JPH08509737A

JPH08509737A - グルタチオンジエステルの使用

Info

Publication number: JPH08509737A
Application number: JP6524467A
Authority: JP
Inventors: レビー，エレン; アンダーソン，メアリー; マイスター，アルトン
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1994-05-02
Publication date: 1996-10-15
Also published as: EP0697882A1; US5869456A; EP0697882A4; WO1994025052A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、実質的に純粋なグルタチオンのジ低級アルキルエステルおよび細胞内グルタチオンレベルを上昇させるためのそれらの化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】グルタチオンジエステルの使用先行技術の説明実質的にすべての細胞機能において見いだされるトリペプチドチオールであるグルタチオン（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニルーグリシン；（ＧＳＨ））は、代謝において、輸送および細胞防御の機能を果たしている。グルタチオンは、ＤＮＡのデオキシリボヌクレオチド前駆体の合成において、さらに代謝中に形成されるフリーラジカルおよび過酸化物のごとき活性酸素中間体の影響からの細胞防御において、蛋白および他の分子のジスルフィド結合を還元する機能を果たしている。細胞内グルタチオンレベルを低下させる選択的酵素阻害剤の投与により、あるいはグルタチオン合成を増加させる化合物を提供することにより、グルタチオン代謝の修飾を行うことができる。化学療法および放射線療法、および薬剤や他の外来性化合物ならびに酸素の毒性効果からの細胞の防御において、かかる効果は有用である。実際、ＧＳＨの広範な機能は、酵素学ならびに物質輸送のみならず薬学、放射線生物学、癌治療、毒物学、内分泌学、微生物学ならびに農学をはじめとする多くの分野に関連している。グルタチオン代謝の酵素的現象および輸送現象は、マイスター（Meister），「セレクティブ・モディフィケーション・オブ・グルタチオン・メタボリズム（Selective Modofocation of Glutathion Met abolism）」,サイエンス（Science）,第２２０巻,ナンバー４５９６,４２７〜４７７頁（１９８３年４月）に概説されており、これを参照により本明細書に取り入れる。細胞のＧＳＨを枯渇または増加させるためのグルタチオン代謝の修飾は、種々の目的に役立つ可能性がある。例えば、チオール類は放射線照射の影響から細胞を防御するということが長い間知られている。細胞のＧＳＨの減少は、細胞を放射線照射に対してより感受性にするので、グルタチオン枯渇は、死滅すべき細胞と更新されるべき細胞が実質的に異なるＧＳＨ量を要求する化学療法の状況において有用である。合成阻害によるＧＳＨの枯渇は、ＧＳＨを必要とする反応により解毒される薬剤での化学療法における貴重なアジュバントとしても役立つ。対照的に、薬剤または放射線に対する耐性の向上は細胞のＧＳＨの増加に関連している。ＧＳＨは、多くの薬剤の解毒に効果的に役立つ。例えば、アセトアミノフェンの解毒経路はＧＳＨとの結合を必要とする。Ｌ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸のごときチアゾリジンでの治療は、肝臓疾患を有する患者およびメチオニンの硫黄をシステイン合成に利用できない未熟児に対して価値がある。かかるチアゾリジンの細胞内システイン前駆体としての有効性は５−オキソプロリナーゼの存在に依存している。該酵素活性はほとんどすべての動物細胞に見いだされる。この酵素は植物にも存在し、そのことはチアゾリジン（以後グルタチオンという）は作物植物を除草剤の毒性効果から防御するための農業における安全化剤として有用でありうる。グルタチオンの細胞レベルを上昇させるための種々の方法が知られている。グルタチオンは３つのアミノ酸：グルタミン酸、システインおよびグリシンからなる。グルタチオンのアミノ酸前駆体の動物への投与は細胞のグルタチオンの増加を引き起こすが、この方法の有効性にが限度がある。ＧＳＨの細胞濃度はシステインの供給に依存し、システインはしばしば制限アミノ酸であり、システインは食物蛋白由来であり、さらに肝臓におけるメチオニンからのトランス−サルフレーション（trans-sulfuration）によっても得られる。しかしながら、システイン投与はＧＳＨ濃度を上昇させるための理想的な経路ではない。なぜなら、システインは急激に代謝され、そのうえ、非常に毒性がある。細胞中に輸送され、細胞内でシステインに変換される化合物の動物への投与は、ときどき、細胞のグルタチオンレベルを上昇させるのに有用である。例えば、チアゾリジンＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシラートは細胞内に輸送され、そこで５−オキソプロリナーゼによりＬ−システインに変換され、システインはＧＳＨ合成に利用される。組織のＧＳＨ濃度を上昇させうるもう１つの方法は、γ−グルタミルシステインまたはγ−グルタミルシスチンの投与によるものである。投与されたγ−グルタミルアミノ酸はそのまま輸送され、ＧＳＨシンセターゼの基質として役立つ。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与が、しばしば、組織のＧＳＨ濃度を上昇させることも知られている。グルタチオン自体の投与がグルタチオンレベルを上昇させうるとも考えられている。しかしながら、グルタチオンがそのまま細胞内に入ることを示す公表された証拠がない。実際、グルタチオン自体は細胞中へ輸送されないということを示す、特別な生物学的システムに関するいくつかの報告がある。グルタチオン投与後に時々見られる細胞のグルタチオンの増加は、（ａ）グルタチオンの細胞外での分解、（ｂ）グルタチオン由来の細胞外遊離アミノ酸またはジペプチドの細胞内への輸送、次いで、（ｃ）グルタチオンの細胞内での再合成による。細胞内グルタチオン濃度を増加させるためのこれらの以前の方法は、これまで議論されていたように、効率、毒性、得られる有効濃度の限界等において不利である。さらに、関連する２種の合成酵素の基質の供給を増加させることによるＧＳＨ合成に依存する既知方法は、合成酵素の存在に依存し、第１の合成酵素はＧＳＨによるフィードバック阻害を受ける。ある種のグルタチオンモノエステルが有効なグルタチオン送達システムであることがよく知られている。例えば、米国特許第４,７１９,４８９号、第４,７８４,６８５号および第４,８７９,３７０号参照。典型的には、グルタチオンのエステルは、水に溶解後、注射により投与される。しかしながら、該エステルは経口投与後も有用である。該エステルを、上記水または生理食塩水のごとき適当な医薬上許容される担体と混合して液体処方とするか、またはラクトース、シュクロース、澱粉、タルク等と混合して粉末を処方することができる。グルタチオンのジエステルはマウスに対して毒性があり、それゆえ、さらなる利用可能性がないことが、もともと上記３つの特許において見いだされ、記載されていた。明らかな毒性に関する正確な理由は知られていないが、不純物が毒性を発生させると強く考えられる。ジエステルが有用性を有し、実際は毒性が内ことが、ついに見いだされた。かくして、要約すると、グルタチオンは有効には動物細胞中に輸送されないが、以前の研究により、グリシンのカルボキシル基がエステル化されたＧＳＨのモノエステルが非常に有効なＧＳＨ送達剤であることが示されたことが知られているようである。よって、ＧＳＨのモノグリシルエステルは動物組織中（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、心臓、肺、骨格筋、リンパ球）に十分に輸送され、細胞内で加水分解されてＧＳＨを生ずるのである。ＧＳＨモノエステルは、細胞のＧＳＨレベルを上昇させることにおいて、ＧＳＨおよび他のＧＳＨ誘導体よりも効果的である。発明の詳細な説明ヒト・赤血球懸濁液を種々のＧＳＨ標品とともにインキュベーションした本発明者らによる実験により、金属混入物（Ｃｕ、Ｆｅ）が細胞のチオールのレベルの著しい低下を引き起こすことが示された。これらの研究において、対応するジエステルを約１０〜１５％含有していたある種のＧＳＨモノエチルエステル標品は、意外にも、細胞のＧＳＨレベルを上昇させることにおいて非常に効果的であることが観察された。この観察結果から、以前には、有効な細胞ＧＳＨ送達化合物として赤血球との試験がされていなかったＧＳＨジエステルに関する再試験を行った。ＧＳＨジエチルエステルが非常に有効にヒト・赤血球中に輸送され、さらにある種の他の細胞中へも輸送されることが、ついに見いだされた。高純度のこの化合物を製造するための改良方法が工夫された。初期の証拠は、ＧＳＨジメチルエステルはマウスに対して毒性があることを示したが、ＧＳＨジエチルエステルをマウスおよびハムスターに与える本研究においては毒性は観察されなかった。ＧＳＨジエチルエステルは、ラットおよびマウスの血漿中に存在するエステラーゼ活性により速やかにＧＳＨモノ（グリシル）エステルに変換される。このことは、これらの種におけるＧＳＨ送達剤としてのＧＳＨジエチルエステルの有用性を制限する。しかし実際のところ、本発明者らは、ＧＳＨジエチルエステルおよびＧＳＨモノエステルのマウスへの注射は同様の結果を与えることを観察した。しかしながら、本発明者らは、ヒト・血漿には検出可能なＧＳＨジエステル α−エステラーゼ活性がないことを見いだした。よって、ＧＳＨジエチルエステルはヒト・血漿中では比較的安定であり、細胞中への透過性が増大していることが予想されるため、有効な細胞ＧＳＨ送達剤として役立つ可能性がある。本研究において、ＧＳＨジエチルエステルはＧＳＨモノエチルエステルよりも効果的にヒト・赤血球および白血球（Ｔ−リンパ球）中に輸送されることが見いだされた。いくつかの種から得られた血漿についての研究により、ハムスターの血漿は、ヒトの結晶と同様、検出可能なジエステルα−エステラーゼ活性がないことが示され、そのことは、ハムスターがＧＳＨジエステル代謝のさらなる研究のためのモデルとして役立ちうることを示すものであった。ある種の大型動物（モルモット、ウサギ、ヒツジ）由来の血漿もまた、このエステラーゼを欠く。本発明は、一部において、グルタチオンのアルキルジエステルを投与することにより細胞内グルタチオンレベルを上昇させる方法に指向される。かかるエステルは、例えば、肝臓および腎臓細胞中に輸送され、細胞中で脱エステル化され、かくして、細胞のグルタチオンレベルの上昇を引き起こす。特に、グルタチオンジエチルエステル（ＧＳＨ−ＤＥ）はヒト・赤血球（ＲＢＣ）中に非常に効率的に輸送されることが見いだされた。グルタチオンモノエチルエステル（ＧＳＨ−ＭＥ）がＲＢＣ中に輸送されることはすでに見いだされているが、本発明者らは、ＧＳＨ−ＤＥがずっと効率よく輸送されることを、ついに見いだした。表１に示すように、ＧＳＨ−ＭＥは約３ｍＭの全ＲＢＣチオールレベルを与える（対照、すなわち、正常なチオール［ＧＳＨ］の約２倍）。他方、ＧＳＨ−ＤＥを含有する溶液中にＲＢＣを懸濁した後には、約２０ｍＭの全チオールレベルが観察される。２０ｍＭの全チオールの大部分はＧＳＨ−ＭＥである。よって、ＲＢＣはＧＳＨ−ＤＥのα−エステル結合を切断して（細胞内て）ＧＳＨ−ＭＥを生じるのである。チオールの増加は赤血球（表１および２）ならびに白血球（表３）において見られる。ラットおよびマウスにおいて−研究室の実験に通常使用される動物において−血漿中でＧＳＨ−ＤＥは速やかにＧＳＨ− ＭＥにまで切断され、その結果、ＧＳＨ−ＭＥ投与に優るＧＳＨ−ＤＥ投与の利点はない。しかしながら、ヒト・血漿（次いで、ハムスター・血漿についてもわかったのであるが）は有意なα−エステラーゼ活性を欠き、よって、ＧＳＨ−ＤＥはＧＳＨ−ＭＥにまで切断されない。それゆえ、ＧＳＨ−ＤＥは、ヒトにおいて（およびハムスター研究動物モデルにおいて）、種々の組織の細胞中への有効な取り込みに利用されうる。ヒトにおけるもう１つのＧＳＨ−ＤＥの利点は、この化合物がＴ−リンパ球をはじめとする末梢白血球中に容易に入ることである。ヒト・ドナー由来の全血をＧＳＨ−ＤＥとともにインキュベーションすると、ＲＢＣおよび白血球（ＷＢＣ）の両方は高レベルのチオールを有する。さらに、先天性免疫不全症候群（エイズ）なる疾病は、ＧＳＨ欠乏、特に、エイズウイルスにより損傷を受けたＷＢＣ（白血球）を包含するＷＢＣのクラスであるリンパ球におけるＧＳＨ欠乏に関連している。２−オキソチアゾリジン−４ −カルボキシラートおよびＮ−アセチルシステインのごとき、ＧＳＨレベルを上昇させる化合物に関して、患者における実験的な試行が進行中である。ＧＳＨ− ＭＥはエイズ治療に使用可能であることが以前示唆されていた。今回の知見は、ＧＳＨ−ＤＥはいっそう良いものである可能性があることを示す。表４は、ＧＳＨ−ＭＥ［９０分で１０.６ｍＭ］およびＧＳＨ−ＤＥ［９０分で３３ｍＭ］に関する、ヒト・ＰＢＭ（ＰＢＭはリンパ球を包含する）の全チオールについてのいくつかの結果を示す。Ｔ細胞に関して、データを表５に示す。モデル動物（ハムスター）に関するデータ−表６−は、肝臓にＧＳＨレベルを上昇させることにおいて、ＧＳＨ−ＤＥはＧＳＨ−ＭＥよりも有効であることを示す。ＧＳＨ−ＤＥはＧＳＨ−ＭＥよりも疎水的であり、それゆえ、非常にうまく脂質含有細胞膜を越えて輸送されうると考えられる。ＧＳＨ−ＤＥは、ＧＳＨ−ＭＥとは対照的に、正味の正電荷を有し、それゆえ、負に帯電した細胞成分（例えば、ＤＮＡ）に引き寄せられると考えられる。このことは、潜在的に、種々のタイプの損傷からのＤＮＡ保護を助ける。細胞のＧＳＨを増加させることに関する以前の考えおよび意見はＧＳＨ− ＤＥにもあてはまる。ＧＳＨ−ＤＥは、いくつかの種類の細胞中へＧＳＨ−ＭＥよりも有効に輸送されるように思われる。ＧＳＨ−ＤＥは容易に細胞外で切断されてＧＳＨ−ＭＥになり、それゆえ、必然的にＧＳＨ−ＭＥと等価であると以前考えられていたが、現在は、ＧＳＨ−ＤＥはヒト結晶において細胞外で切断されないと考えられる。それゆえ、ＧＳＨ−ＤＥはヒトにおける使用にとりより良いものである見込みがある。それは容易に細胞中に入り、細胞のチオールレベルを上昇させる。ＧＳＨジエステルの投与を包含する本発明方法によれば、上昇したＧＳＨレベルが有効かつ迅速に提供される。さらに、本発明は、純粋なジアルキルエステルを提供し、以下に示すような、それらの製造方法を提供する。本発明方法によれば、エステル化されたグルタチオンはそのまま細胞内に輸送され、そこで脱エステル化され、かくして、細胞のグルタチオンレベルの上昇を引き起こす。グルタチオンは２個のカルボキシル基を有し、それらはグルタミン酸残基のカルボキシル基およびグリシン残基のカルボキシル基である。本発明方法に使用される化合物は、その両方のカルボキシル基がエステル化されたグルタチオンのジアルキルエステルである。よって、本発明に使用される化合物は以下の構造：［ＲおよびＲ₁はそれぞれ独立して１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基を意味する］を有する。上記化合物の医薬上許容される塩は本発明の範囲内である。本発明ＧＳＨジアルキルエステルのアルキル基は、１〜１０個の炭素原子を有する飽和の直鎖または分枝アルキル基であり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはデシルのごとき飽和直鎖アルキル、およびイソプロピル、イソブチル、sec−ブチル、 tert−ブチルまたはイソペンチルのごとき飽和分枝アルキルを包含する。それらのうち、メチル、エチルおよびイソプロピルが医薬用途に特に適する。本発明に使用されるグルタチオンの源は重要でなく、よって、グルタチオンを合成してもよく、あるいは当該分野において慣用的な方法により単離してもよく、また、購入してもよい。好ましいエステル化法を以下に記載する。この方法は現在のところ好ましいものであるが、最終生成物の純度が少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９９％であり、動物に対して当該化合物自体よりも毒性のある不純物が実質的にないものを得ることができる限り、いかなる合成法を用いてもよい。典型的には、グルタチオンのジエステルを水に溶解後、注射により投与する。しかしながら、該ジエステルは経口投与後も有効である。該ジエステルを、上記Ｈ₂Ｏまたは生理食塩水のごとき医薬上許容される担体と混合して液体処方とすることができ、あるいはアミノ酸混合物、ビタミン、ラクトース、シュクロース、澱粉、タルク等と混合して粉末を処方することもできる。適当な治療上有効な用量を、通常の実験、特に、グルタチオンおよびグルタチオンのモノエステルの先行技術の用法、以下の実施例を考慮して、さらに、起こると考えられる概算の化学量論的細胞内加水分解を考慮して選択することができる。いかなる場合にも、患者におけるグルタチオンレベルをモニターすることができ、あるいは治療すべき毒性の性質に依存する有効性の池のパラメーターを利用することもできる。この場合、提案される用量は、体重１ｋｇあたり約０.１〜１０ミリモルのエステルであり、好ましくは、体重１ｋｇあたりエステル約１〜３ミリモルを１日１〜６回投与するものとする。典型的には、投与を行って、投与後０.５ないし２時間後にグルタチオンの細胞内レベルを０.５〜３ミリモルにする。反応の正確な機構は不明であるが、本発明方法により得られる細胞内グルタチオンの増加は、投与されたグルタチオンエステルが、少なくとも、肝臓および腎臓の細胞中に輸送され、そこでグルタチオンへと加水分解されることを示すと解釈される。かかる加水分解は、グルタチオンジエステルが肝臓および腎臓ホモジネート物とともにインキュベーションされたインビトロ実験において示された。実施例材料および方法ＧＳＨをカルバイオケム（Calbiochem）、シグマ（Sigma）またはユー・エス・バイオケミカル・コーポレイション（U.S.Biochemical Corporation）から得た。モノブロモビマンをカルバイオケムまたはモレキュラー・プローブス・インク（Molecular Probes Inc.）（オレゴン州ユージーン（Eugene））から得た。ＤＴＴをシグマから得た。ＨＣｌガスをマセソン・ガス・プロダクツ（Matheson Gas Products）（ニュージャージー州イー・ラザフォード（E.Rutherford））から得た。Ｈ₂ＳＯ₄および無水ジエチルエーテルをマリンクロッド（Mallinckro dt）から得た。Ｃｈｅｌｅｘ−１００（２００〜４００メッシュ，Ｎａ⁺型）およびＡＧ１−Ｘ２（２００〜４００メッシュ，Ｃｌ^-型）樹脂をバイオ−ラッド（Bio-Rad）から得た。ＰＢＳをギブコ（GIBCO）から得た。オスのシリアン・ハムスター（Syrian hamster）（５０〜６０ｇ）をチャールズ・リバー（Cherles River）（カナダ）から得た。オスのスイス・ウェブスター・マウス（Swiss Web ster mice）（２１〜２５ｇ）をタコロイック・ファームズ（Tacoroic Farms）から得た。他の種の血液は、親切にも、ラボラトリー・オブ・アニマル・メディシン・アット・コーネル・ユニバーシティー・メディカル・カレッジ（Laborato ry of Animal Medicine at Cornell University Medical College）から提供された。グルタチオンモノエチルエステル（ＧＳＨ−ＭＥ）ＧＳＨ−ＭＥ・ＨＣｌおよびＧＳＨ−ＭＥ遊離塩基を記載（４,５）されたようにして調製した。グルタチオン・ジエチルエステル（ＧＳＨ−ＤＥ）０℃において、５.６ｍｌの濃硫酸を１００ｍｌのエタノールに添加することにより調製された溶液にＧＳＨ（５ｇ）を懸濁し、スラリーを０℃において短時間攪拌して完全な溶液とした。０℃で４〜７日放置した後、反応は約７０％完了する。１０倍体積のジエチルエーテルを添加後、０℃で数時間放置し、エーテルをデカンテーションし、シロップを乾燥窒素の流れの下で乾燥した。シロップを最少量の冷水に溶解し、１０ＭＮａＰＨで注意深くｐＨを４〜５に調節した。この溶液をＣｈｅｌｅｘカラム（Ｎａ⁺型,ｐＨ５.５に平衡化）に供し、次いで、Ｈ₂Ｏで溶出した。フラクションをＤＴＮＢでモニターした。モノエチルエステルの溶出完了後、移動相を０.２ＭＮａ₂ＳＯ₄に変え、ジエステルを溶出した。ジエステル溶液を凍結乾燥し、抽出物からチオールがなくなるまで、固体を無水エタノールで抽出した。合わせたエタノール溶液を減圧蒸発して小体積とし、エーテルを添加することによりジエステルを沈殿された。得られた白色固体をエーテルで繰り返し洗浄し、Ｎ₂の流れの下で乾燥し、次いで、ＫＯＨ上、真空下においた。質量スペクトル分析ＦＡＢ（＋）スペクトルは３６４ａｍｕ（Ｍ＋Ｈ⁺）における分子イオンを示す。Ｄ₂Ｏ中の¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：１.２２および１.３２ｐｐｍにおいて２つの重複トリプレット（６プロトン）,エチルの− ＣＨ₃基；マルチプレット,２.２５ｐｐｍ（２プロトン）,γ−グルタミル残基の β−ＣＨ₂；マルチプレット,２.６１ｐｐｍ（２プロトン）,γ−グルタミル残基のγ−ＣＨ₂；マルチプレット,２.９５ｐｐｍ（２プロトン）,システイニル残基のβ−ＣＨ₂；ＡＢカルテット,４.０２ｐｐｍ（２プロトン）,グリシニル残基の −ＣＨ₂；４.２５ｐｐｍに中心を有するはっきりしないマルチプレット（５プロトン）,エチルの−ＣＨ₂およびγ−グルタミル残基のα−ＣＨ；トリプレット, ４.５６ｐｐｍ（１プロトン）,システイニル残基α−ＣＨ。スペクトルはＴＳＰ基準。ＤＴＮＢによる赤血球チオールの分析細胞上清（４０μｌ）を１ｍｌの６ｍＭＤＴＮＢ（６.３ｍＭのＥＤＴＡを含有する１４３ｍＭリン酸緩衝液中）に添加した。ＧＳＨ標準曲線を用いて１分後の４１２ｎｍにおける吸光度変化を全チオールに関する値に変換した。ＰＢＳ：０.４３５Ｍ酢酸：１０％ＳＳＡ（２ｍＭのＥＤＴＡを含有）の１：２：２混合物（「ＲＢＣ混合物」）中でＧＳＨ標準曲線を作成した。ＨＰＬＣ分析のための細胞のチオールの誘導体化分析混合物の誘導体化を以下のようにして行った：赤血球溶解物：１５５μｌの５０ｍＭＤＴＰＡ（ｐＨ７）、１１０μｌの３.３３％ＳＳＡ、全体積１８０μｌの「ＲＢＣ混合物」添加細胞上清、１０μｌの０.１ＭｍＢＢｒ（ＣＨ₃ ＣＮ中）、１００μｌの２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（室温にてｐＨ９）。試料を室温の暗所に２０〜３０分置いた；９０μｌの氷酢酸で反応を停止した。還元された赤血球溶解物：１５５μｌの５０ｍＭＤＴＰＡ（ｐＨ７）中のｍＭＤＴＴ、ＳＳＡ、試料および上記「ＲＢＣ混合物」。トリスを添加し、試料を室温で２５分間攪拌した。２０μｌのＴｒｉｓおよび１０μｌのｍＢＢｒを添加した；誘導体化法は上記のとおり。Ｔ細胞およびＰＢＭ溶解物：１２０μｌの４ｍＭＤＴＰＡ、全体積３６０μ ｌの試料／４.３１％ＳＳＡ（０.５ｍＭＤＴＰＡを含有）、１００μｌのＴｒｉｓ、５μｌのｍＢＢｒ；暗所に２０分置き、１５μｌの氷酢酸を添加。血漿試料：１９０μｌの５０ｍＭＤＴＰＡ、３.３３％ＳＳＡを含有する全体積７０μｌの試料、１７.５μｌのＴｒｉｓ、１０μｌのｍＢＢｒ；暗所に２０分置いた後、７.５μｌの氷酢酸を添加。還元された血漿試料：１７０μｌの５０ｍＭＤＴＰＡ、２０μｌの５０ｍＭＤＴＰＡ中１６ｍＭＤＴＴ、あとは上記と同じ；試料を室温で２０分攪拌した。還元後、ｍＢＢｒを添加し、上記と同様にして誘導体化を行った。他の動物の組織３８５μｌの５０ｍＭＤＴＰＡ、１４０μｌの試料。２０ μｌのｍＢＢｒ、４０μｌのＴｒｉｓ；暗所に２０分置き、１５μｌの氷酢酸を添加。すべての試料タイプに対する標準物質を、同様の誘導体化法を用いて調製した。細胞チオールのＨＰＬＣ分析３種のグラジエントのうちの１つを用いて、アルテックス・ウルトラスフェアＯＤＳ（Altex Ultrasphere ODS）逆相カラム（５μ；４.６ｍｍｘ２５ｃｍ）で試料のクロマトグラフィーを行った：（１）緩衝液Ａ：１２.８％ＭｅＯＨ、０.２５％酢酸、８７.７５％Ｈ₂Ｏ、ｐＨ３.９。（２）緩衝液Ｂ：９０.０％ＭｅＯＨ、０.２５％酢酸、９.７５％Ｈ₂Ｏ（ｐＨ調節せず）。（３）グラジエント１：最初１００％Ａ、２５分で５０％Ｂまで直線的グラジエント、３５分で１００％Ｂまで直線的グラジエント、３９.５分まで１００％Ｂで洗浄；４０分で１００％Ａに切り替え；４８分まで１００％Ａで平衡化。グラジエント２：最初１００％Ａ、２５分で７５％Ｂまで直線的グラジエント、あとはグラジエント１と同じ。グラジエント３：最初１００％Ａ、２５分で６５％Ａかつ３５％Ｂまで直線的グラジエント、あとはグラジエンント１と同じ。流速は１ｍｌ／分であった。シリアン・ハムスターからの組織の回収キシラジンおよびケタミンを腹腔内注射することにより動物を麻酔し、斬首し、放血した。血液を５０μｌのＥＤＴＡ（０.５Ｍ,ｐＨ７）と混合した。遠心分離により血漿を回収し、半分の体積の１０％ＳＳＡ／０.５ｍＭＤＴＰＡを添加した。肝臓：一方の葉を取り、Ｈ₂Ｏですすぎ、水分を吸い取り、５％ＳＳＡ中でホモジナイズした（０.５ｍＭＤＴＰＡ）（１ｇの組織に対し５倍の体積）。腎臓：一方の腎臓を取り、被膜を剥離し、次いで、肝臓と同様に処理した。脳：肝臓と同様に処理した。原子吸光分析トレイス・メタル・アナリシス・センター・オブ・サ・ホスピタル・フォー・スペシャル・サージェリー（Trace Metal Analysis Center of t he Hospital for Special Surgery）により、腎臓の原子吸光分析が行われた。ＮＭＲおよび質量スペクトル分析ＮＭＲおよび質量スペクトル分析は、ロックフェラー大学（Rockfeller University）において行われた。ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ（０.５Ｍ,ｐＨ７）を抗凝血剤（０.４ｍｌ／血液８〜１２ｍｌ）として、全血を採取した。遠心分離後、血漿および軟層を除去し、１〜２倍体積のＰＢＳ／５ｍＭＤＴＰＡまたはＥＤＴＡで赤血球を３回洗浄した。圧縮された赤血球を半分の体積のＰＢＳに懸濁した。各懸濁液に３分の１体積のＧＳＨ、ＧＳＨ−ＭＥまたはＧＳＨ−ＤＥ（８０ｍＭ,ｐＨ７）を添加した。一定時間３７℃でインキュベーションした後、一部を取り、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＤＴＰＡで洗浄（３〜４回）し、同体積の０.４３５Ｍ酢酸で溶解し、同体積の１０％ＳＳＡ／２ｍＭＤＴＰＡで蛋白を沈殿させ、遠心分離して細胞残渣を除去した。材料および方法に記載のごとぐ上清をＨＰＣＬ分析用に誘導体化した。ｐＨ７において、全血（表１参照）を、半分の体積の１２０ｍＭＧＳＨ、またはＧＳＨ−ＤＥと混合した。試料を３７℃で３０分インキュベーションし、次いで、遠心分離した。血漿および軟層を除去した後、表１記載のごとく赤血球を洗浄し、処理した。ｐＨ７において、６ｍｌの全血（表１参照）を、３ｍｌの６０ｍＭＧＳＨ、ＧＳＨ−ＭＥまたはＧＳＨ−ＤＥと混合した。３７℃で３０分インキュベーションした後、フィコール−ハイパーク（Ficoll-Hypaque）密度勾配遠心分離によりＰＢＭを単離した。細胞を１４ｍｌのＰＢＳで２〜３回洗浄し、４.３１％ＳＳＡ／０.５ｍＭＤＴＰＡ（４００μｌ）で溶解した。遠心分離後、ＨＰＬＣ分析用に上清を誘導体化した。ＰＢＭを全血から単離（表１および表３参照）し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ｐＨ７において、０.９ｍｌの細胞懸濁液（細胞５〜８ｘ１０⁶個）に、０.３ｍｌの８０ｍＭＧＳＨ、ＧＳＨ−ＭＥまたはＧＳＨ−ＤＥを添加した。一定時間３７℃でインキュベーションした後、遠心分離により細胞を回収し、１４ｍｌのＰＢＳで洗浄（２回）し、４.３１％のＳＳＡ／０.５ｍＭＤＴＰＡを添加し２〜３回凍結−融解サイクルを行うことにより溶解させた。遠心分離後、上清をＨＰＬＣ分析用に誘導体化した。精製Ｔ細胞をＰＢＳに懸濁した。ｐＨ７において、０.９ｍｌの細胞懸濁液（９０分の試料および７分のセイライン対照は細胞９ｘ１０⁶個；あとのものは１. ８ｘ１０⁷個）に０.３ｍｌの８０ｍＭＧＳＨ、ＧＳＨ−ＭＥまたはＧＳＨ−ＤＥを添加した。一定時間３７℃でインキュベーション後、表４においてＰＢＭに関して記載したようにして細胞を回収し、処理した。システインに関する値がないところは、レベルは、＜０.３ｎｍｏｌ／細胞１０⁷個（７分の試料について）または＜０.５ｎｍｏｌ／細胞１０⁷個（９０分の試料について）である。ＧＳＨ、ＧＳＨ−ＭＥ、またはＧＳＨ−ＤＥ（５ｍｍｏｌ／ｋｇ）を与える２時間前に、絶食した動物にＢＳＯ（６ｍｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内投与した。値を１時間後に測定した。血漿のＧＳＨレベルは、ＧＳＨ−ＭＥまたはＧＳＨ−ＤＥを与えることによっては影響を受けなかった。各値は、３〜４匹の動物に関する測定値±Ｓ.Ｄ.を表す。今回上に示した知見および本発明ジエステルと従来技術のモノエステルとの間の明確な相関関係を考慮すると、ここに開示された知見は、さらに、投与されたグルタチオンエステルが肝臓および腎臓の細胞中に輸送され、そこで加水分解されてグルタチオンになることを示す。マウスをブチオニンスルホキシミンで前処理した場合の従来技術のＧＳＨモノエステルについての研究は、グルタチオンエステルの輸送に関する強力な証拠を提供する。これらの条件下で、その構成アミノ酸からのグルタチオン合成は著しく阻害される。なぜなら、スルホキシミンはグルタチオン合成の第１段階を触媒する１つの酵素を阻害するからである。さらに、グルタチオン合成はブチオニンスルホキシミンにより著しく阻害されるため、インタクトなグルタチオンは細胞中に送達されないこともわかる。よって、本発明方法は、グルタチオンに関する必要な合成酵素が枯渇している場合に、細胞内グルタチオンレベルを上昇させることができる。明らかな修飾が当業者により行われるたので、本発明は説明された特別な詳細に限定されないことが理解されるべきである。さらに、作物植物の間に存在している、あるいは成長する可能性のある雑草を駆逐するのに用いる除草剤の効果から植物を防御するために、作物植物に投与、または吸収可能な液体の適用により種を撒く前に種子に投与することにより、本発明エステルを安全化剤として使用することができる。本発明の変更は当業者に明らかであろう。略語ＧＳＨ＝グルタチオンＤＮＡ＝デオキシリボ核酸ＧＳＨ−ＭＥ＝グルタチオンモノエチル（グリシル）エステルＧＳＨ−ＤＥ＝グルタチオンジエチルエステルＲＢＣ＝赤血球ＰＢＭ＝末梢血単核細胞ＤＴＴ＝ジチオスレイトールＰＢＳ＝リン酸緩衝化セイラインＤＴＮＢ＝５,５'−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ＤＴＰＡ＝エチレントリアミン五酢酸ＳＳＡ＝５−スルファサリチル酸ｍＢＢＲ＝モノブロモビマンＴｒｉｓ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＨＰＬＣ＝高品質液体クロマトグラフィーＭｅＯＨ＝メタノールＯＤＳ＝ＨＰＬＣカラムの商品名ＢＳＯ＝Ｌ−ブチオニンスルホキシミンＦＡＢ＝高速原子衝撃¹ ＨＮＭＲ＝プロトン核磁気共鳴ＴＳＰ＝３−（トリメチルシリル）プロピオニック２,２,３,３,−ｄ₄アシッドＷＢＣ＝白血球（ＰＢＭ）ＬＤＬ＝低密度リポ蛋白

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アンダーソン，メアリーアメリカ合衆国10021ニューヨーク州、ニューヨーク、イースト・シックスティーサード・ストリート450番 (72)発明者マイスター，アルトンアメリカ合衆国10021ニューヨーク州、ニューヨーク、イースト・セブンティース・ストリート435番

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋なジアルキル（Ｃ₃ないしＣ₁₀）グルタチオン。２．実質的に純粋なジエチルグルタチオン。３．細胞内グルタチオンのレベルを上昇させる量の実質的に純粋な形態の請求項１記載のグルタチオンのジ低級アルキルエステルを投与し、そのことにより該エステルが該細胞中に輸送され、細胞内でグルタチオンにまで加水分解されることを特徴とする、動物における細胞グルタチオンレベルを上昇させる方法。４．該エステルがエチルエステルである請求項３記載の方法。５．該エステル化されたグルタチオンが動物体重１ｋｇあたり０.１ないし１０ミリモルの用量で投与される請求項３記載の方法。６．動物における薬剤の解毒を行う方法であって、該動物において該薬剤を解毒するための用量で請求項１記載の実質的に純粋なグルタチオンのジ低級アルキルエステルを投与することを特徴とする方法。７．動物の放射線照射耐性または薬剤耐性を高める方法であって、該動物の放射線照射耐性または薬剤耐性を高めるに十分な用量で請求項１記載の実質的に純粋なグルタチオンのジ低級アルキルエステルを投与することを特徴とする方法。