JPH08510327A - ゲル浸透クロマトグラフィのための方法及び担持物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は改良されたゲル浸透クロマトグラフィの方法及びこの方法のための担持物に関する。この方法では、使用する担持物は、担体の脂肪族ヒドロキシル基にグラフトしており、かつ、末端モノマー単位で該担体に共有結合している、水溶性ビニルモノマーからつくられた線状ポリマーを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ゲル浸透クロマトグラフィのための方法及び担持物 本発明は、ゲル浸透クロマトグラフィのための改良方法及びこの方法のための 担持物に関する。 マクロ分子のサイズ分離のためのゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）は、バ イオポリマー、特に蛋白質の分離のための標準的な方法となっている。これには 、親水性の表面を有し、さらに可能ならば不特定の吸着挙動を示さない担持物を 必要とする。誘導されたものでない多孔性シリカゲルを用いるときに起る強度に 不特定な吸着行動を回避するために、アメリカ特許第５，０３５，８０３号は、 シリカゲルの表面が水溶性のビニルポリマーで占められるようにすることを提案 している。この刊行物において使用するグラフトプロセスは、このポリマー鎖の 任意の箇所おそらく複数の箇所で、ベースの担体にランダムに連結するポリマー をあげている。 細孔の径はそれぞれの分離の課題にマッチするものでなければならない。分離 材の細孔の径を定めるのに使用する各種の方法は、往々にして多大の努力を必要 とする。この目的のために、重合の際の架橋度を調節 するか、又はシリカゲルの細孔を後処理の段階で拡大させてもよい。 細孔の径が大きいためにゲル浸透クロマトグラフィに基く物質の分離が全くで きないか又は不充分にしか分離できないような、拡大した細孔を有する担持物も 、これら担体の脂肪族ヒドロキシル基に水溶性ビニルモノマーの線状ポリマーを グラフトさせると、すぐれた分離成績をあげることがわかった。本発明のこれら の担持物においては、１つの末端モノマー単位が、各々の場合ベースの担体に共 有結合で結合している。 それぞれの分離の課題に対する細孔径の選択はしたがって大して重要ではなく 、担持物の選択率はグラフトさせるポリマーの性質によって決められ、このポリ マーの性質は重合条件によって容易に調節することができる。 本発明は、ゲル浸透クロマトグラフィ手段によって混合物中の２つ以上の物質 を分離するための方法を提供するものであり、その特徴は、使用する担持物が、 ベースの担体の脂肪族ヒドロキシル基にグラフトしており、かつ、このベースの 担体に末端のモノマー単位で共有結合している、水溶性ビニルモノマーの線状ポ リマーからなることである。 本発明はまた、脂肪族ヒドロキシル基を含むベースの担体に、水溶性ビニルモ ノマーの共有結合した線状 ポリマーがグラフトしており、このポリマーが末端のモノマー単位でベースの担 体に共有結合している、前記ベースの担体からなる、ゲル浸透クロマトグラフィ のための担持物の使用にも関する。 本発明はさらに、ヒドロキシルを含有するベースの担体表面にポリマーが共有 結合している該ベースの担体を基礎とする、ゲル浸透クロマトグラフィのための 担持物を提供する。その特徴は以下のａ）〜ｄ）にある。 ａ）該ベースの担体は脂肪族ヒドロキシル基を含み、 ｂ）該共有結合ポリマーは、末端モノマー単位を通して担体に結合しており、 ｃ）該ポリマーは式Ｉのモノマー単位からなり、 ｄ）該モノマー単位は線状に連結している。 但し上式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、Ｘは複素環式 ラジカル、又は式IIのラジカル、 又は式IIIのラジカルであり、 Ｒ⁴は単一又は重複してヒドロキシル化したＣ₂−Ｃ₇−アルキルラジカルであり 、このラジカル中１個以上の非隣接ＣＨ₂基は−Ｏ−によって置き換えることが でき、Ｒ⁵及びＲ⁶は互いに独立に、各々が単一又は重複してヒドロキシル化した Ｃ₂−Ｃ₇−アルキルラジカルであり、このラジカル中１個以上の非隣接基は−Ｏ −によって置き換えることができ、Ｒ⁵又はＲ⁶の２つのラジカルのうちの１つは Ｈであることもできる。 本発明は、ヒドロキシルを含有するベースの担体表面にポリマーがグラフト重 合により共有結合している該ベースの担体に基ずく担持物を製造する方法を提供 する。その特徴は、式IV のモノマーからなる溶液中において、セリウム（IV）イオンの存在下にヒドロキ シルを含有するベースの担体粒子を懸濁させて重合させることにある。 但し上式中、 Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、 Ｙは複素環式ラジカル、又は式Ｖのラジカル、 又は式VIのラジカル であり、 Ｒ⁷はヒドロキシル基のための１つ以上の前駆基を含むＣ₂−Ｃ₇−アルキルラジ カルであり、このラジカル中１個以上の非隣接ＣＨ₂基は−Ｏ−によって置き換 えることができ、 Ｒ⁸及びＲ⁹は互いに独立に、それぞれヒドロキシル基のための１つ以上の前駆基 を含むＣ₂−Ｃ₇−アルキルラジカルであって、このラジカル中１個以上の非隣接 ＣＨ₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、Ｒ⁸又はＲ⁹ラジカルのうちの １つはＨであることもでき、 そしてもし必要ならば、前駆化合物はヒドロキシル基に変換される。 図１は分離の挙動を示す：ベースの担体としてシリカゲルを使用し、重合の反 応時間を変化させた。 図２は未修飾のヒドロキシル化ポリメタクリレート［フラクトゲル（Ｆｒａｃ ｔｏｇｅｌ）ＨＷ６５（Ｓ） ：登録商標］の分離挙動と、本発明により修飾した同上ポリマーの分離挙動とを 比較している。 適当なベースの担体は、クロマトグラフィに慣用の多孔性の担体物質であって 脂肪族ヒドロキシル基を含むものである。そのような担体物質は、架橋したデキ ストラン又はグルコマンナンなどのポリサッカリド、さらにヒドロキシル−含有 ポリ（メタ）アクリル酸誘導体及びＤＩＯＬ−修飾シリカゲルを含む。 ベースの担体の細孔径は、意図する分離の課題に相応すると思われる細孔径よ りも大きいことが好ましい。前記の拡大した細孔と云う用語を本発明において用 いるのはこの関係においてである。例えば、５００〜４０００オングストローム の細孔径を有するＤＩＯＬ−修飾シリカゲルをベースの担体として使用するのが 好ましい。 多数の水溶性ビニルモノマーが当業者には知られている。これらは、アクリル アミド又はメタクリルアミド、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート又 はＮ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド又はＮ−（２，３−ジヒドロキシ プロピル）−アクリルアミドのような（メタ）アクリル酸誘導体を含む。さらに 、これらは、例えば１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニ ルピリジン、４−ビニルピリジン、４−ビニルピロリドン−Ｎ−オキシドのよう なビニル化した複素環を含む。 三野（Ｍｉｎｏ）及びカイザーマン（Ｋａｉｚｅｒｍａｎ）のＪ．Ｐｏｌｙｍ ｅｒ．Ｓｃ．３１，２４２〜２４３（１９５８）及びＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ．Ｓｃ ．３８，３９３〜４０１（１９５９）によれば、グラフト反応は脂肪族ヒドロキ シル基との反応に基くので、２，３−エポキシプロピルメタクリレートのような 前駆化合物を、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレートのようなヒドロキ シル−含有モノマーの代りに使用しなければならない。重合後、既知の方法によ ってヒドロキシル基が得られる。特定の条件下での重合により、ＤＥ３８ １１ ０４２に正確に開示されているように、低重合度（２＜ｎ＜１００）のポリマ ーが得られる。したがって細孔のスペースは完全には満たされていない。 本発明のクロマトグラフ分離法においては、マクロ分子の拡散は従来技術のゲ ル浸透クロマトグラフィでの分離から類似して知られるように、ベースの担体上 にグラフトする線状ポリマーによって強く影響される。しかしながら本発明の分 離法は、細孔スペースが分析物にとって完全にアクセス可能な、拡大した細孔を 有するマトリックスを使用する。このような条件の下では、従来法のゲル浸透ク ロマトグラフィでは分離は達成できないであろう。 図１において、一連の標準検定蛋白質（１２，６００〜１，３２０，０００ダ ルトン）について、流体力学的半径の対数（log Ｒ_h）が移動相と多孔内相との 間の分配係数ＫＤに対してプロットされている。 重合の際の異なる反応時間によって種々の担持物が得られた： その他の実験詳細は実施例１及び３に挙げられている 図から見られるように、出発物質は使用した蛋白質に対して殆んど分離性を示 さない；内部の細孔スペース全体がすべての蛋白質にとって同等にアクセス可能 である。 時間を増加させてグラフトの後、この物質は蛋白質に対する使用範囲で２〜３ 倍オーダー（表１参照）の高選択率を有するＧＰＣ担持物となる。２１時間後に 達成される選択率の０．３７は、本発明の担持物がすぐれたＧＰＣ担持物である ことを示している。 した結果を同様の方法で比較している。実験の詳細は実施例２及び３にあげられ ている。 表２は得られた生成物の特性データをまとめたものである。選択率は修飾によ り０．１５１から０．３４ ８に増加する。 さらに説明の要もなく、当業者は上記記載を広範囲にわたって利用できること はもちろんである。したがって前記の好ましい実施態様は単に開示の説明として 解釈さるべきであり、いかなる形でも開示を限定するものでない。 前述のすべての出願、特許及び刊行物の完全な開示、ならびに１９９３年５月 １３日出願の該当出願Ｐ４３ １６ １３６を本出願中に引用文献として組み入 れる。 以下の実施例により本発明をさらに説明する。 実施例： 実施例１： シリカゲル上にグラフトさせることに よるＧＰＣ担持物の製造 １５０ｍｌのＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ−Ｄｉｏｌ（登録商標）（細孔径が２０ ００オングストローム；粒径が７μｍ）を２００ｍｌの水及び１００ｍｌのＮ− （２−メトキシエチル）アクリルアミド４モル水溶液と共に３０％ＨＣｌＯ₄を 使用してｐＨ２に調節し、４０℃で撹拌しながら、０．５Ｍ ＨＮＯ₃中１１． ７ｇの硝酸セリウム（IV）アンモニウムを含む溶液の５０ｍｌとアルゴン雰囲気 の下で混合した。３０、９０、及び２４０分後毎に１００ｍｌの懸濁液をとり、 それぞれの場合に４００ｍｌの水で稀釈し、濾紙上で吸引濾過した。続いて生成 物を各ケースとも、それぞれ５０ｍｌの０．４Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₃と０．４Ｍ Ｈ₂ ＳＯ₄の混合物中に懸濁させ、完全脱色後、１００ｍｌの水、２５０ｍｌの０． ２Ｍ醋酸ソーダ溶液及び５００ｍｌの水で洗浄して中性にした。残留混合物を合 計２１時間後、同様方法で操作する。 実施例２： フラクトゲル（商標）上にグラフトさ せることによるＧＰＣ担持物の製造 １００ｍｌのフラクトゲル（商標）ＨＷ６５（Ｓ）を２００ｍｌの０．２Ｍ醋 酸ソーダ溶液及び８００ｍｌの水で洗浄し、２００ｍｌの水及び８４ｍｌのＮ− （２−メトキシエチル）アクリルアミド４モル水溶液中に懸濁させ、さらに４５ ０ｍｌに調合して３０％過塩素酸によりｐＨを２に調節後、４０℃において撹拌 しながら、５０ｍｌの０．５Ｍ硝酸中５．８５ｇの硝酸セリウム（IV）アンモニ ウムを含む溶液とアルゴン雰囲気の下で混合した。１６時間後、この混合物を実 施例１に説明したように操作する。 実施例３： ＧＰＣ担持物上での蛋白質のクロマト グラフィ 各々が１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中の、実施例 １及び２の各ＧＰＣゲルをガラスカラム［スーパーフォーマンス（Ｓｕｐｅｒｆ ｏｒｍａｎｃｅ）（登録商標）３００×１０ｍｍ］中に加圧下に充填し、不活性 のＨＰＬＣユニット（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ）で１０ｍＭリン酸ソーダ緩 衝液（ｐＨ７．２）中０．３Ｍ ＮａＣｌを含む溶液を１．５ｍｌ／分の流速で 使用して平衡させた。ついで検定蛋白質を、単独で又は混合物で各ケースとも０ ．２ｍｌの緩衝液［１０ｍＭリン酸ソーダ緩衝液（ｐ Ｈ７．２）中０．３Ｍ ＮａＣｌを含む］中１ｍｇの濃度で使用し、０．５ｍｌ ／分の速度で溶離させた。溶離曲線は２８０ｎｍにおける光度測定法で求めた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．使用する担持物が、ベースの担体の脂肪族ヒドロキシル基にグラフトしてお り、かつ、該ベースの担体に末端モノマー単位によって共有結合している、水溶 性ビニルモノマーの線状ポリマーからなることを特徴とする、ゲル浸透クロマト グラフィ手段による混合物中の２つ以上の物質を分離する方法。 ２．脂肪族ヒドロキシル基を含むベースの担体上に共有結合している水溶性ビニ ルモノマーの線状ポリマーがグラフトしており、該ポリマーは末端モノマー単位 によってベースの担体に共有結合している、該ベースの担体からなるゲル浸透ク ロマトグラフィのための担持物の使用。 ３．ヒドロキシルを含有するベースの担体表面上にポリマーが共有結合している 該ベースの担体を基礎とする、ゲル浸透クロマトグラフィのための担持体であっ て、以下： ａ）該ベースの担体は脂肪族ヒドロキシル基を含み、 ｂ）該共有結合しているポリマーは末端モノマー単位によって該担体に結合し ており、 ｃ）該ポリマーは式Ｉのモノマー単位からなり、 ｄ）該モノマー単位は線状に連結しており、 ［但し上式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、 Ｘは複素環式ラジカルであるか、又は式II のラジカル、又は式III のラジカルであり、 Ｒ⁴は単一又は重複してヒドロキシル化したＣ₂−Ｃ₇−アルキルラジカルであり 、該ラジカル中１個以上の非隣接ＣＨ₂基は−Ｏ−によって置き換えることがで き、 Ｒ⁵及びＲ⁶は互いに独立に各々が単一又は重複してヒドロキシル化したＣ₂−Ｃ₇ −アルキルラジカルであって、該ラジカル中１個以上の非隣接ＣＨ₂基は−Ｏ− によって置き換えることができ、Ｒ⁵又はＲ⁶の２つのラジカルのうちの１つはＨ であることもできる。］ を特徴とする前記担持物。 ４．ヒドロキシルを含有するベースの担体表面上にポ リマーがグラフト重合によって共有結合している、該ベースの担体を基礎とする 担持物の製造方法であって、該ヒドロキシルを含有するベースの担体粒子を式IV ［但し、上式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、 Ｙは複素環式ラジカルであるか、又は式Ｖ のラジカルであるか、又は式VI のラジカルであり、 Ｒ⁷はヒドロキシル基のための１個以上の前駆基を含むＣ₂−Ｃ₇−アルキルラジ カルであり、該ラジカル中１個以上の非隣接ＣＨ₂基は−Ｏ−によって置き換え ることができ、 Ｒ⁸及びＲ⁹は互いに独立に各々がヒドロキシル基のための１個以上の前駆基を含 むＣ₂−Ｃ₇−アルキルラジカルであり、該ラジカル中１個以上の非隣接ＣＨ₂基 は−Ｏ−によって置き換えることができ、Ｒ⁸及びＲ⁹の２つのラジカルのうちの １つはＨであること もでき、 そして、もし必要なら、前駆化合物はヒドロキシル基に転換される。］ のモノマーからなる溶液中において、セリウム（IV）イオンの存在下で懸濁及び 重合させることを特徴とする、前記担持物の製造方法。 ５．前記式IVの異なるモノマーを共重合させる請求項４に記載の製造方法。