JPH08510015A - 白腐れ菌によるピッチ分解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 菌シゾフィラム・コミュン（Schizophyllum commun e）、トリチャプタム・ビフォルメ（Trichaptum biform e）及びファネロカエテ・ギガンテア（Phanerochaete g igantea）は、セルロース製品の製造において使用されるパルプ及びパルプ材のピッチ含量の減少において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 白腐れ菌によるピッチ分解法 本発明は、セルロース製品の製造において使用される材料のピッチ含量の減少 における特定の菌種の使用に関する。 木は、セルロース、ヘミセルロース、リグニン及び木エキス又は樹脂状材料で あって一般的に“ピッチ（Pitch）”、“樹脂（resin）”又は“木樹脂（wood r esin）”といわれるものから成る複合材料である。ピッチの組成は研究されてお り、そして文献中に広く報告されている。例えば、Wood Extractives and Their Significance to the Pulp and Paper Industry，Chapter 10“Wood Resins”b y D.B．Mutton；W.E．Hills，Ed，Academic Press，N.Y．（1962）。 木パルプからの製品の製造において、ピッチの存在は不所望である。なぜなら 、その粘度及びテナシティーのために、それがしばしば除去することが困難であ る沈殿物を形成し、洗浄のための比較的高頻度の且つ長期間の中断時間を引き起 こし、そして樹脂がストレーナー板、フィルター上に、そして紙加工装置じゅう に沈殿物として蓄積する傾向があるからである。洗浄前にあまりに長く蓄積に供 される場合にピッチがパルプを、そしてそれから形成される紙を変色させること もできることがよく知られている。他の欠点、例えば、排液流汚染が本分野にお いて公知である。 米国特許第3,486,969号中、特定の菌が、木の他成分、特にセルロース及びヘ ミセルロースの分解を最小にしながら、木チップに、そしてその中の樹脂含量を 減少させるためにそれからのパルプに接種するために使用されうることが開示さ れている。しかしながら、その中に開示された菌の種は、明らかにすべて、その 木を変色させ るとき、容易に削り落とされることができる表面又は表在性の染みを本質的に作 り出す糸状菌型（mold type）又は表面形成性の菌（fungi）である（J.S．Boyce ，Forest Pathology，3rd．Ed.，1961，McGraw-Hill Book Co．493-512頁、特に 496-497を参照のこと。）。このような菌は我々の知るかぎり実行的成功を達成 していない。 公開された欧州特許出願第EP 0 387 187 A2号中、子嚢菌類（Ascomycetes）又 は不完全菌類（Deuteromycetes）として一般的に分類される特定の木−透過性の 菌をパルプ材（pulpwood）及びパルプに適用してそのピッチ含量を減少させるこ とについて記載されている。同様に有用な木−透過性菌誘導体も、公開された欧 州特許出願第EP 0 470 929 A2号中に開示されている。 公開されたフランス国特許出願第2692590号中、処理された支持体上白色又は 無色で成長しながら非常に良好なピッチ分解及び積極的な成長特性を示す好まし い木−透過性菌オピオストーマ・ピリフェラム（Ophiostoma piliferum）の他株 誘導体について記載されている。 紙製造における菌及び菌酵素の潜在的用途の研究の一般的分野において、担子 菌類（Basidiomycetes）、特に白腐れ菌（white rot fungi）が、リグニンを分 解し、そしてリグニン分解酵素を生産するそれらの能力について重要とされてき た。このような目的に特に好適と判断された白腐れ菌は、米国開封特許第5,055, 159号中に記載されているようなセリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceripor iopsis subvermispora ）である。 本発明の目的は、パルプ及びパルプ材、並びに特に非−滅菌基質中のピッチの 分解において有用な菌の分野を拡げることである。 他の目的は、所望の性質、例えば、色効果、ピッチ分解能力、非−滅菌基質上 での良好な成長、操作温度における柔軟性、様々な木 種に対するより大きな作用又は作用の柔軟性、等を有し又は併合するピッチ分解 性の菌を提供することである。 本発明に従って、シゾフィラム・コミュン（Shizophyllum commune）、トリチ ャプタム・ビフォルメ（Trichaptum biforme）及びファネロカエーテ・ギガンテ ア（Phanerochaete gigantea）の種の白腐れ菌が、特に非−滅菌木基質中のピッ チを含む木基質のピッチ含量の減少に特に有用であることが発見された。 従って、本発明は、木、特にパルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させる方 法であって、そのパルプ材又はパルプに、シゾフィラム・コミュン（Schizophyl lum commune ）、トリチャプタム・ビフォルメ（Trichaptum biforme）及びファ ネロカエーテ・ギガンテア（Phanerochaete gigantea）からなる群から選ばれた １以上の菌を含んで成る１以上の接種物を適用し、そしてその菌の成長の促進に 有効な環境的条件下を維持することを含んで成る方法を提供する。 用語“樹脂（resin）”又は“ピッチ（Pitch）”（これらは互換使用される。 ）は、一般的にピッチとして知られる木の中の疎水性物質の複雑な混合物であっ て、中性有機溶媒、例えば、塩化メチレン、ジエチル・エーテル、ベンジル・ア ルコール、等中で可溶性であるものを意味する。これらは、テルペン類、ジテル ペン（“樹脂”）酸、脂肪酸及びエステル、グリセリド及びワックス、並びにア ルコール、炭化水素及びそれに関連する他の化合物を含む。本発明の目的のため に、塩化メチレンを使用する標準的Tappi抽出分析が、本発明の目的である樹脂 中の減少を測定するのに十分であろう。 樹脂又はピッチは、軟材、例えば、南松（southern pine）、針葉樹（conifer s）及びヒマラヤスギ（cedars）、及び硬材、例えば、カバノキ（Betula）及びP opulusの両方の重要な構成成分であり、そしてそれは、機械的又は化学的パルプ 化工程に送られるフィード の４重量％以上を、一般的に、パルプ化のために使用されるほとんどの木につい て1.5〜4.0％を占めることができる。軟材は、一般的に、硬材よりも多くの樹脂 を含み、松は、軟材の中で最も高い樹脂含量をもつ。硬材中、樹脂は、主に、木 がパルプ化されるときその繊維画分のほとんどを形成する放射柔組織細胞中に位 置する。軟材中、樹脂は、放射柔組織（ray parenchyma）細胞、そしてまた樹脂 管（resin ducts）の両方の中に含まれる。 本発明は、一般的に、セルロース製品の製造において使用されるパルプ材及び パルプのピッチ含量を減少させるために適用されることができる。 用語“パルプ材（pulpwood）”は、本明細書中に使用するとき、紙、ダンボー ル又は他のセルロース製品、例えば、ビスコース（viscose）の製造においてで あるがパルプ化の前に使用される木の材料のいずれかの収穫（切断）形態を意味 し、そして材木（timber）、丸太（logs）、木チップ（wood chips）、木屑（sa wdust）、等のような形態を含む。用語“精製パルプ材（refine pulpwood）”は 、パルプ化工程に導入されることができる多数の高表面積の小片、例えば、木チ ップ及び木屑を得るために丸太のような全パルプ材形態に機械的及び／又は剪断 の力を加えることから生じたパルプ材を意味する。本発明は、また、そのリグニ ン含量を有意に減少させ（そして含有ピッチを放出させ）るのに十分な処理を未 だ経験していないパルプ、特にその元のリグニン含量の60％以上を未だに保持す るパルプ、例えば、第一段階機械的パルプとして分類されることができるリグニ ン−含有セルロース材料に適用されることもできる。 それ故、本発明は、その１の態様においては、そのパルプ材又はパルプに上記 菌の中の少なくとも１の接種を適用し、その接種されたパルプ材又はパルプをマ スにおいて堆積させ、そして菌によりそ のパルプ材又はパルプの樹脂成分における減少を行わしめるのに十分な時間にわ たりそのマスにおいて菌の成長を許容し又は促進する条件下でその堆積したマス を維持することにより、精製パルプ材及びパルプ及び不完全精製パルプの樹脂成 分を少なくとも部分的に減少させるために使用されることができる。本発明は、 皮を剥がされていない材木の場合においては望ましくは少なくとも部分的に傷つ けられた材木を接種し、そしてその木基質上及び中での菌の成長並びにその樹脂 成分における減少の行使に十分な時間にわたりその材木を維持することにより、 未精製パルプ材、例えば、皮を剥がされた又は剥がされていない形態における切 断された材木に、適用されることができる。 用語“接種（inoculum）”等は、本明細書中に使用するとき、上記基質に適用 されるとき上記菌の成長をもたらすのに十分に生物活性をもついずれかの菌材料 を意味する。典型的な菌接種物は、菌カルチャー又は菌カルチャーから、望まし くは生物学的に純粋なカルチャーから得られた調製物を含む。ほとんどの菌の基 本構造単位は菌糸（fungal filament）又は“菌糸（hypha）”である。集合して 、これらの菌糸は、“菌糸体（mycelium）”といわれる菌体を含んで成る。菌は 、典型的にはその菌糸体によりつくられた分生子（conidia）といわれる胞子に より無性生殖により再生され、又は厚膜胞子（chlamydiospores）又は担子胞子 （basidiospores）により有性生殖により再生することもできる。すべてのこの ような形態及び菌要素、例えば、菌糸体及び胞子は、本発明における接種物とし て好適に使用されることができる。接種形態は、幾つかの慣用方法のいずれかに おいて菌を培養することにより提供されることができる。固体又は液体培養基、 好ましくは液体培地を適宜又は必要により使用することができる。普通には、胞 子形成にふさわしい条件下での菌の培 養が、可能なときには好ましく、そして一般的に好ましい接種は、その菌カルチ ャーから生じた多数の胞子を含むであろう。 上記接種物は固体又は液体形態にあることができる。すべての液体カルチャー 又はその部分、例えば、菌糸体及び胞子の混合物を使用することができる。高含 量の胞子がそのカルチャー中に入手可能なとき、その生成物は、その中で胞子が 接種後の菌を生成するための生物活性成分を構成しているような乾燥接種物を得 るために凍結乾燥されることができる。適用のために水により希釈されるべき濃 縮物の形態における接種物は、一般的には、所望の生物活性を保存するであろう 温度において保存される。液体形態は、普通には、凍結されて、典型的には−５ ℃〜−80℃、より普通には、−10℃〜−75℃の温度において保存される。乾燥形 態も同様に保存される。但し、作用可能な接種物としての胞子を含む凍結乾燥形 態がしばしばより安定であり、そして他の液体形態よりも高い温度において保存 されることができる。接種組成物は、乾燥工程の特定のタイプにおいて導入され る他の成分、例えは、保存剤及び安定剤又は不活性担体を含んで成ることができ る。 接種物を様々なやり方で木基質に適用することができる。典型的には、接種物 を、システム的又は方法論的なやり方で適用する。例えば、接種物を、精製パル プ材のマス中に断続的に、又は好ましくは規則的な間隔において、切断材木の外 表面に分配する。より好ましくは、接種物を、均質的又は均一的なやり方で、す なわち、精製パルプのマスの実質的に全体に分配する。しかしながら、それぞれ の個々の木チップ、木屑、等が接種されることは必要とされない。個々の片の10 ％以下程の少量、好ましくは少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約50 ％が接種されることができる。なぜなら、非接種片がその接種された片と接して 堆積するからである。成長 の間にその感染は非常に容易に拡がるであろう。 木チップのマスの完全な又は均一な接種は、一般的に、その菌がそのマスの実 質的に全体に成長するという事実を反映する。しかしながら、マスの幾つかの部 分、特に精製木パルプの山（pile）の外層が、それが接種されたとしても、その マスの残りと比べて小さな成長を示し、又は全く成長を示さないということが起 こるかもしれない。 １つの好ましい態様において、接種物を、それらがその精製操作から排出され る時であるが山に堆積される前に、木チップ又は木屑上にスプレーする。例えば 、木チップ装置は、一般的に、新たに調製されたチップを受け取り、そしてその 堆積している山にそれらを運ぶコンベア手段を備えている。この接種調製物を含 むスプレー・アプリケーターは、便利には、そのコンベアに、好ましくは、その チップが空気輸送、例えば、自由落下又は転がるとき、上記チップ装置との接続 点において、又はそのコンベアから落下する直前にチップがスプレーされるよう にそのコンベアのまさに端において、接続されることができる。 あるいは、接種物を、堆積する山の上でいくぶん連続的にスプレーすることに よりその堆積の経過中にその木チップの山に適用することができる。 パルプ又は精製パルプ材を処理するとき、適用される投与量は、幾つかの要因 、例えば、処理される木、木の条件又は齢、成長条件、所望の処理時間、等に依 存して変化することができる。一般的には、満足できる結果は、パルプ又はパル プ材100グラム当たり0.5〜10グラムの菌糸体（脱水菌糸体の湿重量、実施例１参 照）、好ましくは処理されるべき基質100グラム当たり１〜５グラムの菌糸体を 含む接種物適用の間に得られることができる。脱水に先立つこの ような菌糸体は、以下の実施例１又は実施例Ａ、好ましくは実施例Ａ中に記載す るように調製されることができ、そして胞子を含むことができる。優先的に又は 完全に胞子に基く接種物の投与量は日常的に決定されることができ、そして基質 １キログラム当たり10⁶〜10¹⁰ CFU（コロニー形成単位）、より普通には10⁷〜10⁹ CFU／kgのレンジであると示されることができる。 この接種投与量は、一般的に、水−希釈されたスプレー可能な組成物、例えば 、基質１kg当たり20〜60mlの容量において適用されるべき組成物において適用さ れるであろう。この菌は、好ましくは、処理まで冷凍又は低温において保存され た新たに切断又は精製されたパルプ材又は新たに切断された基質、あるいは滅菌 された基質に適用される。処理前に熟成された非−滅菌パルプ材、例えば、処理 約５日間以上前に製造された木チップに適用されるとき、接種に先立ちその木に 自然に感染した菌の背景成長効果を回避し、又は抑制するために、その接種物投 与量その投与量レンジの上限まで増加させることが望ましいかもしれない。 他の態様においては、本発明に従って先に接種され、そしてインキュベートさ れたチップを、接種を有効にし又は強化するために新たなチップ中に分散させる ことができる。このような接種物は、おそらく生物学的に純粋ではない。しかし ながら、それは、その接種物の少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％が望 ましい菌であるように先の接種物を反映する。 接種後、堆積したマスを、そのマスの実質的に全体にその菌の成長を許容し又 は促進するであろう条件下で維持する。本発明がほとんどの場合に開放空気中で 行われ、そしてそれ故そのマスが多種多様な気象条件に供されるであろうという 事実が与えられるので、処理期間の全体を通じての理想的条件のいずれかの所定 のセットを維 持することは、普通には達成が困難であり、そしてしばしば実施することも必要 とされない。一般的には、菌が死ぬ高い温度を回避しながら菌が成長する温度に おいてマスを実質的に維持することで十分である。我々の菌が０℃以下において ある妥当な成長を示すことができるけれども、一般的には、少なくとも10℃、例 えば、10℃〜40℃、より好ましくは15℃〜33℃、最も好ましくは22℃〜28℃の温 度を保つことがより好適であろう。 温和な又は温暖な気象条件においては、その環境温度に影響を及ぼすことは必 要とされず、そしてその接種されたマスを、開放空気中で特別な維持を伴わずに 放置することができる。冷気象条件においては、より好適な温度を維持するため の手段をその接種されたマスに提供することが望ましいかもしれない。これは、 その接種されたマスの上又は接して置かれた熱−保持カバー材料、例えば、大き なプラスチック・シートであることができる。あるいは、接種されたマスがその 上に置かれる地面の基礎に加熱パイプ又は暖い空気又は蒸気を放出するための複 数の開口を提供することができる。同様のやり方で、内部を加熱し、そして輻射 熱を放射することができるコンクリートの“イグルー（igloo）”又は類似の構 造を、パルプ材の堆積したマスを支持するために使用することができる。加熱手 段を提供するとき、過度の乾燥を回避するための湿度条件を制御することも望ま しいであろう。この視点において、熱又は蒸気を換気するための手段が適当であ ろう。しかしながら、菌の成長及び他の微生物又は自然の効果から堆積したマス 内で生成した熱のために、多くの冷気象条件下での操作は、ほとんど又は全く支 援なしに首尾よく進行することができる。 接種された精製パルプ材マスが処理される時間は、所望の程度の樹脂の除去、 温度及び湿度条件、接種の程度、等を含む多くの要因 に依存してかなり変化することができる。しかしながら、満足いく結果は、一般 的に３〜40日、好ましくは４〜30日間にわたる時間の後に獲得されることができ る。好ましい条件下では、非常に有効な結果、例えば、約20％以上のピッチ減少 をその接種の４〜20日後、より普通には５〜15日後に得ることができる。 非精製パルプ材、例えば、切断材木の処理は、普通には精製パルプ材のものよ りもいくぶん長くなるであろうし、そして２カ月以上に延長されることができる 。しかしながら、上記の菌によるパルプ及びパルプ材の処理は、一般的には、そ の基質（単数又は複数）のセルロース成分に対するいずれかの実質的な攻撃をも たらすであろう余分な期間を避けながら所望のピッチ減少をを遂げる期間にわた り行われなければならない。非精製パルプ材のための投与量は、精製パルプ材の ものと同様であることができ、そして利用可能な表面の10％〜100％にわたり、 より普通には利用可能な表面の15％〜50％にわたり適用されることができる。 本発明の実施において使用される菌は、先に公知の種であり、そして公知のや り方、例えば、それらが自然に成長する木源からの単離により獲得されることが できる。株中のいくつかの変種が、それらが単離されることができる木源の如き 要因に依存することが予想され得るけれども、我々の菌は、非滅菌Southern Yel low Pine及びAspenの両方の上での顕著な成長を示し、そしてセルロース製品の 製造において一般的に使用される他の木タイプの上でよく成長すると期待される ことができる。我々の菌の天然単離物は、それらの同定種特性を喪失せずに株選 択、接合及び突然変異の様々な公知手段により修飾されることができる。これ故 、我々の好ましい天然単離物は、以下に詳述するようにNorthern Regional Rese arch Center（NRRL）に寄託されたが、同一のものが修飾されることができるこ と 、そして好ましい菌株がこのような単離物だけでなく上記寄託された株により所 有される滅菌Southern Yellow Pine及びAspen上でのピッチ分解及び／又は成長 特性を少なくとも実質的に有するすべての他の単離物及び修飾物をも含むであろ うことは、明らかであろう。このような他の単離物及び修飾物を得るための方法 はEP 0 470 929（引用により取り込む）中に開示されている。本発明において使 用される菌は、パルプ材料及びパルプ上で白色又は本質的に無色で成長するであ ろう。それらが非滅菌基質に自然に感染する他のより黒い成長菌をほとんど又は 完全に排除するために使用されることができるので、本発明に係る菌は、最終紙 製品を得るためにほとんど漂白を必要としない製品を製造するために使用される ことができる。 寄託 我々は、ブタペスト条約の下、Peoria，Illinois，U.S.A.にあるNorthern Reg ional Research Center（NRRL）に、本明細書中に言及する以下の菌を寄託した 。それらの寄託物は、それらの寄託日と共に与えられた以下の寄託番号を付与さ れた。 上記の寄託物を全て米国ミネソタ州の伐採された材木からの天然単離物として 得たが、全てを様々な他の地球上の地域から得ることができる。上記S.commune 及びT.biformeを硬材から単離し、P.giganteaを赤松（red pine）から単離した 。Trichaptum biformeは、 過去に、ポリポラス・パーガメナス（Polyporus pargamenus）及びヒルシオポラ ス・パーガメナス（Hirschioporus pargamenus）ともいわれてた。Gilbertson e t al.，North American Polypores，Vol．2，Fungiflore，Oslo，Norway 1987， pages 770-772及びOtjer et al.，“Selective Delighification of Birch Wood （Betula papyrifera）by Hirschioporus pargamenus in the Field and Labora tory"，Holzforschung 40（1986），183-189を参照のこと。またPhanerochaete gigantea は、過去に、フェニオフォーラ・ギガンテア（Peniophora gigantea） としても知られていた。Burdsall，H.H.，Jr.，“A Contribution to the Taxon omy of the Genus Phanerochaete"，Mycological Memoir，No．10，J．Cramer p ublishers，Braunschueig，Germany（1985）を参照のこと。 実験を、それらの実験において述べられる種が特定の株を代表するように、上 述の寄託された株を用いて行った。 実験 一般的手順：培養及び接種 ： 様々な評価をパルプ材基質に対して行って、ピッチ減少及び成長を測定した。 軟材特性の評価のために、滅菌及び非−滅菌Soythern Yellow Pine木チップを使 用した。硬材特性の評価のために、滅菌及び非滅菌aspen木チップを使用した。 木チップを評価に先立ち５℃において保存した。それぞれの評価を同一の木種の 基質上で及び同一の木チップ源から得られた木チップ・サンプルに対して行った 。それぞれのテストのために、木チップの個々のサンプル・ロットを始めに計量 し、その後、滅菌されるべき木チップ・サンプルをオートクレーブ内で121℃に おいて約20分間加熱し、そしてテスト開始前に室温まで冷却に供した。非−滅菌 形態にあるべき木チップ・ サンプルを処理せず、そしてそれらの自然条件において使用した。個々のサンプ ル・ロットを個々の透明プラスチック・バッグに木チップの計量された量を入れ ることにより調製した；これらのバックは、（密封してシールすることはできな いが）それらが閉じられるのに十分なサイズを有していた。透明バッグの使用は 、チップの成長の肉眼観察を許容し、そしてさらに、評価される木チップのサン プルへの周囲の光の進入を許容した。 液体培養基を、以下の構成成分を使用して調製した（量は作られた液体培養基 の１リッター当たりのグラム数である。）： 10ｇ グルコース 10ｇ 麦芽エキス 2ｇ ペプトン 2ｇ 酵母エキス 2ｇ KH₂PO₄ 1ｇ アスパラギン 1ｇ MgSO₄・7H₂O これらを、順番に１リッターの蒸留水に添加し、そしてその後121℃において 約20分間オートクレーブにかけ、そして室温まで冷却した。以下、YNPD培養基と いう。その後、１mgのチアミンをその他の構成成分に添加し、その後、このYNPD 培地を使用可能状態にした。 先に示したように調製したYNPD培養基を使用して、それぞれの菌を以下の一般 条件下で調製した： （ａ）特定の菌のサンプルを先に調製したようなYNPD培養基を含む滅菌ペトリ 皿に接種するために使用し、そしてその皿に蓋をし； （ｂ）接種されたYNPD培養基を室温（約20℃）において、接種された菌が菌糸 体マット（mats）の形態においてそのYNPD培養基上でよ く成長することが肉眼で識別できるまで（約５日間）維持し； （ｃ）良好な成長が観察された後、その菌糸体マットを次に（ゴム手袋により 覆われた）手でそのペトリ皿から取り出し、そして本質的に水が全く出なくなる まで手で搾り、そしてその搾ったマットを“湿重量（wet weight）”を測定する ために計量した。この搾った又は脱水したマットをきれいな実験ビーカー内に入 れ、そこで次にそれを５−10mlの蒸留水の添加により均質化してピペットで吸い 取ることができるようなスラリーを作り、次にそれをそのビーカーから取り出し 、そして基質を接種するために使用し；そして （ｄ）ビーカーの内容物を次に目盛り付きシリンダーに注ぎ、ピペットで吸い 取ることができるスラリーの容量を測定し、そして一旦測定したら、その内容物 を上記実験ビーカーに戻し、そこからそれを、サンプルの接種のために吸い上げ た。 木チップのサンプルの接種を、木チップの各100グラムについてその菌糸体マ ットの２−５グラムの湿重量を含むピペット内容物を注射することにより行い、 その後、上記バッグの開放端を折り返し、そしてその接種物と接するようになる チップの数を最大化するように、そのバッグの内容物を振とう、そして混合した 。このバッグの折り返し端を２箇所で挟んだ。接種された木サンプルのすべてを 次に室温においてそれぞれの特定のテストにおいて示される時間にわたり実験台 上に置いた。それぞれのテストを、２〜５のサンプルに対して行い；本明細書中 に報告する菌の成長の報告はこれらの複数の結果の平均である。ピッチ含量評価 ： 基質のピッチ含量の評価を標準的なTAPPI Procedure T204 OS-76に従って測定 した。これは、塩化メチレンである“DCM”により抽出された基質の１グラム当 たりのピッチ含量のミリグラムとして表さ れることができる結果を提供する。このTAPPI Procedureに従って、基質、例え ば、木チップ上で使用するとき、その処理されたチップを、約１cmの幅に、剪定 ばさみを用いてわり、次に60℃において一夜乾燥させ、そして次に10−メッシュ ・スクリーン（10ゲージ・ワイヤー・スクリーン）をもつThomas-Wiley Interme diate Millを使用して木屑に粉砕し、再び60℃において一夜乾燥させた。３グラ ムの乾燥木屑を30mlのDCMと併合し、そして得られた混合物を室温（約20℃）に おいて一夜（約15時間）攪拌した。この液体培地をその混合物からピペットによ り吸い取り、0.45μｍの細孔サイズをもつ有機フィルターを通して濾過し、そし て次にその液体を室温において一夜風袋消去（前計量した）皿内で蒸発せしめる 。皿残渣を次に60℃において30分間対流オーブン内で加熱していずれの残DCMを もさらに除去し、その後、その皿を室温まで冷却に供し、そして再計量し；残渣 、すなわち、残ピッチの重量を、ミリグラム（mg）の単位において測定且つ表示 し、そして評価される元のサンプルの量に関連付けて、その基質木チップの１グ ラム当たりのピッチのmg、又はあるいはその基質木チップ・サンプル中に存在す る抽出可能なDCMのパーセントとしての表示を提供して、その結果を等式で結び 、そしてその基質中のピッチのパーセント（％エキス）として得る。 ピッチ評価を滅菌及び非−滅菌基質の両方に対して行うことができる。滅菌基 質の対する評価は、普通にはその基質に自然に感染する他の生物の可能性のある 影響のいずれをも取り除くであろう。滅菌基質に対する評価は、一般的には、菌 が特定の基質に対してピッチを減少させるより客観的な測定を考慮されることが できる。しかしながら、滅菌又は非−滅菌基質のいずれに対して行われても、ピ ッチ減少は、一般的には、そのテスト期間（非−滅菌基質評価）の 間の冷凍状態において保たれる（滅菌又は基質テストのための）滅菌された非処 理対照に対して評価される。一般的には、接種後21日目までに、好ましくは14日 目までに少なくとも20％のこのような対照に対してピッチ減少を達成することが 望ましい。特に、良好な結果は、21日目までにピッチが25％減少されるとき、そ して特に14日目までにこのような減少が達成されるときに、示される。成長評価 ： 菌の成長の評価を、その成長が測定されるべきいくつかのテストのそれぞれに ついて評価される個々のサンプルのすべてについて、可能な限り均一に且つ可能 な限りほとんど同一なやり方で行う。評価を、矛盾しない基準に基づき適用され るプロトコールにより単純な肉眼観察を使用して、そしてそれぞれの評価間隔（ ここで、中間評価をテストの間に行う。）において、そしてそれぞれのテストの 終わりに、行う。このプロトコールは、正常な読み距離において非援助眼により それぞれの個々の木チップ又は基質に対して観察し又は確認されることができる 可能性のある菌成長の色カテゴリーに基く。基質を滅菌するとき、１だけの色カ テゴリー、本発明の候補のものが認識されるであろうし、そしてそのプロトコー ルは、候補菌の可視成長を示すチップの数又はパーセンテージを測定するために すべての木チップの単純肉眼観察を含む。その成長評価を非−滅菌基質上で行う とき、異なる色カテゴリーが、普通には、本発明の又は接種された菌とその基質 に自然に感染した菌との間を区別するために、認識されるであろう。 この接種された候補、典型的には最も明るい色が同定されるであろうし、そし てこのような成長を見えるように示す木チップの数及びパーセンテージがカウン トされるであろう。以下の報告結果を、各テスト・ケースにおける我々の所望の 菌の成長を示すことが観察 された木チップのパーセンテージに換算して与える。処理された非−滅菌木チッ プは、他の生物、例えば、黒色菌のチップの他の領域内での成長を示すことがで き、そしてこのような背景成長の色付けは、同様のやり方で別々に記録されるこ とができる。このような背景変色は、その接種された菌により他の陽性成長結果 を打ち消すものととってはならないが、より望ましい菌の候補は、明らかに、こ のような背景成長を最も良く抑制し又はこれを上回ってはびこるものである。 実施例１ 滅菌及び非−滅菌Southern Yellow Pine上での成長 ： Southern Yellow Pine上での菌成長の評価を滅菌木チップ・サンプル非−滅菌 木チップ・サンプルであって、その木チップを約５日間熟成したものの上で行っ た。このサンプルのそれぞれは、先に記載したように調製した100グラムの木チ ップを含んでいた。上記菌のそれぞれの接種物を先に記載したように調製し、そ して５グラムの菌糸体マット（湿重量）を先に記載したようなやり方で100グラ ムのチップを接種するために使用した。次にバッグを12日間の期間にわたり室温 において保存した。菌成長の評価をそのサンプルの接種後２、５及び12日目に行 った。滅菌及び非滅菌南松上でのこの成長の結果以下の表１と２中に報告する。 非−滅菌基質に対する結果（表２）に関して、わずかな背景成長が、12日後のい くつかの木チップ上で観察され、その背景のいくつかが、他の白色成長テスト菌 の下で現れた。 実施例２ 滅菌及び非滅菌aspen上での成長 ： aspen上での上記菌種の成長評価を、熟成した滅菌及び熟成した非滅菌木チッ プ・サンプルの両方に対して行った。各サンプルは、先に記載したように調製し た100グラムの木チップを含んでいた。各菌の接種を、先に記載したように調製 し、そして３グラムの菌糸体（湿重量）を、上記100グラムのチップを接種する ために使用した。次に、バッグを、12日間の期間にわたり室温において保存した 。上記成長評価を、そのサンプルの接種後２、５及び12日目に行った。滅菌及び 非滅菌aspenに対する結果を、以下の表３と表４中に報告する。非滅菌基質に対 する結果（表４）に関して、わずかな背景成長が12日間成長の後いくつかの木チ ップに対して観察された。 実施例３ 実施例１及び２の手順に本質的に従って、菌ファネロカエテ・ギガンテア（Ph anerochaete gigantea ）を、熟成した非−滅菌Southern Yellow Pineと熟成した 非−滅菌Aspenの両方の上での成長について評価した。但し、各テストにおける 接種物は500グラムの木チップ当り２グラム湿重量の低い投与量であり、そして 評価を、14日目における中間評価を伴って27日間にわたり行った。背景成長は、 14日目又は27日目のいずれにおいても全く観察されなかった。これらの結果を以 下の表５中に示す。 実施例４ 硬材（Aspen）中のピッチ除去 上記菌株を、Aspen中のピッチ除去におけるそれらの効力及び他の特徴につい て評価した。対照サンプルも評価して比較指標を提供した。対照サンプルは、そ のテスト期間じゅう冷凍して（−20℃）維持された非−接種対照サンプル、及び 室温において維持された非−接種対照サンプルを含んでいた。この周囲温度対照 を非−滅菌木 チップ・サンプル上に存在する背景生物のピッチ減少に対する効果の指標として 使用した。すべての評価を接種後14日間の成長の後に非−滅菌aspen木チップ・ サンプルの400グラムのサンプル上で行い、それぞれのテストを３連で走らせ、 そしてそれらの結果を平均した（これらの木チップは接種前約５日間熟成（aged ）されていた。）。比較のために、これらのテストは、登録商標CARTAPIP^R 97下 で入手可能な製品の形態におけるオフィオストーマ・ピリフェラム（Ophiostoma piliferum ）の菌種をも含んでいた。 各サンプルを、TAPPI Procedure T204 OS-76に記載したプロトコールに従って DCM抽出可能な量について評価した。Klasonリグニンの分析を選ばれたaspen木チ ップ・サンプル上で行ってそのサンプル・チップ中のリグニンの分解の指標を提 供し；５つの基本的単糖類（グルカン、マンナン、アラビナン、キシラン及びガ ラクタン）の定量的な測定を絶対基準に基づいて行ってその木の炭水化物組成を 定めた。このKlasonリグニン分析を、一般的に、TAPPI T249 cm-85のテスト・プ ロトコール“Carbohydrate composition of extractive-free wood and good pu lp by gas-liquid chromatography”（1984；TAPPI）に従って行った。簡単に言 えば、TAPPI T249 cm-85プロトコールに従うKlasonリグニン分析は以下のようで ある：サンプルを２段階技術を用いて硫酸により加水分解し；１部の加水分解産 物を次に中和し、そしてそのサンプル中に存在する糖を水素化ホウ素ナトリウム によりそのアルジトールに還元し、これを次に無水酢酸及びピリジンによりアセ チル化し、そして次にその酢酸アルジトールを塩化メチレン中に溶解し、そして 次にそのガス・クロマトグラフィー中へのインジェクションのために使用した。 さらに、選択されたaspen木サンプルについてその炭水化物の分析を行ってセル ロース及びヘミセルロース分解の程度を評価した。 評価されるサンプルの結果、％DCMエキス及び％Klasonリグニンを表６上に、 そして選択されたサンプルの炭水化物の分析を表７上に、両方以下に報告する。 このKlasonリグニン・テスト結果から分かるように、本発明に係る菌種は、上 記木チップ・サンプルのリグニン含量に適当に影響を与えないことが見つかった 。驚くべきことに、本発明に係る菌種は、そのサンプルのピッチ含量における有 意な減少を引き起こし、CARTAPIP^R 97がピッチの有効な分解剤であると認められ ていることに留意のこと。 表７の結果から分かるように、その周囲対照サンプルと比較したとき我々の菌 により処理されたaspen木チップのサンプル中の炭水化物の量における適当な損 失は存在しなかった。これ故、セルロース及び／又はヘミセルロースの減少は、 本ピッチ減少処理の結果として全く示されなかった。 実施例Ａ 液体振とうフラスコ培養における菌の成長特性 シゾフィラム・コミュン（Schizophyllum commune）及びトリチャプタム・ビ フォルメ（Trichaptum biforme）を、１リッターの全容量まで20ｇ麦芽エキス及 び２ｇ酵母エキスを蒸留水に溶解することにより調製した50mlの麦芽エキス／酵 母エキス培地を使用して振とう液体培養において、それぞれ別に培養した。この 培地に、活発に成長している麦芽／酵母エキス寒天プレートからの菌糸体の小さ なプラグを接種した。このフラスコを５日間23−25℃において200rpmにおいて振 とうし、そしてそれぞれのカルチャーからの１mlの滅菌サンプルを顕微鏡分析の ために取り出した。両カルチャーは、菌糸体ボールの濃密な成長を示し、そして そのカルチャー・マスは、約40〜60％の芽胞子（blastospores）（T.biformeに ついて約40％、そしてS.communeについて50〜60％）を含むことも示された。両 生成物は、接種物として使用され、又は接種物形態を作るための様々な方法、例 えば、その後の使用のために均質化及び冷凍することにより、加工されることが できる。このカルチャーの胞子含量に本質的に基く接種物を凍結乾燥により調製 することもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イバーソン，サラ アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02173，レキシントン，チェイス アベニ ュ 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．パルプ材又はその元のリグニン含量の少なくとも60重量％を保持している パルプのピッチ含量を減少させる方法であって、そのパルプ材又はパルプに、シ ゾフィラム・コミュン（Schizophyllum commune）、トリチャプタム・ビフォル メ（Trichaptum biforme）及びファネロカエテ・ギガンテア（Phanerochaete gi gantea ）から成る群から選ばれる１以上の菌を含んで成る１以上の接種物を適用 し、そしてその菌の成長を促進するのに有効な環境的条件を維持することを含ん で成る方法。 ２．接種物が、パルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させるために、その接 種物から生じる菌の成長に対して十分な量にあり、そしてその接種されたパルプ 材又はパルプが、このように接種された菌の成長により、そのパルプ材又はパル プのピッチ含量の減少を遂げるのに十分な時間にわたり、その接種からの菌の成 長を許容する条件下で維持されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．接種物が、ファネロカエテ・ギガンテア（Phanerochaete gigantea）を含 んで成る、請求項１又は請求項２に記載の方法。 ４．全て又は優勢に菌糸体から成る接種物について、100グラムのパルプ材又 はパルプ当り0.5〜10グラムの菌糸体を、全て又は優勢に胞子から成る接種物に ついて、１キログラムのパルプ材又はパルプ当り10⁶〜10¹⁰CFUを、適用し、そし て10〜40℃において３〜40日間維持することを特徴とする、先の請求項のいずれ かに記載の方法。 ５．全て又は優勢に菌糸体から成る接種物について、100グラムのパルプ材又 はパルプ当り１〜５グラムの菌糸体を、そして全て又は優勢に胞子から成る接種 物について、１キログラムのパルプ材又 はパルプ当り10⁷〜10⁹CFUを、適用し、そして22〜28℃において４〜20日間維持 することを特徴とする、先の請求項のいずれかに記載の方法。 ６．非滅菌パルプ材を、そのピッチ含量を減少させるために接種する、先の請 求項のいずれかに記載の方法。 ７．パルプ材が、マスにおいて堆積される非滅菌の精製パルプ材であり、そし てその堆積されたマスが、22〜28℃において４〜30日間維持される、先の請求項 のいずれかに記載の方法。 ８．パルプ材が、木チップであり、そして接種物が、マスにおけるその木チッ プの堆積に先立つその接種物によるその木チップのスプレーにより適用される、 先の請求項のいずれかに記載の方法。 ９．接種物が、生物学的に純粋な菌カルチャーから得られる、先の請求項のい ずれかに記載の方法。 10．菌が、NRRL寄託番号第21056号、NRRL寄託番号第21055号及び／又はNRRL寄 託番号第21054号の株により所有されているような、非滅菌Southern Yellow Pin e及びAspen上でピッチを減少し、そして増殖する能力を少なくとももつ、それぞ れ、シゾフィラム・コミュン（Schizophyllum commune）、トリチャプタム・ビ フォルメ（Trichaptum biforme）及び／又はファネロカエテ・ギガンテア（Phan erochaete gigantea ）である、先の請求項のいずれかに記載の方法。 11．パルプ材又はパルプをそのピッチ含量を減少させるために処理するための 、シゾフィラム・コミュン（Schizophyllum commune）、トリチャプタム・ビフ ォルメ（Trichaptum biforme）及び／又はファネロカエテ・ギガンテア（Phaner ochaete gigantea ）の使用。