JPH08509703A

JPH08509703A - 殺菌／透過性増加タンパク質産物の治療用途

Info

Publication number: JPH08509703A
Application number: JP6520214A
Authority: JP
Inventors: ザセカンド．，ロジャージー．リトル，; ヘレンガザノ−サントロ，; ジェームスブリアンペアレント，
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1993-03-12
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1996-10-15
Also published as: CA2157927C; AU6360594A; US5807818A; CN1124455A; CN1478543A; US20020090368A1; DE69427582D1; ATE202482T1; HK1014497A1; EP0690720A1; JP2005187480A; EP1129718A3; GR3036686T3; DK0690720T3; MX9401807A; EP1129718A2; EP0690720B1; CN1105574C; JP2005206606A; CA2157927A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、殺菌／透過性増加（BPI）タンパク質産物を投与することによる、ヘパリンの抗凝固活性の中和、ならびに脈管形成、腫瘍及び内皮細胞増殖の阻害を包含する状態の治療、さらには慢性炎症性疾患の治療のための、治療学的方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】殺菌／透過性増加タンパク質産物の治療用途本出願は、1993年3月12日付出願の、米国特許出願第08/030,644号の一部継続出願である。発明の背景本発明は、グラム陰性細菌感染に関連する状態ならびに、ヘパリンの抗凝固特性の中和、そして脈管形成、腫瘍及び内皮細胞増殖の阻害を包含する、グラム陰性細菌感染には直接的に関連しない状態の治療、さらには関節炎などの慢性炎症性疾患の状態の治療のための、殺菌／透過性増加（BPI）タンパク質産物の治療用途に関する。ヘパリン結合ヘパリンは、抗凝固特性を有するグリコサミノグリカンと称される、直鎖陰イオン性のムコ多糖の、異成分からなる群である。例外がありうるが、ヘパリンに見られる主要な糖は、（1）α-L-イズロン酸2-硫酸、（2）2-デオキシ-2-スルフアミノ-α-D-グルコース6-硫酸、（3）β-D-グルクロン酸、（4）2-アセタミド- 2-デオキシ-α-D-グルコース、及び（5）α-L-イズロン酸である。これらの糖は、通常（2）＞（1）＞（4）＞（3）＞（5）の順序に減少していく量で存在し、グリコシド結合により連結され、種々のサイズのポリマーを形成している。共有結合した硫酸及びカルボン酸基の含量のゆえに、ヘパリンは強酸性を呈する。ヘパリンは肥満細胞顆粒内に見出され、脱顆粒に際して放出される。ヘパリンの細胞会合型は、ヘパリン硫酸と称される。ヘパリン硫酸は、近遍在（near-ubiquit ous）の分布をもって、哺乳動物細胞表面上及び細胞外マトリックス内に見出される、種々の硫酸化プロテオグリカン（HSPG）を述べるのに用いられる、広範なる用語である。HSPGは、可溶性ヘパリンと類似の様式で機能するペンタマーのヘパリン様配列を種々の比率で含有する。HSPGは、アンチトロンビンIII（ATIII）のための、ならびに繊維芽細胞成長因子（FGF）1〜5、IL-8、GM-CSF及びIL-3などのヘパリン結合性成長因子のための貯蔵所として役立つ。Folkmanら、Inflammation：Basic Principles and Clin ical Correlates、第２版、第40章、821〜839頁（1992）。事実、遺伝的にHSPG が欠損された細胞は、その成長のために外来性のヘパリンを必要とする。心肺のバイパス、心カテーテル及び血液透析法などの外科的手法に際して、このような外科的手法の際の血液凝固を防ぐために、400U/kgまでの投与量で、通常ヘパリンが投与される。血液中でのヘパリンの抗凝固効果は、ヘパリンとATII Iとの相互作用の結果惹起こされるものである。ヘパリン／ATIII複合体は、凝固カスケードの凝塊因子（clotting factor）の多くのものの、強力な阻害剤である。活性化されたIXa、Xa、XIa、XIIIa因子及びトロンビンに対して、特異的な阻害が立証されている。ヘパリン／ATIII複合体は、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を惹起こす、凝塊カスケードの最後の２段階として関与する内性及び外性凝塊経路の双方に共通の、Xa因子及びトロンビンに対して最も高い親和性を有する。外科術に際して、抗凝固効果のためにヘパリンが投与される場合、正常な抗凝固機能を回復することができるように、ヘパリンの効果を速やかに中和することが、外科術後の治療に重要なことである。現在は、ヘパリンを中和するためにプロタミンが用いられる。プロタミンは、通常サケ精子から単離される、低分子量の単純なタンパク質である。プロタミンはアルギニンアミノ酸残基に富んでおり、強塩基性である。単独で投与した場合、プロタミン（普通、プロタミン硫酸の形態で）は抗凝固効果を有する。ヘパリンの存在下に投与すると、安定な複合体が形成され、双方の薬品の抗凝固活性が喪失される。プロタミンの有意な低圧及びアナフィラキシー様の効果により、その臨床的実用に制限が加えられる。ヘパリン中和活性を有するその他の報告された化合物としては、血小板因子４（PF4）及び主要塩基性タンパク質が挙げられ、これらについては米国特許第5,0 86,164号を参照されたい。主要塩基性タンパク質は、ヘパリン中和活性を有することが証明されているものの、高い毒性を有するものでもある。脈管形成脈管形成は、内皮細胞増殖と密接に関連し、新しい毛細血管の発生を生ぜしめる。かくのごとく、哺乳動物の発生及び成長において、また月経のプロセスにおいて脈管形成は重要なプロセスである。線維芽細胞成長因子１〜５などの脈管形成成長因子の放出は、ヘパリン依存性の受容体結合機構を介して内皮細胞の増殖を誘導する。Yayonら、Cell、64巻、841〜848頁（1991）を参照されたい。これらのヘパリン結合性成長因子は、脈管の外傷（創傷治癒）、免疫刺激（自己免疫疾患）、炎症性メディエータ（プロスタグランジン）が原因となって、また腫瘍細胞から、放出されうる。脈管形成はこのような新しい血管の発生を阻害することが望ましいであろうような数多くの病理学的状態に関連するものである。１つの例としては、脈管形成は種々の腫瘍の成長、増殖、及び転移にとって、重大なものである。脈管形成に関連するその他の病理学的状態には、糖尿病性網膜症、後水晶体繊維増殖症、血管新生性緑内障、乾せん、血管繊維腫、ならびに、慢性関節リウマチ、アテローム硬化性斑（atherosclerotic plaque）内での毛管増殖、血管腫、子宮内膜症及びカポジ肉腫を含む免疫性及び非免疫性炎症が包含される。 Folkmanら（前出）は、皮膚における乾せんの障害は、内皮の増殖、血管新生、及び炎症性細胞の浸潤により左右されることを開示している。しかしながら、脈管形成が乾せんの病理学における１つの工程であるのか、または二次的な現象であるのかは、明らかではない。種々の物質が、脈管形成阻害剤として機能することが知られており、腫瘍の脈管形成を阻害すること、関節炎の発症を妨げること、及びコラーゲンで誘導した関節炎モデル（Peacockら、J.Exp.Med.、175巻、1135〜1138頁（1992））において樹立した関節炎を阻害することが報告されている。１つの例としては、プロタミンが腫瘍の脈管形成及びそれに続く腫瘍の成長をを阻害することが知られている。Taylorら、Nature、297巻、307〜312頁（1982）によれば、プロタミンの抗脈管形成活性は、そのヘパリン結合能に寄与するものである。PF4もまた、抗脈管形成活性を呈することが知られている。本出願にとって興味の対象となるのは、抗脈管形成活性は有するがヘパリン結合能は欠いている、修飾されたPF4及びその類似体を開示する米国特許第5,112,946号である。PF4は少なくとも２つの機能的特性を有することが示されている。ヘパリン結合性が最も旺盛に研究されているのではあるが、元来、PF4はコラゲナーゼ阻害特性を有すると言われていた。コラゲナーゼ阻害剤は、発見されたなかで最初の脈管形成阻害剤であった。Fo lkman、1973（前出）を参照されたい。PF4のヘパリン結合領域における変異は、それらのコラゲナーゼ阻害活性に対する効果のゆえに実験がなされなかった。興味深いことには、トロンボスポンジン（thrombospondin）もまた、脈管形成の阻害剤であり、塩基性アミノ酸モチーフに代わって、セリン／トリプトファンモチーフでヘパリンに結合する。かくのごとく、ヘパリン結合または脈管形成阻害に対する明瞭な単一のコンセンサス配列はない。公開されたPCT特許出願第WO 92/01003号は、グリコサミノグリカン（ヘパリン）誘導体の用途及び腫瘍侵襲の阻害剤としてのそれらの用途を開示している。実質的に抗凝固活性がなく、そして宿主における腫瘍の転移の形成を妨げるとして記載されるヘパリン誘導体が、開示される。慢性炎症慢性炎症は普通、脈管形成を伴うものである。関節炎は、滑液の濃密化（syno vial thickening）ならびに、免疫因子、及び多形核性白血球（PMN）などの細胞の流入を伴う末梢関節の炎症によりその特徴が示される、慢性症候群である。慢性関節リウマチにおいては、炎症は免疫により推進されるが、一方反応性（reac tive）関節炎においては、炎症は化膿性細菌またはその他の感染性薬剤での滑液組織の感染に関連している。Folkmanら、1973（前出）には、多くの型の関節炎が、関節における炎症性浸潤により跳梁される段階から、血管新生パンヌスが関節に侵入して軟骨を破壊する後期の段階にまで進行することも述べられている。関節炎における脈管形成が疾患の原因となる要素であって、付帯徴候ではないのか否かは明らかではないものの、脈管形成が慢性関節リウマチにおける滑膜炎の維持に欠かせないことの証拠はある。非ステロイド性抗炎症医薬（NSAID）、コルチコステロイド及びその他の療法により、関節炎の治療のための救済法における改良がなされたものの、関節炎及びその他の炎症性疾患のためのより有効な療法が、当該技術分野において希求され続けている。炎症と脈管形成とは今や、分離しうるが、相互に他方を排除しえないプロセスであるものと理解されている。炎症を起こさすことなく脈管形成を刺激する特異的な脈管形成タンパク質が発見されているが、一方で、脈管形成阻止（angiosta tic）ステロイドは急性炎症を低減させることなく脈管形成を阻害することができる。Folkman、1973（前出）を参照されたい。興味深いことに、内毒素が、マクロファージのサイトカイン及び成長因子の刺激を通じての、脈管形成の最も強力な外来性刺激物質として同定されている。殺菌／浸透性増加タンパク質殺菌／透過性増加（BPI）タンパク質は、微生物侵入に対する防御において必須の赤血球である、哺乳動物PMNの顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトB PIタンパク質は、酸抽出と、イオン交換クロマトグラフィー（Elsbach、J.Biol. Chem.、254巻、11000頁（1979））またはE.coliアフィニティークロマトグラフィー（Weissら、Blood、69巻、652頁（1987））のいずれかとを組み合わせることにより多形核性好中球から単離されており、本明細書中天然BPIとして言及されるものであって、広範囲のグラム陰性細菌に対して強力な殺菌活性を有する。ヒトBPIの分子量は、およそ55,000ダルトン（55kD）である。ヒトBPIタンパク質全体のアミノ酸配列ならびに、該タンパク質をコードするDNAも、Grayら、J.Bio l.Chem.、264巻、9505頁（1989）の図１に明示されており、この文献を引用することにより本明細書に組み込むこととする。 BPIの殺菌効果は、感受性を有するグラム陰性菌種に極めて特異的であることが示されており、一方その他の微生物に対しても真核性細胞に対しても毒性を示さない。BPIが細菌を殺生するところの正確な機構は未だわかっていないが、BPIが第１に感受性の高いグラム陰性細菌の表面に接着しなければならないことは知られるところである。細菌へのBPIのこの初発結合は、塩基性のBPIタンパク質とリポ多糖（LPS）上の陰性電荷を帯びた部位との間の静電気的相互作用が関与するものである。LPSは、それが刺激する強力な免疫応答のゆえに、「内毒素」と称されている。LPSは、宿主炎症性細胞によるメディエーターの放出を誘導し、それが究極的には不可逆的な内毒素性ショックを惹起こしうる。BPIは、LPSの最も毒性を有し、且つ最も生物学的に活性な成分である、脂質Aに結合する。感受性を有する細菌において、BPI結合はLPS構造を崩壊させ、これによりリン脂質及びペプチドグリカンを分解する細菌酵素の活性化が導かれ、細胞外膜の透過性が改められ、そして究極的には細胞死を導く事象が開始されると考えられている。Elsbach及びWeiss、Inflammation：Basic Principles and Clinical Corr elates、Gallinら出版、第30章、Review Press,Ltd．（1992）。BPIは、２段階で作用すると考えられている。第１段階は、即時型成長停止（immediate growth arrest）、外膜の透過性付与（permeabilization）ならびにリン脂質及びペプチドグリカンを加水分解する細菌酵素の選択的な活性化によってその特徴が示される、致死に近い段階である。この段階にある細菌は、血清アルブミンが補給された培地に播種することにより救命されることができる。第２段階は、血清アルブミンにより復元することができない成長阻害により定義付けられており、細菌を長時間BPIに曝した後に起こり、細胞質膜の浸透（penetration）を包含する、広範な生理学的及び構造的変化によってその特徴が示されるものである。 BPIは、それに結合するLPSの内毒素特性を中和することもできる。そのグラム陰性細菌殺菌特性及びLPSを中和する能力のゆえに、BPIは、菌血症または敗血症などのグラム陰性細菌により惹起こされる疾患に罹患した哺乳動物の治療のために利用されることができる。ヒトBPIホロタンパク質のN-末端部分に対応するタンパク質分解断片は、天然に由来する55kDのヒトホロタンパク質の脂質Aへの結合活性及び抗菌活性を保持している。N-末端部分とは対照的に、単離されたヒトBPIタンパク質のC-末端領域は、わずかに検出可能な抗細菌活性を呈するのみである。Ooiら、J.Exp.Med. 、174巻、649頁（1991）。ヒトBPIホロタンパク質の最初のおよそ199アミノ酸残基を含み、「rBPI₂₃」と称されるBPIのN-末端断片が、23kDタンパク質として、組換え手段により製造されている。Gazzano-Santoroら、Infect.Immun.、60巻、 4754〜4761頁（1992）。本出願にとって興味の対象となるのは、BPIタンパク質及び陰イオン性化合物を含む組成物に関する、公開番号第WO 92/03535号を有するPCT国際出願PCT/US91 /05758号における開示であり、該組成物は、（1）殺菌活性は呈さず、（2）内毒素中和活性は呈すると述べられている。陰イオン性化合物は、好ましくは、血清アルブミンなどのタンパク質であるが、ヘパリンなどのプロテオグリカンであることも可能である。加えて、Weissら、J.Clin.Invest.、55巻、33〜42頁（1975 ）は、ヘパリン硫酸とLPSが結合して、BPIの透過性増加活性の発現をブロックすることを開示している。しかしながら、いずれの引用文献もBPIとの併用によるヘパリンの中和は開示していない。当該技術分野において、ヘパリンの中和、腫瘍及び脈管形成、内皮細胞増殖の阻害、ならびに慢性炎症の治療における使用のための新しい産物及び方法に対する要求は現存し続けている。発明の要約本発明の１つの局面によれば、対象者（subject）に対してin vivoで、またはヘパリン含有流体試料にin vitroで、有効量のBPIタンパク質産物を投与することを含む、ヘパリンの抗凝固活性の中和のための方法が提供される。本発明のいま１つの局面によれば、内皮細胞増殖を阻害するために、BPIタンパク質産物が対象者に投与されるが、ここで内皮細胞増殖は、脈管形成に関連する内皮細胞増殖を包含するが、それに限定されるものではない。本発明により、種々の臨床的状態に関連する脈管形成の阻害方法が提供される。本発明により特に提供されるのは、悪性腫瘍増殖、カポジ肉腫障害などに関連する、脈管形成を阻害することによる、癌の治療方法である。BPIタンパク質産物の投与により治療が可能な癌には、黒色腫、肉腫、ならびに、乳房、結腸、肺及び前立腺癌腫を包含するがそれらに限定されない癌腫が包含される。脈管形成の阻害のために、 BPIタンパク質産物を投与することができる他の状態には、眼性網膜症、後水晶体繊維増殖症、乾せん、血管繊維腫、子宮内膜症、血管腫などが包含される。さらに本発明により企図されるのは、受精した卵子の着床を妨げるべく、有効量の BPIタンパク質産物を配送することを含む避妊の方法である。また、本発明により、炎症性疾患状態に罹患している対象者に、有効量のBPI タンパク質産物を投与することを含む、関節炎、乾せん、炎症性腸疾患、限局性回腸炎、潰瘍性大腸炎、狼瘡性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、ライム病、及び喘息などの慢性炎症性疾患状態の治療方法も提供される。本発明はさらに、ヘパリンの抗凝固特性の中和、腫瘍及び内皮細胞増殖の阻害、脈管形成の阻害ならびに慢性炎症性疾患状態の治療のための薬物の調製法をも提供する。このような薬物は、経口投与用、注射またはその他の非経口的方法用に調製されることができ、好ましくは、当業者により周知のごとくに、通例の医薬的に容認しうる担体及び添加剤を含むものである。薬物は、好ましくは、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、ならびに注射可能な及び注入可能な溶液などどいった、固形、半固形の単位投与量形態及び液体投与量形態にある。約100μg/kg 体重から約10mg/kg体重の範囲にわたる有効投与量が、企図される。本明細書中で用いられる場合、「BPIタンパク質産物」には、天然の及び組換え法により製造された殺菌／透過性増加タンパク質：殺菌／透過性増加タンパク質の、天然、合成及び組換え法による生物学的に活性なポリペプチド断片：及び、殺菌／透過性増加タンパク質またはその生物学的に活性な断片のいずれかの、ハイブリッド融合タンパク質を包含する、生物学的に活性なポリペプチドまたは類似体が包含される。図面の簡単な説明図１は、rBPI₂₃及びrBPIについてのヘパリン結合アッセイのグラフを表す。図２は、種々のLPS及びテイコ酸試料に比較した、E.coli J5の脂質AへのrBPI₂ ₃ 結合に対するヘパリンの効果を示すグラフを表す。図３は、トロンビンのATIII/ヘパリン阻害に対するrBPI₂₃の効果を示すグラフを表す。図４は、Xa因子のATIII/ヘパリン阻害に対するrBPI₂₃の効果を示すグラフを表す。図５は、ヒト血漿における、ヘパリンが媒介するトロンビン時間の延長に対するrBPI₂₃の効果を示すグラフを表す。図６は、部分的（partial）トロンボプラスチン化時間に対するrBPI₂₃の効果を示すグラフを表す。図７は、軽い関節炎となった、コラーゲンで誘導した関節炎モデルにおける関節炎スコアに対するrBPI₂₃及びタウマチンコントロールタンパク質の効果を示すグラフを表す。図８は、重篤な関節炎となった、コラーゲンで誘導した関節炎モデルにおける関節炎スコアに対するrBPI₂₃及びプロタミンの効果を示すグラフを表す。図９は、Yersiniaで誘導した関節炎モデルにおける関節炎の発生率に対するrB PI₂₃の効果を示すグラフを表す。図10は、LALアッセイのBorrelia burgdorferi LPS様刺激の阻害に対するrBPI₂ ₃ の効果を示すグラフを表す。図11は、マウス黒色腫転移モデルにおいて、BPIまたは緩衝液を用いて処置したマウスの生残を示すグラフを表す。図12は、II型ネズミ毛細管内皮細胞増殖に対するrBPI₂₃の効果を示すグラフを表す。図13は、内皮細胞へのBPI結合を示す。図14は、合成BPIペプチドについての、ヘパリン結合アッセイのグラフを表す。図15は、合成BPIペプチドについてのLimulus Amoebocyte Lysate（LAL）阻害アッセイのグラフを表す。図16は、合成BPIペプチドについての放射拡散殺菌アッセイのグラフを表す。図17は、ヘパリン結合アッセイにおける合成BPIペプチドの効果を示すグラフを表す。図18a及び18bは、トロンビンのATIII/ヘパリン阻害に対する合成BPIペプチドの効果を示すグラフを表す。図19a及び19bは、LAL阻害アッセイにおける合成BPIペプチドの効果を示すグラフを表す。図20a、20b、20c、及び20dは、放射拡散殺菌アッセイにおける合成BPIペプチドの効果を示すグラフを表す。図20e及び20fは、E．coliブロスアッセイにおける合成BPIペプチドの効果を示すグラフを表す。図21a及び21bは、rBPI₂₃のタンパク質分解断片についてのHPLCでの吸光度測定の結果を表す。図22は、rBPI₂₃のタンパク質分解断片についてのLAL阻害アッセイの結果を示すグラフを表す。図23は、rBPI₂₃の機能性ドメインを表す。発明の詳細な説明本発明は、細菌感染に直接的に関連しない、種々の治療学上の状態の治療のための、殺菌／透過性増加タンパク質（BPI）タンパク質産物の投与に関する。本明細書に記載のBPIタンパク質産物は、グラム陰性細菌に対する強力な細胞毒性物質として、及びグラム陰性細菌の細胞壁に会合するリポ多糖の有害な効果を中和するために有用であるが、グラム陰性細菌感染に直接的に関連しないBPI タンパク質産物についての種々の治療学的効果が発見されてきている。特に、本発明はヘパリンの抗凝固活性の中和ならびに、腫瘍及び脈管形成に関連する細胞増殖を含めた内皮細胞増殖の阻害を包含する、グラム陰性細菌感染に直接的に関連しない状態の治療、さらには関節炎などの慢性炎症性疾患状態の治療のための方法を提供する。本発明の方法に従って投与されるべき、BPIホロタンパク質の生物学的に活性な断片を包含するBPIタンパク質産物は、当該技術分野において知られるところのいかなる手段によって作製及び／または単離されてもよい。共有であり同時係属中の米国特許出願第07/885,501号、及びその一部継続出願である1993年5月19日出願の米国特許出願第08/072,063号（双方とも、引用することにより本明細書に組み込むこととする）は、培養にて遺伝的に形質転換された哺乳動物宿主細胞において発現され該細胞から分泌された組換えBP Iタンパク質産物の新規精製方法を開示し、安定で均質な医薬調製物に混合するために好適な組換えBPI産物を大量に製造する方法を開示するものである。 BPIの生物学的に活性な断片には、分子がBPIホロタンパク質のアミノ末端アミノ酸、内部アミノ酸、及び／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠失していることを除いては、BPIホロタンパク質と同じアミノ酸配列を含む、生物学的に活性な分子が包含される。本発明を限定することのない実施例によれば、このような断片には本明細書中に記載されたもの及び以前に発表された、天然の25kD断片及び、rBPI₂₃と称される組換え体である、ヒトBPIホロタンパク質の199アミノ酸残基の23kDのアミノ末端断片が包含される。Gazzano-Santoroら、Infect.Immun.、60 巻、4754〜4761頁（1992）を参照されたい。該出版物においては、Grayら（前出）より由来の、配列番号：１及び２で示された、成熟ヒトBPIの31残基のシグナル配列及びN-末端の最初の199アミノ酸を有する組換え発現産物（rBPI₂₃）をコードするDNAのソースとして、発現ベクターが用いられたが、但し、前記199アミノ酸は、第151位のバリンがGTCではなくGTGにより特定され、第185位の残基がリシン（AAGにより特定される）ではなくグルタミン酸（GAGにより特定される）であることを除けばGrayらに由来のものと同様である。rBPIまたはrBPI₅₀として本明細書中に言及した組換えホロタンパク質も、やはりGrayら（前出）より由来の配列番号：１及び２で示される配列を有するものとして製造されているが、ここでもrBPI₂₃に対して記した例外を伴うものである。 BPIの生物学的に活性な断片の、その他の本発明を限定することのない例としては、臭化シアン（CNBr）などの試剤を用いた化学的開裂またはエンドプロテイナーゼAsp-Nなどの試剤を用いた酵素的消化にタンパク質を供することで作製された、BPIホロタンパク質またはrBPI₂₃の断片が包含される。BPIタンパク質断片はまた、BPIホロタンパク質の中の、殊に該タンパク質のアミノ末端半分の中の、約5から約50の連続したアミノ酸からの複製物を含んでなる直鎖または環状合成ペプチドの形態で提供されてもよい。このようなペプチドは単量体の形態、二量体または多量体の形態（ペプチドがシステイン残基を有するBPIの領域を複製する場合）及び、BPI配列が選択されたコンホメーションの呈示を許容する「スペーサー」アミノ酸による分離を伴ってまたは伴わずに、ペプチド内でBPI配列が繰り返し存在する「直鎖状」二量体または多量体の形態で、提供されてもよい。 BPIの生物学的に活性な類似体には、BPIホロタンパク質またはその生物学的に活性な断片、及び少なくとも１つの他のポリペプチドの少なくとも一部分を含む組換えハイブリッド融合タンパク質が包含されるが、それらに限定されることはない。このようなタンパク質は、Theofanらの、共有であり同時係属中の米国特許出願第07/885,911号、及びその一部継続出願である1993年5月19日出願の米国特許出願第08/064,693号（代理人事件番号第27129/31429）（これら出願はそのすべてを、引用することにより本明細書に組み込むこととする）により記載されており、これらタンパク質は、アミノ末端部でBPIタンパク質またはその生物学的に活性な断片及び、カルボキシ末端部でイムノグロブリン重鎖またはその対立遺伝子変異体の少なくとも１つの定常ドメインを含んでなるハイブリッド融合タンパク質を包含するものである。 BPIの生物学的に活性な類似体は、さらに１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸または非定型性の（atypical）アミノ酸により置換されたBPIタンパク質産物を包含するが、それらに限定されるものではない。例えば、1993年2月2日出願の、共有であり同時係属中の米国特許出願第08/013,801号（Theofanら、「安定な殺菌／透過性増加タンパク質産物およびそれを含有する医薬組成物」、引用することにより本明細書に組み込むものとする）は、第132位または第135位のシステイン残基が、異なるアミノ酸により置換されている、BPI及びBPI断片のポリペプチド類似体を開示する。rBPI_23Δcysと名付けられた１つの好ましいタンパク質産物は、BPIホロタンパク質の最初の199アミノ酸残基を含んでなるが、ここで第132位のシステイン残基が、アラニンで置換されている。 BPIタンパク質産物の投与は、好ましくはBPIタンパク質産物及び医薬的に容認しうる賦形剤、添加剤または担体を含む医薬組成物を用いて成し遂げられる。BP Iタンパク質産物組成物は、既知の抗生物質、界面活性剤、またはその他の化学療法剤と併用してまたは併用することなく投与されてよい。BPIタンパク質産物を含有する好ましい医薬組成物は、0.1重量％のポロキサマー188（Pluronic F-6 8、BASF Wyandotte、Parsippany、ニュージャージー）及び0.002重量％のポリソルベート80（Tween 80、ICI Americans Inc.、Wilmington、デラウェア）を含むクエン酸緩衝性生理食塩水中（0.02Mクエン酸塩、0.15M NaCl、pH5.0）に、１mg /mlの濃度でBPIを含むものである。このような好ましい組合せは、1993年2月2日出願の、共有であり同時係属中の米国特許出願第08/012,360号（McGregorら、「改良された医薬組成物」、引用することによりその開示を本明細書に組み込むものとする）に記載される。ヘパリンの抗凝固活性の部分的または完全な中和、及びその他の本明細書中に記載の効果のためのBPI及びBPIタンパク質産物の有効投与量は、対象者のサイズ、対象者に投与されたヘパリンの質及びヘパリン投与後の経過時間を包含する通例のパラメータに従って、当業者により容易に決定されえよう。本発明のその他の局面及び利点は、以下に示す実施例を考慮した上で理解されるものであろう。実施例１には、BPIタンパク質産物によるヘパリン結合の定量化のためのアッセイシステムを述べる。実施例２には細菌LPSのBPIタンパク質産物への結合を阻害する、ヘパリンの相対的能力を記載する。実施例３及び４には、それぞれ、アンチトロンビンIII/ヘパリン複合体によるトロンビンまたはXa因子の不活性化を阻害する、BPIタンパク質産物の能力についての試験結果を表す。そして、実施例５は、トロンビン時間のヘパリンにより媒介される延長に対するBPIタンパク質産物の効果に関する。実施例６は、部分的トロンボプラスチン化時間の、ヘパリンにより媒介される延長に対する、BPIタンパク質産物の効果に関する。実施例７〜９は、慢性炎症性疾患状態の治療を例示する、コラーゲン及び細菌で誘導した関節炎動物モデル系におけるモデル系でのBPIタンパク質産物の投与に関する。実施例10〜11には、マウス悪性黒色腫転移モデル系における脈管形成阻止効果についてのBPIタンパク質産物の試験を示す。実施例12には、内皮細胞増殖及び、関与する可能性のある結合機構に対するBPIタンパク質産物の効果を述べる。実施例13は、合成BPIペプチドの調製に関する。実施例14〜16 は、実施例13の合成BPIペプチドについての、ヘパリン結合、LPS結合及び殺菌活性を示す。実施例17は、さらなる合成BPIペプチドの調製に関する。実施例18から実施例21までには、実施例17のペプチドの特性を述べる。実施例 22には、BPIタンパク質分解断片ペプチドの調製を開示する。実施例23には、BPI タンパク質分解断片の殺菌効果を開示する。実施例24には、BPIタンパク質分解断片のヘパリン結合特性を開示する。実施例25には、LALアッセイに対するBPIタンパク質分解断片の効果を開示する。実施例１ BPIタンパク質産物によるヘパリン結合膜結合性の天然のBPI分子及び組換えBPI分子ならびに放射性ラベルしたヘパリンを用いて、ヘパリン結合アッセイを行った。概略としては、rBPI₂₃及びrBPIまたはrBPI₅₀と名付けられたホロタンパク質を、ウェルの底部にイモビロン（Imob ilon）-P（Millipore、Bedford、マサチューセッツ）膜を配した96-ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに加えた。５μgのタンパク質を各ウェルに加えた。ウェルを乾燥して、引き続き、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝性生理食塩水、pH7.4（ブロッキング緩衝液）を用いてブロッキングを行った。ブロッキング緩衝液にて³H-ヘパリン（DuPont、NEN、Wiulmington、デラウェア）の希釈を行い、４℃にて１時間、BPIを含有するウェル内でインキュベートした。結合しなかったヘパリンは吸引し、次いでウェルをブロッキング緩衝液で３回洗浄し、乾燥して、液体シンチレーションカウンターで定量するために取り出した。典型的なアッセイの結果を図１に、グラフによって示す。ブロッキング緩衝液中のBSAはヘパリン結合で低い親和性と許容量を有するが、これは生理学的に無関係であると考えられ、従って常にバックグラウンドを試験化合物のシグナルから差し引いた。放射ラベルしたヘパリンの結合は、ラベルしていないヘパリンの100倍過剰量によって完全に阻害された（データは示さない）。前記と類似のアッセイで、rBPI₂₃、rBPI₅₀、及び天然のホロタンパク質（BPI ）によるヘパリン結合を、タウマチンコントロールタンパク質（rBPI₂₃と類似の電荷及びサイズを有する）と、または洗浄用緩衝液（1％BSA）コントロールと比較した。これらのアッセイにおいて、天然及び組換えBPIホロタンパク質によるヘパリン結合がより低いことが観察された。rBPI及びnBPIによる結合の程度がより低いのは、タンパク質調製物中の炭水化物の混入による結果であるかもしれない。加えて、リガンドとして³H-ヘパリンを用いた場合の結合定数を、rBPI₂₃、rBP I、プロタミン硫酸（Sigma Chemical Co.）及びタウマチンについて、Grafitソフトウェア（Erithicus Software Ltd.、Staines、英国）で、非線状機能最小法（nonlinear function minimization）を用いて決定し、その結果を以下の表１に示す。実施例２ BPIタンパク質産物結合に対するヘパリンの競合可溶性rBPI₂₃への結合について、固定化したE.coli J5の脂質Aと、ヘパリン、可溶性脂質A、LPS、及びテイコ酸が競合する能力を評価した。詳細には、イムノロン（Immunolon）２（Dynatech、Chintilly、バージニア）マイクロタイターウェルを、0.5μg/mLの濃度のE.coli J5の脂質Aメタノール溶液（50μL容量）で被覆した。次いでウェルを、0.1％BSAを含有するPBSを用いて37℃にて４時間ブロッキングした。コントロールのウェルは、50μLのメタノールだけで処置した後、前記と同様にブロッキングした。ブロッキングしたウェルを吸引し、PBS/0.05 ％Tween-20で２回洗浄した。阻害剤と推定される物質は、種々の濃度の25μL容量のPBS溶液として、ウェルに入れて、引き続き、0.1％Tween-20を含有する25μ LのPBS溶液とした200,000 cpmの放射ラベルしたrBPI₂₃を入れた。試験溶液には、200μg/mLの Salmonella minnesota R60由来のRa LPS、200μg/mLのE.coli 0113由来のスムース（smooth）LPS（RIBI Immunochem、Hamilton、モンタナ、#R318）、400μg/mL のStreptococcus faecalis由来のリポテイコ酸（Sigma、St.Louis、ミズーリ、# L-4015）、400μg/mLのStaphylococcus Aureus由来のリポテイコ酸（Sigma、#L- 2525）、及び400μg/mLのヘパリンナトリウムUSP注射液（Lypho-Med、Rosemont 、イリノイ、#9155-01）が包含されていた。穏やかに振盪しながら、４℃にて一晩、結合を進行せしめ、その後ウェルを吸引し、PBS/0.05％Tween-20で３回洗浄して、計測した。図２に示すように、この実験の結果、ヘパリンに対するrBPI₂₃ の高い親和性が示され、さらに脂質Aに対するBPI結合をヘパリンが阻害することも示される。実施例３ BPIタンパク質産物によるヘパリンの中和： ATIII/ヘパリン複合体によるトロンビン不活性化に対する BPIの効果 ATIII/ヘパリン複合体によるトロンビン不活性化に対するrBPI₂₃の効果を調べるために、色素産生性アッセイを用いた。詳細には、Chromostrate（登録商標）抗トロンビンアッセイキット（Organon Teknika Corp.、Durham、ノースカロライナ）を用いて、血漿中で予め形成したATIII/ヘパリン複合体により、精製されたトロンビンの阻害を実験した。アッセイは、三重試験にて、ウェル当たりの最終容量200μLで、96ウェルのマイクロタイタープレート中で実施した。アッセイに要する成分の添加順序は、以下の通りとした。すなわち、1）100、50、25、10及び１μg/ウェルの最終濃度の、試料（rBPI₂₃またはコントロールタンパク質としてタウマチン） PBS溶液50μl、2）緩衝液で1：100に希釈した血漿50μl、3）１nKat/mLのトロンビン含有緩衝液50μl、ならびに4）１μmol/mLの色素産生性基質水溶液50μlである。反応は、37℃にて10分間進行せしめ、0.1Mクエン酸50μLで反応を停止して、マイクロプレートリーダーにて発色反応を定量した。図３に示すアッセイの結果により、rBPI₂₃が量依存的にヘパリン化したヒト血漿中のATIII/ヘパリン複合体を有効に中和することができることが示唆される。血漿を滴定（titrate）するにつれ、トロンビン活性の量は増大した。これは、添加した血漿中の阻害的なATIII/ヘパリン複合体の量の減少により生じていた。コントロールタンパク質であるタウマチンは、類似の中和効果を示さず、すべてのタンパク質濃度において緩衝液コントロールと本質的に同等の結果であった。実施例４ BPIタンパク質産物によるヘパリンの中和： ATIII/ヘパリン複合体によるXa因子不活性化に対する BPIの効果 ATIII/ヘパリン複合体によるXa因子不活性化に対するrBPI₂₃の効果を調べるために、色素産生性アッセイを用いた。詳細には、chromostrateヘパリン抗Xa因子アッセイキット（Organon Teknika Corp.）を用いてアッセイを行い、Xa因子及びATIIIの濃度を固定して実施した。ヘパリン濃度を変動させて、1、0.5、0.25 、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0.004、0.002及び0単位/mLの濃度のPBS 溶液のヘパリンについての、ヘパリン標準線を作製した。このアッセイでは、合成基質からの色素産生性化合物の放出により、機能性のXa因子活性を測定した。 ATIII/ヘパリン複合体はXa因子活性を中和し、かくして放出された色素発生性物質の量は、アッセイ試料中のヘパリンの量及び抗Xa因子活性に連関するものである。アッセイは、三重試験にて、ウェル当たりの最終容量200μLで、96ウェルのマイクロタイタープレート中で実施した。マイクロタイターウェルに、アッセイに要する成分を以下の通りに添加した。すなわち、1）100、50、25、10及び1μg/ ウェルの最終濃度の、試料（rBPI₂₃またはコントロールタンパク質としてタウマチン）PBS溶液50μl、2）0.14 nKat/mLのXa因子水溶液50μl、3）0.5U/mLのATII I水溶液25μl、4）0.25U/mLのヘパリン含有緩衝液24μl、5）基質50μL（3μモル/mL）である。反応は、37℃にて10分間進行せしめ、0.1Mクエン酸50μLで反応を停止して、マイクロプレートリーダーにて発色反応を定量した。図４に示すアッセイの結果により、rBPI₂₃がXa因子のATIII/ヘパリン阻害において、ヘパリンを有効に中和することができることが示唆される。ヘパリンの濃度が増大するにつれ、ヘパリンの中和に必要なrBPI₂₃の量もまた増大した。コントロールタンパク質であるタウマチンは、類似の中和効果を示さず、すべてのタンパク質濃度において緩衝液コントロールと本質的に同等であった。実施例５ BPIタンパク質産物によるヘパリンの中和：ヘパリンにより媒介されるトロンビン時間の延長に対する BPIの効果ヘパリンにより媒介されるトロンビン時間、すなわちトロンビン及び血漿の混合物の凝塊に要する時間の延長に対するBPIタンパク質産物の効果を実験した。トロンビン時間は、内在性または治療上投与されたヘパリンなどの外在性のトロンビン形成の阻害剤の存在により、延長される。ヘパリンの抗凝固効果を中和する試剤は、試験により測定されるトロンビン時間を減少せしめるであろう。クエン酸化（ci trated）ヒト血漿（200μL）を、15μLの希釈剤（0.15M NaCl、0.1Mトリス、pH7 .4）または25μg/mLのヘパリン（187単位/mg）をも含有する15μLの希釈剤のいずれかと共に、37℃にて１分間インキュベートした。15μLの容量の、種々の濃度のrBPI₂₃（0.0から56μg/mLまで）を添加し、続いてその直後に100μLのトロンビン試薬（Sigma Chemical Co.、No.845-4）を加えた。凝塊時間（トロンビン時間）を、BBL Fibrometer（Becton Dickenson Microbiology Systems、Cockeys ville、メリーランド）を用いて測定した。図５に示す結果から、ヘパリンにより媒介されるトロンビン時間の延長をrBPI₂₃が阻害することが実証される。ヘパリンが存在しないと、56μg/mLもの高濃度においてさえ、rBPI₂₃はアッセイに何ら効果を示さなかった。実施例６ BPIタンパク質産物によるヘパリンの中和：部分的トロンボプラスチン化時間に対するBPIの効果ヘパリン処理ラットにおける部分的トロンボプラスチン化時間（PTT）に対するrBPI₂₃、またはプロタミン硫酸の効果を調べた。PTTは内在性または治療上投与されたヘパリンなどの外在性のトロンビン形成の阻害剤の存在により、延長される。ヘパリンの抗凝固効果を中和する試剤は試験により測定すると、PTTを減少せしめるであろう。NIH指針の下に飼育したSprague-Dawleyラットに、動物の尾静脈を介した濃縮塊の静脈注射によって100U/kgのヘパリンを投与し、その後引き続いて５mg/kgのrBPI₂₃、5mg/kgのプロタミン硫酸または緩衝液を投与した。次いで、予め麻酔をかけた動物の腹部大動脈から集めた血液試料より、PTTを調べた。未処置動物のPTTも調べた。図６に示す結果から、処置動物のPTTに対する即時型の効果を、rBPI₂₃及びプロタミンの双方ともが有したことが実証される。これら動物データで、実施例２〜５に示すようなBPIタンパク質産物のヘパリン中和効果が確認されるものである。実施例１から６までの結果をまとめると、直接的結合アッセイにおいてrBPI₂₃ はヘパリンに結合し、凝集プロテアーゼのヘパリン阻害を有効に中和することが示されるものである。これらの特徴に基づき、通常プロタミン硫酸に対して推奨される投与量に機能的に相当する投与量でヘパリンの抗凝固効果を臨床的に中和するのにBPIタンパク質産物が有用であると考えられ、しかもプロタミン材料の重篤な低圧及びアナフィラキシー様の効果は持たないことが期待される。実施例７慢性炎症性疾患に対するBPIタンパク質産物の治療的効果：コラーゲンで誘導した関節炎モデルさらなる本発明の局面は、慢性関節炎リウマチ及び反応性関節炎を包含する関節炎、乾せん、炎症性腸疾患、限局性回腸炎、潰瘍性大腸炎、狼瘡性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、ライム病、及び喘息などの慢性炎症性疾患状態の効果を治療及び予防するための、BPIの実用性の発見に関する。関節炎に罹患している対象者を治療するための代表的な方法が提供され、これは、関節炎を予防または治療するために、有効量のBPIタンパク質産物を投与することを含むものである。BPI タンパク質産物は局所的に、または関節内、静脈内、筋肉内、もしくは皮下などの注射により、または他の非経口的及び経口的方法によって投与されればよい。 BPIタンパク質産物の投与の効果を、コラーゲンで誘導した関節炎モデルにおいて研究した。詳細には、Stuartら、J.Clin.Invest.、69巻、673〜683頁（1982 ）の方法に従って、尾を基点にして、ウシII型コラーゲンの皮内免疫により、マウスに関節炎を誘導した。通常、マウスはコラーゲン免疫の21日後に関節炎症候群を発症し始める。次いで、尾静脈を介して静脈注射したrBPI₂₃、タウマチンコントロールタンパク質、または緩衝液の投与量で、それぞれ21〜25日目の各日に処置したマウスについて、120日間にわたって盲検にて処置マウスの関節炎スコアを評価した。詳細には、それぞれおよそ20〜25gの体重の10匹の雄性マウス（Mouse/DBA/1J ）の群に、0日に尾を基点として皮内注射（0.1mg/マウス）を介してウシII型コラーゲン（Sourthern Biotechnology Associates，Inc.、Birmingham、アラバマ）を投与した。rBPI₂₃は、0.5M NaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH6.0に溶解し、0. 125mg/マウスでの投与用にPBS緩衝液で希釈（1mg/ml）した。コントロールとして、タウマチンタンパク質のPBS溶液（0.121mg/マウス）またはPBS緩衝液単独（ 0.1ml）を投与した。図７に示す結果により、PBS緩衝液及びタウマチンタンパク質コントロールに比較して、rBPI₂₃は、処置マウスの関節炎スコアの低減において統計的に有意な効果を有することが立証される。実施例８プロタミン硫酸と比較した、慢性炎症性疾患に対する BPIタンパク質産物の治療的効果：コラーゲンで誘導した関節炎モデルプロタミン硫酸と比較した、BPIタンパク質産物の効能を評価するために、コントロールとしてタウマチンタンパク質及び緩衝液の両方を使用して、実施例７のコラーゲンで誘導したモデルを用いた。詳細には、rBPI₂₃は、0.5M NaCl、20m M酢酸ナトリウム、pH6.0に溶解し、PBS緩衝液で希釈（1mg/ml）して、0.125 mg/ マウスにて投与した。他の試験材料は、以下の投与量で投与した。すなわち、プロタミン硫酸（Sigma Chemical Co）（0.13mg/マウス）、タウマチン（0.121mg/ マウス）、及びPBS緩衝液（0.1ml）であった。10匹のマウスの各々４群にそれぞれ、28から32日目までの各日に尾静脈を介した静脈注射によって試験またはコントロール物質を与えた。図８に、28〜80日目に評価した、種々の処置及びコントロールプロトコルについての関節炎スコアの結果を開示する。図８で、星印（^* ）は、p＜0.01でのrBPI₂₃と緩衝液との間の統計学的有意差を表し、一方プラス（+）は、p＜0.05でのrBPI₂₃と緩衝液との間の統計学的有意差を表す。これらの結果により、rBPI₂₃は、モデル系において処置されたマウスについての関節炎スコアを有意に低減したことが示される。実施例９グラム陰性により誘導した反応性関節炎モデル反応性関節炎を治療するための、BPIタンパク質産物の投与の効果を、Yongら、Microbial Pathogenesis、４巻、305〜310頁（1988）の方法に従った、Yersin ia enterocolitica反応性関節炎モデルにおいて研究した。詳細にはYersinia en terocolitica cWa 0:8 T2（すなわち、Yongら（前出）の毒性を欠くプラスミド）を、マウスに敗血性でない関節炎を誘導するよう計算された、4x10⁸の細菌数の投与量で尾静脈を介して予め静脈注射しておいたDBA/2J雄性マウスに、BPIタンパク質産物を投与する。15匹のマウスの３群の各々に、それぞれ尾静脈を介した静脈注射にて、試験またはコントロール物質を与えた。20 mMクエン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.1％ポロキサマー188、0.002％ポリソルベート80、pH5.0の緩衝液に溶解して約5.0mg/kgの投与量にてrBPI₂₃；2 0mMクエン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.1％ポロキサマー188、0.002 ％ポリソルベート80、pH5.0の緩衝液に溶解して、約5.0mg/kgの投与量でタウマチンタンパク質；または緩衝液単独、のいずれかを、マウスに与えた。図９に表す結果により、緩衝液またはタウマチンコントロールタンパク質に対して、BPI タンパク質産物は、反応性関節炎の発生率を有意に低減せしめたことが示される。 Borrelia burgdorferiは、ライム病の原因である病原菌であり、関節炎に関連していて、また、E．coliのものと異なるが構造的に関連性を有するLPS様複合体を、その細胞壁に保有している。Limulus Amoebocyte Lysate（LAL）阻害アッセイにおけるBorrelia burgdorferi LPSの阻害に対する、BPIタンパク質産物の投与の効果を調べた。詳細には、実施例15の方法に従うLALアッセイを、2.5μg/mL で投与したBorrelia burgdorferi LPS及び2ng/mLで投与したE．coli 0113 LPSに対するrBPI₂₃の効果を測定して行った。図10に表される結果により、rBPI₂₃が、 LALアッセイにおいてBorrelia burgdorferi LPS及びE．coli 0113 LPSの双方の効果を中和することが示される。実施例10 マウス悪性黒色腫モデルにおけるBPIの効果本実施例では、BPIタンパク質産物、プロタミン、ならびにタウマチンタンパク質及び緩衝液の双方のコントロールを、マウス悪性黒色腫転移モデルにおける効力について試験する。詳細には、９匹のC57BL/6Jマウス４群へ、0日目に尾静脈内への静脈注射を介して10⁵のB16.F10悪性黒色腫細胞を接種した。1、3、6、8、10、13、15、17及び19日目に、マウスの尾静脈内に、rBPI₂₃（ 0.13mg/マウス）、プロタミン硫酸（0.13mg/マウス）、タウマチン（0.13mg/マウス）またはPBS緩衝液（0.1ml/マウス）のいずれかを静脈を介して投与した。動物は、20日目に頚管脱臼により屠殺し、肺組織を観察した。各肺葉を環流し、気管を介して肺の中に3mlの水を注入することにより膨満せしめた。その後、表面上の腫瘍結節を、解剖用顕微鏡を用いて計測し、そして１群当たりに見出された腫瘍の数を、統計学的有意差について分析した。データは統計学的には有意でなかったものの、BPI₂₃で処置した動物は最も低い腫瘍担持数であり、続いてプロタミン処置したもの、タウマチンタンパク質コントロールそして緩衝液コントロールの順であった。統計的有意性に欠くこと（腫瘍数は適切に腫瘍サイズを反映していなかった）により、腫瘍の担持について調べるためのより特異的なアッセイの方法論が必要とされるであろうことが示された。実施例11 マウス悪性黒色腫モデルにおけるBPIの効果 BPIタンパク質産物、プロタミン、ならびにタウマチンタンパク質及び緩衝液の双方のコントロールを、実施例10のマウス悪性黒色腫転移モデルにおける効力について、再度試験した。詳細には、C57BL/6Jマウス６群へ、0日目に尾静脈内への静脈注射を介して10⁵のB16.F10悪性黒色腫細胞を接種した。1、2、5、7、9 、12、14、16及び19日目に、マウスの尾静脈内へ、以下の表２に示すごとくに、rBPI₂₃（0.125mg/マウス）、プロタミン硫酸（0.125mg/マウス）、タウマチン（0.125mg/マウス）、またはPBS緩衝液のいずれかを静脈を介して投与した。Ａ〜Ｄ群のすべての動物は、20日目に頚管脱臼により屠殺し、肺組織を観察した。肺を取り出し、冷水の入ったビーカーに入れた。その後、各肺葉を環流し、気管を介して肺の中に3mlの水を注入することにより膨満せしめた。次いで、表面上の腫瘍結節を、メラニン含量について分析した。それぞれ緩衝液またはrBPI₂₃で処置した動物を含んでなるＥ及びＦ群は、屠殺せずに死亡率について毎日１度、観察した。図11に動物の前記２つの群についての生残データを示す。全部で10匹の動物が43日目までに死亡したのであるが、BP I処置マウスは概して、未処置マウスよりも有意に長きにわたって生残し、BPIが抗脈管形成効果を有していて黒色腫腫瘍の転移を遅延させることを示唆するものであった。前記結果を受けて、本発明のさらに付加される局面に従って、BPIタンパク質産物をMilesら、VII International Conference on AIDS、Florence、イタリア、Paper 41（8）1991のもののようなモデル系においてカポジ肉腫を阻害するために用いることができる。実施例12 内皮細胞増殖に対するBPIの効果 Bauer、Microvascular Research、37巻、148〜161頁（1989）に記載のように、ネズミ脳毛細管内皮細胞（EC）を、Earle's塩、L-グルタミン及び2.2g/lの重炭酸ナトリウム（Gibco、Grand Island、ニューヨーク、♯400-100EB）に加えて 10％熱不活性化ウシ胎児血清（Irvine Scientific、Irvine、カリフォルニア）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、♯600-5140AG）を含有するメディウム（Medium）199において継代した。集密となった細胞の採取は、トリプシン−EDTA（Gibco、♯610-5300PG）を用いて３分間トリプシン処理することにより実施した。トリプシン処理は、フラスコに継代培地を10ml添加することによって停止した。増殖アッセイは、標準平底96ウェルマイクロタイタイプレートにて、新鮮に採取したECに対して実施した。アッセイの各ウェルにつき、200μl /ウェルの最終容量を維持した。濃度を変動させたrBPI₂₃、タウマチンコントロールタンパク質または緩衝液コントロールとともに、総計4x10⁴のECを各ウェルに添加した。5％CO₂インキュベーター内で48時間培養した後、1μCiの［メチル-³ H］チミジンを含む10μlのメディウム199を各ウェルに添加した。24時間パルスラベルした後、EC細胞をガラスミクロファイバーフィルター上に、トリプシン処理により採取し、そして取り込まれた［³H］チミジンをガス比例式固相ベータカウンターを用いて定量した。 rBPI₂₃によるEC細胞増殖の濃度依存的阻害を、図12に示す。同様の濃度のタウマチンまたは等容量の緩衝液をウェルに添加した場合には、効果は何ら示されなかった。増殖の阻害は最初に、12.4μg/mlの rBPI₂₃にて観察され、その効果は50μg/mlにて最大となるようである。EC細胞の成長は、ウシ血清中のFGF-2（bFGF）に依存することが知られており、そしてFGF -2は受容体活性化のために細胞表面ヘパランを必要とする（Yanonら、Cell、64 巻、841〜848頁（1991））。本発明の理論により結びつけることを意図しなくても、EC細胞上の細胞表面ヘペランに結合したrBPI₂₃がFGF-2による細胞の活性化を干渉するものと考えられる。集密となったフラスコから10代継代した細胞を採取し、12.5mlの培養培地中に、そのトリプシン処理した細胞を再懸濁して、EC細胞上のrBPI₂₃の直接的な結合試験を実施した。該懸濁液0.5mlを、標準24ウェル組織培養プレートの各ウェルに加えて、一晩インキュベートした。プレートを、0.1％ウシ血清アルブミンのカルシウム及びマグネシウムを含有するリン酸緩衝性生理食塩水溶液（Gibco）で洗浄した。洗浄後ウェル当たり0.5mlのBSA/PBSを添加した。予備的な実験によって、ウェルに添加した50ng/mlの¹²⁵IでラベルしたrBPI₂₃にて、4℃で3時間インキュベートし、PBSで３回洗浄して1M NaOHで溶解したものの溶解液をガンマ線計測すると、およそ30,000の比活性のcpmを産生することが示唆された。 50ng/mlの、¹²⁵Iでラベルした、「ホット（hot）」rBPI₂₃の、EC細胞への特異的な結合は、20μg/mlのヘパリン（Sigma、Gradel）の添加によって競合させることができた。ラベルしない「コールド（cold）」rBPI₂₃を結合培養系に添加しても、同様の競合が観察された。ラベルしないrBPI₂₃とヘパリンとの組合せ（同時に添加または、添加前に予め混合）では、ヘパリンのみの競合を下回るほどに結合を低減させることはできなかった（図13）。これらのデータにより、rBPI₂₃はヘパリン様分子を介して内皮細胞に結合し、この結合がヘパリン結合性成長因子（FGF-2）に対して、EC細胞増殖に干渉するらしいことが示唆される。実施例13 BPIの15マー合成ペプチドの調製ペプチド断片BPIタンパク質産物の生物学的特性を評価するために、BPIの23kD アミノ末端断片に基づき15マーのアミノ酸合成ペプチドをを調製して、ヘパリン結合活性、Ljmulus Amoebocyte Lysate阻害（LAL）アッセイにおける活性及び殺菌活性について解析した。詳細には、前記のrBPI₂₃の配列に基づき、二重操作で、各々15アミノ酸を含み、11アミノ酸だけ近接ペプチドと重複している、47の合成ペプチドを調製した。 Coselco Mimotopes Pty Ltd.のライセンス下にあるCambridge Research Bioch emicals Ltd.の固相技術を利用し、Maejiら、Immunol.Methods、134巻、23〜33 頁（1990）及びGammonら、J.Exp.Med.、173巻、609〜617頁（1991）の方法に従ってペプチドを同時に合成した。概説すると、rBPI₂₃（第1〜199位）の配列を、 rBPI₂₃の線状配列に沿って５つのアミノ酸ごとにその次のペプチドを開始することにより前に進めていって、47の異なる15マーのペプチドに分割した。このペプチド合成技術によって、96ウェルプレートの形式にある独立したピン上に、複数のペプチドを同時に少量合成することが許容される。かくして、本合成のためには94の個別のピンを利用し、残りのピン（B、B）は、活性化FMOC−アミノ酸は添加せずに、他のピンと同じ工程に付した。固相ピン支持体からの15マーのペプチドの最終的な切断には、水性塩基性緩衝液（炭酸ナトリウム、pH 8.3）を使用した。ピンへのユニークな連結により、これらの条件下で定量的なジケトピペラジン環化が行われ、その結果、切断したペプチドはシクロ（リシルプロリル）部分を各ペプチドのカルボキシル末端に伴う。アミノ末端はアセチル化されておらず、従って遊離のアミノ基が潜在的に陰イオン結合反応に寄与することができた。各15マーのペプチドが、ウェル当たり平均して約15μg回取される。実施例14 BPIの15マーの合成ペプチドによるヘパリン結合前記の合成BPIタンパク質産物を、実施例１に記載の方法に従って、ヘパリン結合アッセイに供した。図14に示すように、その結果ヘパリン結合活性を持つ３つの独立した機能性ドメインの存在が示唆される。すなわち、第１は、約第21〜 55位のアミノ酸にわたり、第２は、約第65〜107位のアミノ酸にわたり、そして第３は、約第137〜171位のアミノ酸にわたるものである。ブランクのコントロールピンからの物質は、ヘパリン結合効果を有していなかった。実施例15 LALアッセイに対するBPIの15マーの合成ペプチドの効果合成BPIタンパク質産物ペプチドをLimulus Amoebocyte Lysate（LAL）阻害アッセイに供して、LPS結合特性を調べた。詳細には、Eppendorfチューブの中で合成BPIペプチドを所定濃度のE．coli 0113 LPS（最終濃度4ng/ml）と共に混合し、時折振盪しながら37℃にて3時間インキュベートした。0.05μg/mLを含む追加のコントロールについても試験した。インキュベーションに続き、チューブ当たり360μlのD-PBSを添加して、LALアッセイ用に200pg/mLのLPS濃度のものを得た。次いで、各試料をイムノロンIIストリップ（Dynatech、Chantilly、バージニア）に、ウェル当たり50μlの容量づつ移した。 Limulus amoebocyte Lysate（Quantitative chromogenic LALキット、Whitake r Bioproducts，Inc.、Walkersville、メリーランド）をウェル当たり50μl添加し、ウェルを室温にて25分間インキュベートした。次いで色素発生性基質をウェル当たり100μl容量で添加し、充分に混合した。室温にて20から30分間インキュベートした後、100μlの25％酢酸を添加して反応を停止した。その後、405nmにおける光学密度を、マルチプレートリーダー（Vmax、Molecular Dynamics、Menl o Park、カリフォルニア）で測定し、LPSの阻害率としてその結果を図15に示す。図15のデータにより、有意なLAL阻害をなす少なくとも３つの主要なドメインが示唆され、これら３つのドメインとはすなわち、第１には第17〜55位のアミノ酸にわたるもの、第２には、第73〜99位のアミノ酸にわたるもの及び第３には、第137〜163位のアミノ酸にわたるものである。その他の個々のペプチドもまた、 LAL阻害を呈する。これに対して、ブランクコントロールのピンからの物質は、L ALアッセイにより測定されるLPS中和効果を呈しなかった。実施例16 BPIの15マーの合成ペプチドの殺菌効果合成BPIタンパク質産物ペプチドを、放射拡散アッセイにて、ラフ（rough）変異体E．coli J5細菌に対する殺菌効果について試験した。詳細には、E．coli J5 を一晩培養したものを、新鮮なトリプシン処理したダイズブロスにて1：50に希釈し、対数増殖期に達するまで37℃で3時間インキュベートした。Sorvall RT6000Bで3,000rpmにて5分間遠心して、細菌をペレットとした。10mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）5mLを加えて、その調製物を再度遠心した。その上清を移注し、5mLの新鮮な緩衝液を加えて細菌を再度懸濁し、590nmでの吸光度を測定することにより懸濁液の濃度を算定した。ここで、1.25x10⁹CFU/mLの懸濁液の吸光度は1.00に等しい。細菌を10mLの、溶解した下層のアガロース（およそ45℃）で4x10⁶CFU/mLにまで希釈して、この目的のために用いられる15mLのプロピレンチューブで反転を繰り返して混合した。チューブの中身全体を完全に平坦な角型ペトリ皿へと注ぎ、皿を左右に揺することにより均一に分布せしめた。アガロースは30秒たたないうちに固まり、約1m mの一様な厚みとなった。次いで、真空装置に接続した滅菌済みの3mmパンチを用いて、固化したアガロースに穴をあけて一連のウェルを設けた。パンチは、100 ％アルコールで滅菌し、風乾させておいた。 10μLの合成BPIペプチドを注意深く、各ウェルにピペットで入れた。コントロールとして、pH8.3の緩衝液を別個のウェルに加え、陽性コントロールとして5μ g/mL及び1μg/mLの濃度のrBPI₂₃も加えた。さらに、ブランクのピンB及びBからの産物をコントロールとして用いた。プレートを37℃にて3時間インキュベートしておき、次いで10mLの溶解した上層のアガロース（およそ45℃）を平坦なペトリ皿に添加して、固化させ、37℃にて一晩インキュベートした。殺菌活性を有するウェルにおいては細菌の繁茂する部位に対して清澄なゾーンが認められた。このゾーンを、視覚的観察性を高めるために、寒天全体にクマシー溶液（0.002％クマシーブリリアントブルー、27％メタノール、15％ホルムアルデヒド（37％保存溶液）及びH₂O）を注ぎ、24時間染色せしめた。細菌のゾーンを、Mitutoyoミクロメーターで測定した。アッセイの結果を図16に示すが、ここで殺菌活性を有することが認められる唯一の合成BPIペプチドは、アミノ酸第85〜99位に対応する断片であった。陽性のr BPI₂₃コントロールもまた殺菌効果を有しており、一方緩衝液及びブランクピンのコントロールは殺菌効果を有していなかった。実施例17 BPIペプチド断片の調製実施例13から16までの重複した配列を有するペプチドの試験の結果に基づいて、Applied Biosystems，Inc．Model 432合成機を用いて、Merrifield、J.Am.Che m.Soc.、85巻、2149頁（1963）及びMerrifieldら、Anal.Chem、38巻、1905〜191 4頁（1966）の方法に従う固相ペプチド合成により、BPIタンパク質産物ペプチド断片を調製した。以下の表３に表すように、rBPI₂₃のアミノ酸残基第1〜199位の一部分のアミノ酸配列を有する、BPI-2からBPI-10と名付けた、９つのBPIタンパク質産物ペプチドを調製した。BPI-7、BPI-9及びBPI-10の場合、ペプチドは部分的または同じものの複数の配列の反復を呈していた。すなわち、BPI-7は第90〜9 9位のアミノ酸残基が１本の直鎖において２度反復される構成の20マーを含む。B PI-10は第90〜99位のアミノ酸残基が１本の直鎖において３度反復される構成の3 0マーを含む。BPI-9は第94〜99位のアミノ酸残基に続いて、第90〜99位のアミノ酸残基が１本の直鎖を構成する16マーを含むものである。実施例18 BPIタンパク質産物ペプチドによるヘパリン結合本実施例においては、BPIタンパク質産物ペプチドBPI-2、BPI-3、BPI-4、BPI- 6、BPI-7、及びBPI-8を、BPIcysと共に、実施例１に記載の方法に従ってヘパリン結合アッセイに供した。その結果、図17に示すように、BPI-7及びBPI-8が極めて高いヘパリン結合能を有し、一方BPI-2及びBPI-3はより穏やかなヘパリン結合能を有するものであって、BPI-4及びBPI-6は殆どまたは全く、ヘパリン結合能を有しないことが示唆される。実施例19 BPIタンパク質産物ペプチドによるヘパリンの中和本実施例においては、BPIタンパク質産物ペプチドBPI-2、BPI-3、BPI-4、BPI- 5、BPI-6、BPI-7、及びBPI-8を、rBPI₂₃と共に、実施例３の方法に従って、ATII I/ヘパリン複合体によるトロンビン不活性化に対する効果を調べるため、アッセイに供した。それらの効果を調べるために、1.0μg/mLから100μg/mLまでの範囲で変動させた濃度のBPIタンパク質産物を投与した。BPIタンパク質ペプチドBPI- 7、BPI-3、及びBPI-5は各々、図18a及び18bに示すように、最も有意なヘパリン中和効果を有していた。この図18a及び18bは、それぞれ重量またはモル濃度として試料濃度を表すものである。実施例20 BPIタンパク質産物ペプチドのLALアッセイに対する効果本実施例においては、BPIタンパク質産物ペプチドBPI-2、BPI-3、BPI-4、BPI- 6、BPI-7、及びBPI-8を、rBPI₂₃と共に、実施例15の方法に従って、それらのLPS 結合及び阻害特性を調べるため、LALアッセイに供した。その結果、図19a及び19 bに表すように、BPI-7及びBPI-3は有意なLPS阻害特性を有し、BPI-2及びBPI-8は中程度のLPS阻害特性を有し、そしてBPI-4及びBPI-6は有意なLPS阻害活性を有しないことが示される。この図19a及び19bは、それぞれ重量またはモル濃度として試料濃度を表すものである。実施例21 BPIタンパク質産物ペプチドの殺菌アッセイ本実施例においては、BPIタンパク質産物ペプチドBPI-2、BPI-3、BPI-4、BPI- 5、BPI-6、BPI-7、BPI-8、BPI-9及び BPI-10を、rBPI₂₃と共に、実施例16の方法に従う放射拡散アッセイにおける、変異体E．coli J5（ラフ）及びE．coli 0111：B4（スムース）細菌に対する殺菌効果について試験した。図20a〜20dに表す結果により、BPI-2、BPI-3、BPI-5、BPI -7、BPI-8、BPI-9及びBPI-10は各々、より強いまたはより弱い程度の殺菌活性を有し、一方BPI-4及びBPI-6は殺菌活性を呈さなかったことが示される。殺菌ペプチドは各々、スムースよりもラフE．coli菌株に対してより有効である傾向にあった。本実施例のさらなる局面として、ブロス抗細菌アッセイを行って、BPIペプチドのいくつかのものの殺菌活性を調べた。詳細には、寒天プレート上でE．coli J5（ラフ）及びE．coli 0111：B4（スムース）細菌のいずれかを単一のコロニーから選択し、それを用いて培養プレートに接種し、該培養プレートに連続的に10 倍希釈したBPIタンパク質産物ペプチドを加えた。プレートを一晩インキュベートし、生残コロニー形成単位を調べるためにELISAプレートリーダーで読み取った。このアッセイの結果を図20e（E．coli J5）及び20f（E．coli 0111：B4）に表したが、これにより、BPIタンパク質産物ペプチドBPI-3、BPI-7、BPI-9及びBP I-10が有意な抗細菌活性を有することが示される。ヘパリン結合及びLALアッセイと共に、前記殺菌アッセイの結果から、殺菌、ヘパリン結合及びLPS中和効果のうち１以上の効果を持つ小さな合成BPIペプチドが存在すること、ならびに23kDアミノ末端断片内に少なくとも３つの異なる独立した機能性ドメインが存在することが示唆される。１つのドメインは、アミノ酸残基第17位と第45位の間にある。第２の、３つのアッセイすべてにおける活性によりその特徴が示された、最も活性の強いドメインは、アミノ酸残基第71位と第 99位の間にある。第86〜99位の、１つの特記すべきペプチドは、前記３つのアッセイすべてにおいて活性を示した。第３のドメインは、第142〜169位の残基で構成される。実施例22 BPIタンパク質分解断片の調製本実施例においては、化学的開裂及び酵素的消化処理をrBPI₂₃に施し、組換えタンパク質の種々のサイズとしたタンパク質分解断片を生成する、Gazzano-Sant oroら（前出）の方法に従って製造した。 rBPI₂₃は臭化シアン（CNBr）またはエンドプロテイナーゼAsp-Nによるタンパク質分解に先立って、還元及びアルキル化した。冷（4℃）アセトン沈澱（1：1v /v）を一晩行うことによりタンパク質を脱塩し、10分間遠心（5000xg）を行ってペレットとしておいた。そのrBPI₂₃ペレットは、冷アセトンで２度洗浄し、チッ素気流下で乾燥した。その後、rBPI₂₃を8M尿素／0.1Mトリス、pH8.1中で1mg/ml に再構成し、37℃にて90分間、3.4mMジチオスレイトール（Calbiochem、San Die go、カリフォルニア）を添加して還元した。アルキル化は、最終濃度が5.3ミリモル濃度となるようヨードアセトアミド（Sigma Chemical Co.、St．Louis、ミズーリ）を暗所で室温にて30分間添加することで実施した。還元しアルキル化したタンパク質はアセトン沈澱し、前記の通りに遠心して洗浄し、そのペレットを、CNBrまたはAsp-N消化のいずれかのために再溶解した。 CNBrに先立って、洗浄したペレットを5ng/mlの最終タンパク質濃度にまで、70 ％トリフルオロ酢酸（TFA）（タンパク質配列決定用の等級、Sigma）に溶解せしめた。70％TFAに溶解した臭化シアン（Baker Analyzed Reagent、VWR Scientifi c、San Francisco、カリフォルニア）を添加して、最終的にCNBrとタンパク質との割合（w/w）を2：1とした。これは、タンパク質中のメチオニン残基に対しておよそ75倍過剰のモル数のCNBr量である。反応物をチッ素でパージ（pu rge）し、室温にて暗所で24時間、反応を進行させておいた。9倍容量の蒸留水を加えることにより反応を停止し、続いて、凍結し（-70℃）そして凍結乾燥した。還元しアルキル化したrBPI₂₃は、8M尿素/0.1Mトリス、pH8.1中に5.0mg/mlで可溶化した。等容量の0.IMトリス、pH8.1を添加して、5M尿素/0.1Mトリス、pH8.1 中最終条件を2.5mg/mlのタンパク質濃度とした。Pseudomonas fragi由来のエンドプロテイナーゼAsp-N（Boehringer-Mannheim、Indianapolis、インディアナ）を1：1000（w/w）の酵素：基質の割合で加えて、37℃にて6時間消化を進行せしめた。TFAを0.1％の最終濃度となるように添加することにより反応を停止し、次いで、逆相HPLCによって試料を分画した。 CNBr及びAsp-N断片の混合物を、Zorbak Proteins Plus C₃カラム（4.6x250mm 、300オングストローム孔径、MACMOD Analytical Inc.、Chadsford、ペンシルベニア）で精製した。5％アセトニトリルを含む0.1％TFAから80％アセトニトリルを含む0.1％TFAまでの濃度勾配を、1.0min/mlにて2時間にわたって実行した。断片の溶出は、Beckman System Gold HPLCを用いて、220nmでモニターした。カラム加熱装置を35℃に保ち、画分を手で集めて-70℃にて凍結し、Speed Vac濃縮機の中で乾燥した。使用前に断片は、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0/0.5M NaClに可溶化した。 Children's Hospital-Oakland Research InstituteのCedric Shackleton博士の研究室所属の、Francis Bitsch博士及びJohn Kim氏によって、VG Bio-Q質量分析計で、電子噴射イオン化質量分析が実施された。データを数学的に変換することにより、分子質量が得られた。 rBPI₂₃に対するDNA配列は成熟タンパク質の第1〜199位のアミノ酸残基をコードするものであるが、電子噴射イオン化質量分析（ESI-MS）によって調べると、生産されるタンパク質の重要な部分が、Leu-193及びVal 195で切除されている。 C-末端のトリプシン処理によるペプチドを単離し、配列決定してESI-MSにより分析することによって、これらのC-末端での切除が証明された。第56、70、100、1 11，170、及び196位に、６つのメチオニン残基があり、臭化シアンによる化学的開裂により、推定されるとおり６つの主要なペプチドが産生された。CNBr開裂実験の結果を表４にまとめる。断片は逆相（C₃）HPLCにより単離し（図21A）、それらのN-末端配列をEdman分解によって決定した。最も大きな２つの断片（C1及びC5）は、C₃HPLCカラムにより分離されず、それらを分離するべくさらにイオン交換クロマトグラフィーを試みたが、不成功に終わり、これはおそらく、両者が長さ及び等電点において類似しているためであると考えられる。混合物中のC1、 C5断片の同定は、ESI-MSを用いて調べた。CNBr開裂反応に際してのC-末端メチオニンのホモセリンへの変換に起因する、30a.m.u.の損失を考慮に入れて、推定されるC1の質量は6269（表４）である。観察された質量6251.51±0.34は、ホモセリンラクトン中間体における水分子の損失（18a.m.u.）に合致しており、C1断片 C-末端アミノ酸の疎水性のゆえにホモセリンの形成に好都合であるかのもしれない。C5断片の推定される質量は6487であり、観察された質量は6385.4±0.39（表１）である。C5断片については、C-末端アミノ酸は疎水性であり、従って、ホモセリンラクトン中間体の加水分解がおそらくは好都合である。N-末端配列決定及び質量分析データの双方から、C1/C5混合物中、C5成分はそのおよそ10〜25％を占めるものである。 CNBrによるC1/C5混合物の中に含まれる領域に対するさらなる断片を得るために、エンドプロテイナーゼAsp-Nを用いたタンパク質分解性開裂を実施した。rBP I₂₃配列内の第15、36、39、57、105、及び116位に、６つのアスパラギン酸残基がある。C₃HPLCにより単離される６つの主要なAsp-N断片（図21B）を配列決定し、ESI-MSによって質量を決定した（表４）。特にグルタミン酸において起こりうる非特異的開裂を排除すべく、1：1000（W/W）の酵素：基質の割合で短時間での消化を採用した。Asp残基（アミノ酸第15及び35位）が開裂されていない１つの断片（第1〜38位）が単離されたので、この消化は完全消化にまでは至っていないことが明らかである。Asp-N断片の質量分析結果は、各々個別の断片について推定される質量に合致していた。C-末端断片がうまく分離しないCNBr開裂とは異なり、第116位のアミノ酸からC-末端までのAsp-N断片は他のすべてのAsp-N断片から良好に分離された。実施例23 BPIタンパク質分解断片の殺菌効果実施例22に従い生成したBPIタンパク質分解断片を、本質的に実施例16の方法に従う放射拡散アッセイにおける、ラフ変異体 E．coli J5細菌に対する殺菌効果についてスクリーニングした。25pmol/ウェルまで試験した限りでは、CNBrにより、またはAsp-N消化により作製したrBPI₂₃断片について、殺菌活性は立証されなかった。このアッセイでは、ウェル当たりたかだか0.75pmolのrBPI₂₃で、測定可能な殺菌活性を検出した。還元し、アルキル化したrBPI₂₃（100pmol/ウェルまで）もまた殺菌性を示さなかったが、アルキル化したrBPI₂₃はrBPI₂₃と同等の殺菌活性を保持していた。実施例24 BPIタンパク質分解断片によるヘパリン結合 rBPI₂₃及び実施例22に従って作成したBPIタンパク質分解断片を、本質的に実施例１の方法に従うヘパリン結合アッセイにおいて使用した。 CNBr断片のヘパリン結合は、飽和濃度の³H-ヘパリン（20μg/ml）とともに、ウェル当たり各々100ピコモルの断片を用いて評価した。表５にその結果を示す（三重に行ったウェルの平均プラスまたはマイナス、２つの値の間の範囲）が、これにより第71〜100位のアミノ酸を含むCNBr断片（C3）ならびに第1〜56位及び 112〜170位を含む断片（C1、5）はかなりの程度でヘパリンに結合したことが示唆される。第171〜193位のCNBr断片もまた、コントロールタンパク質であるタウマチン（rBPI₂₃に類似の分子量及び電荷を有するタンパク質）よりも多くのヘパリンに結合した。 Asp-N断片によってもやはり、rBPI₂₃における複数のヘパリン結合領域が証明された。表５に認められるように、第57〜104位のAsp-N断片は最も多くの量のヘパリンを結合し、その次には第1〜38位の、そして第116〜193位の断片という順序であった。 CNBr断片のデータとこれらのデータを合わせて、rBPI₂₃内に少なくとも３つの独立したヘパリン結合領域があって、最も高い結合能は第71〜100位の残基内にあることが示唆される。実施例25 BPIタンパク質分解断片のLALアッセイに対する効果実施例22に従って作成したBPIタンパク質分解断片を、本質的に実施例15に記載の方法に従うLAL阻害アッセイにおいて使用し、図22に示す結果が得られた。図22において、黒塗りの三角形はrBPI₂₃を表し、白抜きの円形はAsp-N断片A3を表し、黒塗りの円形はAsp-N断片A2を表し、白抜きの四角形はAsp-N断片A3を表し、黒塗りの四角形はAsp-N断片A1A2を表し、白抜きの三角形はAsp-N断片A6bを表し、小さな白抜きの三角形はCNBr断片C3を表し、そして小さな黒塗りの四角形は CNBr断片C1/C5を表す。第1〜56位及び第112〜170位のアミノ酸断片を含むCNBr消化画分は、およそ100 nMのIC₅₀にて、LPSで誘導したLAL反応を阻害した。このIC₅₀は、同じアッセイにおけるrBPI₂₃（9nM）に対するIC₅₀よりもおよそ10倍高いものである。その他のC NBr消化断片は阻害的でなかった。 Asp-N消化により作製された断片を用いるとわずかに異なる結果が観察され、すなわち、３つの断片がLALアッセイにおいて阻害効果を有することが見出された。第116〜193位のアミノ酸に対応する断片は、LPSで誘導したLAL反応を15nMで完全に阻害する、無傷のrBPI₂₃と同様のLAL阻害活性を呈した。第57〜104位及び第1〜38位のアミノ酸に対応する断片もまた、LALアッセイを阻害したが、それには10倍多くの量を要した。これらの結果は、CNBr消化による結果と合わせて、rB PI₂₃分子の少なくとも３つの領域がLAL反応のLSB活性化を中和する能力を有し、最も強力な領域は第116〜193位のアミノ酸断片内に存在するようであることを示唆するものである。 rBPI₂₃の殺菌及びLAL阻害特性をブロッキングすることができるウサギポリクローナル抗−rBPI₂₃抗体ならびに、２つの相異なる、ブロッキングしないマウス抗−rBPI₂₃モノクローナル抗体を用いたELISAアッセイに関する、実施例22のタンパク質分解断片の関連研究において、前記ポリクローナル抗体は、第116〜193位及び第57〜 104位のAsp-N断片のみならず、第1〜56位及び第112〜170位のCNBr断片と免疫反応性があることがわかり、一方ネズミモノクローナル抗体は、rBPI₂₃の第1〜14 位の残基を表すAsp-N断片のみと反応した。総合的には、前記結果より、rBPI₂₃が分子の総生物学的活性に寄与する３つの機能性ドメインを含むことが示唆される。第１のドメインは、第17〜45位のアミノ酸の配列に現れ、第36位の残基でAsp-N開裂により破壊される。このドメインは、LPSで誘導したLAL活性及びヘパリン結合アッセイの阻害の双方において、中等度の強さの活性を呈する。第２の活性ドメインは、第65〜99位のアミノ酸の領域に現れ、その、LPSで誘導したLAL活性の阻害は、第70位の残基におけるCNBr開裂によって減じられる。このドメインは、最も高いヘパリン結合能も呈し、そして第85〜99位の殺菌ペプチドを含むものでもある。第142〜169位の間のアミノ酸の、第３の活性ドメインは、LPSで誘導したLAL刺激アッセイの阻害において活性を有し、３つの領域のうち、最も低いヘパリン結合能を呈するものである。例えば、セクロピン（cecropin）及びマガイニン（magainin）といった、他の殺菌性タンパク質は、活性に必要な連続性、両親媒性、α−ヘリックス領域によりその特徴が示される。LPS結合／殺菌性分子の陽イオン性／疎水性モチーフと、ヘパリン結合性タンパク質のコンセンサス配列との間に、高い度合いで構造上の類似性が観察された。特に卓越した相関性は、ヘパリンに結合する合成rBPI₂₃ ペプチドと、LPSで誘導したLAL反応を阻害するものとの間に存在する（r＝0.75 、p＝0.0001、n＝47）（図14から16）。これらのデータにより、LPSとヘパリンは、それらが相互作用するタンパク質と類似の電荷を有する配列部位を表しているのかもしれない。その結果、LPSと強く結合する他のタンパク質もまた、強固にヘパリンに結合するかもしれない。当業者であれば、本発明の好ましい実施態様を考慮して、本発明の実施に際して数多くの修正や変更を行うことが予測される。本発明の１つの局面によれば、グラム陰性細菌殺菌活性を有するBPIタンパク質産物ペプチドを投与することを含む、グラム陰性細菌感染及びその余病の治療法が企図される。結論として、本発明の範囲に定めるべき限定範囲は、添付の特許請求の範囲に記載における限定のみである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＬＣ０７Ｋ 14/47 ＡＣＶ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡＣＺＣ１２Ｐ 21/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ペアレント，ジェームスブリアンアメリカ合衆国 94618 カリフォルニアオークランドビアシュコート 5826

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘパリンの抗凝固効果の中和方法であって、有効量のヘパリン結合性BPI タンパク質産物を対象者に投与することを含む方法。２．脈管形成阻害法であって、脈管形成を阻害するのに有効な量のBPIタンパク質産物を対象者に投与することを含む方法。３．流体試料中のヘパリンの抗凝固効果の中和方法であって、該試料を有効量のヘパリン結合性BPIタンパク質産物に接触せしめることを含む方法。４．阻害される前記脈管形成が眼性網膜症に関連する、請求の範囲第２項記載の方法。５．内皮細胞増殖の阻害方法であって、増殖阻害に有効な量のBPIタンパク質産物を対象者に投与することを含む方法。６．子宮内膜症の治療法であって、子宮内膜に内皮細胞の増殖阻害に有効な量のBPIを投与することを含む方法。７．避妊方法であって、対象者に、受精した卵子の着床に関連する内皮細胞増殖を妨げるに有効な量のBPIタンパク質産物を子宮内層に投与することを含む方法。８．悪性腫瘍細胞増殖の阻害方法であって、増殖阻害に有効な量のBPIタンパク質産物を対象者に投与することを含む方法。９．前記悪性腫瘍がカポジ肉腫である、請求の範囲第８項記載の方法。 10．慢性炎症性疾患状態の治療方法であって、炎症を低減するのに有効な量の BPIタンパク質産物を対象者に投与することを含む方法。 11．前記慢性炎症性疾患が関節炎である、請求の範囲第10項記載の方法。 12．前記関節炎性炎症性疾患状態が慢性関節リウマチである、請求の範囲第11 項記載の方法。 13．前記関節炎性炎症性疾患状態が反応性関節炎である、請求の範囲第11項記載の方法。 14．前記BPIタンパク質産物が、殺菌／透過性増大タンパク質の、23〜25kDのアミノ末端断片である、請求の範囲第１、２、５、６、７、８及び10項記載の方法。 15．ヘパリン結合性薬物としての用途のためのBPIタンパク質産物。 16．ヘパリンの抗凝固効果の中和における、ヘパリン結合の用途のためのBPI タンパク質産物。 17．脈管形成阻害におけるヘパリン結合の用途のためのBPIタンパク質産物。 18．阻害される前記脈管形成が、眼性網膜症に関連する、請求の範囲第17項記載の産物。 19．内皮細胞増殖阻害におけるヘパリン結合の用途のためのBPIタンパク質産物。 20．前記内皮細胞増殖が子宮内膜症に関連する、請求の範囲第17項記載の産物。 21．避妊薬としてのヘパリン結合の用途のためのBPIタンパク質産物。 22．悪性腫瘍細胞増殖阻害におけるヘパリン結合の用途のためのBPIタンパク質産物。 23．前記悪性腫瘍がカポジ肉腫である、請求の範囲第22項記載の産物。 24．慢性炎症性疾患状態の治療におけるヘパリンの結合の用途のためのBPIタンパク質産物。 25．前記慢性炎症性疾患が関節炎である、請求の範囲第24項記載の産物。 26．前記関節炎性炎症性疾患が慢性関節リウマチである、請求の範囲第25項記載の産物。 27．前記関節炎性炎症性疾患が反応性関節炎である、請求の範囲第24項記載の産物。 28．殺菌／透過性増大タンパク質の、23〜25kDのアミノ末端断片である、請求の範囲第15、16、17、19、21、22及び24項記載のうちのいずれかの産物。 29．ヘパリン結合性薬物の製造のための、BPIタンパク質産物の用途。 30．ヘパリンの抗凝固効果を中和するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、BPIタンパク質産物の用途。 31．脈管形成を阻害するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、BPIタンパク質産物の用途。 32．眼性網膜症に関連する脈管形成を阻害するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、BPIタンパク質産物の用途。 33．内皮細胞増殖を阻害するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、BPIタンパク質産物の用途。 34．内皮細胞増殖阻害により子宮内膜症を治療するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、BPIタンパク質産物の用途。 35．ヘパリン結合性避妊薬の製造ための、BPIタンパク質産物の用途。 36．悪性腫瘍細胞増殖を阻害するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、BP Iタンパク質産物の用途。 37．前記悪性腫瘍がカポジ肉腫である、請求の範囲第36項記載の用途。 38．慢性炎症性疾患状態を治療するためのヘパリン結合性薬物の製造ための、 BPIタンパク質産物の用途。 39．前記慢性炎症性疾患が関節炎である、請求の範囲第38項記載の用途。 40．前記関節炎性炎症性疾患が慢性関節リウマチである、請求の範囲第39項記載の用途。 41．前記関節炎性炎症性疾患が反応性関節炎である、請求の範囲第39項記載の産物。 42．前記タンパク質産物が、殺菌／透過性増大タンパク質の、23〜25kDのアミノ末端断片である、請求の範囲第29、30、31、32、33、34、35、36及び38項記載のうちのいずれかの用途。