JPH08510127A

JPH08510127A - シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエのｈｒｐＺ遺伝子

Info

Publication number: JPH08510127A
Application number: JP6525560A
Authority: JP
Inventors: コルマー，アラン; ヒー，シェン−ヤン
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-05-17
Filing date: 1994-05-05
Publication date: 1996-10-29
Also published as: EP0702694B1; ATE334143T1; DE69434802D1; DE69434802T2; WO1994026782A1; EP0702694A4; ES2273332T3; US5708139A; US5858786A; EP0702694A1

Abstract

(57)【要約】シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）に対する過敏性応答として知られる植物の防御反応の蛋白性誘発物質に関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、その製造方法とともに記載する。

Description

【発明の詳細な説明】シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエのｈｒｐＺ遺伝子高等植物の過敏応答（ＨＲ）は、病原体の侵入部位における植物細胞の急激かつ局部的な死滅により特徴づけられている。ＨＲは、典型的には、別の植物においてのみ疾病を引き起こす微生物に関連する両立しえない相互作用の間に生じ、多くの線虫、真菌、ウイルスおよび細菌に対する抵抗性に関連している。ＨＲを誘発する細菌の能力は、クレメント（Klement）および共同研究者が、高レベルの蛍光性シュードモナス（Pseudomonas）であるシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ（Pseudomonas syringae pv．syringae）（豆類の病原菌）、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・タバチ（Pseudomonas syringae p v．tabaci）（タバコの病原菌）、およびシュードモナス・フルオレセンス（Pse udomonas Fluorescens）をタバコの葉の細胞間空間に注入した１９６３年に初めて報告された［ネイチャー（Nature）第１９９巻：２９９頁（１９６３年）；およびフィトパソロジー（Phytopathology）第５４巻：４７４頁参照］。彼らは、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエが浸潤した部位は崩壊したこと、２４時間以内に乾燥したこと、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・タバチが浸潤した部位はゆっくりと広がり、徐々に含水傷害が広がったこと、さらに、シュードモナス・フルオレセンスが浸潤した部位は何の応答も示さなかったことを観察した。より低い接種レベルにおいては、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエは目に見える反応を起こさなかったが、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・タバチはやはり疾病を引き起こした。シュードモナス・シリンガエ種は、その病原性の多様性が著しい（ヒラノ（Hi rano）およびアッパー（Upper），１９９０年）。種々の株は、擦り傷から「野火のごとき広がる」胴枯れ病に至るまでの徴候を引き起こし、十分に特徴づけられた毒性（徴候増強）因子は、植物ホルモンおよびペプチド毒と同じくらい多様であり、宿主特異性の多様なパターン（いくつかの場合、ａｖｒにより媒介される遺伝子対遺伝子相互作用を包含する）は実質的にはすべての作物植物を包含し、植物の関連は、エペフィティズム（epephytism）から国土を荒らす病因論に至るまでまでさまざまである。植物と病原微生物との相互作用における多くの重要な現象に関連するシュードモナス・シリンガエ種が存在し、よって、この種は多くの研究対象となっている。これらの初期の観察結果は、多くの研究者を、ＨＲに存する機構の研究へと駆り立てた。例えば、適合しない宿主中の低濃度の病原体は、散在した個々の植物細胞（１個の植物細胞を死滅させる引き金となる１個の細菌を伴う）におけるＨＲを引き起こすこと、さらに肉眼で見えるＨＲは自然条件下で作用しうる細胞の過敏性の証拠であることが知られている［フィトパソロジー（Phytopathology）第６４巻：８８５頁（１９７４年）参照］。さらに、ＨＲの誘発には、蛋白を合成でき、ドーム状の植物細胞の表面に接触する細菌が必要であることが知られている［フィトパソジェニック・プロカリオーツ（Phyt opathogenic Prokaryotes）第２巻,マウント（Mount）およびレイシー（Lacy）編,アカデミック・プレス（Academic Press）,１４９〜１７７頁（１９８２年）参照］。しかしながら、実際にＨＲを誘発する（逆説的には、病因論に不可欠な）シュードモナス・シリンガエ分子は把握しにくいままであった。宿主でない植物または宿主植物においてＨＲまたは病気を誘発するシュードモナス・シリンガエ株の能力は、ｈｒｐ遺伝子により調節され、典型的なＨｒｐ変異株はすべての植物において病原性のないヌル表現型（null phenotype）を有する［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻：４０６頁（１９８５年）；ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第１６８巻：５１２頁（１９８６年）；およびモレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ（Mol.Plant-Microbe Interact.）第４巻：１３２頁（１９９１年）参照］。ｈｒｐ遺伝子はクラスター化しており、いくつかのものは、その宿主を最終的に壊死させるグラム陰性病原細菌において広く保存されている。これらの病原体は、シュードモナス・シリンガエ、シュードモナス・ソラナセアルム（Pseu domonas solanacearum）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora ）、エルウィニア・ステワルティ（Erwinia stewartii）およびエルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）を包含する［モレキュラー・プラント− マイクローブ・インターラクションズ第５巻：３９０頁（１９９２年）参照］。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株（ブダペスト条約の要請に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託され、ＡＴＣＣ５５４２７と命名された）およびエルウィニア・アミロボナＲａ３２１由来のｈｒｐクラスターは、タバコおよび他の植物において非病原性細菌がＨＲを誘発することを可能にするという点で独特である［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７０巻：４７４８頁（１９８８年）；およびアドバンシズ・イン・モレキュラー・ジェネティックス・オブ・プラント−マイクローブ・インターラクションズ（Advances in Molecular Ge netics of Plant-Microbe Interactions）第２巻,ネスター（Nester）およびバーマ（Verma）編,クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ（Kluwer Academi c Publishers）,５３〜６０頁（１９９１年）参照］。かくして、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１のｈｒｐ遺伝子の２５ｋｂのクラスターは、細菌のＨＲ表現型（しかし、病原性の表現型ではない）に関して十分である［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７０巻：４７４８頁（１９８８年）参照］。ＴｎｐｈｏＡ突然変異およびコスミドｐＨＩＲ１１上で行われたシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１のｈｒｐ遺伝子のＨＲ活性クラスターの相補性分析を包含する本発明につながった初期の研究により、まず我々は、シストロンレベルにおいて１３の相補性群を同定することができた。そのうちの２つは外套蛋白をコードしていた。［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第４巻：４６９頁（１９９１年）、該開示を本明細書に取り入れる］。相補性群IIからXIIIまでにおけるＴｎｐｈｏ変異は、強力なＨｒｐ表現型を有し、マメ類の植物において疾病を悪化または引き起こす能力、およびタバコ細胞においてＨＲを誘発する能力を失っている。外套蛋白をコードしている２つの遺伝子のＤＮＡ配列分析により、ＨｅｐＨ（X群）産物は多くのグラム陰性細菌における蛋白またはファージ分泌に必要とされる外膜蛋白に類似であり、ＨｒｐＩ（IV群）は蛋白分泌調節における明らかな機能を有する内膜蛋白のスーパーファミリー（superfamily）の一員であることが明らかとなった［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：６８７８頁（１９９２年）参照］。それらの蛋白の推定上の読み取り枠も、シュードモナス・ソラナセアルムおよびキサントモナス・カンペストリス・ピーブイ・ベシカトリア（X.campestris pvv esicatoria）において報告されており、エルウィニア・アミロボラもまたＨｒｐＩ蛋白を産生することが示されている［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第５巻：３９０頁（１９９２年）；およびモレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第５巻：３８４頁（１９９２年）参照］。これらの観察結果は、いくつかの保存されたｈｒｐ遺伝子は、宿主でない植物においてＨＲを誘発し宿主における発病に必要とされる１種またはそれ以上の蛋白の分泌に必要であるという仮説を支持する。ハーピン（harpin）と命名されたＨＲの蛋白性誘発物質は、バラ科の植物の極めて広がりやすい病原菌であるエルウィニア・アミロボラＥａ３２１から単離された［サイエンス（Scie nce）第２５７巻：８５頁（１９９２年）参照、その開示を本明細書に取り入れる］。ハーピンは、見かけの分子量４４ｋＤａの、熱安定性のある、細胞の外套に関連した蛋白である。同種のｈｒｐＮ遺伝子を欠損した変異株は、タバコの葉においてＨＰを誘発できず、また、感受性の高い成熟したナシの果実において徴候を生じさせることができない。シュードモナス・シリンガエのＨＲ誘発物質の同定は有用である。なぜなら、この種およびその病原性変種は植物と病原体との相互作用におけるいくつかの鍵となる現象を調べるためのモデルとなっているからである。不幸なことに、エルウィニア・アミロボラのｈｒｐＮ遺伝子およびその産物に対する抗体によっては、対応するシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエの誘発物質を明らかにすることはできなかった。すなわち、サザンブロットされたシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のＤＮＡに対する緊縮性の低い条件でのプロービングによってはｈｒｐＮの相同性が見いだされず、さらにシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株の遺伝子を発現する活性のある細菌由来の蛋白のイムノブロットにおいては交差反応する蛋白が見いだされなかったのである。これらのｈｒｐ遺伝子を発現する細菌の培養液の無細胞抽出物における誘発物質の活性を検出することも不可能であった。それにもかかわらず、ＨｒｐＨはＨＲに必要とされるという観察結果により、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のＨＲ誘発物質は、その１次構造がエルウィニア・アミロボラのハーピンとは非類似であり、不明なことが多くても、やはり分泌蛋白であることが示唆された。かかる蛋白を見いだすために、本発明者らは、本発明の１の態様であるインサイチュ（in situ）溶解法を開発した。該方法により、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のハーピン遺伝子の発現ライブラリーをＨＲ誘発活性に関して直接スクリーニングすることが可能となった。かくして、ｈｒｐ遺伝子は、シュードモナス・シリンガエの病原性の多様性に存する共通要素であり、この種におけるｈｒｐ遺伝子の機能を調べることにより大きな説得力が得られるであろう。本発明者らは、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のｈｒｐクラスターの生物学的に活性のある産物は３４．７ｋＤａの細胞外蛋白であるハーピンＰ_ssであることを見いだし、本明細書に記載する。ハーピンＰ_ssは、ｈｒｐ依存的に細胞外環境に分泌されるものであり、最近発見されたＨｒｐ分泌経路を通じて細胞外環境に到達することが明確に示された最初の蛋白である。インサイチュ溶解法を用いて、本発明者らは、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のｈｒｐクラスターにおいて相補性群XIIは３４．７ｋＤａの蛋白をコードしており、該蛋白はｈｒｐＨ依存的に分泌されてタバコの葉においてＨＲを誘発し、さらに該蛋白は反復アミノ酸配列を有するカルボキシル末端領域中に誘発物質の情報を持っているという、本発明のもう１つの態様を説明することができる。ハーピンＰ_ssと命名された蛋白は、そのアミノ酸配列において、エルウィニア・アミロボラのハーピンＥａとは非類似であるが、この２種のハーピンは、ＨＲ誘発活性に関する蛋白のクラスの共通した構造上の特徴を示唆する他のいくつかの特性において類似である。本発明者らはサザンブロット分析を用いて、ハーピンＰ_ssをコードしているｈｒｐＺ遺伝子の同族体がシュードモナス・シリンガエの異なる病原性変種のうちのいくつかの重要な株に存在することを調べた。最終的には、代謝阻害剤（α−アマニチン、シクロヘキシミド、バナジン酸ナトリウムおよび塩化リチウム（シグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社製）を用いて、タバコの葉においてハーピンｐ_ssにより誘発されるＨＲは植物の積極的な応答により生じることを示した。病原性、寄生体との適合性、過敏性、および宿主範囲の決定は、特にシュードモナス・シリンガエ病原体が関与しうる植物−微生物相互作用における中心的現象である。シュードモナス・シリンガエと植物との不可欠は相互作用を媒介する分子の発見は、これらの現象に対する分子の面からの説明を促進するはずである。本発明のこれらの、そして他の態様は、以下の図面、実施例および発明の詳細な説明を参照して、より明確になるであろう。図中、図１は、本発明ＨＲ誘発物質を産生するｐＨＩＲ１１サブクローンの制限酵素地図を示し；図２は、本発明ハーピンＰ_ssの誘発物質活性における、保存または反復アミノ酸配列の役割を試験するのに用いるｈｒｐＺフラグメントのダイアグラムを示し；図３は、精製の前後におけるイー・コリ（E.coli）形質転換体により生産される本発明ハーピンＰ_ssおよびハーピンＰ_ssΔ１２５蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し；図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、最少培地中で増殖した６１株の培養物においてイー・コリ（ｐＳＹＨ４）およびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１により生産される本発明ハーピンＰ_ss蛋白の同一性を示すイムノブロットを示し；図５は、本発明の３株のシュードモナス・シリンガエがｈｒｐＺ同族体を有するというサザンブロットによる証拠を示し；図６は、さらに３株のシュードモナス・シリンガエにおけるハーピンＰ_ss同族体を示すイムノブロットを示す。より詳細には、図１は、ｐＨＩＲ１１および相補性群（complementation grou p）（ＴｎｐｈｏＡ突然変異により決定）ならびにｈｒｐクラスターからなる推定上の転写単位（Ｔｎ−ｇｕｓＡ１突然変異およびＤＮＡ配列分析により決定）［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第４巻：４６９頁（１９９１年）；フアング（Huang）ら,キャラクタリゼイション・オブ・ザ・シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ・ｈｒｐＪ・アンド・ｈｒｐＩ・ジーンズ：ホモロジー・オブ・ＨｒｐＩ・トゥ・ア・スーパーファミリー・オブ・プロテインズ・アソシエイテッド・ウイズ・プロテイン・トランスロケイション（Characterization of the Pseudomonas siringae pv．siringaehrp J and hrpI genes: homology of HrpI to a super family of proteins associa ted with protein translocation）,モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ,印刷中（１９９３年）；およびジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：１７３４頁（１９９２年）参照］を示す最上段の線を含む。分泌に関連する外套蛋白をコードしている２つの遺伝子（ｈｒｐＩおよびｈｒｐＨ）および誘発物質遺伝子（ｈｒｐＺと命名）が同定されている。相補性群Ａ（ｈｒｍＡ）は発病には必要でなく、さらに、相補性群Ａ、ＩおよびIIが、ＴｎｐｈｏＡならびにＴｎ−ｇｕｓＡ１挿入により定義されている［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第４巻：４６９頁（１９９１年）：フアング（Huang）ら,キャラクタリゼイション・オブ・ザ・シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ・ｈｒｐＪ・アンド・ｈｒｐＩ・ジーンズ：ホモロジー・オブ・ＨｒｐＩ・トゥ・ア・スーパーファミリー・オブ・プロテインズ・アソシエイテッド・ウイズ・プロテイン・トランスロケーション（ Characterization of the Pseudomonas siringae pv．siringae hrpJ and hrpI genes: homology of Hrpl to a superfamily of proteins associated with pro tein translocation）,モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ,印刷中（１９９３年）；およびジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：１７３４頁（１９９２年）参照］。ｐＳＹＨ１およびｐＳＹＨ４は、タバコの葉におけるＨＲ誘発活性により、ｐＨＩＲ１１サブクローンのランダムライブラリーにおいて同定された。サブクローンｐＳＹＨ５およびｐＳＹＨ８はｐＳＹＨ１の誘導体である。他のすべてのものはｐＳＹＨ４由来である。これらのサブクローンの産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析され、３２ｋＤａの蛋白は４２ｋＤａの蛋白のアミノ末端が切断された誘導体である。斜線を付したボックスは、各サブクローン中に存在するｈｒｐＺの読み取り枠の伸長を示す。ＢはＢａｍＨＩ；ＢｇはＢｇｌII；ＥはＥｃｏＲＩ；ＨはＨｉｎｄII I；ＶはＥｃｏＲVを示す。図２に関しては、下記実施例に記載されたように制限部位（図の最上段の線および下に示すＤＮＡ配列中に示す）を用いることによりサブクローンおよびｈｒｐＺの欠失誘導体をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に構築した。白い部分は、各プラスミドのＨｒｐＺ生成物を示し、左側がアミノ末端である。ｐＳＹＨ１０は完全なｈｒｐＺ読み取り枠を有し、ブダペスト条約の要請に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにイー・コリＤＨ５α（ｐＹＳＨ１０）として寄託された。寄託番号はＡＴＣＣ６９３１７である。黒い部分は、ハーピンＥａとの類似性を示す２２個のアミノ酸からなる領域を示す（下記ＤＮＡ配列を参照）。斜線を付した部分はＧＧＧＬＧＴＰをコードする反復部分である。網掛け部分はＱＴＧＴをコードする反復部分である。ビア（Beer）により概説された方法にしたがって、超音波処理したイー・コリＤＨ５α形質転換体のＰＭＳＦ処理抽出液を、タバコの葉における典型的なＨＲを誘発する能力について試験した［サイエンス第２５７巻：８５頁（１９９２年）参照］。ここに、「＋」はＨＲを示し、「−」は応答が観察されないことを示す。図３に関しては、慣用的方法を用いて調製され、クーマシーブルー染色されたＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥゲルであり、本発明による粗誘発物質標品の熱処理により得られた部分精製標品、および４％ＮｕＳｅｉｖｅアガロース（ＦＭＣ）による電気泳動およびその後の電気溶出により得られたさらなる精製標品を示す。レーン１、２および５は、それぞれ、イー・コリＤＨ５α（pBluescript）、ＤＨ５α（ｐＳＹＨ１）およびＤＨ５α（ｐＳＹＨ４）から得た全蛋白抽出物を示し、レーン３および６は、ＤＨ５α（ｐＳＹＨ１）およびＤＨ５α（ｐＳＹＨ４）の超音波処理物を熱処理した標品中の可溶性蛋白を示す。レーン４は、ＤＨ５α （ｐＳＹＨ１）から得たゲル精製ハーピンＰ_ssΔ１２５を示し、レーン７は、ＤＨ５α（ｐＳＹＨ４）から得たゲル精製ハーピンＰ_ssを示す。市販標準マーカー蛋白の分子量（ｋＤａ）を左に示す。図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに関しては、細菌をＯＤ₆₀₀が０.５〜０.８になるまでキング（King）のＢ培地で増殖させ、次いで、実施例IIIで詳述するように、最少培地またはキングのＢ培地で２４時間インキュベーションした。次いで、細胞および細胞外フラクションを遠心分離し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する前にＳＤＳローディングバッファー中で煮沸し、次いで、抗−ハーピンＰ_ss抗体でイムノブロットして証明（ＡおよびＢ）するか、あるいはクーマシーブルー染色（Ｃ）を行った。市販標準マーカー蛋白の分子量（ｋＤａ）を各図の左に示す。より詳細には、図４Ａは、抗−ハーピンＰ_ss抗体でプローブしてアルカリ性ホスファター結合ゼヤギ・抗−ウサギ抗体で可視化したイムノブロットであり、イー・コリＤＨ５α（ｐＳＹＨ４）およびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株により生産されたハーピンＰ_ss蛋白の移動度が同じであることを示す。レーン１は、イー・コリＤＨ５α（ｐＳＹＨ４）由来の精製ハーピンＰ_ssを示す。レーン２は最少培地で増殖したシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株の溶解物を示す。より詳細には、図４Ｂは、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエの細胞外ハーピンＰ_ssの生産は、ｈｒｐＨ、ｈｒｐＺおよびｈｒｐを抑制する最少培地に依存することを示す。レーン１は、キングのＢ培地における６１株由来の細胞フラクションを示す。レーン２は、キングのＢ培地における６１株由来の細胞外フラクションを示す。レーン３は、最少培地における６１株由来の細胞フラクションを示す。レーン４は、最少培地における６１株由来の細胞外フラクションを示す。レーン６は、最少培地における６１−２０８９株由来の細胞外フラクションを示す。レーン７は、最少培地におけるｈｒｐＺ変異株６１−２０９２由来の細胞フラクションを示す。レーン８は、最少培地におけるｈｒｐＺ変異株６１−２０９２由来の細胞外フラクションを示す。より詳細には、図４Ｃは、図４Ｂのレーン３〜８において分析されたのと同じ試料のクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１から６は上記レーン３から８に記載したものであり、細胞外フラクションへのハーピンＰ_ssの分泌は細胞溶解の結果ではないことを示す。より詳細には、図５のサザンブロットは、ｈｒｐＺのｐＨＩＲ１１中（レーン１）、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエＢ７２８ａ株中（レーン２）、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・グリシネア（glycinea）品種４中（レーン３）、およびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・トマト（ Tomato）ＤＣ３０００株中（レーン４）のＥｃｏＲＩフラグメントとのハイブリダイゼーションを示す。同様に消化されたエックス・カンペストリス・グリシネス（X.campestris glycines）（レーン５）はハイブリダイズしなかった。このデータの収集に使用したプローブは、以下に配列を示すｈｒｐＺ遺伝子の０.７５ｋｂのＢｓｔXl内部フラグメントであった（製造者の説明に従ってPrime-it I I（ストラタジーン（Stratagene）社製）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識）。インモビロン−Ｎ（Immobilon-N）膜（ミリポア（Millipore）社製）を用い、５８〜６０℃の中庸の温度において１４時間、ハイブリダイゼーションを行った。次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２ＸＳＳＣ中で１５分間室温にて膜を洗浄し、次いで、０.５％ＳＤＳを含有する０.１ＸＳＳＣ中、５８〜６０℃でさらに１時間洗浄した。コダック（Kodak）Ｘ−ＯｍａｔＡＲフィルムを用いて、−８０℃においてオートラジオグラフィーを３時間（レーン１、２、３、５）および７時間（レーン４）。標準マーカーフラグメントのサイズを左に示す。特に図６に関しては、他のシュードモナス・シリンガエ株から得たイムノブロットを示す。これらのイムノブロットを得るために、最少培地で２４時間培養を行い。培養物を直接超音波処理した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白を分離し、図４Ａのごとく免疫染色した。レーン１は、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株を示す。レーン２は、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエＢ７２８ａ株を示す。レーン３は、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・グリシネア品種４を示す。レーン４は、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・トマトＤＣ３０００株を示す。レーン５は、シュードモナス・フルオレッセンス５５株を示す。標準マーカー蛋白の分子量（ｋＤａ）を左に示す。以下の記載において、タバコ（ニコチアナ・タバクム・エル・シーブイ・サムスン（Nicotiana tabacum L.cv.Samsun））、トマト（リコペルシコン・エスクレントゥム・ミル・シーブイ・ペアーソン（Lycopersicon esculentum Mill.cv. Pearson））、大豆（グリシン・マックス・エル・シーブイ・ノルチエフ（Glyci ne max L.cv.Norchief））、ジャガイモ（ソラヌム・ツペロスム・エル・シーブイ・カタージン（Solanum tuperosum L.cv.Katahdin））、およびソラマメ（ファセオルス・ブルガリス・エル・シーブイ・ピント（Phaseolus vulgarisL.cv.P into））の市販種をグリーンハウス中、光周期１６時間として２３〜２５℃で成長させた。エイ・タリアナ（A.thaliana）（Ｃｏ−１）植物を、光周期１６〜２４時間として２１〜２３℃で成長させた。ＨＲを示すために本発明の以下の説明において用いる研究室的方法は簡単なものでる。まず、通常のまっすぐな解剖用針で穴をあけることにより、タバコの葉の細胞間空間を浸潤させる。次いで、０.１〜０.５ｍｌの細菌細胞懸濁液（通常は１０⁷〜１０⁸個の生細胞／ｍｌ）の入った１ｍｌ容シリンジで葉の片側の横の方に入れる。葉の反対側を指で押さえて葉を固定し、穴の部分から液が漏れないようにしながらシリンジのプランジャーを静かに押し込んで細菌懸濁液を葉の中に導入する。葉の水に浸された面積が１〜４ｃｍ²である場合に、浸潤は成功したものと見なす。ハーピンＰ_ss標品（ｐＨ６.５の５ｍＭリン酸バッファー中）または細菌（１０ｍＭＭｇＣｌ₂中）での植物の葉の浸潤を以下に説明する。特記しないかぎり、本明細書記載のすべてのＤＮＡ操作は慣用的プロトコールに従った［アウスベル（Ausbell）ら,カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology）,ジョン・ウィリー（John Wiley）（１９８７年）；およびサムブルック（Sambrook）,上記参照］。シークエンス・バージョン２.０キット（Sequence Version 2.0 kit）（ユーエス・バイオケミカル（U.S.Biochemical）社製）を用いてＤＮＡ配列決定を行った。ジェネティックス・コンピューター・グループ・シークエンス・アナリシス・ソフトウェア・パッケージ（Genetics Computer Group Sequence Ana lysis Software package）を用いて配列を分析した［ジーン（Gene）第１２巻：３８７頁（１９８４年）参照］。使用した２つのシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ・ＴｎｐｈｏＡ変異株、６１−２０８９および６１−２０９２は、以前構築された［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第４巻：４６９頁（１９９１年）参照］。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・グリシネア品種４（大豆のいくつかの栽培変種作物の病原菌）、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・トマトＤＣ３０００株（トマトのいくつかの栽培変種作物の病原菌）、ならびにエイ・タリアナを種々の源から得た。さらにシュードモナス・フルオレッセンス５５株（非病原菌）はすでに報告されているものであった［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７０巻：４７４８頁（１９８８年）参照］。主に使用したイー・コリ株はＤＨ５α株（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ Bethesda Research Laboratories））であった［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）第１６６巻：５５７頁（１９８８年）参照］。ｐＨＩＲ１１のＨｒｐ⁺表現型を観察する必要がある実験には、ＭＣ４１００株［シルハビー（Silhavy）ら,イクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョンズ（Experiments with gene fusions）,コールド・スプリング・ハーバー（Co ld Sprong Harbor）（１９８４年）］を用いた。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株の２５ｋｂのｈｒｐ遺伝子クラスターを含んでいるコスミドクローンであるｐＨＩＲ１１は、シュードモナス・フルオレッセンスおよび多くのイー・コリのＲｅｃＡ⁺株のごとき非病原性細菌が植物における過敏性応答を誘発することを可能にする［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７０巻：４７４８頁（１９８８年）参照］。ｐＳＹＨ１およびｐＳＹＨ４は、 pBluescript SK（ストラタジーン社製）中のｐＨＩＲ１１のサブクローンであり、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエのｈｒｐＺ遺伝子を含んでいる。本明細書記載の微生物は、本発明の実施に用いるとしてても、あるいは有用性を示すためのスクリーニングに用いるとしても、それらは市販されているか、本明細書に引用した文献の著者から得られるか、あるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ベセスダ）に寄託されている。さらに、本明細書記載の微生物は、デパートメント・オブ・プラント・パソロジー・アット・コーネル・ユニバーシティー（Departmant of Plant Pathology at Cornell University）（ニューヨーク州イサカ（Ithaca））において維持されており、ブダペスト条約と同等の規定に基づきデパートメント・オブ・プラント・パソロジーに要請する研究者はその微生物を利用することができる。フイン（Huynh）のｈｒｐ抑制最少培地［サイエンス第２４５巻：１３７４頁（１９８９年）参照］であると断らない限り、シュードモナスをｐＨ５.５に調節したキングのＢブロス［ジャーナル・ラボ・メディ（J.Lab.Med.）第２２巻：３０１頁（１９５４年）参照］中３０℃で通常どおり増殖させた。イー・コリをＬＭまたはテリフィック・ブロス（Terrific Broth）［サムブルック（Sambrook ）ら,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）,第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８９年）参照］中、プラスミド抽出には３７℃で、蛋白発現には３０℃で増殖させた。上記サムブルックらにより報告された認められている化学的方法、または製造者に指示に従いジーン・パルサー（Gene Pulser）（バイオラッド（Bio-Rad）社製）を用いる電気穿孔法により、プラスミドを細菌中に導入した。植物中での細菌による溶解に基づくハーピンＰ_ss生産組み換えイー・コリの迅速同定法を下記実施例に記載する。実施例I 慣用的方法を用いて、ｐＨＩＲ１１の部分Ｓａｕ３Ａサブクローン（１.５〜３.５ｋｂの挿入断片）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）中に組み込み、イー・コリＤＨ５α中で維持した。２００個のランダムに選択された形質転換体を、タバコの葉におけるＨＲ誘発活性についてスクリーニングした。１ｍＭＩＰＴＧ含有テリフィック・ブロス（Terrific Broth）中、室温で一定の振盪をしながら形質転換体を増殖させた。遠心分離により細菌を集め、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）および１０ｍＭＥＤＴＡからなる溶液中、ＯＤ₆₀₀を０.４ないし０.６としてで１０分間インキュベーションした。この処理により、細菌の外膜が細菌を溶解するリゾチームのごとき高分子に対して透過性となった。次いで、遠心分離により細胞を集め、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する同体積の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に再懸濁した。直ちに懸濁液をタバコの葉中に浸潤させた。ＨＲ表現型を２４時間後に記録した。本発明ハーピンＰ_ssを、以下の実施例を用いて均一に精製した。実施例II 適当なプラスミドを含有しているイー・コリＤＨ５α細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧ存在下、テリフィック・ブロス中３０℃で一晩増殖させた。遠心分離により細菌を集め、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６.５）にてペレットを１回洗浄し、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ,セリンプロテアーゼ阻害剤）を含有する１０分の１体積の同バッファーに再懸濁した。次いで、超音波発生器ウルトラソニック・セル・ディスラプター（Ultrasonic Cell Disruptor）（登録商標）（ヒート・システム−ウルトラソニックス（Hea t System-Ultrasonics）社製）を用いる超音波処理により細胞を破壊した（出力４、パルスサイクル時間を４０％デューティーサイクルにセット、これらの条件下で１０ｍｌの細菌懸濁液を氷で冷却しながら１０分間超音波処理した）。超音波処理物を１００℃で１０分間処理し、次いで、１６５００ｘｇで２０分遠心分離を行った。０.０２５ＭＴｒｉｓ、０.１９２ＭグリシンからなるｐＨ８.３のバッファー中の慣用的な水平アガロースゲル電気泳動により上清中の蛋白を分離した。個々の蛋白を含むアガロースの領域を切り出し、製造者の指示に従いエルトラップ（Elutrap）装置（シュライヒャー・アンド・シュール（Schleicher and Schu ell）社製）を用いてアガロースのブロックから蛋白を溶出した。セファデックスＧ−２５スピンカラムに通すことにより溶出物を脱塩した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロッティングの条件は、ヒー［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第１７３巻：４３１０頁（１９９１年）参照］により報告されたものと同じであった。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ培養物の細胞外液中の誘発物質活性の検出を以下の実施例記載のごとく行った。実施例III シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株および６１−２０８９株を、まず、５０ｍｌのキングのＢブロス中、３０℃でＯＤ₆₀₀が０.５ないし０.８になるまで増殖させた。遠心分離により細胞を集め、５ｍｌのｈｒｐ抑制最少培地［サイエンス第２４５巻：１３７４頁（１９８９年）参照］にて１回洗浄し、５０ｍｌの同培地に再懸濁し、振盪しながら一晩インキュベーションした。培養物を２７０００ｘｇで３０分遠心分離し、得られた上清を直ちに沸騰水浴中に１０分間置き、２００倍体積の１０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５.５）および１ｍＭＰＭＳＦに対して一晩透析し、セントリコン（Centricon）１０チューブ（アミコン（Amicon）社製）を用いる限界濾過により５０倍に濃縮した。次いで、濃縮された上清を、同バッファーを用いて種々の程度に希釈し、タバコの葉に浸潤させた。ＨＲ徴候を２４時間後に記録した。切断されたハーピンＰ_ssポリペプチド産生する本発明ｈｒｐＺ誘導体の構築および分析を、以下の実施例に従って行った。実施例IV ＭｓｃIおよびＫｐｎIでの消化、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理、次いで再連結により、ｐＳＹＨ１２［図２］をｐＳＹＨ５から誘導した。ｐＳＹＨ１４は、 pBluescript SK（−）のＥｃｏＲＶ部位中のｐＳＹＨ５の０.７３ｋｂのＭｓｃI −ＥｃｏＲVフラグメントを含んでいる。ｐＳＹＨ２６は、pBluescriptのＥｃｏＲV部位中のｐＳＹＨ５由来のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理された０.６ｋｂのＡｖａII−ＥｃｏＲVフラグメントを有している。ｐＳＹＨ３２は、pBluescript SK（−）のＳｍａI部位中のｐＳＹＨ５由来のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理された０.７３ｋｂのＰｖｕII−ＥｃｏＯ１０９１フラグメントを有している。すべての構築物は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端の３０ないし４１個のアミノ酸を伴う翻訳融合物を生じ、ｈｒｐＺ停止コドン（ｐＳＹＨ１４およびｐＳＹＨ２６）またはpBluescript SK（−）多重クローニング領域中の停止コドン（ｐＳＹＨ１２、ｐＳＹＨ３２およびｐＳＹＨ３３）において翻訳を終止する。イー・コリＤＨ５α形質転換体を０.５ｍＭＩＰＴＧ含有テリフィック・ブロス中、３０℃で一晩増殖させることにより誘発物質活性分析を開始した。遠心分離により細胞を集め、５ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５.５）で２回洗浄し、１ｍＭＰＭＳＦを含有する５分の１体積の同バッファーに再懸濁し、超音波処理により破壊した。超音波処理物を１６５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清フラクションをタバコの葉中に浸潤させた。説明したように、植物内での細菌による溶解を用いるスクリーニング法は、本発明ピー・シリンガエのＨＲ誘発物質を発現するイー・コリ形質転換体の同定を容易にした。ＨＲ誘発活性を非病原性細菌に付与するｐＨＩＲ１１の能力は、そのｈｒｐクラスターが誘発物質をコードしている遺伝子を有している可能性があることを本発明者らに示唆するものであり、よって、pBluescript SK中のｐＨＩＲ１１の部分消化されたＳａｕ３Ａフラグメント（１.５〜３.５ｋｂ）の発現ライブラリーを調製し、イー・コリ形質転換体をタバコの葉におけるＨＲ誘発活性についてスクリーニングした。先の観察結果は、インサイチュ溶解法の利用は誘発物質活性に検出を容易にするであろうということを示唆するものであった。初期の報告には、イー・コリＭＢ５５０４において外膜の漏出性を付与するｅｎｖＡ１変異は、ｐＨＩＲ１１におけるｈｒｐＨ変異を表現型的には抑制することができないことが記載されていたが［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：６８７８頁（１９９２年）参照］、そのことにより、本発明者らは、他のｈｒｐ遺伝子の不存在下においてはｈｒｐサブクローンにより産生される誘発物質は細胞質に存在する可能性があり、それゆえ、細胞溶解後にのみ検出可能であると確信した。本発明によれば、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ,セリンプロテアーゼ阻害剤）で処理されたイー・コリＭＣ４１００株（ＡＴＣＣ寄託番号３５６９５）（ｐＨＩＲ１１）、シュードモナス・フルオレッセンス５５株（ｐＨＩＲ１１）およびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株（ｐＨＩＲ１１）の培養液または超音波処理した抽出液においては誘発物質活性の検出を観察することはできなかった。このことは、本発明者らに、誘発物質が非常に不安定であることを示唆した。植物体外での溶解物の調製を迂回するために、本発明者らは、本発明の１態様（実施例Ｉ）、すなわち、接種時にＥＤＴＡおよびリゾチーム処理を行うことにより植物中でイー・コリを溶解させることを開発した。この方法によりスクリーニングされた２００個のランダムに選択されたイー・コリ形質転換体のうちの２個（１％）が、迅速に葉の組織を崩壊させるというＨＲの特徴を示すことがわかった。溶解工程を省略した場合、あるいはこれらの２つのサブクローンを欠くイー・コリＤＨ５α細胞に対して溶解を行った場合には崩壊は起こらなかった。プラスミドｐＳＹＨ１およびｐＳＹＨ４を、２個の陽性形質転換体から単離した。重複したサブクローンはハーピンＰ_ssおよび切断された誘導体を産生し、両サブクローンは熱安定性のＨＲ誘発活性を有していた。ｐＳＹＨ１およびｐＳＹＨ４の制限酵素地図（図１）は、２つのプラスミド中の挿入断片は、ｐＨＩＲ１１の相補性群XIIと符号する２.０ｋｂの領域において重複していることを示す。興味深いことに、その２つのプラスミドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると異なるサイズの蛋白を発現した。ｐＳＹＨ１は３２ｋＤａの蛋白を発現し、ｐＳＹＨ４は４２ｋＤａの蛋白を発現した。両方の蛋白は可溶性のままであり、１００℃で１０分のインキュベーション後でも８５％より高い誘発物質活性を保持しており、そのことにより、迅速な部分精製が容易となった。４.０％アガロースによる電気泳動により均一まで精製した後、蛋白はタバコの葉において、０.６μＭ（３２ｋＤａの蛋白）および２.４μＭ（４２ｋＤａの蛋白）でＨＲを誘発した。さらなるサブクローン化により、３２ｋＤａの蛋白は４２ｋＤａの蛋白の切断生成物であることが明らかとなった。よって、ＨＲ誘発において、切断生成物は全長蛋白の４倍の活性があった。慣例に従い、ハーピンＰ_ssの名を４２ｋＤａの蛋白に用いて、現在ハーピンＥａと呼ばれているビア［サイエンス第２５７巻：８５頁（１９９２年）参照］により報告されたエルウィニア・アミロボラのハーピンと区別した。ｐＳＹＨ４によりコードされる３２ｋＤａの蛋白は、アミノ末端の１２５個のアミノ酸が欠失しており、それゆえハーピンＰ_ssΔ１２５という。ハーピンＰ_ssはｐＨＩＲ１１によってのみコードされるＨＲ誘発物質であると思われる。ＨＲ誘発活性を示すクローンは他にはない。さらに本発明者らは、ハーピンＰ_ssは、ｈｒｐ遺伝子を抑制する最少培地中でシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株により生産され、該蛋白はＨｒｐＨに依存する様式で分泌されることを本明細書に示す。このことを示すために、慣用的方法を用いて、イー・イＤＨ５α（ｐＳＹＨ４）から精製された４２ｋＤａのハーピンＰ_ss蛋白に対する抗体をウサギにおいて生成させ、該蛋白およびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株由来の蛋白を負荷したイムノブロットＳＤＳ−ＰＡＧＥのプローブとして用いた。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株を、キングのＢブロスまたはｈｒｐ抑制最少培地において増殖させた。次いで、両方の細胞溶解物および培養液フラクションを分析した。図４Ａは、種６１株が、抗ハーピンＰ_ss抗体と交差反応し、生成ハーピンＰ_ssと同じ移動度を有することを示す。図４Ｂは、ｈｒｐ遺伝子発現を抑制［サイエンス第２４５巻：１３７４頁（１９８９年）参照；アップライド・アンド・エンバイオロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl .Environ.Microbiol.）第５５巻：１７２４頁（１９８９年）；ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：３４９９頁（１９９２年）；およびジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：１７３４頁（１９９２年）参照］するキングの培地中のシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエによってはこの蛋白は生産されず、さらにｈｒｐＺ変異株であるシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１−２０９２株によってもこの蛋白は生産されないことを示す。当該結果は、野生型シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株による４２ｋＤａの蛋白の生産を確認するものであり、明らかな蛋白のｈｒｐ依存性翻訳後プロセッシングに対する議論となる。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株におけるハーピンＰ_ssの局在性を調べるために、ｈｒｐ抑制最少培地で２４時間増殖させ、遠心分離により分画し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で抗ハーピンＰ_ss抗体をプローブとしてイムノブロットすることによりハーピンＰ_ssの分配を分析した。図４Ｂに示すように、ハーピンＰ_ssの半分以上が培養上清に見いだされた。培養上清ならびに細胞溶解物中の全蛋白のクーマシーブルー染色（図４Ｃに示す）により、ハーピンＰ_ssに放出は細胞溶解によるものではないことが示された。そのうえ、図４Ｂは、ハーピンＰ_ssは、ｈｒｐＨ変異株であるシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１−２０８９の培地には分泌されなかったことを示す。ｈｒｐＨは、いくつかのグラム陰性細菌における蛋白またはファージ分泌に必要であることがわかっている外膜蛋白に類似した配列の外套蛋白をコードしており、該外套蛋白はシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株がＨＲを誘発するのに必要とされる。予想したように、ハーピンＰ_ssは生産されたが、ｈｒｐＨ細胞中に保持された。よって、ハーピンＰ_ssはＨｒｐ分泌経路を経て分泌される細胞外蛋白であり、その輸送はＨＲの誘発に不可欠である。ハーピンＰ_ssが分泌されるという観察結果は、本発明者らの以前の検出の失敗にもかかわらず、ｈｒｐ抑制培地で増殖したシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ培養の菌体外液は、誘発物質活性を有するはずであるということを示唆する。実際に、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株培養物の透析上清は、タバコの葉において典型的なＨＲを誘発することが見いだされたが、それは集菌後ただちに１００℃で１０分インキュベーションし、ＰＭＳＦ存在下で透析し、次いで、限界濾過により３０倍以上に濃縮した場合にのみ見いだされた。同様に調製されたシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１−２０８９株培養物由来の上清はＨＲを誘発しなかった。本発明ｈｒｐＺのＤＮＡ配列分析により、その生成物であるハーピンＰ_ssが既知蛋白には類のないグリシンに富む蛋白であることが明らかとなった。ｐＳＹＨ１０およびｐＳＹＨ５中のＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列を当該分野において知られた方法を用いて決定し、本発明ｈｒｐＺ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：３）を以下に示す。ｐＳＹＨ１０中にあり、完全なｈｒｐＺの読み取り枠を有するシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列を、本明細書記載の他のサブクローンの範囲を決定する重要な制限部位とともに上に示す。矢印の後に示されたプラスミドは指示された制限部位の５’側に欠失を有しており、かっこ内に示されたプラスミドは指示された制限部位の３’側に欠失を有する。このＤＮＡ（すなわち、ヌクレオチド８１〜１１０３、または配列番号：４）の産物、すなわち本発明ハーピンＰ_ssの予想アミノ酸配列（配列番号：５）は以下のごとし。このアミノ酸配列において、精製ハーピンＰ_ssの配列決定により確認されたアミノ酸をイタリックで示す。エルウィニア・アミロボラのハーピンＥａと類似の領域を１本下線により示し（同一アミノ酸を太字で示す）、ハーピンＰ_ss中の反復アミノ酸配列を２本下線により示す。ハーピンＰ_ssの暗号配列は、ヌクレオチド８１から開始し１１０３で終了する、３４.７ｋＤａのものである。これはＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価したハーピンＰ_s _s のサイズ（図３）よりも小さく、蛋白がこれらのゲル中を異常な移動をした可能性がある。このことは、質量スペクトル計（レイザーマット（Lazermat）,フィンニガン・マット（Finnigan Mat））を用いる分子量のより正確な測定により確認され、ハーピンＰ_ssは３４.７ｋＤａであり、ハーピンＰ_ssΔ１２５は２５. １ｋＤａと算定され、配列からの推定値と極めてよく一致した。精製ハーピンＰ_ss およびハーピンＰ_ssΔ１２５のアミノ末端配列決定によりハーピンＰ_ssの開始コドンが確認され、ハーピンＰ_ssΔ１２５はβ−ガラクトシダーゼのＮ末端配列を有し、それゆえ融合蛋白であることが確認された。ハーピンｐ_ssは、ブラスト・サーチ・プログラム（Blast search program）［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）第２１５巻：４０３頁（１９９０年）参照］でアクセスできる主な配列データベースに寄託された配列と類似する有意な配列を有しておらず、さらにジェネティックス・コンピューター・グループ・シークエンス・アナリシス・ソフトウェア・パッケージ（Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package）のＭＯＴＩＦプログラム［ジーン第１２巻：３８７頁（１９８４年）参照］を用いてハーピンＰ_ssに関して検索される既知の生物学的に有意なモチーフも存在しない。しかしながら、限定的ではあるが、興味深い配列の類似性が、ハーピンＰ_ssとハーピンＥａとの間において２２アミノ酸の長さにわたり検出された。ハーピンＰ_ssはグリシンに富み（１３.５％）、システインおよびチロシンを欠く。ハーピンＰ_s _s のアミノ末端配列は、Ｓｅｃ輸送経路を通る細菌の細胞質膜を越えたトランスロケーションに関する蛋白を標的とする典型的な配列とは類似でない。明らかなトランスメンブレン配列および疎水性配列はハーピンＰ_ssには存在しない。実際、ハーピンＰ_ssは非常に親水性であると思われ、イー・コリで発現された場合、可溶性の細胞質蛋白である。ハーピンＰ_ssをコードしている遺伝子は、エルウィニア・アミロボラのｈｒｐＮ遺伝子とはほとんど関連性を示さず、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のｈｒｐクラスターの見かけ上の最終産物をコードしているので、その遺伝子はｈｒｐＺと命名された。ハーピンＰ_ssのカルボキシル末端の１４８個のアミノ酸部分は、２種の直接的な反復配列を含むことが見いだされ、該１４８個のアミノ酸部分は誘発物質活性にとり十分なものである。該２種の配列ＧＧＧＬＧＴＰ（配列番号：１）およびＱＴＧＴ（配列番号：２）は、ハーピンＥａとの類似性を示す２２個のアミノ酸の領域に対するカルボキシル末端であるハーピンＰ_ssの当該部分において直接的に反復されている。誘発物質活性におけるハーピンＰ_ssのこれらの特徴の重要性を評価するために、一連の欠失体をｈｒｐＺにおいて構築した。図２は、サブクローンおよび欠失誘導体の構築に使用されたｈｒｐＺ制限部位、ならびに得られたハーピンＰ_ssポリペプチドを示す。抗ハーピンＰ_ss抗体を用いるイムノブロット分析により、種々のプラスミドによる予想されたサイズのポリペプチドの生産が確認された。プラスミドを有するイー・コリＤＨ５α細胞をＰＭＳＦ存在下で超音波処理し、可溶性抽出物をタバコの葉中に浸潤させた。ｐＳＹＨ１４により産生されたポリペプチドの異なった効果により、ハーピンＥａと類似性のある領域は、誘発物質活性にとり十分でも必要でもないことが示された。対照的に、両方の反復配列を有するすべてのポリペプチドにより、２４時間以内に典型的なＨＲが誘発された。さらに、ｐＳＹＨ３３により産生されたポリペプチドの効果は、反復配列の両方の組が誘発物質活性には不可欠であることを示唆する。サザンブロットおよびイムノブロット分析は、他のピー・シリンガエ病原性変種においてｈｒｐＺ同族体が存在し発現されていることを示唆する。ｈｒｐＺ配列が他のシュードモナス・シリンガエの病原性変種に存在するか否かを決定するために、本発明者らは、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエＢ７２８ａ株、シュードモナス・シリンガエ・トマトＤＣ３０００株およびシュードモナス・シリンガエ・グリシネア品種４由来のＥｃｏＲI消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットにおけるプローブとして、ｈｒｐＺ内にあるＢｓｔXIフラグメントを用いた。これら３種の株は、実験的に興味深い多様なシュードモナス・シリンガエの病原菌であるという理由で選択された。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエＢ７２８ａ株は、ソラマメに茶色の斑点を生じさせ、植物病理学者による寄生適合性の研究のための適当なモデルとなっている。シュードモナス・シリンガエ・トマトＤＣ３０００株は、トマトの細菌小斑を生じさせ、さらにアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のいくつかの生態型に対する病原菌である。シュードモナス・シリンガエ・グリシネア品種４は、大豆の胴枯れ病を引き起こす。後者２株は、ａｖｒ遺伝子依存性（遺伝子対遺伝子）不和合性の減少の研究に特に有用である。図５に示すように、これらの各病原菌からの単一バンドはｈｒｐＺプローブにハイブリダイズし、該遺伝子が種シュードモナス・シリンガエにおいて広く存在することが示唆された。しかし、ハイブリダイゼーションシグナルの強度はさまざまで、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエＢ７２８ａ株が最も強く、この株がシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株に最も関連している。さらに本発明者らは、エックス・シー・グリシネス（X.c.glycines）におけるｈｒｐＺ同族体の存在について検索したが、ハイブリダイゼーションは観察されなかった（図５のレーン５）。抗ハーピンＰ_ss抗体と交差反応する蛋白の生産について分析した。細胞をｈｒｐ抑制最少培地中で２４時間増殖させ、培地を直接超音波処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをイムノブロットすることにより得られた溶解物を分析した。図６に示すように、交差反応のバンドがシュードモナス・シリンガエの３株すべてにおいて検出されたが、非病原性のシュードモナス・フルオレッセンスにおいては検出されなかった。タバコ以外に、いくつかの高等植物のハーピンＰ_ssに対する応答を試験し、異なる植物が異なるレベルのハーピンＰ_ssに対する感受性を有することがわかった。これらの植物には２種のナス科の植物（トマトおよびジャガイモ）、２種のマメ科（ソラマメおよび大豆）ならびに典型的なアブラナ科であるエイ・タリアナ（A.thaliana）が包含されていた。５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６.５）中のハーピンＰ_ssΔ１２５およびハーピンＰ_ssは、ジャガイモの葉（それぞれ＞０. ６μＭおよび＞２.４μＭ）およびトマトの葉（それぞれ＞５μＭおよび＞２０ μＭ）において、７〜１６時間以内に使用誘発物質濃度に対応したＨＲを誘発した。さらにハーピンＰ_ssΔ１２５は、大豆の葉（＞５０μＭ）およびエイ・タリアナ（＞５０μＭ）の葉においてもＨＲを誘発した。ハーピンＰ_ssΔ１２５およびハーピンＰ_ssのいずれについても、６０μＭの濃度において、ソラマメ（シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株の宿主植物）の葉においては何の応答もなかった。現行の分析条件下（プロテアーゼ阻害剤無添加）では、大豆およびエイ・タリアナの葉におけるＨＲはハーピンＰ_ssに応答するものは一貫して観察されなかったし、さらにＨＲは葉により異なっていた。ハーピンＰ_ssに対する異なる植物の異なる応答は、大豆、エイ・タリアナおよびソラマメのごときいくつかの植物はハーピンＰ_ssに対して低い感受性を有するか、またはハーピンＰ_ssをより迅速に分解するか、あるいはその両方であることを示すといえる。これらの植物種の精製ハーピンＰ_ssに対する応答は、ハーピンＰ_ss生産細菌に対する応答と相関関係があるが、生きた細菌により送達されるハーピンＰ_ss はより効果的と思われるということが重要である。例えば、シュードモナス・フルオレッセンス５５株（ｐＨＩＲ１１）は、エイ・タリアナの葉における細胞密度（＞１ｘ１０⁸個／ｍｌ）よりも低い細胞密度（１ｘ１０⁷個）でタバコの葉においてＨＲを誘発した。５ｘ１０⁸個より高い密度において、シュードモナス・フルオレッセンス５５株（ｐＨＩＲ１１）はソラマメの葉において組織の壊死を弱く誘発した。さらに、タバコにおいてハーピンＰ_ssにより誘発されたＨＲは、植物の積極的な応答であることがわかった。ハーピンＰ_ssにより誘発されたＨＲが、直接的な毒性効果から生じるものか、あるいは壊死につながる積極的な応答の誘発から生じるものかを調べるために、植物の代謝に対する種々の阻害剤を試験して、それらがＨＲを防止しうるかどうかを調べた。そのうえ、精製ハーピンＰ_ssの利用により、細菌による代謝またはｈｒｐ遺伝子発現の不存在下で植物代謝の阻害剤を使用することが可能になった。使用した４種の阻害剤はα−アマニチン（真核細胞ＲＮＡポリメラーゼIIの特異的阻害剤）、シクロヘキシミド（８０Ｓリボゾームの特異的阻害剤）、バナジン酸塩（ＡＴＰアーゼおよびホスファターゼの阻害剤）およびランタン（カルシウムチャンネルブロッカー）であった。４種すべての阻害剤は、α−アマニチンについては２.２ｘ１０^-4Ｍ、シクロヘキシミドについては７.１ｘ１０^-5Ｍ、バナジン酸については５ｘ１０^-5Ｍ、ランタンについては１ｘ１０^-3Ｍの濃度で精製蛋白とともに同時浸潤させた場合、タバコの葉において、ハーピンＰ_ssにより誘発されるＨＲを効果的に防止することがわかった。実験中（１６〜２４時間）に細胞内部にどれくらいの濃度の阻害剤が存在したのかは不明であるが、それにもかかわらず、実験により、ハーピンＰ_ssにより誘発されるＨＲは積極的な過程であり、以下の重要な代謝プロセスを必要とする可能性があることが明確に示された。以下の重要な代謝プロセスとは、デノボ（ de novo）遺伝子発現ならびに蛋白合成、膜を通過するカルシウムの流れ、およびＡＴＰアーゼ活性である。よって、ハーピンＰ_ssは、直接的な毒物としてよりもむしろ過敏性の誘発物質として作用する。さらに、ハーピンＰ_ssがシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のＨＲ誘発物質であるということを示す強力な証拠が存在するということが、本発明によりわかった。本発明者らは、以前、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のｈｒｐクラスターのすべてのｈｒｐ相補性群におけるＴｎｐｈｏＡ挿入は、非病原性細菌のヌル表現型（null phenotype）を生じることを観察した［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ（Mol.Plant-Microb e Interact.）第４巻：４６９頁（１９９１年）参照］。すなわち、変異株は、宿主でないタバコの葉においては、宿主のソラマメの葉における水に浸った状態、壊死障害を増加または生成するようなＨＲを誘発しない。このことに基づいて、本発明者らは、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株が植物と相互作用するのに不可欠な唯一の因子の生成にｈｒｐ遺伝子が必要とされると仮定した。現在、いくつかの系統の証拠により、ハーピンＰ_ssが活性因子であることが示されている。第１に、ハーピンＰ_ssはタバコにおけるＨＲの誘発にとり十分であること（細菌不存在下において分析されうる唯一の表現型の特質）；第２に、ｐＨＩＲ１１サブクローンの発現ライブラリー中の他のｈｒｐ遺伝子はＨＲ誘発物質活性を有しないこと；第３に、タバコにおいてＨＲを誘発するためには、ハーピンＰ_ssはシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株にとり明らかに不可欠であること（なぜなら、相補性群XII（ｈｒｐＺ）における変異は典型的なヌル表現型を生じるが、別の誘発物質がｈｒｐクラスターにより産生される場合には植物に対する副次的効果が考えられるから）；第４に、ハーピンＰ_ssの細胞外における存在は、誘発物質としての機能と矛盾せず、他のいくつかのｈｒｐ産物の調節または分泌における別の役割に対する説明となること；そして最後に、ハーピンＰ_ssは強力に調節されていることである。このことは、最少培地で増殖し、接種時にリファマイシン処理されたシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ細胞はやはりＨＲを誘発するが、リッチな培地で増殖した細胞はＨＲを誘発することができないという観察結果［サイエンス第２４５巻：１３７４頁（１９８９年）参照］と矛盾しない。ハーピンに関して予想されるさらなる特徴を以下に述べる。エルウィニア・アミロボラおよびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエの無関係な蛋白がＨＲを誘発するという知見は、それらに共通する特性に基づく現実的な定義を示唆する。よって、ハーピンは、親水性でアミノ末端シグナルペプチドを欠いたｈｒｐによりコードされた蛋白であり、多くの植物において過敏性壊死を誘発する蛋白である。そのうえ、本発明者らは、Ｈｒｐ分泌経路を通じてハーピンＰ_ssが細菌培地中に分泌されること、該蛋白のカルボキシル末端の４３％の部分が誘発物質活性にとり十分であること、そしてハーピンＰ_ss に対するタバコの過敏性は植物の積極的な応答であることを示した。ハーピンＰ_ssのさらなる構造上の特徴は記載に値する。まず、ハーピンＰ_ssのアミノ酸組成は、一般的にはハーピンＥａの組成と類似である。例えば、両方の蛋白はグリシンに富み、システインを欠く。このことは、蛋白が開いた構造を有し、それらが熱による変性に耐性があり、それらがトリクロロ酢酸に溶解することと矛盾しない。興味深いことに、本発明者らが構築した最も小型のポリペプチドであるｐＳＴＨ１４の１４８個のアミノ酸産物は、特にグリシン含量が高く（２０％）；第２に、２種のハーピンは、内膜アンカーとして役立つ疎水性アミノ酸の伸長部分を欠き；第３に、２種のハーピンは、２２個のアミノ酸のうち１１個が同じである内部配列を有しており（この類似性のレベルからは容易には構造上の相同性を予想しえないが［ジェネティクス（Genetics）第９巻：５６頁（１９９１年）参照］、この領域は細菌表面へのｈｒｐ依存性トランスロケーションに関する候補標的シグナルである）；第４に、２つの配列ＧＧＧＬＧＴＰおよびＱＴＧＴはハーピンＰ_ssのカルボキシル末端において直接反復されおり（かかる反復配列はハーピンＥａにはないが、それらは明らかにハーピンＰ_ssの誘発物質活性に必要であり、いすれのうちの一方のメンバーを欠失すると誘発物質活性がなくなる）；第５に、ハーピンＰ_ssはチロシンを欠いているが、このことから、細胞壁蛋白におけるチロシン残基のＨ₂Ｏ₂媒介性クロスリンキング（潜在的な防御応答）が生じた場合、蛋白の植物細胞壁通過が容易になると推論できる。チロシン残基を欠くことは、明らかに、ハーピンＰ_ssの一般的特性ではない（ハーピンＥａは４個のチロシンを有する）［サイエンス第２５７巻：８５頁（１９９２年）参照］。ハーピンＰ_ssの構造と機能との間の関係についての基本的な疑問は、該蛋白が、その生成物が実際の誘発物質である酵素（例えば、植物細胞壁中の基質と関連している）であるかどうか、あるいは植物がハーピンの構造自体に存する情報に応答するのかどうかである。本発明者らの仮説は、後者が正しいとするものである。例えば、ハーピンＰ_ssはペクチン溶解活性を示さない（ペクチン溶解酵素も植物を死滅させうるが、ＨＲ誘発における役割を示唆する報告は、次いで行われた遺伝学的分析によっては支持されていない）、さらに、誘発物質活性は、ハーピンＰ_ss処理されたタバコの葉から遠心分離により回収されたプロテアーゼ処理したアポプラスティックな液体（apoplastic fluid）中には見いだされていない［フィジオロ・プラント・パソロ（Physiol.Plant.Pathol.）第２１巻：１頁（１９８２年）参照］。そのうえ、ハーピンＰ_ssの熱安定性および生の蛋白の半分以上を欠く切断された誘導体における活性保持は、酵素の特徴ではない特性である。シュードモナス・シリンガエ、シュードモナス・ソラナセアルム、エックス・カンペストリスおよびエルウィニア・アミロボラのｈｒｐクラスターは、イェルシニア・エスピーピー（Yersinia spp.）ならびに他のヒトの病原菌における分泌経路の構成成分に類似した蛋白に関する推定上の読み取り枠を含んでいる［モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第５巻：３９０頁（１９９２年）；およびモレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ第５巻３８４頁（１９９２年）参照］。該経路は、そのすべてがアミノ末端シグナルペプチドおよび他の標的配列を欠くいくつかの細胞外の毒性「Ｙｏｐ」蛋白により使用さる［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７３巻：１６７７頁（１９９１年）参照］。培地中へのＹｏｐ蛋白の分泌およびイェルシニア・エスピーピーの毒性はこの経路に依存しており、この経路は、少なくともその一部はｙｓｃ（Ｙｏｐ分泌）オペロンによりコードされている。分泌経路間（これらの動植物の病原体の成分間）の類似性により、ｈｒｐ遺伝子のいくつかはＹｏｐ様蛋白の分泌を調節することが示唆された。シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ６１株のＨｒｐＨ蛋白（ＹｓｃＣ同族体）はハーピンＰ_ss分泌に必要とされるという本発明者らの知見は、この仮説に関する直接的な実験的証拠を提供する。シュードモナス・ソラナセアルムおよびエックス・カンペストリスにおけるＹｓｃＣ同族体の存在は、これらの細菌もハーピンを生産することを示唆する。宿主でない植物においてＨＲを誘発する植物病原細菌間におけるハーピンの可能性のある一般性により、シュードモナス・ソラナセアルムが、Ｈｒｐ⁺細胞により分泌されタバコにおいてＨＲ様壊死を誘発する１種またはそれ以上の熱安定性かつプロテアーゼ感受性因子を生産するということにおいてさらなる実験的支持が見いだされる。ｈｒｐ分泌遺伝子の保存性にもかかわらず、ハーピンをコードしている遺伝子は異なる属の植物病原細菌間で保存されているようには思えない。エルウィニア・アミロボラのｈｒｐＮおよびシュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエのｈｒｐＺ遺伝子の非類似性、ならびに、その多様な植物との相互作用がシュードモナス・シリンガエの相互作用と同様のものであるエックス・カンペストリスのゲノムＤＮＡとｈｒｐＺがハイブリダイズしないことにより、保存性の欠如が示される。一般的には、細菌性病因に対する植物の過敏性は植物の積極的な応答であると考えられている。過敏性壊死は接種後長時間たってから起こる。過敏性壊死には、比較的短い誘導期間が過ぎれば生きた細菌は必要でなく、過敏性壊死は、遮光、高温、蛋白合成、ブラスティシジンＳのごとき阻害剤、およびコバルトおよびランタンのごときカルシウムチャンネルブロッカーにより抑制されうる。これらの処理が潜在的にインビボでの細菌の代謝および／またはｈｒｐ遺伝子発現に打撃を与える効果を有す可能性があるが、それらは、シュードモナス・シリンガエのＨＲ誘発物質が、植物細胞を直接死滅させる毒物としてよりはむしろ植物の防御応答経路の引き金を引くシグナルとして、宿主でない植物において作用することを強く示す。上記のごとく、タバコの葉においてハーピンＰ_ssにより誘発された壊死は、実際には、デノボ転写、翻訳、カルシウム流入、およびＡＴＰアーゼ活性を必要とする。生きたシュードモナス・シリンガエ細胞および単離ハーピンＰ_ss の植物に対する類似の効果は、シュードモナス・シリンガエがその細胞外ハーピンＰ_ssを生産することにってのみＨＲを誘発するというさらなる証拠を提供する。これらの知見の重要な意味は、遺伝子発現、特別な転写物、および過敏性を調節する植物シグナル変換経路を遮断された変異株について、細菌不存在下で追跡研究を行うことができるということである。本発明の種々の態様およびその一部が提供される利用は多種多様である。例えば、ｈｒｐＺ変異株を用いて、相補性により、ハーピンと同様に機能する蛋白をコードしている他の植物病原生物（例えば、細菌、真菌、線虫）由来の遺伝子を同定してもよい。かかる蛋白は、実質的には異なる１次構造を有する可能性があるが（それゆえ、ＤＮＡハイブリダイゼーション法によっては検出が困難である）、これらの蛋白は、機能的なｈｒｐクラスター（ｈｒｐＺ遺伝子を除く）を有するシュードモナス・シリンガエまたはイー・コリ細胞のいずれについてもＨＲ誘発能を回復させるはずである。本発明の範囲内の別の利用は、植物におけるハーピン受容体および／またはシグナル変換経路におけるそれらの相互作用因子、ならびにそれらをコードしている遺伝子を有するクローンを同定するためのハーピンおよび／またはハーピン生産株の使用である。かくして、この使用により、植物病原体に対する改善された抵抗性を有する遺伝子工学的に得られる植物の生産を目的として、ハーピン受容体をコードしている植物遺伝子の構造あるいは発現を操作するために、病原性因子としてあるいは防御反応誘発物質として機能するハーピンの潜在能力を利用することが可能になる。本発明の範囲内のさらに別の利用は、自然環境または組織培養において生育した植物の２次代謝産物生産の促進であろう。さらにもう１つの利用は、特異的トランスジェニック植物を開発するための、ハーピンをコードしている遺伝子と植物遺伝子の特異的プロモーターとの融合であろう。該植物遺伝子が「スイッチ・オン」されると、ハーピンが発現され、植物細胞が死滅するであろう。いくつかの適当な植物遺伝子プロモーターおよびそれらの計画的な利用は、花粉の成長に必要な遺伝子（雄性の不稔植物の開発に帰着する）；真菌による感染に応答して発現される遺伝子、例えばフェニルアラニンアンモニアリアーゼおよびカルコンシンターゼをコードしている遺伝子（植物細胞は死滅し、そのことにより真菌の増殖が制限され、植物は真菌による疾病に対して抵抗性になる）；および老化の進行に必要な遺伝子（ｈｒｐ遺伝子の発現は落葉を引き起こして収穫を容易にするであろう）を包含する。本発明の範囲内のさらにもう１つのハーピンの利用は、ハーピンと反応し、そのことにより細菌のハーピンを不活性化させるように設計された化合物が反応する標的分子としてのハーピンの使用であろう。かかる利用は、ハーピンが疾病に不可欠であるため、特異的な殺細菌剤の標的を提供するであろう。本願記載のヌクレオチドおよびアミノのリストは以下のごとし。かくして、本発明者らは、本発明の好ましい具体例を図示し、説明したが、本発明は変更および修飾を許容し、それゆえ本発明者らは、記載されている言葉どおりに発明を限定されることを望まず、本発明を種々の利用および状況に適合させるために行われてもよいかかる変更および修飾を利用することを望む。例えば、かかる変更および修飾は、上で詳細に説明したものと実質的に類似の活性を生ずるように機能する構造的に類似の配列（天然のものであっても合成的に製造されたものであっても）を、本発明誘発物質およびｈｒｐＺ遺伝子に代えて用いることを包含する。よって、上で詳細に説明された配列の機能を実質的に変化させない核酸の置換、欠失、挿入もしくは付加による配列の変更（ＤＮＡ配列における）またはアミノ酸の変更（ペプチド配列における）は、本発明の範囲内であると考えられる。さらに、上記配列表の配列番号：３のオリゴヌクレオチド配列のフラグメント、すなわち、ｐＳＹＨ１０、ｐＳＹＨ４、ｐＳＹＨ５、ｐＳＹＨ１２、ｐＳＹＨ３２、ｐＳＹＨ８、ｐＳＹＨ９、ｐＳＹＨ１４、ｐＳＹＨ３３、ｐＳＹＨ１２、ｐＳＹＨ２６、ｐＳＹＨ３２およびｐＳＹＨ３３として示された配列も、本発明の範囲内であると考えられる。したがって、かかる変化および変更は、均等物の全範囲に正当に属し、それゆえ、以下の請求の範囲内である。よって、本発明および本発明を実施または利用する方法ならびに手順は、当業者が本発明に関係し、本発明に密接に関連を有し、さらに本発明を実施し利用できるように、十分に、明確に、簡潔にそして正確な文言で説明されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．ｈｒｐ遺伝子により発現される蛋白に対応する単離蛋白であって、疎水性で、アミノ末端シグナルペプチドを欠き、熱安定性であり、植物における過敏性壊死を誘発し、蛋白中にアミノ酸配列GlyGlyGlyLeuGlyThrProおよびアミノ酸配列GlnThrGlyThrを含むことを特徴とする単離蛋白。２．配列の全部またはフラグメントから選択されるフラグメントである核酸配列。３．である請求項２記載の配列。４．である請求項２記載の配列。５．である請求項４記載の配列。６．ＡＴＣＣ寄託番号６９３１７であるエシェリア・コリ（Escherichia coli ）ＤＨ５α（ｐＳＹＨ１０）。