JPH08510063A

JPH08510063A - リコンビナントタンパクおよび合成ペプチド試薬を用いるｈｉｖイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH08510063A
Application number: JP7522932A
Authority: JP
Inventors: ギヤラーダ，ジエイムズ・エル; ストーン，バーバラ・エル; リユー，ダグラス・ジエイ; ハーリントン，スーザン・ケイ; ドーソン，ジヨージ・ジエイ; ウー，ピン
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-03-02
Filing date: 1995-02-21
Publication date: 1996-10-22
Also published as: WO1995023973A2; CA2161872A1; EP0698214A1; WO1995023973A3; AU1880995A

Abstract

(57)【要約】検査試料中のＨＩＶ−１抗体および／またはＨＩＶ−２抗体の存在を同時に検知するアッセイが開示されている。分析対象物は同一または異なる固相に捕捉され、この分析対象物の存在は、合成及び組換え抗原含有指示試薬の混合物を用いて発生させた信号を検出することによって決定される。

Description

【発明の詳細な説明】リコンビナントタンパクおよび合成ペプチド試薬を用いるＨＩＶイムノアッセイ本願は１９９２年４月９日出願の米国特許出願第０７／８６６，３８０号の一部継続出願であり、その出願は１９９１年１１月４日出願の米国特許出願第０７／７８７，７１０号の一部継続出願であり、その出願は１９８９年６月２日出願の米国特許出願第０７／３６１，７３３号の継続出願（放棄）であり、その出願は１９８９年３月９日出願の米国特許出願第０７／３２０，８８２号の一部継続出願（放棄）であり、その出願は１９８７年２月２７日出願の米国特許出願第０７／０２０，２８２号の継続出願（放棄）であり、その出願は１９８５年１２月２０日出願の米国特許出願第０６／８１１，２４０号の一部継続出願（放棄）であり、これらはすべて同一人の所有になるもので、これらの内容を明細書の一部としてここに援用する。発明の技術分野本発明はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびイムノアッセイに関する。特に、本発明は検査試料中のＨＩＶ−１抗原および／またはＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体の同時検出のためのイムノアッセイおよび試薬に関するものである。発明の背景後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は米国ならびにヨーロッパや中央アフリカで流行病比率に到達している日和見感染および／または新生物に関連する免疫系の疾患である。疫学的なデータではＡＩＤＳは、ＨＩＶと総称されている少なくとも２つのタイプのヒト免疫不全ウイルスによって引き起こされるものであることが示唆されている。ＨＩＶタイプ１（ＨＩＶ−１）はＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）の患者、ならびにＡＩＤＳの可能性の高い健常者から単離されている。たとえば、エフ．バール−シヌーシ（F．Barre-Sinoussi）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２０：８６８−８７１、９１９８３）；エム．ポポビック（M ．Popovic）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：４９７−５００（１９８４）、およびアール．シー．ガロ（R.C．Gallo）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：５００−５０３（１９８４）参照。ＨＩＶ−１は性的接触、血液およびある種の血液製品への曝露によって、あるいは感染した母から彼女の胎児または子供へ感染する。ピー．ピオット（P．Piot）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：５７３−５７９（１９８８）。ＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者およびＡＩＤＳの危険性がある人におけるＨＩＶ−１抗体の出現率は高く、そのウイルスは血清反応陽性の個体のほぼ９０％から単離され得る。たとえば、エム．ジー．サルンガドハラン（M．G．Sarngadharan）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：５０６−５０８（１９８４）；およびディー．ガロ（D．Gallo）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２５：１２９１−１２９４（１９８７）参照。１９８６年に２番目のヒト免疫不全ウイルスである、ＨＩＶ−２が西アフリカのＡＩＤＳ患者から単離された。エフ．クラベル（F．Clavel）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：３４３−３４６（１９８６）。ＨＩＶ−２感染はまた西アフリカ以外の数か国の個人においても同定されている。たとえば、エー．ジー．サイモット（A.G．Saimot）ら、Ｌａｎｃｅｔｉ：６８８（１９８７）；エム，エー．レイ（M.A．Rey）ら、Ｌａｎｃｅｔｉ：３８８−３８９（１９８６）；エー．ワーナー（A．Werner）ら、Ｌａｎｃｅｔｉ：８６８−８６９（１９８７）；ジー．ブルッカー（G．Brucker）ら、ＡＩＤＳ２：１４１（１９８８）；およびケイ．マーコート（K．Marquart）ら、ＡＩＤＳ２：１４１（１９８８）参照。現在はＨＩＶ−２は西アフリカに限られた風土病のように見受けられるが、ＨＩＶ−１の経験からするとＨＩＶ−２は世界の他の地域へも広がるであろう。ＨＩＶ−２ウイルスは、その形態学的様相、細胞向性、ＣＤ４細胞受容体との相互作用、ＣＤ４細胞に対するインビトロの細胞変性作用、全体的なゲノム構造およびＡＩＤＳを引き起こす能力においてＨＩＶ−１ウイルスと類似している。エフ．クラベル（F．Clavel）ら、ＡＩＤＳ１：１３５−１４０（１９８７）。しかしながら、ＨＩＶ−２はいくつかの点においてＨＩＶ−１とは異なる。エフ．クラベル（F．Clavel）、同上およびアール．エー．ワイス（R.A．Weiss）ら、ＡＩＤＳ２：９５−１００（１９８８）参照。血清学的試験の結果によると、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパクの交差反応性は非常に低いが、それらの核抗原は多くの共通エピトープを有している。エフ．クラベル（F．Clavel）、前掲。このエンベロープ抗原の交差反応性の低さが、現在ＨＩＶ−１用に適用可能な血清学的アッセイのほとんどがＨＩＶ−２に対する抗体を有する個体の血清と反応しないことの原因となっているのであろう。エフ．デニス（F．Denis）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２６：１０００−１００４（１９８８）。最近アボットラボラトリーズ（Abbott Laboratories；イリノイ州６００６４、アボットパーク）から入手できるようになった、ＡｂｂｏｔｔＨＩＶＡＢ（登録商標）ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡと呼ばれるＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２抗体に対する市販のアッセイ法は、ＨＩＶ−１エンベロープおよびＨＩＶ−２エンベロープの２つのウイルス性タンパク質に対応するリコンビナント抗原を使用している。これらのリコンビナント抗原の使用によって、抗ＨＩＶ−１および／または抗ＨＩＶ−２を含む検査試料での検出が改善され、一方で主としてウイルス全体またはウイルス溶解産物との交差反応のために引き起こされる非特異的な反応を抑えることができるようになった。検査試料中のＨＩＶ抗体を検出するために少なくとも１つのリコンビナントＨＩＶタンパクを標識リコンビナントＨＩＶ抗原とともに使用する方法についてはすでに親特許出願に記載しており、この内容を明細書の一部として援用する。ヒト血清中のＨＩＶウイルスに対する抗体の存在を検出するためのイムノアッセイとして、ウイルスの複製可能な細胞系から得られる不活性化ウイルス全体を抗原試薬として使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）については以前に記述した。それに続くＨＩＶ用イムノアッセイとしては、リコンビナントＤＮＡ法によって得られるポリペプチド配列を使用する方法が記述されている。カブラディーヤ（Cabradilla）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１２８−１３３（１９８５）参照。しかし以前紹介されているこれらのイムノアッセイは感度と特異性が低く、ウイルスを含んだ血液製剤等の試験検体が検出もれとなりかねず、したがってそうした血液製剤などを受け入れた患者に潜在的な感染の危険性をもたらす。そうしたイムノアッセイにおける特異性の欠如（すなわち、疑似陽性）は、大抵ウイルス溶解産物中の細胞タンパクに対する免疫グロブリンの非特異性結合によるためであり、あるいはリコンビナント抗原の場合は、ＡＩＤＳに関係のないウイルスとの共通エピトープによってこの特異性欠如が引き起こされるものと考えられる。たとえば、ガラハー（Gallahar）、Ｃｅｌｌ５０：３２７−３２８（１９８７）はＨＩＶ−１ｇｐ４１領域は、ＲＳウイルスおよび麻疹ウイルスのＦ１糖タンパクと抗原性領域が共通であることを報告している。したがって、いかに高度に精製されたリコンビナントＨＩＶポリペプチドであっても潜在的に疑似陽性の原因となりうるのである。どちらのケースにおいても、そのような疑似陽性はＡＩＤＳの誤診を招くことになる。ウイルスゲノムのヌクレオチド分析に基づくと、ＨＩＶゲノムＲＮＡは下記をコードしている（５’末端から始まる）：（ｉ）ヌクレオチド３１０から１８６９までの間にあって内部構造核または最も抗原性の高い核タンパクであるｐ２４を含むヌクレオカプシドタンパクをコードするｇａｇ遺伝子；（ii）ヌクレオチド１６２９から４６７３までの間にあって逆転写酵素をコードするｐｏｌ遺伝子；および（iii）ヌクレオチド５７８１から８３６９までの間にあって最も抗原性の高いエンベロープタンパクであるｇｐ４１を含むエンベロープ糖タンパクをコードするｅｎｖ遺伝子。ラトナー（Ratner）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７−２８４（１９８５）。今日の医学界が直面している課題の１つは血液製剤のＨＩＶ汚染の防御である。このＨＩＶによる汚染は血液製剤（ならびにその他のヒト体液）において発見されており、供給血液の中にも伝播していることが報じられている。今日までのところ、ガロ（Gallo）らの米国特許第４，５２０，１１３号に記載されているアッセイを含め、いくつかのアッセイが適用可能となっている。また、ＨＩＶ抗原またはＨＩＶ抗体を検出することができるその他のアッセイも知られている。それらのアッセイには、上に記載すると共に本明細書の一部として引用した特許出願に記述されている抗ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２アッセイの開示、ならびにディー．ポール（D．Paul）に対する米国特許第４，７４８，１１０号、ジェイ．スチュワート（J．Stewart）らの米国特許第４，９８３，５２９号、および米国特許出願第０７／２０４，７９８号などの開示を含み、これらはすべて同一人の所有になるもので、ここにこれらすべてを明細書の一部として援用する。しかしながら、現在知られているＨＩＶ抗原の分析対象物またはＨＩＶ抗体の分析対象物を検出するための連邦承認のアッセイはすべて、検査試料中のＨＩＶ抗原分析対象物またはＨＩＶ抗体分析対象物のいずれかを個別に検出することができるだけである。市販され、かつ連邦承認のアッセイとしては、検査試料を使用する１回の検定でＨＩＶ抗原の分析対象物および／またはＨＩＶ抗体の分析対象物の両方を検出する方法はない。検査試料中の一以上の分析対象物を検出するには、通常別々の検定でそれぞれの分析対象物を個別に検出する方法がとられる。そのような検出法の方が好まれているが、これは試験しようとするそれぞれの分析対象物に対して厳格な品質保証を定めうるためである。医学の進歩により多くの疾患や臨床用に新しいマーカーが認められるようになり、またこれらのマーカーを臨床試験で使用する要求も高まっている。検査ラボでは一方でコスト削減に取り組みながら、タイムリーに提供しなければならない検査件数が増大するという問題を抱えている。たとえば、血液銀行では検査要求件数が劇的に増加しているが、これはドナー血液中におけるこれら検査薬の存在を調べたりあるいはこれらの検査薬に曝露するために、検査ラボで試験する検査薬パネルにヒトＴ白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ＨＩＶおよび肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）が加わったためである。検査の要求件数の増加による検査ラボの作業量を減らすために考えられる１つの解決策、特に血液銀行における解決策はアッセイを組み合わせる方法を考え出すことである。しかしながら、個々の性能標準を低下させることなくアッセイを組み合わせることは難しく、さらに重要なこととして製造および品質管理にまつわる問題に越えがたい難しさがある。１つの検査試料中の一以上の分析対象物を同時に検出するアッセイは有利であると考えられる。なぜなら、検査試料中の一以上の分析対象物を検出するのに必要な時間が大幅に減少し、そのような試験を行うのに必要な分析時間、試薬類、試験設備が少なくなることから、１回の試験コストが低くなるであろうからである。たとえば、フリドレンダー（Fridlender）らの米国特許第４，３１５，９０７号は異種特異結合アッセイシステムを教示しており、そこでは自由種（free−sp ecies）の形態の標識試薬から結合種（bound-species）が分離される。ザーフラドニク（Zahradnik）らの米国特許第４，３７８，３４４号および欧州特許第０２７００８号は、各分析対象物の存在を決定するための容器と挿入物を包含した固相器具を教示しており、これによると各分析対象物の存在が特許請求の範囲に記載されている試験法によって決定される。英国特許第２１８８４１８号は反応ウェルを有するアッセイトレイ組立て体を教示している。各ウェルは上面に開口部を有すると共に中に向かって突起物が延びており、各ウェルの側壁の内側表面と各突起物の外側表面を同時にインキュベートすることによってあらかじめ反応ウェルに導入された試験片中に存在する２以上の特定の物質を検出するものである。出願人イデックスコーポレーション（IDEXX Corportion）のＥＰＡ第０３５１２４８号は、一つの結合対中の抗原および／または抗体が検出できるネコウイルスまたはＨＩＶ用の同時イムノアッセイを開示している。また、パプシデーロ（Papsidero）の米国特許第５，０３９，６０４号は、２つの異なる抗原を加え、次いでこの２つの抗原と反応する１つの標識抗体を加えることにより、ＨＴＬＶまたはＨＩＶ抗体の２つを同時に検出するイムノアッセイを教示している。さらに、コートライト（Kortright）らの米国特許第４，８７０，００３号は、不活性化された抗原による抗原“スパイク”を利用して、一つの結合対中の抗原および／または抗体を検出するための固相イムノアッセイを開示している。また、２以上の固相を使用して１以上の分析対象物を検出するというのが、同時係属出願の米国特許出願第５７４，８２１号の主題であり、これは同一人の所有になるもので、明細書の一部としてここに援用する。同時アッセイの開発成功のための要因として確認されている事項として、同時に実施される二つのアッセイは同じサンプル量で、同一のインキュベーション時間、同一のカットオフ値でなければならないということがある。こうした同時アッセイはまた、このイムノアッセイの感度、特異性および再現性を確保するために、製造業者およびこの試験法を利用する検査ラボの両方において、それぞれの分析対象物に対して個別に品質が管理できるものでなければならない。したがって、一以上のＨＩＶ分析対象物、すなわちＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗体または抗原の存在を同時に検出でき、しかも個々の検出されるべき別個の分析対象物を個々に品質管理しうるアッセイを提供することは意義のあることであろう。このようなアッセイは他の既知のアッセイに比べて改良されたものであろう。なぜならばこうしたアッセイではＨＩＶ抗原分析対象物および／またはＨＩＶ抗体分析対象物の存在の同時測定を１つの容器で行うことができ、一以上の固相を利用する場合でも固相成分の分離が必要とされず、またこのアッセイでは同時アッセイで検出すべき個々の分析対象物を品質管理することができるからである。その上、ＨＩＶウイルスのユニークかつ高度に保存されたエピトープを有する合成ＨＩＶ抗原を使用する診断アッセイを提供できれば有利であろう。そのような合成ＨＩＶ抗原はそれらを比較的容易かつ低コストで調製することができること、そしてさらに重要なことは、不純物やＡＩＤＳに関係ないウイルスタンパクの共通エピトープが存在することによって疑似陽性がもたらされる危険を低下させるという点で便利である。発明の要旨本発明は、検査試料を一以上の固相材料に固定化した（ａ）ＨＩＶ−２ｇｐ３６ｅｎｖ、（ｂ）ＨＩＶ−１ｇｐ４１ｅｎｖ、および（ｃ）ＨＩＶ−１ｐ２４ｇａｇのリコンビナント抗原（以下“捕捉試薬”という）と接触させて第１の混合液を得る段階を包含する、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のイムノアッセイを提供する。この第１混合液を、ＨＩＶｅｎｖ抗体／リコンビナント抗原複合体、およびＨＩＶｇａｇ抗体／リコンビナント抗原複合体を形成するために充分な時間と条件でインキュベートし、こうして得られた複合体を（ａ）信号発生化合物で標識した合成の抗原性部位指向ＨＩＶ−２ｅｎｖ抗原を含有する改良指示試薬、（ｂ）信号発生化合物で標識付けされたリコンビナントＨＩＶｅｎｖ抗原、および（ｃ）信号発生化合物で標識されたリコンビナントＨＩＶｇａｇ抗原と接触させて第２の混合液を形成する。この第２の混合液を、ＨＩＶ抗体／捕捉試薬／指示試薬複合体を形成するのに充分な時間と条件でインキュベートする。検査試料中のＨＩＶ−１ｅｎｖ抗体、ＨＩＶ−２ｅｎｖ抗体、および／またはＨＩＶｇａｇ抗体の存在は、これらの複合体が発生する合計信号量で決定される。本発明によるアッセイの改良された感度は、ＨＩＶ−２の一免疫支配領域ｇｐ３６の免疫反応特異性を有する合成の部位指向ＨＩＶｅｎｖ抗原を含有する少なくとも１つの指示試薬を使用する場合に認められる。特に本発明は期せずして、本発明のアッセイにＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドを使用した場合、リコンビナント抗原だけを使用するＨＩＶイムノアッセイに比べて、著しくＨＩＶ− ２疑似陽性の頻度を減少させるということを発見したのである。本発明のアッセイを実施するための試験キットもまた提供されている。発明の詳細な説明アッセイ方式検査試料中のＨＩＶ抗原分析対象物および／またはＨＩＶ−１およびＨＩＶ− ２抗体分析対象物の本発明による検出は、公知の種々の同種または異種アッセイ方式を使用し上述のような種々の試薬を加えて同時にまたは順次に行うことができる。本発明のアッセイは好ましくはイムノアッセイ方式で行うが、必ずしも免疫反応アッセイに限定されるものではない。たとえば、特異結合物質を使用するアッセイも可能である。ここで使用している“特異結合物質”とは特異結合対の一メンバー物質のことである。すなわち、２つの異なる分子中の一方の分子が化学的または物理的手段によって第２の分子に特異的に結合するものである。したがって、通常のイムノアッセイにおける抗原と抗体という特異結合対に加えて、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補ヌクレオチド配列、エフェクターとレセプター分子、コファクターと酵素、酵素阻害剤と酵素など、その他の特異結合対も含まれる。さらに、特異結合対にはもとの特異結合物質のアナログ、たとえば分析対象物のアナログも含めることができる。免疫反応特異結合物質には抗原、抗原フラグメント；モノクローナルおよびポリクローナル両方の抗体および抗体フラグメント；およびリコンビナントＤＮＡ法で形成されるものも含むそれらの複合体がある。ここで使用する“分析対象物”とは、検査試料中に存在する可能性があって、検出しようとする物質のことである。天然の特異結合物質（たとえば抗体）が存在するものであれば何でも、あるいはそれに対して特異結合物質を調製することができるものは何でも分析対象物たりうる。よって、分析対象物とはアッセイ中に一以上の特異結合物質に結合しうる物質ということである。“分析対象物”にはまた、抗原性の物質、ハプテン、抗体、およびこれらが組み合わされた物などもすべて含まれる。特異結合対の一方の物質として分析対象物は、たとえばビタミンＢ１２測定用の捕捉および／または指示試薬における内因性因子タンパクの使用、あるいは炭水化物測定用の捕捉および／または指示試薬におけるレクチンの使用のように、天然の特異結合パートナー（対）を使用することによって検出することができる。分析対象物にはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的ならびに不法な目的で投与されるものを含む薬物、バクテリア、ウイルス、および上記物質の代謝産物やそれらに対する抗体などが含まれる。検査試料としては哺乳類の生体液を使用することができ、全血および全血成分、すなわち赤血球、リンパ球またはリンパ球サブセット調製剤を含む白血球、血小板、血清および血漿；腹水；唾液；大便；髄液；尿；痰；気管吸引液および検出しようとする分析対象物を含んでいるか、含んでいると疑われる身体のその他の構成物質である。検査試料はまた、培養上清、あるいは培養細胞の懸濁液でもよい。本発明に基づいて体液中のＨＩＶ抗原分析対象物またはＨＩＶ抗体分析対象物を検定できる哺乳類としては、これら分析対象物を所有していると疑われるヒトおよび霊長類、ならびにその他の哺乳類が含まれる。非生体液サンプルの利用もまた本発明の範疇に含まれる。本発明の方法はサンドイッチ法および競合アッセイ方式の両方を含む固相異種結合アッセイで有利に使用することができる。異種結合アッセイ技法では固相材料を使用するが、これに結合反応のメンバー物質が結合されることになる。検査試料中の分析対象物の存在や量を示す標識の検出に先だって、固相を反応混合液から除去することによって、固定化された反応成分を余剰のサンプルおよびアッセイ試薬から分離する。固相サンドイッチアッセイにおいては、下記のように規定される捕捉試薬は通常、固相材料に予め結合させた捕捉用結合物質を含んでいる。たとえば、特異結合物質を検査試料中の抗原分析対象物に結合する固定化抗体とすることができ、あるいは検査試料中の抗体分析対象物に結合する固定化抗原とすることもできる。この捕捉試薬を分析対象物を含むと思われる検査試料と接触させ、かつ標識された第２の特異結合物質を包含する指示試薬、たとえば標識された抗−分析対象抗体または標識された抗原に接触させる。試薬類は単独または組み合わせたものを同時に混合してもよいし、順次加えてもよい。結合反応によって捕捉試薬／分析対象物／指示試薬の複合体が形成される。このアッセイにはまたこの生成複合体を余剰の試薬および検査試料から分離する段階を包含するようにしてもよい。固相材料の上に保持された複合体は固相上の指示試薬を検査することによって検出することができる。もしサンプル中に分析対象物が存在すれば、標識が固相上に存在することになる。固相上に付着した標識の量はサンプル中の分析対象物の量に直接比例したものとなる。本発明のアッセイは正（forward）、逆（reverse）、または同時（simultaneo us）手法を含むいずれのサンドイッチアッセイ方式でも行うことができる。典型的には、正アッセイの場合は検査試料を捕捉試薬に接触させた後、インキュベーション期間をおき、指示試薬を加える。逆アッセイの場合は指示試薬を検査試料に加えた後、インキュベーション期間をおいて捕捉試薬を加える。同時アッセイの場合は、捕捉試薬と指示試薬を同時に検査試料に接触させるので１回のインキュベーション段階だけとなる。メンバー物質本発明の抗原を使用して競合アッセイを行うこともできる。固相競合アッセイにおいては、捕捉試薬は典型的にはまたも予め固相材料に付着させた捕捉結合メンバー物質を含み、検査試料および指示試薬の両方に接触させる。ただし、指示試薬は、標識を接合した分析対象物または分析対象物アナログから形成したものとすることもできる。結合反応が起こるとその結果、（１）固定化された捕捉試薬／分析対象物複合体、および（２）固定化された捕捉試薬／指示試薬複合体が生成される。あるいは、固定化された特異結合メンバー物質を分析対象物または分析対象物アナログとして、これと検査試料中の分析対象物が指示試薬への結合で競合するようにすることもできる。競合アッセイにおいては、固相上に捕えられた標識の量はサンプル中の分析対象物の量に反比例したものとなる。したがって、陽性の検査試料が発生する信号量は少なくなる。これらの結合アッセイにおいて、検査試料中の分析対象物の存在又は量は通常固相上に捕えられた標識の存在又は量を検出することによって決定することができるが、遊離または結合されなかった指示試薬の量を検出することによっても可能である。競合アッセイにおいては、検査試料中の分析対象物が多いほど、固相上の標識の量は少なくなる。サンドイッチアッセイにおいては、検査試料中の分析対象物が多いほど、固相上の標識の量は多くなる。指示試薬本発明の指示試薬は、各分析対象物のための特異結合メンバー物質を信号発生化合物（標識）に接合したものを包含している。各指示試薬は検査試料中の分析対象物の量に関連したレベルの検出可能な信号を発生する。好ましい実施態様においては、各指示試薬は異なる分析対象物に対する特異結合メンバー物質を包含し、それが検出可能な信号を発生する能力を有する同一の信号発生化合物に接合される。一般的には、この指示試薬は捕捉試薬に捕捉された後で検出または測定される。本発明においては、指示試薬により発生される合計信号量が検査試料中に一以上の分析対象物が存在することを示す。本発明を実施する場合には異なる信号発生化合物を使用することもできるようになっている。したがって、たとえば信号発生化合物として、各指示試薬ごとに異なった蛍光化合物を使用することが可能で、それらを異なった波長で読み取ることによって検出することができる。あるいは、アクリジニウムまたはフェナントリンジウム化合物のような短寿命の化学発光化合物、およびジオキセタンのような長寿命の化学発光化合物を、異なる分析対象物について異なる時間で信号を発生させるために使用することができる。異なる時間で信号を発生することができる二以上の化学発光化合物を使用する具体的な方法は、同一人の所有になる同時係属出願の米国特許出願第６３６，０３８号の主題であり、ここにこれを明細書の一部として援用する。アクリジニウムおよびフェナントリンジウム化合物については、同一人による１９８９年６月２３日出願の同時係属の米国特許出願第０７／２７１，７６３号に記述しており、これを明細書の一部として援用する。指示試薬の特異結合メンバー物質は、特異結合物質対の中の抗原メンバーまたは抗体メンバーのいずれかであることに加えて、ビオチンまたはアビジン、炭水化物またはレクチン、相補ヌクレオチド配列、エフェクターまたはレセプター分子、酵素コファクターまたは酵素、酵素阻害剤または酵素のいずれかなど、どのような特異結合対のメンバー物質であってもよい。免疫反応性特異結合メンバー物質は抗体、抗原、または抗原／抗体複合体であって、サンドイッチアッセイの場合のように分析対象物に結合するか、競合アッセイの場合のように捕捉試薬に結合するか、あるいは間接アッセイの場合のように副特異結合メンバー物質に結合する能力のあるものであればよい。もし抗体を使用する場合、この抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、リコンビナント抗体、それらの混合物、または抗体とその他の特異結合メンバー物質の混合物とすることができる。そうした抗体の調製および特異結合メンバー物質としてのそれらの適性の詳細は当業者には周知の事項である。好ましい実施態様において、指示試薬の抗原はＨＩＶ−１の核およびｅｎｖタンパクの免疫支配領域、及びＨＩＶ−２のｅｎｖ領域に結合できる合成またはリコンビナント法により製造された抗原である。一実施態様においては、ＨＩＶ− ２の指示試薬に用いられる抗原はＨＩＶ−２のｇｐ３６の免疫支配領域に対応する合成的に生産されたペプチドであり、ＨＩＶ−２により誘発される抗体と免疫反応する能力によって特性付けされる。この合成ペプチドは長さが約１０アミノ酸から約５０アミノ酸長の範囲で、−ＣＡＦＲＱＶＣ−のアミノ酸残基配列を含むものである。好ましい合成ペプチドは下記のものであるが、これに限定されない：本発明のペプチドはＣＡＦＲＱＶＣまたはそのホモローグを含み、ＨＩＶ−２によって誘発される抗体に結合できるものであれば、必ずしも上述の特定のアミノ酸配列と同一である必要はないということを理解しておくべきである。さらに、本発明の合成ペプチドは挿入や削除、および本質的に保存性であれ非保存性のものであれ、１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換など、種々の変更を加えることが可能である。本発明のペプチドは好ましくは従来の固相合成法により調製する。しかし、その他当分野で公知のペプチド合成法を使用してもよい。樹脂製支持体は従来ペプチドの固相調製に当業界で従来採用されている適当な樹脂であればいずれのものでもよいが、好ましくはｐ−メチルベンジルオキシアルコールポリスチレンおよびｐ−メチルベンジルアミン樹脂である。第１の保護アミノ酸を樹脂支持体に結合させた後、固相ペプチド合成の分野で従来使用されている標準的な方法でアミノ保護基を除去する。アミノ保護基を除去した後、残っているαアミノ保護、およびもし必要ならば、側鎖保護アミノ酸を、製品を得るために望ましい順序で順次カップリングさせる。適当なカップリング試薬の選定は、当分野の確立された方法に基づいて行う。たとえば、適当なカップリング試薬はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドまたはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を単独または好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で使用するものである。他の有用なカップリング手順は保護アミノ酸の対称無水物を使用して行うものである。本発明の環状ペプチドは、ペプチド合成の分野で一般的に知られている手法により、保護または非保護ＳＨ基をジスルフィド結合に直接酸化変換することにより調製される。好ましい方法は遊離のＳＨ基をフェリシアン化カリウムにより直接酸化するものである。このような環状ペプチドはＨＩＶ抗体への結合に役立つ堅固な構造を与えるものと考えられている。指示試薬の標識は外部手段によって検出できる測定可能な信号を発生する能力のあるものである。本発明の範囲に入る標識は、これらに限定されるものではないが、色素原；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびβガラクトシダーゼなどの酵素のような触媒；フルオレセインおよびローダミンのような発光化合物；アクリジニウム化合物、フェナントリジニウム化合物およびジオキセタン化合物のような化学発光化合物；放射性元素；および直接可視標識などが含まれる。特定の標識を選定することは決定的に重要なことではないが、それ自身であるいは一以上の追加メンバー物質と共同して信号を発生させる能力のあるものでなければならない。標識もしくは特異結合メンバー物質を変更することによって種々異なる指示試薬を生成することができる。捕捉試薬本発明の捕捉試薬は、少なくとも１つの固相に標識を付けない状態で付着させた、検出しようとする分析対象物のそれぞれに特異的に結合するメンバー物質を包含する。捕捉試薬はサンドイッチアッセイの場合は分析対象物に特異的であるが、競合アッセイの場合は指示試薬または分析対象物に特異的なものとし、あるいは間接アッセイの場合はそれ自体が分析対象物に特異的な副特異結合メンバー物質に対して特異的なものとする。捕捉試薬はアッセイの実行前あるいはアッセイの実行中に直接または間接的に固相材料に結合できるものとし、それによって固定化された複合体を検査試料から分離できるようにする。この付着は、たとえば特異結合メンバー物質を吸収または共有結合によって固相にコーティングすることによって行うことができる。コーティング方法およびその他の付着方法として公知のものは当業者には周知である。捕捉試薬の特異結合メンバー物質は他の分子に特異的に結合する能力のある分子であれば何でもよい。捕捉試薬の特異結合メンバー物質は、抗体、抗原、または抗体／抗原複合体のような免疫反応性の化合物とすることができる。もし抗体を使用する場合は、この抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、リコンビナント抗体、それらの混合物、または抗体とその他の特異結合メンバー物質の混合物とすることができる。 “固相”そのものは決定的に重要なものではなく、当分野に詳しい人であれば選定できる。ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性のビーズおよび微粒子、メンブラン、プラスチックチューブ、反応トレイのウェル壁、ガラスまたはシリコンチップおよびタンニン酸処理ヒツジ赤血球はすべて好適なものの例である。固相への捕捉試薬を固定化する方法にはイオン法、疎水法、共有相互反応法などがある。本発明の一例では、６０穴のポリスチレン反応トレイおよび１／４インチのポリスチレンビーズが使用され、一方別の実施例では９６穴の反応トレイが唯一の固相として使用されている。すべての固相は信号の定量期間中そのまま存在するようになっており、これにより信号検出のために固相を分離する必要を無くしている。ここで使用されているように“固相”は不溶性、または次段階の反応で不溶性となる材料を意味している。固相は捕捉試薬を付着し固定化させる本質的な能力によって選定することができる。あるいは代わりに、捕捉試薬を付着させ固定化させる能力を持ったレセプター（受容体）を追加して保持することができる固相としてもよい。この追加レセプターとしては捕捉試薬自体とは反対に荷電された電荷物質または捕捉試薬に接合された電荷物質がある。さらに別のものとしては、レセプター分子は固相上に固定化（付着）されて、特異結合反応により捕捉試薬を固定化する能力を有する特異結合メンバー物質であれば何でもよい。レセプター分子はアッセイの実行前またはアッセイの実行中に、捕捉試薬を固相材料に間接的に結合させる。したがって固相はプラスチック、誘導プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、微量滴定ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、および当分野の通常技術者に知られているその他の形状のものであればよい。本発明においては、固相はまた検出抗体が入り込むことができるような充分な空隙率と、抗原を結合するために適当な表面親和力を有する適当な多孔質材料を包含するものもその範囲に入る。微細多孔構造が一般的に好まれるが、水和状態でゲル構造となる材料もまた使用することができる。こうした有用な固相支持体としては、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル、特に硝酸およびカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、およびセルロースエーテルのような天然のポリマー性炭水化物およびそれらの合成による修飾物、架橋物または置換誘導体；架橋または修飾ゼラチンを含むタンパク質およびタンパク誘導体など含窒素天然ポリマー；ラテックスおよびゴムなどの天然炭化水素ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、およびその部分加水分解誘導体などのビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記の重縮合物のポリエステル、ポリアミドのような共重合物および三量体（terpolym er）、およびポリウレタン、またはポリエポキシドのようなその他のポリマー類などの合成ポリマー類であって好適な多孔構造物となしうる物；バリウムサルフェート、カルシウムサルフェート、カルシウムカーボネート、アルカリおよびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムの硅化物を含むアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫化物または炭化物のような多孔質の無機材料；および粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラス（これらの材料は上記の重合性材料とともにフィルターとして使われるであろう）のようなアルミニウムまたはシリコンの酸化物または水和物；および元来天然に存在する天然ポリマー基材の上に合成ポリマーを重合開始することによって得られるグラフト共重合物のような、上群の物質の混合体または共重合物、などであるがこれらに限定されない。これらの材料はすべてフィルム、シート、またはプレート状の適当な形で使われるか、または紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは繊維のような適当な不活性キャリアの上に被膜を作るか、結合させるか、または積層して使用される。ニトロセルロースの多孔質構造は、モノクローナル抗体を含めた種々の試薬に対して優れた吸収および吸着性能を有している。ナイロンもまた同様の特性を有しており、適当なものである。上述のような多孔質の固相支持体は好ましくは厚さ約０．０１から０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシート状で使用する。孔のサイズは広い制限範囲の中で種々のものがあるが、好ましくは約０．０２５から１５ミクロン、特に好ましくは約０．１５から１５ミクロンである。そうした支持体の表面は化学処理によって活性化され、これによって支持体に抗原または抗体を共有結合させる。抗原および抗体の不可逆的な結合は、一般的には、詳細不明の疎水力による多孔質材料への吸着によって得ることができる。通過方式のアッセイ装置に好ましい固相材料としては多孔質のファイバーグラス材料またはその他のファイバーマトリックス材料のようなフィルターペーパーがある。それらの材料の厚さは決定的なものではないが、主として検査試料の流動性などサンプルまたはアッセイしようとする分析対象物の特性に応じて適宜選択されるものである。固相の固有電荷を変化させたり強化するために、荷電物質を材料の上に直接被覆するか、または固相支持材料によって保持される微粒子の上に直接被覆することができる。あるいは、微粒子をカラムの中に保持するか、溶解試薬と検査試料の混合物中に懸濁するか、または粒子自体を固相支持材料で保持および固定化することによって微粒子を固相として用いることもできる。“保持および固定化する”とは、支持材料上または支持材料中の粒子が支持材料中の他のどこかに実質的に動くことができないという意味である。これらの粒子は当分野の熟練者が適当なタイプの粒状材料から選択することができるが、そうした材料としてはポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネートまたは類似の材料が挙げられる。粒子のサイズは決定的に重要ではないが、粒子の平均直径は使用されている支持材料の平均孔サイズより小さいことが望ましい。したがって、その他の各種固相を使用した実施態様も本発明の範疇に入るものである。たとえば、固定化可能な反応複合体を負に荷電したポリマーとともに固定化するイオン捕捉手法は本発明に基づいて迅速な液相免疫化学反応を実施するのに使用することができるが、これについては欧州特許公報第０３２０６１００号に対応する同時係属の米国特許出願第１５０，２７８号、および米国特許出願第３７５，０２９号（欧州特許公報第０４０６４７３号）に記述しており、これらは同一人の所有になるものでここに明細書の一部として援用する。固定化可能な免疫複合体を残りの反応混合物から、負に荷電したポリアニオン／免疫複合体と予め処理して正に荷電した多孔性マトリックスの間のイオン相互作用によって分離し、すでに記述した各種の信号発生システムによって検出する。この信号発生システムについては欧州特許公報第０２７３，１１５号に対応する併願の米国特許出願第９２１，９７９号に記載の化学発光信号測定法の記述が含まれるが、これは同一人の所有になるものでここに明細書の一部として援用する。また、本発明の方法は微粒子技術を利用した自動および半自動システムで固相に微粒子を包含したシステムにも応用することができる。そのようなシステムとしては出願中の米国特許願第４２５，６５１号および米国特許第５，０８９，４２４号に記載されているものがあり、これらはそれぞれ公開欧州特許出願ＥＰ第０４２５６３３号および第０４２４６３４号に対応する。更に、米国特許第５，００６，３０９号に記載されているものも挙げられる。これらはすべて同一人の所有になるものでここに明細書の一部として援用する。加えて、こうしたシステムとしてはまた１９９２年３月２７日出願の米国特許出願第０７／８５９，２１８号も挙げられ、これも同一人の所有になるもので、ここに明細書の一部として援用する。本発明の一実施態様においては、ＨＩＶ抗原分析対象物またはＨＩＶ抗体分析対象物のいずれかを含むと思われる検査試料を、第１の分析対象物に対する第１の特異結合メンバー物質を付着させた固相、および第２の分析対象物に対する第１の特異結合メンバー物質を付着させた固相に同時に接触させ、混合液を得る。この特異結合メンバー物質は（１つまたは複数の）分析対象物を固相に結合させる捕捉試薬の役割をする。この特異結合メンバー物質を免疫反応性物質とする場合、それは各分析対象物に特異性の抗体、抗原、またはそれらの複合体とすることができる。この特異結合メンバー物質を抗体とする場合、それらは各分析対象物に特異性のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、抗体フラグメント、リコンビナント抗体、ならびにそれらの混合物、または抗体とその他の特異結合メンバー物質の混合物とすることができる。この混合物を結合反応を起こさせるのに充分な時間と条件でインキュベートし、その結果もし検査試料中に第１の分析対象物が存在する場合には捕捉試薬／第１分析対象物複合体が、および／またはもし検査試料中に第２の分析対象物が存在する場合には捕捉試薬／第２分析対象物複合体が形成される。次に、それぞれの分析対象物に対する指示試薬をこの複合体に接触させる。第１分析対象物に対する指示試薬は、検出しようとする第１分析対象物に対して特異結合する物質を包含し、この物質はあらかじめ信号発生化合物で標識されている。第２分析対象物に対する指示試薬は、検出しようとする第２分析対象物に対して特異結合する物質を包含し、この物質は第１分析対象物のための指示試薬と同じ信号発生化合物であらかじめ標識されており、これによって第２の混合物を得る。この第２混合物を、捕捉試薬／第１分析対象物／指示試薬の複合体、および／または捕捉試薬／第２分析対象物／指示試薬の複合体を形成させるのに充分な時間と条件でインキュベートする。検査試料中に一以上の分析対象物が存在することの証として、固相上に形成された複合体が発する信号を検出することにより、いずれかの分析対象物が存在することが確定される。もし指示試薬に信号発生化合物（標識）として酵素を使用した場合、信号は目視または分光光度計により測定することができる。あるいは、信号を発生するために使用される標識の種類に応じて、蛍光、化学発光、放射エネルギー放出などを測定することにより標識を検知することができる。捕捉試薬は同一の固相に付着させることもできるし、また異なる固相に付着させることもできる。本発明ではすべての捕捉試薬を同一の固相に付着させることも、または各捕捉試薬を別々の固相に付着させることも、あるいは組み合わせた捕捉試薬を別々の固相に付着させることも考慮されている。たとえば、微粒子を固相に選んだ場合、個別の微粒子が少なくとも１つの捕捉試薬を付着することができる。検査試料中に存在する各種の分析対象物を捕捉するために、微粒子の混合体（固相）を使用することができる。そのようなアッセイの場合、（１つまたは複数の）分析対象物の検出を最適なものとするために、捕捉試薬を異なった割合で固相に付着させることも可能としている。上記の実施態様においては、分析対象物がＨＩＶ−１抗体の場合、捕捉試薬に使用する特異結合メンバー物質はＨＩＶ−１ｐ４１抗原が望ましく、また分析対象物がＨＩＶ−１抗原の場合、捕捉試薬に使用する特異結合メンバー物質は抗ＨＩＶ−１ｐ２４抗体が望ましい。最も望ましいのは、使用されるＨＩＶ−１ｐ４１がリコンビナントで調製された抗原（タンパク）であるものである。同じく、抗体分析対象物指示試薬のための特異結合メンバー物質は酵素で標識されたＨＩＶ−１ｐ４１抗原が望ましく、かつ抗原分析対象物指示試薬のための特異結合メンバー物質は酵素で標識された抗ＨＩＶ− １ｐ２４抗体が望ましい。最も望ましいのは、このＨＩＶ−１ｐ４１抗原がリコンビナントで調整されたものであり、酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）であるものである。本発明の別の実施態様においては、検出しようとするなんらかの分析対象物を含むと思われる検査試料を、第１の分析対象物に対する第１の特異結合メンバー物質と第２の分析対象物に対する第１の特異結合メンバー物質を付着させた第１固相、第１分析対象物に対して特異結合するあらかじめ信号発生化合物で標識された物質を含有する第１分析対象物に対する指示試薬、および第２分析対象物に対して特異結合するあらかじめ信号発生化合物で標識された物質を包含する第２分析対象物に対する指示試薬に同時に接触させ、混合液を得る。この特異結合メンバー物質は（１つまたは複数の）分析対象物を固相に結合させる捕捉試薬の役割をする。もしこの特異結合メンバー物質を免疫反応性物質とする場合、それらは各分析対象物に特異性の抗体、抗原、またはそれらの複合体とすることができる。もしこの特異結合メンバー物質を抗体とする場合、それらは各分析対象物に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体、抗体フラグメント、リコンビナント抗体、ならびにそれらの混合物、または抗体とその他の特異結合メンバー物質の混合物とすることができる。指示試薬は第１および第２の分析対象物に対する特異結合メンバー物質を含有し、あらかじめ信号発生化合物で標識されている。この混合物を結合反応を起こさせるのに充分な時間と条件でインキュベートし、その結果、もし検査試料中に第１および第２の分析対象物のいずれかまたは両方が存在する場合には捕捉試薬／第１分析対象物／第１分析対象物の指示試薬複合体、および／または捕捉試薬／第２分析対象物／第２分析対象物の指示試薬複合体が形成される。いずれかの分析対象物の存在は、一方又は両方の固相上に形成した複合体に関連して発生する信号を検出し、検査試料中の第１分析対象物および／または第２分析対象物の存在を示すものとして決定される。もし指示試薬に信号発生化合物（標識）として酵素を使用した場合、信号は目視または分光光度計により測定することができる。あるいは、信号を発生するために使用される標識の種類に応じて、蛍光、化学発光、放射エネルギー放出などを測定することにより標識を検知することができる。また、このアッセイではハプテン−抗ハプテンシステムを使用することもでき、この場合は指示試薬はさらにビオチンのようなハプテンを包含することができる。ビオチン／抗ビオチンシステムをアッセイに使用するのが同時係属の米国特許出願第６８７，７８５号の主題であり、これは欧州特許公報第０１６０９００号に対応（１９８５年１１月１３日発行）するもので、これらはすべて同一人の所有になるもので、ここに明細書の一部として援用する。上記の実施態様においては、分析対象物がＨＩＶ−１抗体の場合の捕捉試薬に使用する特異結合メンバー物質はＨＩＶ−１ｐ４１抗原が望ましく、また分析対象物がＨＩＶ−１抗原の場合の捕捉試薬に使用する特異結合メンバー物質は抗ＨＩＶ−１ｐ２４抗体が望ましい。最も望ましいのは、使用するＨＩＶ−１ｐ４１がリコンビナントにより調製された抗原（タンパク）であるものである。同じく、抗体分析対象物指示試薬のための特異結合メンバー物質は酵素で標識されたＨＩＶ −１ｐ４１抗原が望ましい。最も望ましいのは、このＨＩＶ−１ｐ４１抗原がリコンビナントで作られたものであり、酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）であるものである。望ましい固相としては、磁性または非磁性のビーズ、反応トレイのウェル、および微粒子の単独使用またはこれらの組合せ使用である。信頼性の高い結果を得るために、本発明のアッセイに陽性および陰性の対照を含めることができる。陰性の試薬対照として捕捉試薬を付着させないブランクの固相（１つまたは複数）を利用することができる。陽性対照としては、各分析対照物ごとに個別に試験した陽性対照、およびアッセイで検出しようとするすべての分析対照物を確認した組合わせの陽性対照も含まれる。前述のように、アッセイにはリコンビナントで調製した抗原または合成ペプチドを使用することが好ましい。しかしながら、本発明は上記のようなリコンビナントタンパク試薬および合成ペプチド試薬の組み合わせに限定されるものではなく、その他の組み合わせもその範疇に入る。たとえば、一以上あるいはすべての捕捉試薬タンパクは、標識試薬のタンパクと同様に、合成によって製造することができる。その上、本発明の標識ＨＩＶ−２合成ペプチド試薬を使用する場合には、特定の分析対象物のウイルス溶解物または分離物を使用することができる。ＨＩＶエンベロープ配列から導きだされたリコンビナントＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の診断試験における有用性がＨＩＶｇｐ４１またはＨＩＶｇｐ４１の部分の発現によって示されている。ウッド（Wood）ら、“ＲＮＡ腫瘍ウイルスに関するコールドスプリングハーバーシンポジウム”［ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、５月２２−２６日（１９８５）］；チャング（Chang）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：９０５−９０９（１９８５）；クロウル（Crowl）ら、Ｃｅｌｌ、４１：９７９−９８６（１９８５）：カブラディーヤ（Cabradilla）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：１２８−１３３（１９８６）。大腸菌またはその他の微生物中に発現されたウイルスタンパクが診断アッセイにおいて有用であることは周知のこととなっているが、これらの試薬を使用したイムノアッセイの開発、また細胞培養物から取り出された天然のウイルスタンパクと同じかまたはより強い特異性と感度を有するようなイムノアッセイの開発は困難な課題となっている。さらに、大腸菌の中のＨＩＶｇａｇタンパクの発現によって、ｒＤＮＡ技術によって製造されるＨＩＶｇａｇタンパクが診断有用性を持っていることを示している。ウッド（Wood）ら、“ＲＮＡ腫瘍ウイルスに関するコールドスプリングハーバーシンポジウム”、［ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、５月２２−２６日（１９８５）］；ダウベンコ（Dowbenko）ら、ＰＮＡＳＵＳＡ８２：７７４８−７７５２（１９８５）；グライエブ（Ghrayeb）ら、ＤＮＡ５：９３０９９（１９８６）；スタイマー（Steimer）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５０：２８３−２９０（１９８６）。本発明はリコンビナントにより製造されたＨＩＶエンベロープタンパクをアッセイ試薬として利用している。ＨＩＶゲノムのクローン化、ならびに大腸菌中でのＨＩＶエンベロープおよび核タンパクの発現、ｇｐ４１およびｐ２４の精製と特性付け、ならびにこれらのリコンビナントタンパクを利用した各種のアッセイ方式については１９８７年２月２７日出願の米国特許出願第０７／０２０，２８２号に記述しており、すでに明細書の一部として引用しているが、本発明の優先権はこれに基づく。即ち、ＨＩＶに感染したＨＴ−９細胞を採取し、全細胞性ＤＮＡを単離し消化させる。核タンパクおよびエンベロープ糖タンパクをコードするＤＮＡセグメントをさらに公知のリコンビナント技術を使用してバクテリア性発現ベクター中にサブクローン化する。米国特許出願第０７／０２０，２８２号もまた、ＨＩＶ−１抗体の検出において、捕捉試薬および指示試薬としてリコンビナント抗原を使用することによって異なる免疫グロブリンクラスの抗−ＨＩＶ−１抗体を検出できることを教示している。これらの免疫グロブリンのクラスにはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭが含まれる。ＡｂｂｏｔｔＨＩＶＡＢ（登録商標）ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡアッセイを使用して抗−ＨＩＶ−１ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡを検出する方法については、ジェイ．エル．ガラーダ（J.L．Gallarda）らのアブストラクト、“ＡＩＤＳ、肝炎およびその他の血液性疾患に関する第５回年次フォーラム”［ジョージア州、アトランタ、１９９２年３月２９日−４月１日］に記述がある。異種原料から産生されたリコンビナント抗原を本アッセイに利用することも本発明の範囲であり、これは疑似陽性をさらに大幅に減らすことにも貢献するであろう。たとえば、もし大腸菌から調製されたｐ４１のようなリコンビナント抗原を捕捉試薬として使用すると、大腸菌以外の適当な宿主、たとえば適当な酵母宿主またはＢ．メガテリウムのようなその他の適当な宿主などで産生されたリコンビナント抗原ｐ４１も使用することができる。アッセイでの異種原料の抗原の使用は、リコンビナント抗原の使用も含めて、同時係属の米国特許出願第０７／７０１，６２６号の主題であり、これは同一人の所有になるもので、ここに明細書の一部として援用する。さらに、本発明は好ましくはリコンビナントにより製造される抗原を利用するが、リコンビナントで製造される抗原の代わりに合成タンパクを利用することも本発明の範囲に充分含まれるものである。したがって、合成により調製される種々の長さのＨＩＶペプチドも使用することができる。本発明はまたＨＩＶ抗原分析対象物に特異的に結合する抗体も利用する。好ましい実施態様においては、抗−ＨＩＶｐ２４抗体が使用される。最も好ましい実施態様においては、モノクローナル抗体の混合物で、両方の抗体がＨＩＶｐ２４抗原に特異的な混合物が使用される。この混合物では、ＨＩＶ−１ｐ２４のエピトープに特異的に結合する一つのモノクローナル抗体（ただしこのエピトープにはヒト抗−ＨＩＶ−１ｐ２４ＩｇＧは競合的には結合しない）と、ＨＩＶ−１ｐ２４の別のエピトープに特異的に結合するもう１つのモノクローナル抗体（ただしこのエピトープにはヒト抗−ＨＩＶ −１ｐ２４ＩｇＧは競合的に結合する）が使用される。さらに、ヒト抗−ＨＩＶ−１ｐ２４ＩｇＧに競合的に結合しないモノクローナル抗体はＨＩＶ− １ｐ２４抗原には特異的に結合する。これらのモノクローナル抗体およびＨＩＶ抗原アッセイにおけるそれら抗体の使用が同時係属の米国特許出願第０７／２０４，７９８号の主題であり、これは同一人の所有になるもので、ここに明細書の一部として援用する。これらのモノクローナル抗体は３１−４２−１９および３１−９０−２５と命名されている。モノクローナル抗体３１−４２−１９を産生するハイブリドーマ細胞系３１−４２−１９はメリーランド州、ロックビル、パークローン通り、１２３０１所在のＡＴＣＣ（米国基準菌株収集所）に寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７２６が与えられている。モノクローナル抗体３１− ９０−２５を産生するハイブリドーマ細胞系３１−９０−２５はメリーランド州、ロックビル、パークローン通り、１２３０１所在のＡＴＣＣ（米国基準菌株収集所）に寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７２５が与えられている。これらのモノクローナル抗体をＨＩＶ抗原アッセイの抗体フラグメントとして使用する方法もまた米国特許第７，２０４，７９８号に記述しており、これも同一人の所有になるもので、ここに明細書の一部として援用する。本発明のアッセイでＨＩＶ−２抗原の検出が可能であり、これも本発明の範疇である。このアッセイ方式においては前述のＨＩＶ−１ｐ４１抗原捕捉試薬およびＨＩＶ−１抗体捕捉試薬に加えて、ＨＩＶ−２ｐ４１がＨＩＶ−２抗原捕捉試薬として固相に付着される。この場合の固相支持体はすべてのその他捕捉試薬が付着されるものと同じ固相支持体で、ＨＩＶ−１リコンビナント抗原が付着された固相支持体と同じものとすることができ、あるいは他の捕捉試薬が付着されていない（ＨＩＶ−２ｐ４１を除いて）固相とすることもできる。アッセイ手順は前述の本発明の種々の実施態様におけるものと同じである。ＨＩＶ−２抗体分析対象物指示試薬は検出可能なラベルに付着したＨＩＶ−２ｐ４１抗原を包含する。好ましい実施態様においてはリコンビナントにより調製されたＨＩＶ −２ｐ４１を利用するのが好ましい。ＨＩＶ−２ウイルス（ｐ４１抗原を含む）の配列は１９８９年１２月２０日にダイアゲン社（Diagen Cor p）のＥＰ第０３４７，３６５号に記述されており、これを明細書の一部としてここに援用する。最も好ましいＨＩＶ−２リコンビナント抗原は、ＨＩＶ−２ｐ４１抗原の最初の１０４のアミノ酸をコードするものである。こうして得られたｐＪＣ１０４と命名されたプラスミドはＣＫＳタンパクとの融合体としてＨＩＶ−２ｅｎｖタンパクを発現する。このプラスミドはＣＫＳタンパクの最初の２３９のアミノ酸、ｐＴＢ２１０Ｎの多重制限部位リンカーからの１３のアミノ酸、ＨＩＶ−２ｅｎｖタンパクからの１０４のアミノ酸（アミノ酸５０６−６０９）、およびｐＴＢ２１０Ｎの多重制限部位リンカーからの別の１５のアミノ酸を含むリコンビナントタンパクをコードするものであるが、これはボーリング（Bolling）およびマンデッキー（Mandecki）の開示による方法、即ち１９８８年３月１１日出願の米国特許出願第１６７，０６７号の“タンパク合成のＣＫＳ法”に基づくもので、これも同一人の所有になり、ここに明細書の一部として援用する。以下、本発明を実施例により説明するが、これらは説明のためのものであり、本発明の精神および範囲を制限するものではない。実施例実施例１２つの固相を用いるコーティング手順この方法では１／４インチのポリスチレンビーズ（アボットラボラトリーズ（ Abbott Laboratories）、イリノイ州６００６４、アボットパーク、から入手可能）および６０穴のポリスチレン反応トレイ（アボットラボラトリーズ、イリノイ州６００６４、アボットパークから入手可能）を使用した。２つの異なる抗ＨＩＶ−１ｐ２４モノクローナル抗体を以下のようにしてビーズにコーティングした。８μｇ／ｍｌ（約１．６μｇ／ｍｌ／ビーズ）の濃度で、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）の中でビーズを４５℃で２時間被覆した。次にビーズを０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で洗浄し、次いで０．１％トライトンＸ−１００（登録商標）（ポリオキシエチレンエーテル、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）から入手可能）を含む洗剤液中で１時間、４５℃で反応させた。このビーズを次に、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）の中で４５℃で３０分間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロックし、次いで２％ショ糖、１％の燐酸塩ガラスを用いて０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中で１５分間、１５−３０℃で表面被覆し、乾燥させた。使用した２つのモノクローナル抗体は３１−４２−１９および３１−９０−２５と命名されたものである。これらのモノクローナル抗体は、それらの開発とその用途について記述した米国特許出願第０７／２０４，７９８号の主題であり、すでに明細書の一部として援用している。これらの用途についてはまた、同一人の所有になる米国特許第７，２０４，７９８号にも記述されており、ここに明細書の一部として援用する。モノクローナル抗体３１−４２−１９を産生するハイブリドーマ細胞系３１−４２−１９はメリーランド州、ロックビル、パークローン通り、１２３０１所在のＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９７２６が与えられている。モノクローナル抗体３１− ９０−２５を産生するハイブリドーマ細胞系３１−９０−２５はメリーランド州、ロックビル、パークローン通り、１２３０１所在のＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９７２５が与えられている。次に、６０穴の反応トレイのウェルを以下のようにして、ＨＩＶ抗原で被覆した。ｐＴＢ３１９と命名されている組換えタンパクＨＩＶ− １ｐ４１ｅｎｖタンパクを、０．１Ｍ3-［シクロヘキシルアミノ］-1-プロパンスルフォン酸（ＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１１）中１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加え、４０℃で２時間インキュベートした。次いでこれらのウェルを４００ μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）と４０℃で１時間反応させ、次にＰＢＳ中３％のＢＳＡにより４０℃で１時間ブロックした。次いでこれらのウェルをＰＢＳ中で５％庶糖により室温で２０分間表面被覆し、乾燥させた。組換えタンパクｐＴＢ３１９を産生するｐＴＢ３１９プラスミドはボーリング（Bolling）およびマンデッキー（Mandecki）の特許出願、“タンパク合成のＣＫＳ法”、１９８８年３月１１日出願の米国特許出願第１６７，０６７号の主題であり、すでに本明細書の一部として援用している。ｐＴＢ３１９は、前掲のボーリング（Bolling）およびマンデッキー（Mandecki）に記述されているように、ＨＩＶ−１ｐ１２０のカルボキシ末端の４２のアミノ酸をコードする合成的に作られたＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＴＢ３１５に挿入することにより得られる。実施例２ＨＩＶ抗原およびＨＩＶ抗体の同時アッセイ実施例１で述べたようにして調製された２つの固相を、検査試料中のＨＩＶ抗原および／またはＨＩＶ抗体を検出するためのアッセイに、以下のように使用した。セロコンバージョンした９人のＨＩＶ感染者から採取された６５の血清サンプルを含むＨＩＶ−１セロコンバージョンパネルをこのアッセイに使用した。各血清サンプルを、あらかじめ実施例１で調製した６０穴のトレイの各ウェルの中で、１５０μｌの血清サンプルを５０μｌの検体用希釈液に加えて希釈した。この希釈液は２％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）から入手可能）を含むものである。次に、実施例１で説明したように抗ＨＩＶｐ２４抗体を被覆したビーズを１個ずつ血清サンプルを含んだ各ウェルに入れた。各トレイのウェルを４０℃で６０分間、連続回転条件下でインキュベートした。インキュベーションの後、６０穴反応トレイの各ウェルをアボット社のパラレル・プロセシング・センター（登録商標）（ＰＰＣ；アボットラボラトリーズ（Abbott L aboratories）、イリノイ州、アボットパーク、から入手可能）の中で１５ｍｌの脱イオン水（ｄＨ₂Ｏ）により洗浄した。２００μｌのＨＩＶｐ２４抗体プローブ試薬（ウサギポリクローナルＦ［ａｂ’］₂抗ＨＩＶ−１［活性成分：濃度２〜６μｇ／ｍｌの抗ｐ２４抗体］）を抗体用希釈液（２．２５％ＢＳＡ、７．５％子ウシ血清、７．５％ヤギ血清、２５％ヒトカルシウム再添加（recalcified）血漿、０．１％アジ化ナトリウム塩）に入れたものを各ウェル／ビーズに加え、ついでこの混合物を４０℃で６０分間、回転せずにインキュベートした。反応トレイの各ビーズ／ウェルを１５ｍｌのｄＨ₂Ｏで洗浄した。ついで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した組換えＨＩＶ−１ｐ４１抗原（ＨＲＰＯに結合させたｐＴＢ３１９）およびＨＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体の混合物を含んだ２００μ ｌの接合用希釈液（０．１８％Ｔｒｉｓ、１．１９％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８％ＮａＣｌ、９．０％子ウシ血清、０．９％ヤギ血清、１０．０％ヒトカルシウム添加血漿、４．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）、０．０１３％硫酸ゲンタマイシン、０．００９％チメロサール）を反応トレイの各ビーズ／ウェルに加え、４０℃で６０分間、回転せずにインキュベートした。６０穴反応トレイの各ビーズ／ウェルを、前に説明したように１５ｍｌのｄＨ₂Ｏで洗浄した。次に、各ウェル／ビーズに３００μｌのｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を加え、ついで室温下、暗所で３０分間インキュベートした。各ウェル／ビーズに３００μｌの停止試薬（１ＮＨ₂ＳＯ₄）を加えて反応を停止させた。この反応をアボットＰＰＣ（Abbott PPC）により測定した。これは６３０ｎｍの基準を使用して４９２ｎｍにおける反応の光学密度を測定するものである。カットオフ値は０．１ＯＤ＋陰性対照のＯＤ平均値とされた。したがって、もしサンプルのカットオフ値が１より大きい場合、血清サンプルは反応性がある（陽性）ということになる。前述の９人から得た６５の血清サンプルはすべてこの手順にしたがって試験した。得られた結果を、同じ血清サンプルでＨＩＶ抗原アッセイ（ＨＩＶＡＧ（登録商標）、アボットラボラトリーズ、イリノイ州、アボットパークから入手可能）およびＨＩＶ抗体アッセイ（ヒト免疫不全ウイルスタイプ１および２：大腸菌およびＢ．メガテリウム、組換え抗原、Abbott ＨＩＶＡＢ（登録商標）ＨＩＶ −１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡ；アボットラボラトリーズ、イリノイ州、アボットパークから入手可能）をそれぞれの製品ごとに提供されている製造業者の指示書に従って使用して得られた結果と比較した。これらのデータを表１に記載する。表中、“ＯＤ”は光学密度読み取り値を表し、“Ｓ／ＣＯ”はサンプル／カットオフ値を意味し、“結果”は試験結果の解釈を示し、“ＨＩＶ−１／２ＡｂＨＩＶ−１ＡｇＣｏｍｂ”は本発明のアッセイを示し、“ＨＩＶ−１／２Ａｂ”はＨＩＶＡＢ（登録商標）ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡアッセイを示し、“ＨＩＶ −１Ａｇ”はアボットのＨＩＶＡＧ（登録商標）アッセイを示す。表１のデータは、この３つの個々の試験の結果をそれぞれ個別に互いに比較した場合、本発明の方法がＨＩＶ−１／２ＡｂまたはＨＩＶ−１Ａｇ試験のいずれよりも良好な感度を有することを示している。感染の初期の段階およびＨＩＶ感染の最終段階にも存在するＨＩＶｐ２４抗原、ならびに感染の後でセロコンバージョン時に現われるＨＩＶ抗体の両方を検出するのに、このアッセイはさらに最適化できるものと期待される。実施例３一つの固相をコーティングする方法この方法においては下記のように、ただ１つの固相をＨＩＶ抗原およびＨＩＶ抗体で被覆した。９６穴の微量滴定プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ４（登録商標）、ヴァージニア州アレキサンドリア所在ダイナテック社（Dynatech）から入手可能）の各ウェルにモノクローナル抗体３１−４２−１９、モノクローナル抗体３１ −９０−２５およびｐＴＢ３１９と命名された組換えＨＩＶ−１ｐ４１抗原（実施例１で説明したもの）を、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中１μｇ／ｍｌの濃度としたもので、室温で２時間被覆した。次いで各ウェルを３００ μｌのブロッキング剤（５％脱脂粉乳、１０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含有）により室温で１時間ブロックした。実施例４１つの固相を使用したＨＩＶ抗原／抗体アッセイ実施例３で説明したように調製した固相を、検査試料中のＨＩＶ抗原および／またはＨＩＶ抗体の存在を検出するためのアッセイに、下記のように使用した。１２人分のセロコンバージョンパネル（マサチューセッツ州ボストン所在のバイオメディカ社（Biomedica Inc.）から入手可能のパネルＧ）の各血清サンプル、ならびに陽性および陰性対照を試験した。１５０μｌの各サンプルまたは陽性あるいは陰性対照を、微量滴定プレートの各ウェル中で５０μｌの検体用希釈液（実施例３で説明したように、１５μｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）および３５μｌのブロッキング剤を含む）を用いて希釈し、回転させずに室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションのあと、ヌンク（Nunc）の８チャネル“免疫洗浄（Immunowash）”マニフォールド（ヌンク社（Nunc）、デンマークから入手可能）を使用して、これらのウェルを３００μｌの洗浄緩衝液（０．０５％脱脂粉乳、１０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標））を用いる８サイクル洗浄を行った。次に、１７５μｌのＨＩＶｐ２４抗体プローブ試薬（ウサギポリクローナルＦ［ａｂ’］２抗ＨＩＶ−１［活性成分：濃度２から６μｇ／ｍｌの抗ｐ２４抗体］）を抗体希釈液（２．２５％ＢＳＡ、７．５％子ウシ血清、７．５％ヤギ血清、２５％ヒトカルシウム再添加血漿、０．１％アジ化ナトリウム）を各ウェルに加え、回転させずに室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションのあと、これらのウェルを前述のような洗浄緩衝液による８サイクル洗浄を行った。次いで、ＨＰＲＯで標識した組換えＨＩＶ−１ｐ４１タンパク（ｐＴＢ３１９）抗原とＨＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体との混合物を含む１５０μｌの結合用希釈液（実施例２で説明したもの）を各ウェルに加え、室温で回転せずに６０分間インキュベートした。これらのウェルを洗浄緩衝液で８サイクル洗浄（前述）し、ｄＨ₂Ｏですすぎ洗いした。次に、各ウェルに１２５μｌのＯＰＤ基質を加え、それらのウェルを室温で１０分間暗所でインキュベートした。１２５μｌの停止試薬（実施例２で説明したもの）を加えて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を６３０ｎｍの基準を使い４９０ｎｍで測定した。カットオフ値は０．０２５ＯＤ＋陰性対照のＯＤ平均値となった。サンプル／カットオフ値が１より大きい場合、反応性がある（陽性）とみなされる。これらのアッセイの結果を表２に示す。表２の中の“ＯＤ”は光学密度読み取り値を表し、“Ｓ／ＣＯ”はサンプル／カットオフ値を意味し、“結果”は試験結果の解釈を示し、“ＮＣ”は陰性対照、“ＰＣ”は陽性対照を示す。表２のデータが示すように、本発明のアッセイはセロコンバージョンパネル中のＨＩＶ抗体および／またはＨＩＶ抗原の存在を検出できた。ＨＩＶ−１／２抗体試験およびＨＩＶ抗原試験と個別に比較した場合、本発明の方法は抗原または抗体のいずれかの検出において、いずれの試験単独の場合よりも検出感度が高かった。本発明の方法による表２の結果をＨＩＶ−１／２抗体試験およびＨＩＶ抗原試験の組み合わせ結果と比較すると、本発明の方法はどちらかの試験で反応性があったすべての検体で検出が可能であった。実施例５微粒子へのＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原捕捉試薬の同時コーティング前述のモノクローナル抗ＨＩＶｐ２４抗体（３１−４２−１９および３１− ９０−２５）および前述の組換えＨＩＶ−１ｐ４１抗原（ＨＩＶ−１ｐ４１組換えタンパクｐＴＢ３１９およびＨＩＶ−２ｐ４１組換えタンパクｐＪＣ１０４）の両方を、それぞれ０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中に各１５０μ ｇ／ｍｌの濃度で、ポリスチレン微粒子（インディアナ州インディアナポリス所在のセラダイン社（Seradyne Inc.）より入手可能）の均質な０．５％（重量／容量）懸濁物上に、２時間室温（１５〜３０℃）で同時コーティングした。この微粒子の懸濁液を簡単に遠心分離し、微粒子ペレットを未結合の余剰のタンパクを洗い流すために、０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。結合しなかったタンパクが残らなくなるまでこの洗浄を繰り返した。この微粒子を１０ｍｇ／ｍｌカゼイン添加０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌで、５６℃で１８〜２４時間ブロッキングし、この微粒子を再び前記のように洗浄し、０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、１５％庶糖および０．１％アジ化ナトリウム中に、０．０１５％懸濁液（重量／容量）となるように希釈した。実施例６微粒子を使用したＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原の同時検出微粒子を使用する系であればいずれも使用可能であるが、ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）システムを使用する。ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡシステムについてはＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）の操作およびユーザートレーニングマニュアル（イリノイ州アボットパーク所在、アボット研究所のアボット診断部門より入手可能）に詳しく説明されている。このアッセイにおいては、実施例５で調製した０．１５％懸濁液１００μｌをＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗体および／またはＨＩＶ−１抗原を含むと思われる検査試料１００μｌと混合し、ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）反応セル中で４０℃で１０分間インキュベートし、反応混合物を得る。ＨＩＶ抗体および／またはＨＩＶ抗原は抗体／抗原／微粒子複合体の中の微粒子に結合する。１５０μｌの反応混合物を、微粒子が不可逆的に結合するガラス繊維マトリックスの上に移す。この抗体／抗原／微粒子複合体を次に、０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２％ＢＳＡ、０．２５％サポニンおよび０．１％アジ化ナトリウムに、ビオチニル化した組換えＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２組換えｐ４１抗原（前述のｐＴＢ３１９およびｐＪＣ１０４）およびビオチニル化したＦ（Ａｂ’）₂抗ＨＩＶ−１ｐ２４を添加したもので構成されたプローブ５０μｌと４０℃で１０分間反応させる。０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．５ＭＮａＣｌ、０．９％Ｂｒｉｊ−３５（登録商標）、１．０％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム中に溶解したヤギ抗ビオチンアルカリフォスファターゼで構成された５０μｌの抗体結合体を、ビオチンプローブ／抗体／抗原／微粒子の複合体と４０℃で１０分間反応させる。次に、これらの微粒子の複合体を０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌおよび０．１％アジ化ナトリウムで６回洗浄し、ビオチンプローブ／抗体／抗原／微粒子の複合体を５０ μｌの基質メチルウンベリフェリルフォスファーゼ（ＭＵＰ、アボット研究所、イリノイ州アボット）と反応させ、生成物メチルウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光を測定する。ＭＵの生成割合は検査試料中の分析対象物の濃度に比例する。実施例７ＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原捕捉試薬による微粒子の個別コーティングこの実施例においては、各種の捕捉試薬をポリスチレン微粒子（セラディン社（Seradyne Inc.）インディアナ州インディアナポリス、より入手可能）の上に別々にコーティングした。各試薬はそれぞれ別々に、あるいは種々の組み合わせでコーティングしてもよい。各試薬をそれぞれの微粒子の上にコーティングした後、それらのコーティング済み微粒子を１つにプールしてアッセイに使用する。この実施例の場合は、組換えＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ｐ４１抗原（ｐＴＢ３１９およびｐＪＣ１０４）を同時にコーティングした微粒子とは別の微粒子の上に、２つのモノクローナル抗ＨＩＶｐ２４抗体（３１−４２−１９および３１−９０−２５）を共にコーティングする。正確な量は異なるであろうが、全般的にはコーティング手順は実施例５で述べたものとほぼ同じである。物理的に分離された微粒子を、１０ｍｇ／ｍｌカゼイン含有０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌにより、５６℃で１８〜２４時間ブロッキングした後、微粒子を再び実施例５の記載のように洗浄し、合わせてプールし、０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡおよび１５％庶糖中に、０．０１５％懸濁液（重量／容量）となるように希釈する。プールする段階で、これら微粒子の使用を最適なものとするために、アッセイの感度と特異性を変えるように種々の割合になるようにプールしてもよい。実施例８ＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原捕捉試薬を別々にコーティングした微粒子上でのＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原の同時検出微粒子を使用する系であればいずれも使用可能であるが、ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）システムを使用する。ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡシステムはＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）の操作およびユーザートレーニングマニュアル（イリノイ州アボットパーク所在のアボット研究所アボット診断部門より入手可能）に詳しく説明されている。このアッセイにおいては、実施例５で調製した０．１５％懸濁液１００μｌを、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗体および／またはＨＩＶ−１抗原を含むと思われる検査試料１００μｌと混合し、ＡｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）反応器中で４０℃ で１０分間インキュベートし、反応混合物を得る。ＨＩＶ抗体および／またはＨＩＶ抗原は抗体／抗原／微粒子複合体の中の微粒子に結合する。１５０μｌの反応混合物を、微粒子が不可逆的に結合するガラス繊維マトリックス上に移す。次いでこの抗体／抗原／微粒子複合体を０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０）、２％ＢＳＡ、０．２５％サポニンおよび、０．１％アジ化ナトリウムにビオチニル化した組換えＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２組換えｐ４１抗原（前述のｐＴＢ３１９およびｐＪＣ１０４）およびビオチニル化したＦ（Ａｂ’）₂抗ＨＩＶ−１ｐ２４を添加したもので構成されたプローブ５０μｌと４０℃で１０分間反応させる。０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５ＭＮａＣｌ、０．９％Ｂｒｉｊ −３５（登録商標）、１．０％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム中に添加したヤギ抗ビオチンアルカリフォスファターゼで構成された５０μｌの抗体結合体を、ビオチンプローブ／抗体／抗原／微粒子の複合体と４０℃で１０分間反応させる。次に、これらの微粒子の複合体を０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌおよび０．１％アジ化ナトリウムで６回洗浄し、ビオチンプローブ／抗体／抗原／微粒子の複合体を５０μｌの基質メチルウンベリフェリルフォスファーゼ（ＭＵＰ）イリノイ州アボットパーク所在アボット研究所）と反応させ、生成物メチルウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光を測定する。ＭＵの生成割合は検査試料中の分析対象物の濃度に比例する。実施例９組換えＨＩＶ−１抗原の調製および発現初期ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２クローンの調製ＨＩＶ−１に感染したＨＴ−９細胞（National Cancer Institute、Laborator ies of Tumor Cell Biologyのロバートギャロ博士（Dr．Robert Gallo）より入手、ロット番号P3-21）に由来するゲノムＤＮＡの部分ＥｃｏＲＩ分解物をバクテリオファージラムダＣｈａｒｏｎ４ＡＥｃｏＲＩアームと連結し、大腸菌Ｃ６００に形質移入することによりＨＩＶ−１ゲノムライブラリーを調製した。このライブラリーをＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡから調製したｃＤＮＡとハイブリッド化することによりスクリーニングし、ＨＩＶ−１ゲノム全体を含む単一のファージ（ファージ４Ｂと命名）を得た。ファージ４ＢＤＮＡをＫｐｎＩにより消化し、ｐＵＣ１８（ベセスダ研究所（Bethesda Research Laboratories））のＫｐｎＩ部位に連結した。ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子のｐ４１領域全体を含むクローン（ｐｃＫ２と命名）を同定し、遺伝子地図を作成した。ファージ４ＢＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に連結した。ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子の全体を含むクローン（ｐｃＲ２３と命名）を同定し、遺伝子地図を作成した。ＨＩＶ−２プロファージ単離物Ｄ１９４５からのｔｈｅ／ｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡ断片がプロファージＤＮＡのラムダゲノムライブラリー中に同定された。この断片を大腸菌発現ベクター（ラムダＰＬベクターｐＫＨ２０）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＥＨａと命名した。組換えＨＩＶ−１ｇｐ４１抗原の調製エンベロープ発現ベクターの構築は２段階で行った。第１段階はｅｎｖを含む小さなＤＮＡ断片を含む大腸菌プラスミド（ｐ４１Ｃと命名）の構築である。第２段階はエシェリキアＳｐ．とバチルスｓｐ．の両方の中で生存する能力を有する発現ベクターの構築、およびこのプラスミド（ｐＯＭ１０と命名）へのｅｎｖ断片の導入を含む。プラスミドｐｃＫ２から得られた８５４塩基対（ｂｐ）ＢｇｌII／ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を、ｐＵＣ９（ファルマシア）のＢａｍＨＩ部位に連結した。ｌａｃＺ遺伝子と同じ配向のｅｎｖ遺伝子の１部分を含んだクローンが同定され、遺伝地図を作成し、ｐ４１Ａと命名した。プラスミドｐｃＫ２から得られた５５７塩基対ｂｐＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐ４１ＡのＢａｍＨＩ部位に連結した。ｌａｃＺ遺伝子と同じ配向のｅｎｖ遺伝子の完全なｐ４１配列を含んだプラスミドを同定し、遺伝子地図を作成し、ｐ４１Ｃと命名した。バチルス芽胞形成プロモーターｓｐｏＶＧを含む大腸菌プラスミド（ハーバード大学、アール．ロシック博士（Dr．R．Losick）により開発され、ｐＶＧ１と命名されている）をＳｍａＩにより切断した。このＤＮＡ断片を、あらかじめＸｂａＩにより切断されたバチルスプラスミドｐＥ１９４に連結し、“付着性”のＤＮＡ端を充填するために、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノー断片）を用いて平滑末端処理した。プラスミド（ｐＡＳ５と命名）を単離し、遺伝子地図を作成した。このプラスミドは大腸菌およびＢ．サブチリス両方の中で生存する能力のあることが判った。次にｅｎｖ遺伝子をｐＡＳ５に挿入した。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化およびそれに続く平滑末端処理により、プラスミドｐ４１Ｃからのｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、あらかじめＳａｌＩで直線化し平滑末端処理したプラスミドｐＡＳ５に連結した。単離されたクローン（ｐＡＳ１４と命名）は、ｅｎｖ遺伝子が適切な配向でｓｃｏＶＧプロモーターに融合していることが確認された。最後に、ｐＳＡ１４中のエリスロマイシン耐性遺伝子を以下のようにして、関連するバチルスプラスミドｐＣ１９４からのクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えた。プラスミドｐＣ１９４のＣｌａＩ／ＤｒａＩ消化物からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む１１０７ｂｐＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を、ｐＡＳ１４のＣｌａＩ／ＳｍａＩ消化から単離された６４０７ｂｐＤＮＡ断片に連結した（この処理でもとのエリスロマイシン耐性遺伝子はすべて除去される）。最終的に得られたプラスミドをｐＯＭ１０と命名した。プロモーター領域、転写開始点、およびリボソーム結合部位は塩基４８４０− ４９７１に亘る。コード化領域（塩基４９７２−６１８３）は、親プラスミドｐＶＧ１のｓｐｏＶＧ領域からの配列（塩基４９７２−５００４）、ＤＮＡ連結中に派生する配列（塩基５００５−５０１０）およびＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子ｇｐ１２０から派生する配列（塩基５０１１−５１４５）から構成される（ラトナー、エル（Ratner，L）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７−２８４、１９８５）。ｐ４１の配列は塩基５１４６−６１８０からのものである。翻訳はｅｎｖ遺伝子の本来の終止コドン（塩基６１８１−６１８３）で終結される。組換えタンパクをコードするＤＮＡ配列は発酵後採取した３ロットのプラスミドを配列分析することにより確認された。配列決定されたロットは臨床用マスターロット用の抗原を作成するために用いられたものと同じ細胞バンクから発酵させたものである。プラスミドｐＯＭ１０は、ｓｐｏＶＧタンパクのアミノ末端に由来する１１個のアミノ酸、連結中のＤＮＡ操作に由来する２個のアミノ酸、それに続くｐ１２０エンベロープタンパクからの最終の４５個のアミノ酸およびｐ４１タンパク配列の全長を含む、融合タンパクとしてのＨＩＶ−１エンベロープを発現する。このタンパクは組換えｐ４１（ｒｐ４１）と呼ぶ。組換えＨＩＶ−１ｇｐ４１融合タンパクの調製ＨＩＶ−１ＣＫＳ−１２０１４１融合抗原を発現する組換え大腸菌クローンの構築は数段階で行われた。第１段階はＨＩＶ−１抗原のｇｐ４１部分の遺伝子を合成し、改変ｐＵＣ１８に挿入してプラスミドｐＴＢ３１５を得た。次に、ｇｐ１２０タンパクのカルボキシ４２アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＴＢ３１５に挿入してプラスミドｐＴＢ３１６とした。最後に、ｇｐ１２０／４１遺伝子を、融合タンパクとしての抗原を効果的に発現する発現プラスミド（ｐＴＢ２１０）に形質移入した。こうして得たプラスミドｐＴＢ３１９を単離して遺伝子地図を作成した。ＨＩＶ−１ｇｐ１６０エンベロープタンパクのアミノ酸５１９−６７３、および７１２−８６３をコードする遺伝子（ラトナー（Ratner）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７−２８４、１９８５）を、ｐＵＣ１８プラスミド誘導体中の一連の合成ＤＮＡ断片から構築するべく設計した。公表されているｇｐ４１配列部分を複製して１４断片を化学的に合成した。この配列はアミノ酸５１９−６７３および７１２−８６３と、アミノ酸６７４−７１１から３８アミノ酸トランスメンブラン領域を削除したもので構成されている。１４の合成断片をｐＷＭ５００（マンデッキー（Mandecki）およびボーリング（Bolling）、Ｇｅｎｅ６８：１０１−１０７、１９８８）にサブクローニングし、融合タンパクのｇｐ４１部分を得るために一緒に連結し精製した。しかしながら、アミノ酸７４１および７４２においてＡ／Ｔ欠失が起こり、１４アミノ酸フレームシフトおよび断片９での早期の翻訳終結となった。こうして得られた合成ＤＮＡ配列は、リンカーの挿入によってＮａｒＩ部位が破損された改変ｐＵＣ１８プラスミドへの挿入のためのフランキングＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位を保持するもので、ｐＭＢ１０．５と命名した。ｇｐ１２０のカルボキシ末端を表す１２９塩基対二本鎖ＤＮＡ断片を合成し（３１１．３および３１１．４）、ｐＴＢ３１５の残存ＮａｒＩ部位へ挿入した。この断片を、ＮａｒＩで消化したプラスミドｐＴＢ３１５へ挿入した。ｐＴＢ３１６と命名されたプラスミドが単離され、挿入された断片がｇｐ４１遺伝子と同じ配向であるようにスクリーニングした。プラスミドｐＢＲ３２２から誘導されたこのプラスミドはｋｄｓＢ遺伝子断片（大腸菌ＣＭＰ−ＫＤ０シンセターゼまたはＣＫＳタンパクの全２４８アミノ酸の最初の２３９個をコードする）と融合した改変ｌａｃプロモーター、およびｋｄｓＢ遺伝子断片の末端に融合した合成リンカーを含む。この合成リンカーは遺伝子挿入のための多制限部位、翻訳停止信号およびｔｒＰＡｒｈｏ非依存性転写ターミネーターを含む。このプラスミドはＣＫＳの２３９個のアミノ酸および合成リンカーによってコードされる２２個のアミノ酸をコードする。プラスミドｐＴＢ３１６をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩによって消化し、１０７３ｂｐ断片を単離した。この断片は元の合成ｇｐ４１遺伝子と、正しい位置に挿入されたｇｐ１２０遺伝子のカルボキシル側４２アミノ酸からなる。この断片を、予めＢｇｌIIおよびＫｐｎＩで消化したｐＴＢ２１０に挿入した。こうして得られたプラスミド（ｐＴＢ３１９と命名）を単離し遺伝子地図を作成した。プロモーター領域、転写開始点、およびリボソーム結合部位は塩基４５から１２５にわたる。コード化領域はＣＫＳタンパク（塩基１２６− ８４２）の２３９個のアミノ酸から派生した配列および合成ポリリンカー（塩基８４３−８７５）からの１１個のアミノ酸で構成される。これにｐ１２０ＨＩＶ −１ｅｎｖ（塩基８７６−１００１）の４２個の残基とＨＩＶ−１ｐ４１ｅｎｖ（塩基１００２−１５５６）の１８５個の残基が続く。トランスメンブラン領域の３８アミノ酸欠損は塩基対１４６６と１４６７の間である。最後に、単一のＡ／Ｔ欠失によるフレームシフトおよび早期の翻訳終結（塩基１５９９−１６０１）による付加的な１４個のアミノ酸（塩基１５５７−１５９８）がある。組換えタンパクをコードするＤＮＡ配列は発酵後採取した３ロットのプラスミドの配列を決定することにより確認された。プラスミドｐＴＢ３１９は、ＣＫＳタンパクの２３９個のアミノ酸とｐＴＢ２１０の多制限部位リンカーからの１１個のアミノ酸を含む組換えタンパクをコードする。これにＨＩＶ−１ｐ１２０のカルボキシ末端からの４２個のアミノ酸、ＨＩＶ−１ｐ４１タンパク（ｐ４１トランスメンブラン領域にわたるアミノ酸６７４−７１１から３８個のアミノ酸が欠損した切頭型タンパク（ラトナーら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７−２８４、１９８５））からの１８５個のアミノ酸が続く。最後にヌクレオチド１５５６と１１５７の間の単一のＡ／Ｔ欠失によるフレームシフトと早期終結の結果できる１４個のアミノ酸が続く。このタンパクは組換えｐＣＫＳ−４１（ｒｐＣＫＳ−４１）と呼ばれる。組換えＨＩＶ−１ｐ２４抗原の調製ｐ２４ｇａｇ発現ベクターの構築は多段階のプロセスで行った。最初の段階はより小さなｇａｇを含むＤＮＡ断片を有する大腸菌プラスミドｐＢ１の構築である。第２段階は効率的な発現をさせるための適当な分子信号を有する発現ベクターｐＫＲＲ９５１の構築である。最後に、遺伝子発現を調節するためにプラスミドに分子情報を加え、最終的なプラスミドｐＫＲＲ９５５を得た。プラスミドｐｃＲ２３から得られた９４９ｂｐＰｖｕII／ＢｇｌII ＤＮＡ断片を、予めＨｉｎｄIIおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ９（ファルマシア）に連結した。ｌａｃＺ遺伝子と同じ配向のｇａｇ遺伝子（ｐ２４コード化領域を含む）の一部を含むクローンを同定し、遺伝子地図を作成し、ｐＢ１と命名した。次いでｇａｇ遺伝子ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＫＲＲ８１０に導入した。この発現ベクターは、ｇａｇ遺伝子の発現を大腸菌ラムダファージＰ、プロモーターのコントロール下におき、タンパク合成を効率的に終結させるものである。プラスミドｐＢ１のＥｃｏＲＩ（完全）／ｐｓｔＩ（部分）消化により、ｇａｇ遺伝子のほとんどを含む９６３ｂｐＤＮＡ断片を得た。コードされたタンパクのアミノ末端を再構築し、ＥｃｏＲＩ部位を開始コドンのすぐ上流に置くために、３６ｂｐの合成オリゴヌクレオチドをｇａｇ遺伝子断片に付加した。この改変断片を発現ベクターｐＫＲＲ８１０のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ファージＰ．プロモーターと同じ配向のｇａｇ遺伝子を有するクローン（ｐＫＲＲ９５０）を同定・単離し、遺伝子地図を作成した。このクローンの大きさをΛｐａＩ消化およびｐＫＲＲ９５０プラスミドの再連結により１０６ｂｐに減らし、ｐＫＲＲ９５１と命名するプラスミドを得た。発現ベクターの構築を完成させるために、この構築物の中にラムダｃＩｔｓ調節遺伝子および大腸菌ラムダファージＰ_Rプロモーターを挿入した。温度に敏感なこの遺伝子を付加することによってラムダプロモーターのコントロール、従ってｇａｇ遺伝子の発現もコントロールできるようになる。ラムダｃＩｔｓ調節遺伝子および大腸菌ラムダファージＰ_Rプロモーターを含む２３９２ｂｐＤＮＡ断片を、ｐＲＫ２４８、ｃＩｔｓと呼ばれるプラスミドのＢｇｌII消化によって得た。この断片をプラスミドｐＫＲＲ９５１のＢｇｌII部位に挿入し、プラスミドｐＫＲＲ９５５を得た。プロモーター領域、転写開始点およびリボソーム結合部位は塩基７７５７−２７１にわたる。この領域は二つの異なるラムダファージ突然変異体および一つの合成領域に由来する。コード化領域はｐＵＣ９からのｌａｃＺ’遺伝子のＮＨ₂ 端を複製する合成配列（塩基２７２−３０７）と、ｐ２４配列の全長（塩基３４４−１０３６）を含むＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子の一部をコードする配列（塩基３０８−１１８３）とを含み、これにベクターｐＫＲＲ８１０の合成の３つのフレーム翻訳ターミネーターからの短い配列（塩基１１６９−１１８０）が続く。このセグメントの３番目の停止コドン（塩基１１８１−１１８３）で翻訳が終結する。この配列はｒｒｎＢｔ１転写ターミネーター（塩基１１８４−１２４１）を示す。プラスミドｐＫＲＲ９５５はｌａｃＺタンパクに由来する１２個のアミノ酸およびｐＵＣ９ポリリンカー領域を包含する融合タンパクを産生する。これにｇａｇタンパクの一部（ｐ１７タンパクの最後の１２アミノ酸、ｐ２４タンパクの全部のアミノ酸２３１個およびｐｌ５タンパクの最初の４４個のアミノ酸を含む）が続く。ｐＫＲＲ８１０ベクターのターミネーター部分から派生する４つのアミノ酸が続く。このタンパクは組換えｐ２４（ｒｐ２４）と呼ばれる。組換えＨＩＶ−２ｇｐ３６ｅｎｖ抗原の調製ｒｐ４１ＨＩＶ−２抗原を発現する組換え大腸菌クローンの構築は２つの段階で行われた。第１段階はＨＩＶ−２プロファージからＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の断片を単離し、ｐＥＨａと命名された大腸菌発現ベクターの中にサブクローニングした。次に、ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子断片をプラスミドｐＥＨａから別の発現ベクターｐＴＢ２１０Ｎにサブクローニングし、プラスミドｐＪＣ１０４を得た。ＨＩＶ−２からのｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡ断片（プロファージ単離物Ｄ１９４．５）がプロファージＤＮＡのラムダゲノムライブラリ中に同定された。この断片を大腸菌発現ベクター（ラムダＰ_LベクターｐＫＨ２０）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。こうして得たプラスミドをｐＥＨａと命名した。この作業はダイアゲン社（DIAG EN GmbH、Neiderheider Strasse 3、4000 Dusseldorf）により行った（クーネル（Kuhnel）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２３８３ −２３８７、１９８９）。クローニングベクターｐＴＢ２１０は組換え遺伝子をＣＫＳタンパクへ融合させる。このプラスミドはプラスミドｐＢＲ３２２とｋｄｓＢ遺伝子断片（大腸菌ＣＭＰ−ＫＤ０シンセターゼまたはＣＫＳタンパクの全２４８個のアミノ酸の最初の２３９個をコードしたもの）に融合した改変ｌａｃプロモーター、およびｋｄｓＢ遺伝子断片端に融合した合成リンカーから成る。この合成リンカーは遺伝子挿入のための多制限部位、翻訳停止信号、ｔｒｐＡｒｈｏ非依存性転写ターミネーターを含む。プラスミドｐＴＢ２１０Ｎは合成リンカーの中にＮｃｏＩ部位を含み、プラスミドｐＴＢ２１０から誘導される。プラスミドｐＥＨａをＮｃｏＩで消化し、ＨＩＶ−２ｐ４１タンパクの最初の１０４個のアミノ酸をコードする３１４塩基対断片を単離し、プラスミドｐＴＢ２１０ＮのＮｃｏＩ部位に挿入した。ｐＪＣ１０４と命名されたこのプラスミドはＣＫＳタンパクとの融合体としてＨＩＶ−２ｅｎｖタンパクを発現する。プロモーター領域、転写開始点およびリボソーム結合部位は塩基４５−１２５にわたる。コード化領域はＣＫＳタンパクの２３９個のアミノ酸から派生した配列（塩基１２６−８４２）および合成ポリリンカーの１３個のアミノ酸配列（塩基８４３−８８１）を包含する。これにＨＩＶ−２ｅｎｖのアミノ末端の１０４残基（塩基８８２−１１９３）およびポリリンカーの残りの１５個のアミノ酸（塩基１１９４−１２３８）が続く。翻訳は塩基１２３９〜１２４１の終止コドンで停止する。プラスミドｐＪＣ１０４はＣＫＳタンパクの最初の２３９個のアミノ酸、ｐＴＢ２１０Ｎ多制限部位リンカーからの１３個のアミノ酸、ＨＩＶ−２ｅｎｖタンパクの１０４個のアミノ酸（ＨＩＶ−２ｅｎｖタンパクのアミノ酸５０６− ６０９）、ｐＴＢ２１０Ｎ多制限部位リンカーからの追加の１５個のアミノ酸を含む組換えタンパクをコードする。このタンパクは組換えｐ４１ＨＩＶ−２（ｒｐ４１ＨＩＶ−２）と呼ばれる。プラスミド宿主細胞系上記のように調製されたプラスミドｐＯＭ１０をＢ．メガテリウム菌株ＰＹ３６１（野性型プラスミドをキュアしたＱＭＢ１５５１菌株の原栄養株誘導体）の原形質体に移入し、生存力のあるクロラムフェニコール耐性細胞を再生させた。ｒｐ４１抗原の発現はｓｐｏＶＧプロモーターのコントロール下にあり、細胞が芽胞形成長期に入った時に発現が観察された。独立要素として複製されたこのプラスミドは可動性がなく、１細胞当たり約１０から３０コピーに維持された。上記のように調製されたプラスミドｐＴＢ３１９を、塩化カルシウム法でコンピテントにした大腸菌Ｋ−１２の菌株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ−／Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^qＺｄｅｌｔａＭ１５、ＴＮ１０）細胞中に形質転換した。この構築においてｒｐＣＫ−Ｓ４１タンパクの発現はｌａｃプロモーターのコントロール下にある。組換えｐＣＫＳ−４１の発現はＩＰＴＧを１００μ ｇ／ｍｌ添加することにより誘発された。独立要素として複製されたこのプラスミドは可動性がなく、１細胞当たり約１０から３０コピーで維持された。上記のように調製されたプラスミドｐＫＲＲ９５５を、塩化カルシウム法でコンピテントにした大腸菌Ｋ−１２の菌株ＫＰＲ１３６（Ｄｌａｃ−ｐｒｏ、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ−１、ｒｐｓＬ、ｓｂｃＢ１５、ｅｎｄＡ、ｈｓｄＲ４、ｌｏｎ− ９、ｔｓｘ：−４６２：ＴｎｌＯ／Ｆ’、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩ^q ＺｄｅｌｔａＭ１５）細胞中に形質転換した。この構築においてｒｐ２４タンパクの発現はラムダＰ_LおよびラムダＰ_Rプロモーターの両方、ならびにプラスミド上に存在するｃＩｔｓ遺伝子から発現されたｃＩｔｓリプレッサーのコントロール下にあった。組換えｐ２４の発現は温度を３０℃から４２℃に変更することによって誘発された。このプラスミドは可動性がなく、１細胞当たり約１０から３０コピーで維持された。上記のように調製されたプラスミドｐＪＣ１０４を、塩化カルシウム法でコンピテントにした大腸菌Ｋ−１２の菌株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕＤＥｉ４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ−／Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^qＺｄｅｌｔａＭ１５、ＴＮ１０）細胞中に形質転換した。この構築においてｒｐ４１ＨＩＶ−２融合タンパクの発現はｌａｃプロモーターのコントロール下にある。組換えｐ４１ＨＩＶ−２の発現はＩＰＴＧを１００μｇ／ｍｌ添加することにより誘発された。独立要素として複製されたこのプラスミドは非可動であり、１細胞当たり約１０から３０コピーで維持された。上記のように調製されたプラスミドｐＴＢ２１０を、塩化カルシウム法でコンピテントにした大腸菌Ｋ−１２の菌株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ−／Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^qＺｄｅｌｔａＭ１５、ＴＮ１０）細胞中に形質転換した。この構築において、ＣＫＳタンパクの発現はｌａｃプロモーターのコントロール下にあった。組換えｐ２４の発現は、ＩＰＴＧを１００μｇ／ｍｌ添加することによって誘発した。独立要素として複製されたこのプラスミドは可動性がなく、１細胞当たり約１０から３０コピーで維持された。実施例１０１つの固相を使用したＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２抗体のアッセイ実施例３で説明したように１つの固相を組換え抗原ｒｐ２４、ｒｐ４１、およびｒｐ３６でコーティングし、検査試料中のＨＩＶ−１／ＨＩＶ −２抗体の存在を検出するためのアッセイに使用した。アッセイ条件はサンプル量を実施例３記載のアッセイの場合の１５０μｌから５０μｌに減らした以外は基本的に実施例３で説明した通りである。評価はｆｒｐからの１２１個の希釈ＨＩＶ−２サンプル、３０名の個体、２１９４個の血漿および９８０個の血清からなる新鮮供血群、および１９名の個体からの１５３個のＨＩＶ−１セロコンバージョンサンプルで行った。合成ＨＩＶ−２を使用したアッセイの結果を、同じ血清をＨＩＶ抗体アッセイ（ヒト免疫不全ウイルス１型および２型：大腸菌およびＢ．メガテリウム、組換え抗原、ＡｂｂｏｔｔＨＩＶＡＢ（登録商標）ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡ；イリノイ州、アボットパーク所在アボットラボラトリーズから入手可能）、ＡｂｏｔｔＬｉｓｔ３Ａ７７またはＡｂｏｔｔＬｉｓｔ３Ａ１０をそれぞれの商品に対して提供されている製造者の指示に従って使用したものと比較した。これらのアッセイの結果を表３に示す。各ウェルの吸光度を６３０ｎｍの基準を使って４９０ｎｍで測定した。カットオフ値は０．０２５ＯＤ＋陰性対照のＯＤ平均値とした。サンプル／カットオフ値が１より大きい場合、反応性がある（陽性）と判断した。表３の中の“ＯＤ”は光学密度読み取り値を表し、“Ｓ／ＣＯ”はサンプル／カットオフ値を意味し、“ 結果”は試験結果の解釈を示し、“ＮＣ”は陰性対照、“ＰＣ”は陽性対照を示す。この結果から、改良されたＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ｒＤＮＡ／合成ＨＩＶ−２ペプチドは、ＨＩＶ−１セロコンバージョン感度を損なうことなく、より高いＨＩＶ−２感度とより強い特異性を提供することがわかる（下記表５）。サンプル必要量が減ることにより、１５０μＬでは制限が大きすぎる場合のアッセイに使用することが可能となる。実施例１１ｒＤＮＡ／合成ＨＩＶ−２ペプチド方式とＡ３１０の比較実施例１０で説明したように５０μＬのサンプルを使用してアッセイを行った。均質方式を使用した。結果を下記表６に示す。この結果は、合成ＨＩＶ−２抗原を指示試薬の成分として使用した場合、純粋な組換えＨＩＶ−２ｇｐ３６抗原を指示薬として使用する場合のアッセイに比べて、疑似陽性数が著しく減ることを示している。本発明のアッセイは、抗原または抗体の捕捉またはプローブ試薬の種々異なる組み合わせを使用したり、当分野の当業者に公知のその他の方法、試薬および条件を利用するなどして、アッセイ条件および／またはインキュベーション時間を変えることによってさらに最適化が図れるようになっている。したがって、ＨＩＶｐ２４、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｐ１７などを含むその他種々の抗体捕捉試薬を使用することができる。抗体捕捉試薬を変更する場合は、別の抗原捕捉試薬を使用する必要が出てくる。こうした変更はすべて本発明の範囲内である。また実施例の中で説明したいくつかのアッセイにおいて自動化システムを使用しているが、手動式あるいは他の自動分析器を使用したり、または本発明のアッセイに応用することも本発明の範囲に充分入るものである。したがって、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ストーン，バーバラ・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイランド・パーク、デイアーフイールド・ロード・771 (72)発明者リユー，ダグラス・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60640、シカゴ、エヌ・ウエイン・5447 (72)発明者ハーリントン，スーザン・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60085、ウオーキガン、スタンリー・アベニユー・322 (72)発明者ドーソン，ジヨージ・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、スプルースウツド・15670 (72)発明者ウー，ピンアメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイランド・パーク、オーク・ストリート・ 2680

Claims

【特許請求の範囲】１．検査試料中のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に対する抗体の存在または量を検知するアッセイであって、ａ．検査試料を、ｉ．固相に付着させた、ＨＩＶ−２ｅｎｖを含むポリペプチドである第１の捕捉試薬と、 ii．固相に付着させた、ＨＩＶ−１ｅｎｖを含むポリペプチドである第２の捕捉試薬と、 iii．固相に付着させた、ＨＩＶ−１ｇａｇを含むポリペプチドである第３の捕捉試薬とに接触させ第１の混合物を生成させる段階と；ｂ．前記第１混合物をｉ．信号発生化合物で標識した合成ＨＩＶ−２ｅｎｖ抗原を包含する第１の指示試薬と、 ii．信号発生化合物で標識したＨＩＶ−１ｅｎｖ抗原を包含する第２の指示試薬と、 iii．信号発生化合物で標識したＨＩＶｇａｇ抗原を包含する第３の指示試薬とに接触させて第２の反応混合物を生成させる段階と；ｃ．検査試料中の前記ＨＩＶ−１ｅｎｖ抗体、ＨＩＶ−２ｅｎｖ抗体、および／またはＨＩＶｇａｇ抗体の存在を、ＨＩＶ抗体／捕捉試薬／指示試薬複合体により発生される合計信号量を検出することにより測定する段階とを包含するアッセイ。２．前記第１指示試薬がＨＩＶ−２のｇｐ３６の１つの免疫支配領域特有の免疫反応特異性を有する合成の部位指向ＨＩＶｅｎｖ抗原を含有する請求項１に記載のアッセイ。３．前記合成ＨＩＶ抗原の免疫支配領域がＨＩＶ−２のｇｐ３６のＮ末端領域からの約１２０個のアミノ酸である請求項２に記載のアッセイ。４．前記合成ＨＩＶ抗原が少なくとも１つのシステイン残基を含有する請求項２に記載のアッセイ。５．前記合成ＨＩＶ抗原が、からなる群から選択されるペプチドである請求項２に記載のアッセイ。６．前記第２指示試薬がＨＩＶ−１のｇｐ４１の免疫支配領域特有の免疫反応特異性を有するリコンビナントまたは合成ＨＩＶｅｎｖ抗原を含有する請求項１に記載のアッセイ。７．前記第３指示試薬がＨＩＶ−１のｐ２４の免疫支配領域特有の免疫反応特異性を有する合成または組換えＨＩＶｇａｇ抗原を含有する請求項１に記載のアッセイ。８．前記第１、第２、および第３捕捉試薬が少なくとも１つの固相に結合する請求項１に記載のアッセイ。９．前記固相が磁性または非磁性のビーズ、反応トレイのウェル、微粒子、ナイロン細片、およびニトロセルロース細片から成る群から選ばれる請求項８に記載のアッセイ。１０．前記第１のＨＩＶ−１ｇｐ４１ｅｎｖ捕捉試薬、前記第２のＨＩＶ− ２ｇｐ３６ｅｎｖ捕捉試薬、および前記第３のＨＩＶｐ２４ｇａｇ捕捉試薬が組換えまたは合成により調製された請求項１に記載のアッセイ。１１．ＨＩＶ抗体指示試薬の信号発生化合物が、酵素、発光化合物、化学発光化合物、および放射性元素で構成される群から選ばれる請求項１に記載のアッセイ。１２．前記酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼである請求項１１に記載のアッセイ。１３．さらに、信号発生化合物によって標識された組換えＨＩＶ−２ｅｎｖ抗原を含有する指示試薬を包含し、該指示試薬がアッセイ１回当たり０．０１４− １．４マイクログラム存在する請求項１に記載のアッセイ。１４．検査試料中のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体の存在または量を同時に検出する試験キットであって、（ａ）固相に付着した、ＨＩＶ−１のｇｐ４１ｅｎｖ領域に特有の免疫反応特異性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含有するＨＩＶ−１抗原捕捉試薬と；（ｂ）固相に付着した、ＨＩＶ−２のｇｐ３６ｅｎｖ領域に特有の免疫反応特異性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含有するＨＩＶ−２抗原捕捉試薬と；（ｃ）固相に付着した、ＨＩＶのｐ２４ｅｎｖ領域に特有の免疫反応特異性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含有するＨＩＶ抗原捕捉試薬と；（ｄ）信号発生化合物によって標識された合成ＨＩＶ−２ｇｐ３６ｅｎｖ抗原を含有する指示試薬と；（ｅ）信号発生化合物によって標識されたＨＩＶ−１ｇｐ４１ｅｎｖ抗原を含有する指示試薬と；（ｆ）信号発生化合物によって標識されたＨＩＶｇａｇ抗原を含有する指示試薬とを包含する試験キット。１５．さらに、信号発生化合物によって標識された組換えＨＩＶ−２ｅｎｖ抗原を含有する指示試薬を包含する請求項１４に記載の試験キット。