JPH08510246A - Ｈｉｖ免疫原性複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 HIV感染に対する中和抗体を誘起するワクチンおよび方法。ワクチンは、CD4またはスクシニルコンカナバリンAと共有結合したgp120の複合体を含む。複合体またはそれに対する抗体を使ってHIV感染を検出する免疫学的検査についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ免疫原性複合体 発明の分野 本発明者は、共有結合したgp120-CD4複合体では、gp120またはCD4あるいはそ の両者に、複合体を形成していない分子には存在しない潜在エピトープの特異的 なサブセットがあることを発見した。これらの複合体は新しい特異性を持った中 和抗体を誘起させえたので、HIV感染に対するワクチンおよび免疫療法において 有用である。さらに、複合体またはそれに対する抗体を、HIV感染の免疫学的検 査に利用することができる。 発明の背景 中和抗体は、レトロウイルスによるものを含め多くのウイルス性感染からの防 御に欠くべからざるものとみなされている。HIV感染者における中和抗体につい て最初に報告されて以来、これらの抗体の血清中濃度が高いほど臨床面での結果 がよいことが次第に明らかになってきている^3-5)。これらの研究から、高力価の 中和抗体をもたらすエピトープを同定することが、HIV感染に対するワクチンの 開発に欠かせないことがわかった。 ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）の主要受容体はCD4分 子で、もっぱらTリンパ球表面に見られる。HIV-1とCD4との結合は、主要ウイル ス・エンベロープ糖蛋白gp120を介して生じ、これによってウイルス感染のプロ セスが始まる。 ヒト免疫不全ウイルスによる感染に対するワクチン開発の現在の戦略は、ウイ ルスエンベロープ糖蛋白gp120またはその細胞表面受容体CD4に対する抗体の生成 に重点を置いている。精製されたgp120は、エピトープに対して反応性のある、 タイプに特異な中和抗体をもたらすのが標準的だが、このエピトープはウイルス 分離株によって大きく異なる。こうした特徴がgp120をワクチンとして使用する 妨げとなってきた。 CD4も、HIV-1に対するワクチン開発の中心的な候補とみなされてきた。最近の 研究では、sCD4が動物でHIV中和抗体をもたらし、SIV感染アカゲザルで感染の拡 大を防ぐことが実証されている¹⁾。ただし、CD4に対する自己抗体は、正常なT細 胞の機能を妨げると、それ自体が免疫した宿主の体内に免疫異常を生み出すこと もある。gp120に対する中和抗体は、HIV-1感染者の生体内で生成され、また精製 したエンベロープ糖蛋白を使ってin vitroで生成することができる。ただし、gp 120には５つの超可変領域があり、その１つであるV3領域が主要な中和 エピトープである。様々な株の中でもこのエピトープが超可変性であることが、 多様な株のHIV-1に対して有効な中和抗体生成にとって大きな障害となっている 。これらの理由から、精製したCD4またはgp120のいずれかを用いるというワクチ ン戦略は幾つかの欠点があると考えられてきている。 本発明者は、可溶性CD4または、マンノース特異的なレクチンであるスクシニ ルコンカナバリンA（SC）のいずれかと化学的に結合したgp120の複合体を免疫原 として使って、抗HIV-1中和抗体を生み出すことにより、タイプ特異的な抗gp120 抗体およびCD4に対する抗体の欠点を克服した。本発明者は、これらの化合物はg p120に同じような立体配座上の変化をもたらすことを発見した。複合体を形成し たgp120は、複合体形成をしていない糖蛋白質上に、隠されていた一連のエピト ープを露出するといった立体配座の変化を受けるようである²⁾。このようなエピ トープの一部はグループ特異的な中和抗体をもたらし、それは前記のようなタイ プ特異的な抗体と違って株によって制限されることがない。本発明者は、共有結 合したCD4-gp120複合体がHIV-1の様々な分離株およびHIV-2に対する中和抗体を 生成するのに有効であることを発見した。 HIVに対するサブユニットワクチンを開発するための研究作業の中心は、ウイ ルスのエンベロープ糖蛋白質に向けれらてきた。gp160またはgp120を動物に接種 すると、HIVに対する中和抗体が生成される^3),4)。gp120上の主要中和エピトー プは、蛋白質の第３可変領域（V3ループ）のアミノ酸306と326の間に位置してい る⁴⁾。このエピトープについては、ポリクロナール抗体とモノクロナール抗体の 双方を使って広く研究されている^3,4)。ほとんどの場合、この領域を標的とする 抗体は分離株に特異な形でHIV-1を中和するが、抗V3ループ抗体のうち弱い中和 抗体が異なる分離株と交差反応しうるとの証拠がある⁸⁾。抗V3ループ抗体がタイ プ特異であるのは、様々な分離株によって配列が実に多様だからである。HIV感 染細胞をタイプ特異な抗V3ループ抗体と長期にわたって培養すると、中和に抵抗 性を持つ逃避型突然変異体が生じる⁹⁾。 V3ループに加えて、エンベロープの遺伝子的に保存された領域を包含する他の 中和エピトープも同定されている^10,11)。ただし、これらのエピトープに対する 免疫化からは、中和力価の低いポリクロナール抗血清がもたらされる¹²⁾。たと えば、gp120のCD4結合領域は、保存領域を包含するが、様々な分離株 に対する中和抗体を生成する¹³⁾。ただし、この領域は通常は糖蛋白質上の免疫 優性エピトープではない。 gp120とCD4の相互作用についてはかなり詳しく調べられており、複合体形成に 関与する分子の領域がすでに決定されている^14-16)。現在では、CD4との相互作 用によりgp120の立体配座に変化が生じることが複数証拠に基づいて立証されて いる。まず第１に、gp120に結合した組換え可溶性CD4（sCD4）はV3ループをモノ クロナール抗体と結合しやすくし、また外因性プロティナーゼによる消化を受け やすくする²⁾。２番目に、sCD4の結合により、ウイルスからgp120が解離する^{17, 18)} 。gp120のこのような立体配座の変化は、ウイルスが宿主細胞膜に付着し融合 するプロセスを容易にすると考えられている²⁾。共有結合ではなく自然の親和性 により複合体形成された可溶性CD4および組換えgp120により免疫すると、抗CD4 抗体が生成される³¹⁾。組換えgp120およびsCD4の混合物を使った免疫化により、 複数のマウスモノクロナール抗体が開発されてきた^31,32)。これらの研究でもた らされた抗体は、厳密には複合体特異ではなく、遊離したgp120またはCD4と反応 した。中和抗体は遊離sCD4と反応したが、gp120存在下では程度は様々ながら反 応性 が増大した。これらの研究で使用した複合体は不安定で、非共有結合したgp120 とCD4から成った。 gp120分子に見られる高マンノースの多様なN-結合炭水化物構造、複合体およ びハイブリッド・タイプも、宿主細胞膜とgp120の相互作用において役割を果た しているのかもしれない^19-20)。実際、炭水化物が媒介するgp120の反応性は、 マンノース結合蛋白質として知られている血清レクチンですでに実証されており 、またこの血清レクチンはCD4+細胞のHIV-1感染を阻害することも明らかにされ ている²²⁾。この他にヒトマクロファージ膜のエンドサイトーシス受容体との間 でも、gp120の炭水化物媒介相互作用が認められている²¹⁾。gp120上の接近可能 なマンノース残基のマクロファージ膜との結合の親和性が高いことから、マクロ ファージによるウイルスの取込みを招くと想定されている²¹⁾。 組換え可溶性CD4は、主として細胞表面CD4との競合によりin vitroでHIV感染 を阻害することがわかっている。この知見から、HIV感染者の治療にsCD4を利用 する可能性があると考えられている^23,24)。さらに、sCD4は動物におけるウイル ス感染をブロックする免疫原として使われてきた。sCD4を使った SIV_MAC感染アカゲザルの治療から、ヒトCD4だけでなくサルCD4に対する抗体反応 も引き出されている。このような免疫応答の生成と矛盾なく、これらの動物のPB Lおよび骨髄マクロファージからはSIVが単離できなかった¹⁾。チンパンジーを使 った最近の研究でも、ヒトCD4がin vitroでHIV感染を阻害する抗自己CD4抗体を 生み出すことが実証された²⁵⁾。sCD4を使った免疫化はHIV感染のブロックには効 果があるかもしれないが、自己抗原を認識する循環抗体が感染していないCD4+細 胞と結合することによって免疫異常および機能不全を引き起こすかもしれない。 それにもかかわらず理論的には、正常なCD4機能を損なうことなくウイルスの付 着および侵入を混乱させることができれば、抗CD4抗体はHIV感染をブロックする のに有効でありうるということになる。これらの抗体は、gp120との相互作用の 後でのみ存在するCD4エピトープを認識するのが理想的である。 発明の概要 本発明者は、gp120-CD4複合体形成によりgp120またはCD4あるいはその両者の 上に、複合体を形成していない分子上には存在しない潜在エピトープの特異的な サブセットがもたらされ ることを発見した。これらのエピトープは新たな特異性を持った中和抗体を誘起 し、したがってHIVに感染した患者のワクチンまたは免疫療法、あるいはその両 者に有用である。さらに、この抗体または複合体はHIV感染の免疫学的検査にも 利用できる。本発明者は、レクチンであるSCがCD4が媒介するのと同じような形 でgp120の構造の変化を媒介することを実証している。SCのgp120との結合も、ウ イルス糖蛋白質上に新たなエピトープをもたらすもう１つの機序である。 本発明者は、化学的に結合したgp120-CD4複合体を中和抗体生成のための免疫 原として用いた。gp120-CD4複合体が、中和抗体を生成する新たなエピトープを 持っていることがわかった。SCとの結合によりgp120の立体配座に動揺が生じ、 その結果、gp120上の潜在的な中和エピトープが露出する。 図面の説明 図１は、sCD4およびSC存在下におけるHIV-1からのgp120の解離を示す。図1Aで は標識した細胞を0（レーン１、２）または1.5μg/mlのsCD4（レーン３、４）で 処理した。ウイルスと結合したgp120（レーン１、３）または可溶性gp120（レー ン２、４）が、HIV-1抗体陽性ヒト血清を使った免疫沈降法、SD S-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより検出された。図1Bでは、標識した細 胞を0（レーン１、２）、5μg/ml（レーン３、４）または10μg/ml（レーン５、 ６）のSCで処理した。ウイルスと結合したgp120（レーン１、３、５）または可 溶性gp120（レーン２、４、６）は、1Aの場合と同様に検出した。 図２は、SCおよびsCD4存在下におけるgp120のトロンビン消化に対する感受性 を示している。Molt3/HIV-1_IIIB細胞を³⁵S-メチオニンで４時間標識してから、0 .25％メチオニンの入った培地で３時間インキュベートした。図2Aでは、標識培 地のアリコート（1ml）をトロンビン（7μg/ml）で37℃で90分間消化させてから 、HIV-1陽性ヒト血清で免疫沈降させ、SDS-PAGEで分析した。レーン１は未処理 培地、レーン２はトロンビン処理した培地である。トロンビン消化前に、培地の アリコートを2.5μg/ml（レーン３）または10μg/ml（レーン４）の濃度のSCで 、あるいは2.5μg/ml（レーン５）または10μg/ml（レーン６）の濃度のsCD4で 前処理した。トロンビン切断により生成されたgp120フラグメントは矢印で示し てある。図2Bでは、標識した培地のアリコートを、前処理なし（レーン１）、5 μg/mlのSC（レーン２）、あるいは5μg/mlのSCと0.1mM α-メチルピラ ノシドの混合液（レーン３）で前処理後に前記の場合と同じようにトロンビンで 消化した。 図３は、HIV-1によって引き起こされた融合細胞（syncytia）形成が、gp120-s CD4に対するマウス抗血清によって阻害されるのを示す。図3Aでは、gp120-sCD4 に対するマウス抗血清を、HIV-1_IIIB（○）、HIV-1_MN（□）またはHIV-2_WAVZ（ ◇）に感染した細胞とともにCEM細胞に加えた。図3Bでは、トロンビン処理したg p120-sCD4複合体に対して生成されたマウス抗血清について試験した。定量分析 の条件は実施例の項で述べる。各実験条件について、別々の３つのフィールドの 融合細胞を計数した。平均値をシンシチウム（融合細胞）数／フィールドとして 出した。 図４は、gp120、sCD4および複合体を用いた、gp120-CD4複合体に対して生成さ れたモノクロナール抗体のウエスタンブロット分析である。レーン１はMoAb7E3 、レーン２はMoAb 8F10B、レーン３はMoAb 8F10C、レーン４はMoAb 8F10D、レー ン５は抗gp120 MoAb、レーン６は抗p24 MoAb（陰性対照）、レーン７は家兎抗CD 4高度免疫血清、レーン８は正常家兎血清である。 図５は複合体特異モノクロナール抗体のgp120-レクチン複合 体への結合を示す。MoAb A（○）およびB（△）を、gp120-SC（白抜き）またはg p120（黒色）のいずれかを使ってELISAで検査した。 図６は、複合体特異的モノクロナール抗体および免疫ヤギ血清を使った競合EL ISAのグラフである。精製したMoAb 7E3（■）、MoAb 8F10B（○）、MoAb 8F10C （●）およびMoAb 8F10D（▲）の限界希釈液をヤギ69血清の連続希釈液とインキ ュベートし、go120-CD4 ELISAで試験した。免疫血清中の抗体結合レベルと免疫 前に採った血清中の抗体結合レベルの比として競合率を求めた。 図７は、実施例IIIに従って調製したgp120-CD4複合体を示すゲルの写真である 。図４のレーン１はgp120、レーン２はsCD4である。レーン３にはgp120-CD4複合 体が、レーン４には分子量マーカーがある。 実施態様の詳細な説明 本発明者は、強力で幅広い中和免疫反応を引き起こすことのできる新たなエピ トープをgp120またはCD4あるいはその両者上で露出させるか生成させる必要があ ると判断した。共有結合したgp120-CD4複合体を免疫原として用いた。二価架橋 剤を使 ってgp120分子を可溶性組換えCD4に共有結合させ、いかなる操作を行おうとも複 合体の完全性が維持されるよう確保した。複合体の構成要素は、遊離糖蛋白質と は少なくとも次の２点で異なると予想された。（１）gp120およびCD4上の一部の エピトープは複合体形成によって隠されてしまう。（２）複合体のgp120およびC D4の立体配座が変化する結果、潜在エピトープが露出する。これらのエピトープ はウイルスが標的細胞に侵入するときに大きな役割を果たしうるので、これらに 対する抗体があれば、侵入プロセスのいずれかの側面を阻害するはずである。こ うした抗体はgp120-CD4の相互作用を阻害しないだろうが、その代わりに感染に 必要な結合後の融合事象を防止するかもしれないと考えた。 この方策を抗HIVワクチンに応用することで、他にも幾つかの利点が得られた 。まず第１に、複合体を形成したgp120に特異的なエピトープは、in vivoでは中 和抗体の正常な標的となるとは予想されない。HIV-1は37℃では３分以内には標 的細胞に結合して侵入する²⁶⁾。本来のgp120-CD4複合体は一時的なもので短命で あるという性質を考えると、複合体特異な抗体を生成するなどの形で免疫系に現 れることはありそうにない。し たがって、in vivoで免疫選択がないということから、結局は様々なウイルス株 の複合体特異なエピトープにおける変異の程度が最小限になる。第２に、CD4上 の複合体特異的なエピトープに対する抗体は、正常な細胞の表面上にある複合体 を形成していないCD4を認識できる抗自己抗体を生成するとは思われない。抗CD4 抗体は細胞毒性作用を媒介することができるので、この点は特に重要である。 HIVに対するワクチンの開発では、CD4のない状態でgp120上に新しいエピトー プをもたらすことができれば大いに有利だろう。本発明者は、これが可能である ことを発見した。マンノース特異的なレクチンであるSCをgp120と結合すると、 これが糖蛋白上にsCD4で見られるのとよく似ているらしい立体配座の変化をもた らす。その変化とは、V3ループが外因性プロテアーゼに曝露されることと、gp12 0がウイルス膜から解離することである。したがって、共有結合したgp120-SC複 合体も、CD4がない状態で新しいエピトープおよび複合体特異的な抗体を露出す るための免疫原として有用である。 本発明のワクチンは、ワクチン技術ですでに知られている許容される懸濁液と 、gp120-CD4またはgp120-SCの複合体から成 る。アジュバントを追加するのが望ましい。ヒトワクチンで使用が許されている 唯一のアジュバントはリン酸アルミニウム（ミョウバン・アジュバント）なので 、本発明のワクチンはリン酸アルミニウムゲルで調製するのが望ましい。引用に より本明細書に含まれるものとするドリンらによるAnn Intern Med114巻119〜12 7頁（1991年）を参照されたい。ワクチン接種の目的での免疫原複合体の投与量 は、１回の接種あたり約40〜200μgである。初回接種の後で、１回以上の追加接 種を行ってもよい。ワクチン接種のプロトコルは、臨床ワクチン接種試験で現在 用いられているプロトコルと同じにするのが好ましくこれについてはやはりここ で引用により本明細書に含まれるものとする、ドリンらによる前掲文献、ならび にロイベンらによるJ Acquired Immune Deficiency Syndrom 5巻719〜725頁（19 92年）に開示されている。 本発明の免疫原複合体に対して作られる抗体は、受動免疫法または免疫療法に も利用できると考えられている。これらの抗体の投与量及び接種回数は免疫グロ ブリンによる免疫化または免疫療法のために当業界で確立されているものに従う 。 複合体またはそれに対する抗体を、HIV感染の検出方法に利 用できる。たとえば、固体支持体に結合しているかもしくは標識されている複合 体を試験液に接触させると、本発明の複合体と試験液中の抗体の間で形成された 免疫複合体が検出される。本発明の免疫原複合体に対して作られた抗体を、HIV 感染検出の方法で使用するのが好ましい。これらの抗体は、当業界公知の方法に 従って固体支持体に結合させるか、あるいは標識することができる。検出方法と しては、試験液を抗体と接触させ、試験液中の抗原と抗体の間で形成された免疫 複合体を検出し、これによりHIV感染が存在していることを明らかにする。これ らの検出方法を使用して生じる免疫化学反応は、サンドウィッチ反応、凝集反応 、競合反応、あるいは阻害反応であることが好ましい。 前段落で触れた方法を実施するための試験キットには、本発明に基づく免疫原 複合体か、もしくはそれに対して作られた１ないし複数の抗体が入っていなけれ ばならない。キット中では、免疫原複合体または抗体は、固体支持体に結合して いるか、あるいは従来使われている標識が施されているかのいずれかである。固 体支持体および標識ならびに特異的免疫学的検査法については、引用により本明 細書に含まれるものとするハーロー とレーンによる『抗体、実験室マニュアル』（Cold Spring Harbor Laboratory 、1988年）に開示されている。 実施例 本発明者は幾つかの試験を行って、新しいエピトープをgp120およびCD4上で露 出できることを明らかにした。これらの試験では、糖蛋白質の立体配座を変化さ せる処置を施した後でgp120に対する中和抗体を作れることも実証された。 実施例Ｉ ａ．CD4との複合体形成によってもたらされるgp120の立体配座の変化 様々な条件下で、ウイルス表面からのgp120の遊離について分析した。Molt3/H IV-1_IIIB細胞を³⁵S-メチオニン（150μCi／ml）で３時間標識した。標識済みの 細胞を洗浄し、冷メチオニンを含有するRPMI培地に再懸濁した。それからその細 胞を組換えsCD4（DuPont）存在下で４時間培養した。細胞の入っていない上清を 採集し、Sephacryl S 1000カラムに通して遊離ウイルス蛋白質からビリオンを分 離した。各分画を界面活性剤で処理し、抗HIV-1抗体陽性のヒト血清で免疫沈降 させ、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーで分析した。オートラジオグラ フをデンシトメーターでスキャンして、ウイルスおよび遊離ウイルス蛋白質中に 存在するgp120の量を定量した。以前の試験のやり方^17,18)に従って、sCD4でウ イルスを処理すると遊離蛋白質分画中のgp120の量が増え、それに対応してウイ ルス分画中の量が減るのを認めたが（図1A）、このことからgp120の立体配座が 変化してgp120がビリオンから遊離したことがわかった。 sCD4がgp120の立体配座をどのように変化させるのかさらに調べるために、gp1 20のトロンビン媒介切断について試験した。トロンビンによるgp120の消化によ り70KDと50KDが生成される（図2A）。この切断はV3ループの位置で起こる。ルー プ内のエピトープに対するモノクロナル抗体作用の結果、切断が完全にブロック される。gp120のV3ループにおけるトロンビン媒介切断は、sCD4と結合後は増強 される。このことから、蛋白質表面上でのV3ループ露出が増え、いっそうプロテ アーゼ切断を受けやすくなっていることがわかる。 ｂ．スクシニルコンカナバリンAを使った複合体形成によりもたらされたgp120の 立体配座の変化 コンカナバリンAまたはスクシニルコンカナバリンAなどの マンノース特異的なレクチンとHIVをインキュベートするとウイルスの感染力が 弱められることはすでに実証した^27,28)。³⁵S-メチオニン標識gp120をSCとイン キュベートすると、V3ループがトロンビン消化をさらに受けやすくなった（図2A ）。レクチンをα-メチルマンノシドとあらかじめインキュベートしておくと増 強された作用が完全にブロックされるので、この作用は特異的なものである（図 2B）。V3ループの露出が増えるのに加えて、HIV-1とSCの相互作用の結果、gp120 がウイルス膜から解離した（図1B）。この解離の程度は、sCD4で見られたよりは いくらか少なかった。それにもかかわらず、これらの試験からsCD4およびSCはgp 120の立体配座を変化させること、それも非常によく似た形で変化させることが 明らかにわかった。 ｃ．化学的に結合したgp120-CD4複合体の免疫学的特性 本発明者は、gp120-sCD4が免疫原性であり、HIV-1中和抗体を生成することが できるのを実証した。免疫アフィニティー法を利用して、慢性感染させたH9/HIV -1_IIIB細胞からgp120を精製した。次に、切断されない水溶性架橋剤であるビス （スルホスクシンイミジル）スベレート（BS）を使って、この精製したgp120をs CD4（DuPont）と架橋させた。マウスに複合体を接 種し、免疫血清がHIV誘導シンシチウム形成に影響を及ぼすか調べた。HIV-1_IIIB およびHIV-1_MN感染細胞によって誘導されたシンシチウム形成は、免疫血清によ って著しく阻害された。ある免疫血清の代表的阻害曲線を図3Aに示す。非常に関 係の深いHIV-2に感染した細胞によって誘導されるシンシチウム形成も、血清が 存在すると阻害された。これらの結果から、gp120-sCD4複合体は幅広い中和抗血 清を生成できることが実証される。 トロンビン消化されたgp120およびsCD4を含んで成る複合体もマウスに接種し た。この場合、gp120のV3ループは、プロテアーゼ切断により改変されると予想 された。V3はgp120上の中和エピトープであると報告されているので、このよう な切断が複合体が中和抗体を生成する能力にどのように影響するかを調べるのは 興味深いことであった。図3Bに示すように、トロンビンで消化したgp120-CD4複 合体をマウスに接種すると、HIV-1_IIIBおよびHIV-1_MN分離株により誘導されるシ ンシチウム形成をブロックすることのできる抗体が生成された。ただし、この阻 害作用はHIV-2が誘導するシンシチウム形成では認められなかった。 予備的実験で、共有結合したgp120-CD4複合体は幅広い中和 抗体反応をもたらすことができるのがはっきりと示された。そこで、複合体上の 潜在エピトープが中和抗体によって認識されるかどうかを調べ、またそのエピト ープの特徴を明らかにした。 実施例II gp120-CD4複合体の免疫学的特性 gp120-CD4複合体調製に使用した糖蛋白gp120は、H9/HIV-1_IIIB細胞から免疫ア フィニティークロマトグラフィーにより精製した。その細胞を、20mMトリス（pH 8.2）、0.15MNaCl、1.0％トリトンX-100、および0.1mM PMSFを含む緩衝液で溶解 （リシス）した。溶解液を100,000×gで１時間遠心分離した。上清のNaCl濃度を 1Mに調整し、それからHIV抗体陽性者の血清から精製したヒト抗HIV免疫グロブリ ンを使って調製したアフィニティーマトリックスと溶解液を反応させた。結合し た抗原を50mMジエチルアミン（pH11.5）で溶出し、溶出液のpHをトリスHClで直 ちに8.0に調整した。溶出液は、0.5M NaCl、0.1mM CaCl₂、1mM MgCl₂、0.2mM Mn Cl₂を含有する10mMリン酸緩衝液（pH6.5）で徹底的に透析し、その後トリトンX- 100を加えて界面活性剤溶液の重量パーセントが2.0％になるようにした。透析物 はレンチル-レクチン・カラムに通した。 0.4Mα‐メチルマンノシドで溶出してレンチル‐レクチン・カラムから糖蛋白質 を分離し、さらに1M NaClおよび0.2％トリトンX-100を含有する20mMトリスHCl（ pH8.2）で透析した。透析物を、gp41に対して反応し、gp160およびgp41が存在す ればそれを吸収するマウスモノクロナール抗体SVM-25（米国特許第4,843,011号 明細書）で調製したアフィニティー・マトリックスに入れた。アフィニティー・ カラムからの通過液を1mM EDTAを含有する10mM BES（pH6.5）で徹底的に透析し 、同一緩衝液で平衡化したホスホセルロース・カラムに入れた。このカラムを0 〜500mM NaClの直線勾配で展開し、gp120を含む分画をプールし、濃縮してからP BSで透析した。 精製した糖蛋白を、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート（BS）（Pierce ）を架橋剤として使ってsCD4（DuPontから市販されているもの）と結合させた。 このためにgp120およびsCD4をPBS中で1:2のモル比で混合し、37℃で１時間イン キュベートしてから、0.5mM BSで室温で１時間処理した。複合体をさらに１晩、 ４℃でインキュベートした。過剰なBSは20mMトリス-HCl（pH8.0）でブロックし た。 gp120-CD4複合体特異的モノクロナール抗体の開発 Balb/Cマウスに、２週間毎にgp120-CD4複合体を６回接種した。最初の接種（ マウス１匹につき48μg）は、完全フロイントアジュバントで乳化し、皮下注入 して投与した。その後の接種原（マウス１匹につき24μg）は不完全フロイント アジュバントで乳化し、腹腔内注入により投与した。最終接種の２週間後に動物 の血液を採り、シンシチウム・ブロッキングアッセイにより血清にHIV-1中和抗 体があるか調べた。簡単に説明すると、CEM細胞（１×10⁵）を試験血清存在下で HIV-1感染細胞（１×10⁴）と培養し、24〜40時間後に巨大細胞の数を数えた。HI V-1_IIIB感染細胞およびHIV-1_MN感染細胞により誘導されたシンシチウム形成は、 gp120-CD4複合体で免疫化したマウスの血清により著しく阻害された。HIV-2感染 細胞により誘導されたシンシチウム形成もこのような血清により阻害されたこと から、gp120-CD4複合体はマウスで幅広い中和抗体を生成できることがわかる。 マウスで中和抗体を検出した後に、アジュバントなしのPBS中gp120-CD4複合体 の最後の腹腔内投与を行った。４日目に、動物を犠牲死させ、脾臓を摘出した。 脾臓から注射器を使って脾臓リンパ球を流し出させた。細胞（７×10⁷）を、40 ％PEG 1540を含有するスーパーHT［20％ウシ胎仔血清（Hyclone）、0.1Mグルタミン、1 0％NCTC-¹⁰⁹リンパ球順化培地、0.5mM Na-ピルビン酸、0.2U/mlインスリン、1mM オキサロ酢酸、100U/mlペニシリン／ストレプトマイシン］（GIBCO）中で１晩、 １×10⁷NS-1マウス骨髄腫細胞（ATCC、メリーランド州ロックビル）と融合させ た。それから 0.4μMアミノプテリンを含有するスーパーHTで細胞を懸濁し、96 -ウェル・プレートに入れた。 最初に、gp120-CD4複合体特異抗体の産生用のハイブリドーマを選択した。プ ールしたハイブリドーマ上清を、gp120、CD4およびgp120-CD4を抗原として使っ てELISAで調べた。複合体特異抗体を含有するプールの上清を個別に試験した。 問題のハイブリドーマは、スーパーHTに１細胞/ウェルの密度で再培養してクロ ーン化した。クローンしたハイブリドーマからの上清を、gp120-CD4複合体を使 ってELISAによりさらに調べた。 免疫グロブリンを分泌し、ELISAでgp120-CD4複合体に対する反応性が高く、gp 120またはsCD4のいずれとの反応性も無視しうる程度のハイブリドーマ４種類を 選択した（表１）。特に、モノクロナール抗体の１つのMoAb 7E3は、IgAイソタ イプであ った。それから各ハイブリドーマの腹水から免疫グロブリンを精製し、gp120-D4 複合体、遊離gp120またはsCD4を使ってウエスタンブロット法によりさらに分析 を行った。どの抗体も遊離gp120またはsCD4とは反応しなかったが、抗体7E3およ び8F10Bは複合体（図４）および複合体の低分子量フラグメントとの間で高い反 応性を示した。抗体8F10Cおよび8F10DはELISAでは複合体に対して強く反応した が（表１）、ウエスタンブロット法での複合体との反応性は弱かった。これらの 結果から、MoAb 8F10Cおよび8F10Dは、MoAb 7E3および8F10Bが認識するエピトー プとは区別される、立体配座依存性の高い複合体特異なエピトープのセットを標 的とするものであることがわかる。 精製された7E3、8F10B、8F10Cおよび8F10D免疫グロブリンを、PHA刺激した末 梢血単核細胞（PBMC）および様々なHIV-1分離株を使った無細胞感染定量分析で 試験した。表２に示しように、実験室順応株HIV-1_IIIBによるPBMCの感染に対し て有意な影響を及ぼした抗体はなかった。ただし、抗体7E3、8F10Bおよび8F10C は、HIV-1_MNの一次分離株によるPBMCの感染を有意な程度で中和したが、抗体8F1 0Dは影響を示さなかった。これらの結果とは対照的に、いずれの抗体もCEM細胞 上におけ るH9/HIV-1_IIIBまたはH9/HIV-1_MNにより誘導されるシンシチウム形成をブロック しなかった。予備実験では、これらの複合体特異抗体による無細胞中和の程度が 分離株の感染率に依存するかもしれないことが示唆されている。一般に、感染率 の低い一次HIV-1株は、より病毒力の強いHIV-1の実験室順応株よりもさらに有効 に中和される傾向がある。 複合体特異抗体が複合体のgp120部分に結合するのかCD4部分に結合するのかを 明らかにするために、マンノース特異的レクチンであるスクシニルconA（SC）が sCD4により誘導されたのと同じような方法で糖蛋白の立体配座をかき乱すという 本発明者らの知見³³⁾を利用した。SCおよびgp120をBS3で架橋させ、ELISAで試験 した。MoAb 7E3および8F10Bは、gp120-SC複合体と強く反応したが（図５）、遊 離したgp120またはSCとは反応しなかった。それに対して、抗体8F10Cおよび8F10 Dは複合体と弱い結合しか示さなかった。これらの結果から、抗体7E3および8F10 BはsCD4およびSCの結合に応じてgp120上に曝露された潜在エピトープを標的とす ることがわかる。 ヤギにおけるgp120-CD4複合体に対する免疫学的反応 より多くの種の動物で、gp120-CD4複合体に対する免疫学的 反応を分析した。動物（ヤギ69）にフロイントアジュバントに入れたgp120-CD4 の100μgを繰り返し接種し、５回接種した後で血清をELISAで調べてgp120、sCD4 および複合体に対する反応性を明らかにした。血清中には、遊離したgp120およ びsCD4の双方に対して反応する抗体が検出された。複合体特異抗体も生成されて いるかを調べるために、MoAb 7E3、8F10B、8F10C、8F10Dを使ったクロス競合定 量分析法で血清を試験した。ヤギ69の血清の２倍連続希釈液を各MoAbの限界希釈 液とインキュベートし、gp120-CD4複合体ELISAで試験した。図６に示すように、 ヤギ血清の抗体は４種類のモノクロナール抗体すべての結合をブロックできた。 ヤギ血清について、シンシチウムのブロッキングおよび無細胞感染の定量分析 により中和抗体があるか調べた（表３）。比較のために、別の動物（ヤギ58）か らHIV-1_IIIBウイルスのgp120を５回接種した後に採った血清についても試験した 。シンシチウム定量分析では、ヤギ69の血清では、HIV-1_IIIBに対しては1:640、 HIV-1_MNに対しては1:80の力価でシンシチウム形成が≧80％減少した。ヤギ58の 血清はこれよりはるかに効力が小さかった。ヤギ69の血清は、1:80の力価でHIB- 1IIIBによる CEM細胞の無細胞感染を中和した。この場合もまた、その力価値はヤギ58血清の もの（1:20）に比べて有意に高かった。ヤギ69の血清は、一次分離株HIV-1_MNお よびHIV-1JRFLによる無細胞感染のグループ特異的中和の媒介もした（表３）。 その中和力価（1:80）は、並行して処理した広域にわたる中和ヒト血清（1:160 ）に匹敵するものであった。ヤギ58の血清は、＜1:20希釈でさえもHIV-1_MN感染 のブロックに失敗した。ヤギ69の血清については、CEM細胞で事前吸収すること で抗CD4抗体を除去した後で再試した。このような抗体が除去されたかどうかは 、SupT1細胞を使ったフローサイトメトリー分析により検証し、細胞表面結合が9 0％近く減少していることがわかった。このように減少しているにもかかわらず 、吸収された血清の中和力価は吸収されていない血清の２分の１（1:40）にすぎ ず、中和が全面的には抗CD4抗体によるのではないことがわかる。 本実施例で提示した結果から、共有結合架橋したgp120-CD4複合体は、免疫原 性複合体特異的エピトープを多数所有することがわかる。これらのエピトープの 少なくとも一部は複合体のgp120部分に存在する。さらに、一部の複合体特異的 エピトープは、PBMCを標的とする一次フィールド分離株を含め様々なHI V-1株による無細胞感染に対して特に有効な広域中和抗体の標的である。これら の知見に基づくと、複合体は防護的ワクチンまたは免疫療法試薬として働く可能 性がある。 実施例III 複合体を形成していないCD4がいっさいないgp120-CD4複合体（モル比1:1）の調 製 先に述べた免疫化プロトコルでは、gp120およびCD4を1:2のモル比で複合体に した。この物質を使って免疫化を行った結果、抗CD4抗体が分離されたので、複 合体を形成していない受容体分子がいっさいないgp120-CD4複合体（モル比1:1） を調製して、抗gp120抗体生成の最適条件を得られるようにしたいと考えた。gp1 20およびCD4（モル比1:1）を37℃で１時間結合させ、BSと室温で１時間、次いで 4℃で１晩反応させた。トリス緩衝液（pH8.0）で遊離架橋剤をブロックした後、 溶液を抗CD4モノクロナール抗体Eに結合させたセファロースで室温で30分処理し た。gp120との相互作用に関与するCD4上のエピトープにEが結合するので、この 処置により複合体を形成していないCD4があれば除去された。このような方法で 調製されたgp120-CD4複合体を示すゲルが図４である。ゲル中では、分子 量170kDおよび〜340kDの複合体のみがはっきりとしていることが明らかであった 。調製物質中には遊離したgp120またはCD4は存在しなかった。 実施例IV gp120-CD4複合体に対する免疫応答が複合体の構成要素個別に対する応答と異 なるかをより正確に調べるために、次の実験を実施した。別々の群のマウスに等 量のCD4、gp120またはgp120-CD4複合体を接種した。５回接種した後、血清を採 って分析した。表４に示すように、CD4で免疫化した動物３匹はすべてHIV-1_IIIB およびHIV-1_MNに対して有効なシンシチウム・ブロック血清抗体を保有していた 。複合体で免疫化した動物４匹すべての血清が、HIV-1_IIIBにより誘導されるシ ンシチウムをブロックした。４匹中２匹ではHIV-1_MNが誘導するシンシチウムも ブロックされた。全体として、複合体で免疫化した動物の血清における中和力価 は、CD4で免疫化した動物の血清の力価よりも低かった。驚いたことに、gp120で 免疫化した動物ではシンシチウムをブロックする血清抗体はまったく見られなか った。 ELISAにおけるCD4との反応性は、CD4および複合体のいず れで免疫化した群でも同じようなものであった（表４）。１つの例外は複合体で 免疫化した動物（マウス8）で、これは他の動物に比べて抗CD4抗体の力価が有意 に低かった。複合体で免疫化した動物では、抗CD4反応レベルとシンシチウム・ ブロッキング活性の間に相関はなかった。マウス10の血清とマウス9の血清を比 較した場合、マウス9の血清のほうが抗CD4反応レベルがやや高かったにもかかわ らず、マウス10の血清のほうがシンシチウム・ブロッキングについてはより有効 であった。 全体として、複合体で免疫化した動物は抗V3ループ抗体の力価が相対的に低く 、マウス9の血清にはこのような抗体が実質的にまったくなかった。 実施例Ｖ CD4で免疫化した動物および複合体で免疫化した動物の血清についても、CD4配 列に由来する様々な合成ペプチドとの反応性を試験した（表５）。抗CD4反応性 の全体的なレベルは、CD4および複合体のいずれで免疫化した動物でも同じよう なものであったが（表４）、線形エピトープとの反応性パターンが違っていた。 CD4で免疫化した動物の血清はCD4のN-末端部分に由来するペプチド（ペプチドA およびB）と反応するのに対し て、複合体で免疫化した動物の血清ではこのような反応がなかった。これは、CD 4のN-末端がgp120と反応するという事実と一致する。特に目立っているCD4の領 域３に由来するペプチド（ペプチドD）との反応も、CD4で免役化した動物に比べ ると複合体で免疫化した動物では小さくなっていた。特にCD4の領域４に由来す るペプチド（ペプチドＦ）との反応性は、複合体で免疫化した動物10および11に 固有に見られた。 実施例IVおよびＶのデータを合わせると、gp120-CD4複合体に対する免疫応答 は固有のものであり、遊離CD4および遊離gp120に対する反応とは異なることがわ かる。抗複合体反応の相違は、1）gp120 V3ループに対する反応の低減、2）CD4 N-末端における線形エピトープに対する反応の低減、3）CD4領域４における線形 エピトープに対する反応の増大となって現れている。最後のエピトープは遊離CD 4分子の中に隠れている可能性があることを注意しておかなければならない。 gp120-sCD4複合体を免疫原として使用する本発明に基づくと、複合体特異的な HIV-1中和抗体を作り出す（又は誘起する）ことができた。これらの抗体を使っ て得られた結果から、共有結合したgp120-CD4複合体は未結合の蛋白では通常機 能しない免疫原性エピトープを保有していることがわかる。 ここに示した結果はハイブリドーマ上清を使った場合のもので、精製免疫グロ ブリンでも同じ特異性が見られた。 aPHA刺激PBMC（２×10⁵細胞）を、示されている量の精製抗体の存在下で、HIV -1IIIBまたはHIV-1MNの一次分離株（50 TCID50）のいずれかで18時間感染させた 。それから細胞を洗浄し、同一量の抗体を含有する新鮮な培地で培養した。第７ 日に上清のp24含有量を測定し、抗体がない状態で実施した対照測定に比較して 阻害率を算出した。 下記の文献は明細書中に引用されたものである

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/10 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/10 16/28 8517−4Ｈ 16/28 19/00 8517−4Ｈ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/08 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 33/577 9284−4Ｃ Ｓ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ｕ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者 サーンガダラン，マンガラツセーリ・ジー アメリカ合衆国、バージニア・22102、マ ツクリーン、ホリー・リーフ・ドライブ・ 8422

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 医薬上許容されうる媒体中にCD4と共有結合したgp120の複合体を免疫原と して有効な量含んで成るワクチン。 ２． ヒトにおいてHIV感染に対する中和抗体を誘起する方法であって、医薬上 許容されうる担体中にCD4と共有結合したgp120の複合体を免疫原として有効な量 含む請求項１に記載のワクチンを投与することを包含する方法。 ３． 医薬上許容されうる媒体中にスクシニルコンカナバリンAと共有結合したg p120の複合体を免疫原として有効な量含んで成るワクチン。 ４． ヒトにおいてHIV感染に対する中和抗体を誘起する方法であって、医薬上 許容されうる担体中にスクシニルコンカナバリンAと共有結合したgp120の複合体 を免疫原として有効な量含む請求項３に記載のワクチンを投与することを包含す る方法。 ５． CD4と共有結合したgp120を含んで成る免疫原性複合体。 ６． スクシニルコンカナバリンAと共有結合したgp120を含んで成る免疫原性複 合体。 ７． 請求項５に記載の免疫原性複合体を含んで成る組成物。 ８． さらにリン酸アルミニウムゲルから成るアジュバントを含む請求項７に記 載の組成物。 ９． 請求項６に記載の免疫原性複合体を含んで成る組成物。 10． さらにリン酸アルミニウムゲルから成るアジュバントを含む請求項９に記 載の組成物。 11． 請求項５に記載の免疫原性複合体と反応する抗体。 12． モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項11に記載の抗体。 13． 請求項６に記載の免疫原性複合体と反応する抗体。 14． モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項13に記載の抗体。 15． 請求項12に記載の抗体を産生することを特徴とする不死化細胞系。 16． 請求項14に記載の抗体を産生することを特徴とする不死化細胞系。 17． 試験液中の抗HIV抗体を検出するための方法であって、CD4およびスクシニ ルコンカナバリンAの１つと共有結合したgp120の免疫原性複合体を接触させ、該 抗体および該免疫原性複合体の間で形成される免疫複合体の存在を検出すること を含 む方法。 18． 試験液中のHIV抗原を検出するための方法であって、試験液をCD4およびス クシニルコンカナバリンAの１つと共有結合したgp120の免疫原性複合体に対して 作製した抗体と接触させ、試験液中の抗原および該抗体の間で形成される免疫複 合体の存在を検出することを含む方法。 19． 請求項17に記載の方法を実施するための試験キットであって、固体支持体 に結合させたか又は標識した前記免疫原性複合体と、検出方法の実施に関する使 用説明書とを含んで成るキット。 20． 請求項18に記載の方法を実施するための試験キットであって、固体支持体 に結合させたか又は標識した前記抗体と、検出方法の実施に関する使用説明書と を含んで成るキット。