JPH08510117A - 生物学的物質の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 以下の反応（Ｉ）および（II）に付される物質Ｃ₁、物質Ｃ₂、基質がＣ₁およびＳ₁である酵素Ｅ₁および、基質がＣ₂およびＳ₂である酵素Ｅ₂のいずれかの存在を検出する方法を提供する。この方法は、当該反応の進行に充分な他の物質を添加し、次いでＳ₁もしくはＳ₂の損失またはＰの形成を観察することを含んでなる。Ｐの形成は、指数関数的に増大し、これは、微生物の存在下（Ｃ₁がＡＴＰ）に好適なＰ連結反応によって発色反応を迅速かつ簡易に得るのに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的物質の検出 発明の分野 本発明は、生物学的物質の検出法および当該方法に使用される物質に関する。 発明の背景 生物学的物質の検出には、たとえば発色法のような多数の技術が利用されてい る。たとえば、標的物質の存在下に、過酸化水素またはＮＡＤＨを形成するよう な物質を添加することができ、これにより付加的な反応が生じて着色した化合物 が生成される。別法としてより直接的に、標的物質を着色することもでき、たと えば多数の加水分解酵素を人工的基質に作用させて着色生成物を得ることができ る。 しかしながら、ごく少量の標的物質の検出に関し、複雑な装置を用いることな く分析するには着色生成物の量があまりにも少量であるという問題が生じ、確か に肉眼では確認できない。ある種の増幅メカニズムとして、たとえば低レベルの ＮＡＤ（Ｈ）またはＮＡＤＰ（Ｈ）測定用のサイクル反応が記載されている（EP −A−0060123参照）。これは、標的物質の直線的な増幅が得られるようなサイク ル、すなわち標的基質の濃度が反応時間に比例して増加するようなサイクルの例 示であるため、鋭敏な測定には長い期間が必要である。 ＧＢ−Ａ−２０５５２００は、上記と同一または他の直線的増幅サイクルを開 示し、また、ある種のサイクル、即ちアデニル酸キナーゼがＡＭＰとＡＴＰの反 応を触媒してＡＤＰを形成し、次いでこれをピルビン酸キナーゼの作用によって 再ホスホリル化してＡＴＰを形成するサイクルを開示する。また、当該特許は、 各サイクルにおいて１分子過剰のＡＴＰが生成される旨、開示する。この反応は 生物発光のためにＡＴＰを増幅するのに使用される。ＡＴＰ増幅の方法には、反 応の進行に充分な他の物質の添加、サイクル反応の停止、および生物発光分析お よびルミノメーターを用いる蓄積したＡＴＰの測定が包含される。 また、チトックら〔Biochemical society Transactions、1991年、19:160S〕 は、既知の生物発光反応の光強度は、ミオキナーゼ（アデニル酸キナーゼ）、ピ ル ビン酸キナーゼ、ホスホエノルピルベートおよびＡＭＰを含む系においてＡＴＰ を再循環させることによって増加できる旨、開示する。この著者はサンプル中に 当初から存在する２分子のＡＴＰの結末を検討している。１分子は、ルシフェラ ーゼ反応によって消費され、ＡＭＰへ変換される。次いで、ミオキナーゼ（アデ ニル酸キナーゼ）によって触媒される反応において、ＡＴＰの他の分子との反応 が進行して２分子のＡＤＰを形成する。その後これらの分子は、ピルビン酸キナ ーゼにより触媒されるホスホエノルピルベートとの反応によって再ホスホリル化 して、当初のＡＴＰ２分子を再生する。添加したＡＭＰは、再循環反応の進行を 補助するＡＴＰのための「トラップ」として記載される。 しかし、チトックらが提案した反応工程は、提案された再循環メカニズムがル シフェラーゼ反応のピーク発光量増大の観察を可能にさせる理由について、不明 である。なぜなら、ＡＴＰ濃度の正味の増加が全く起こらないからである。それ にもかかわらず、著者はかかる現象をＡＴＰの増幅として記載している。 発明の概要 かかる系は、単にＡＴＰの再生だけでなく、ごく低レベルのＡＴＰおよびＡＤ Ｐの定量化に使用しうる他の容易に検知可能な信号の形成や発色に利用できるこ とを知見するに至ったのである。この信号は、可視的であって、ルミノメーター のような付加的な装置のための予備的な条件を排除することができる。 更に詳しくは、本発明によれば、図１に示したようなタイプの連結反応を用い 、酵素基質Ｓ₁およびＳ₂の各々を含め、反応の進行に必要な他のサイクル成分を 供給し、基質（Ｓ₁またはＳ₂）の損失または好適には生成物（Ｐ）の形成を観察 することによって、相互に変換可能な化合物Ｃ₁およびＣ₂のいずれか一方または 両方の存在または酵素Ｅ₁およびＥ₂の存在を検出する。ＧＢ−Ａ−２０５５２０ ０開示の方法と比較すると、過剰のサイクル成分の観察に指数関数的な増幅を採 用している。 観察は、直接的に行うかまたは、検出可能な誘導体（または誘導反応）が得ら れるようなそれ自体既知の系に当該反応を連結して行うことができる。本発明に 伴う利点は、イエス／ノーの結果を得られること、当該反応が迅速であること、 お よび本発明の方法を微生物の検出に使用できることである。 図面の記載 添付の図面を参照しながら、単なる実施例によって本発明を説明する。 図１〜図５は、各々本発明に利用しうるような、多かれ少なかれ全般的な反応 工程である。 図６は本発明によって得られた結果を示すグラフである。 図４、図５などで用いる省略名は以下の意味である。 ＡＭＰ：アデノシン−５’−一リン酸 ＡＤＰ：アデノシン−５’−二リン酸 ＡＴＰ：アデノシン−５’−三リン酸 Ｇ６Ｐ：Ｄ−グルコース−６−リン酸 Ｇ ：Ｄ−グルコース ＡＡＰ：４−アミノアンチピリン ＤＭＡ：Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン Ｇox ：Ｄ−グルコノ−１,５−ラクトン ＡＫ ：アデニル酸キナーゼ ＧＫ ：グルコキナーゼ ＧＯ ：グルコースオキシダーゼ ＨＲＰ：ホースラディシュペルオキシダーゼ ＧＩＰ：Ｄ−グルコース−１−リン酸 Ｇ１,６ＤＰ：Ｄ−グルコース−１,６−二リン酸 ３ＰＧＰ：３−ホスホ−Ｄ−グリセロイル・ホスフェート ３ＰＧ：３−ホスホ−Ｄ−グリセレート ３ＰＨＰ：３−ホスホヒドロキシピルベート ＧＰＰＤＭ：グルコース−１−リン酸ホスホジスムターゼ ＧＢＰＳ：グルコース−１,６−二リン酸シンターゼ ＰＧＤＨ：ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ ＤＰＡ：ジアホラーゼ Ｃol ：色彩 ＩＮＶ：ＩＮＴ−バイオレット Ｆzn ：ホルマザン 発明の記載 本発明の基礎となる連結反応全般を、図１によって示す。当該サイクルを用い て１組の相互変換可能化合物Ｃ₁およびＣ₂の検出方法を、説明のためにのみ以下 に記載する。酵素Ｅ₁および酵素Ｅ₂の一方または両方の検出には、同様なメカニ ズムが適用される。 酵素Ｅ₁によって触媒される反応は、「コンプロポーショネーション（comprop ortionation）」反応であって、当該反応において、１分子の第１標的化合物Ｃ₁ は添加した基質Ｓ₁と反応して２分子の第２標的化合物Ｃ₂を形成する。触媒Ｅ₂ およびその共基質Ｓ₂の作用によって、これら２分子の化合物Ｃ₂は、酵素Ｅ₁の 基質として利用される２分子の第１標的化合物Ｃ₁へ変換する。したがって、１ 分子の第１標的化合物が２分子に変換し、サイクルの次のターンでは４分子、さ らにもう１つ次のターンでは８分子が順次生成される。 更に詳しくは、サイクルの第１、第２および第３ターンで行なわれる反応は、 以下の通りである。 １） Ｃ₁＋ Ｓ₁→２Ｃ₂ および２Ｃ₂＋２Ｓ₂→２Ｃ₁＋２Ｐ ２）２Ｃ₁＋２Ｓ₁→４Ｃ₂ および４Ｃ₂＋４Ｓ₂→４Ｃ₁＋４Ｐ ３）４Ｃ₁＋４Ｓ₁→８Ｃ₂ および８Ｃ₂＋８Ｓ₂→８Ｃ₁＋８Ｐ このように、標的化合物の指数関数的な増幅が生じる。当初から存在している 第２標的化合物の分子も同様な方法で増幅することができる。 図１に関し、サイクルの進行を継続しうる方法を選択できる。サイクルの進行 につれて、Ｓ₁およびＳ₂の濃度は減少する一方、Ｃ₁、Ｃ₂およびＰの濃度は増大 する。過剰のサイクル物質のいずれの当該濃度変化も、たとえば着色化合物の形 成または損失に関連付けるのに適しうる。増幅サイクルと同じ反応系において、 色彩の変化を生じさせることができない場合、サンプルを別の分析のために取り 出すことができ、またＰの除去はサイクル反応を促進することができる。 図２および図３は、本発明のより特異的な実施例を示し、ここでは２つの標的 化合物の相互変換には化学基の移動が包含される。たとえば、酸化還元活物質の 間における１またはそれ以上の電子の移動を含め、より一般的な類似のメカニズ ムが存在する。 図２におけるＸ−Ｙ−ＹおよびＸ−Ｙは、各々ＡＴＰおよびＡＤＰのような化 合物とすることができ、これらは、相互に１つのホスフェート基しか相異がない 。この場合の酵素Ｅ₁はアデニル酸キナーゼ（E.C.2.7.4.3.）とすることができ 、こ の酵素は、コンプロポーショネーション反応を触媒し、当該反応では１分子の第 １標的物質Ｘ−Ｙ−Ｙ（たとえばＡＴＰ）は１分子の添加基質Ｘ（たとえばＡＭ Ｐ）と反応して２分子の第２標的物質Ｘ−Ｙ（たとえばＡＤＰ）を形成する。こ の具体例の酵素Ｅ₂はキナーゼとすることができ、これは、添加したホスホリル 化共基質Ｚ−Ｙと共に、ホスホリレートＡＤＰをＡＴＰへ変換する。 図３は、化学基Ｙの流れ方向が本質的に反対である別のサイクルを示す。また 、この場合２つの標的化合物はＸおよびＸ−Ｙである。 図４は、ＡＤＰ／ＡＴＰ増幅の場合について、図２の酵素サイクルを発色工程 と連結したものを示す。酵素Ｅ₁はアデニル酸キナーゼおよび酵素Ｅ₂はグルコキ ナーゼであり、これは、Ｄ−グルコース−６−リン酸およびＡＤＰからＤ−グル コースおよびＡＴＰを生成させる。グルコースの濃度増加は、好適な色素原物質 とともに、グルコースオキシダーゼ（E.C.1.1.3.4.）およびホースラディシュペ ルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7.）の連結反応によってモニターすることで示さ れる。Ｅ₂として役立つ多数の別のキナーゼ酵素をその特異的共基質と一緒に利 用することができ、たとえば、ピルビン酸キナーゼ（E.C.2.7.1.40.）とホスホ エノルピルベート、酢酸キナーゼ（E.C.2.7.2.1.）とアセチル・ホスフェート、 ＮＡＤＨキナーゼ（E.C.2.7.1.86.）とＮＡＤＰＨ、フルクトキナーゼ（E.C.2.7 .1.4.）とＤ−フルクトース−６−リン酸またはグリセロールキナーゼ（E.C.2.7 .1.30.）とグリセロール−３−リン酸が挙げられる。事実、酵素命名法〔Enzyme Nomenclature、1984年、アカデミック・プレス〕のＩＵＢ推奨の２.７群からの多数の酵 素をかかる工程において使用することができる。各場合において、生成物は特異 的酵素反応、一連の酵素反応、化学反応、発色または色彩の消失によって検出す ることができる。 所望により、増幅試薬中のＡＴＰおよびＡＤＰの汚染レベルは、ＡＴＰ／ＡＤ Ｐの両者をＡＭＰへ加水分解するポテトアピラーゼ（E.C.3.6.1.5.）のような酵 素ともに当該試薬成分をはじめにインキュベートすることによって低下させるこ とができる。アピラーゼの存在は、低濃度であれば増幅サイクルを妨害しない。 したがって、ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの検出試薬は、ＡＭＰ、アデニル酸 キナーゼ、グルコキナーゼ、Ｄ−グルコース−６−リン酸、グルコースオキシダ ーゼ、アピラーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼおよび１またはそれ以上 の色素原ペルオキシダーゼ基質を好適なマグネシウムイオン含有緩衝剤系中に含 んでなる。サイクルは実質的に指数関数であるため、完全試薬中に存在する少量 のＡＤＰまたはＡＴＰ（恐らく単一の分子）は、基質の一方が消費されるまで急 速に増幅することができる。所望により、試薬は、分析サンプルの添加とほぼ同 時に混合されるような、２またはそれ以上の別々の溶液として調製することがで きる。 図２および図４は、検出可能で相互に変換可能な化合物の１つがＡＴＰである ことを示す。したがって、本発明は微生物存在に関する準備テストとして特に適 している。非常に低い微生物濃度の液体サンプルでも、たとえばマルチウエルプ レートのような担体上へ定位し、次いで反応の進行に必要な試薬を添加すること によって、テストすることができる。液体サンプル中の濃度が非常に低い場合で も、ＷＯ−Ａ−９３１９１９９記載の方法を用いて、微生物をウエル中に保持す ることができる。本発明は、合理的な時間内に肉眼で利用可能な結果を得ること で、各ウエル中の微生物を検出することができる。 ＡＴＰ／ＡＤＰ増幅サイクルの別法が存在する。条件は、（ｉ）１分子の第１ 標的物質を存在させることによって２分子の第２標的物質の形成を引き起こすよ うな、コンプロポーショネーション反応を触媒する酵素、および（ii）第２標的 物質から第１標的物質の形成を触媒する酵素である。実施例を図５に示す。図５ において、Ｅ₁はグルコース−１−リン酸ホスホジスムターゼ（E.C.2.7.1.41.） であり、Ｅ₂はグルコース−１,６−二リン酸シンターゼ（E.C.2.7.1.106.）であ り、標的物質はＤ−グルコース−１,６−二リン酸およびＤ−グルコース−１− リン酸である。次いで、酵素ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（E.C.1.1.1. 95.）の基質としてＥ₂によって生成される３−ホスホ−Ｄ−グリセレートを用い 、増幅サイクルの進行を継続して、ＮＡＤＨを生成することができるが、このＮ ＡＤＨは、化学的または酵素的手段（たとえば酵素ジアホラーゼ（E.C.1.8.1.4. ）によって触媒されるＩＮＴ−バイオレットとの反応）による発色に利用するこ とができる。 以下の実施例によって、本発明を説明する。 実施例１ 以下の組成を有する、２つの試薬である予備混合物ＡおよびＢを調製した（Ｍ ＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸） 各予備混合物を別々に２５℃で３時間インキュベートして、ＡＴＰおよびＡＤ Ｐ汚染物質を破壊した。次いで、３つのキュベットの各々において、予備混合物 Ａ（0.225ml）を予備混合物Ｂ（0.075ml）と混合し、サンプル０.３mlを直ちに 添加した。各サンプルは、ブランクサンプルとしての水、２０pＭ ＡＴＰおよび ２００pＭ ＡＴＰを含んでなる。次いで、各キュベットの５５５nmの吸光度を２ ００分×２５℃のインキュベーションの間に分光光度計で測定した。 吸光度（Ａ）一時間（Ｔ）のプロットを図６に示す。約１５０分の反応時間後 、３つのサンプルは肉眼で容易に区別できることに注目すべきである。溶液にお いて、より多量のＡＴＰを添加したものは、より迅速に紫色が現れた。 実施例２ 同様な試薬組成を用い、最確数（ザ・モースト・プロバブル・ナンバー）技術 に よって大腸菌（イー・コリ）の迅速な算出を行った。この方法は、培養液の希釈 度と、多数の区画室への均一な分布（この場合サンプル１つ当たり２４個）とを 基本とし、希釈度は、各セットが細菌不存在の区画室または少数の細菌が存在す る区画室のいずれかを含むように、選択する。次いで、増殖培地を添加して、細 菌を検出可能なレベルへ増殖し、増殖が陽性を示す区画室の数によって、サンプ ルの細菌数を評価する。この一般的な方法はＷＯ−Ａ−９３１９１９９に記載さ れている。 ５mＭ塩化マグネシウム含有０.９％（w/v）ＮaＣl中の大腸菌一夜培養液の希 釈を用い、各ウェルの底部に０.２μmの膜を有するマイクロタイター・プレート を、以下のように設定した。 カラム１〜６：０.０４ml希釈剤 カラム７〜９：０.０４ml、大腸菌１０^-8希釈 カラム10〜12：０.０４ml、大腸菌２.５×１０^-8希釈 真空にして液体を除去し、細菌を膜フィルター上に集めた。次いで、滅菌酵母 抽出ペプトンブロス０.１mlを各ウェルに添加し、マイクロプレートを覆い、３ ７℃で８.５時間インキュベートした。 インキュベーション期間の終了時において、ブロスを真空下に除去し、各ウェ ルを滅菌希釈剤０.２５mlで洗浄して、ブロス中に存在する非微生物ＡＤＰおよ びＡＴＰを除去した。再度、真空にしたのち、０.２２％（w/v）クロロヘキシジ ン・ジグルコネート（溶菌に使用されるカチオン性界面活性剤）０.０２５mlを 各ウェルに添加し、次いで希釈剤０.０２５mlを添加した。カラム１〜６につい ては、種々の濃度のＡＴＰ（0〜6×10^-9M）を希釈剤に添加（スパイク（spike） ）した。 実施例１と同様ではあるが、この実験では異なるサンプル容量を考慮に入れて 調節した成分濃度を有する２つの予備混合物を急速に混合し、０.１ml容量を直 ちに各ウェルに添加した。プレートを、３０℃でインキュベートしたセレッス（ CERES）９００ＨＤiマイクロプレート・リーダー（バイオ・テック）に入れ、吸 光度を５５０nmで３時間まで測定した。 明確な結果は７０分後に得られた。この時点でカラム１〜６では最も高濃度の ＡＴＰ標準（最終反応混合物中で１０^-9Ｍ）のみが測定可能な程度で発色した。 カラム７〜１２では、各ウェルの吸光度は出発の値（即ち負の値）に非常に接近 するか、または明確に検出可能（少なくとも１つの細菌が当初から存在すること を示す陽性）であるかのいずれかであった。カラム７〜９は１５個が陽性を示し 、これは、最確数２４.５／mlに相当する（95％信頼域13〜42）。カラム１０〜 １２は２１個が陽性を示し、最確数５２／ml（95％信頼域28〜91）を得た。当初 の大腸菌培養液の酵母抽出ペプトン寒天における従来からのプレートのカウント 数は、２つの希釈液について各々２９および７１cfu／mlと評価された。 したがって、当該方法は、大腸菌サンプルの評価のために１０時間よりも少な い時間しかかからなかった。発色の程度は肉眼でのプレートの読取りを可能にす るのに充分であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/48 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グラント、ピーター・レオナルド イギリス、ピーイー17・３ユーイー、ケン ブリッジ、ニーディングワース、ルセッ ト・アヴェニュー28番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： で示される反応に付される物質Ｃ₁、物質Ｃ₂、基質がＣ₁およびＳ₁である酵素Ｅ₁ および、基質がＣ₂およびＳ₂である酵素Ｅ₂のいずれかの存在を検出する方法で あって、 当該反応の進行に充分な他の物質を添加し、次いでＳ₁もしくはＳ₂の損失また はＰの形成を観察することを含んでなる方法。 ２．式： で示される反応に付される物質Ｘ−Ｙ、物質Ｘ−Ｙ−Ｙ、酵素e₁および酵素e₂の いずれかの存在を検出するために、 当該反応の進行に充分な他の物質を添加し、次いでＸもしくはＺ−Ｙの損失ま たはＺの形成を観察する請求項１記載の方法。 ３．式： で示される反応に付される物質Ｘ、物質Ｘ−Ｙ、酵素e₁および酵素e₃のいずれか の存在を検出するために、 当該反応の進行に充分な他の物質を添加し、次いでＺもしくはＸ−Ｙ−Ｙの損 失またはＺ−Ｙの形成を観察する請求項１記載の方法。 ４．物質Ｚ−Ｙがホスホエノルピルベートまたはグルコース−６−リン酸であ る請求項２記載の方法。 ５．Ｙがホスフェート基である請求項２〜４のいずれかに記載の方法。 ６．Ｘ、Ｘ−ＹおよびＸ−Ｙ−Ｙがヌクレオチド・ホスフェート類である請求 項５記載の方法。 ７．Ｘ、Ｘ−ＹおよびＸ−Ｙ−Ｙが、各々ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰである 請求項６記載の方法。 ８．ＡＤＰおよび／またはＡＴＰを検出する請求項１〜７のいずれかに記載の 方法。 ９．微生物を検出する請求項８記載の方法。 １０．Ｐの形成を観察することを含んでなる請求項１〜９のいずれかに記載の 方法。 １１．Ｐの形成に対し信号を発生するような１またはそれ以上の物質の存在下 に行う請求項１０記載の方法。 １２．Ｐを単離し、次いで請求項１１記載の１またはそれ以上の物質の添加に よって、単離したＰの存在を測定する請求項１０記載の方法。 １３．前記信号が可視的な色彩である請求項１１または１２記載の方法。 １４．請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法の使用に適した試薬を含んで なるキットであって、 当該試薬が、１またはそれ以上の容器中の前記した他の物質および前記した１ またはそれ以上の物質を含んでなるキット。