25に記載の方法。 27．用いられる細菌細胞は、ヘリコバクター・ピロリ株NCTC11637、NCTC11638、 WV229およびP466の細胞から選択される、請求項17〜26のいずれかに記載の方法。 28．ヘリコバクター・ピロリによる胃腸感染が関与する状態は慢性活動型（Ｂ型）胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌、および胃リンパ腫からなる、請求項17 〜27のいずれかに記載の方法。 29．ジまたはオリゴ糖グリコシドが、糖タンパク質である、請求項17〜28のいずれかに記載の方法。 30．糖タンパク質はヒトκ-カゼイン、ヒト初乳IgA、およびウシ顎下腺ムチンから選択される、請求項17〜29のいずれかに記載の方法。 31．オリゴ糖グリコシドが２個の末端フコース単位を有する、請求項17〜29のいずれかに記載の方法。 32．オリゴ糖グリコシドの糖鎖の非還元末端の末端四糖が、ルイスｂ-四糖Fucα １-２Galβ１-３（Fucα１-４）GlcNAcβ１-である、請求項31に記載の方法。