JPH08510376A

JPH08510376A - 新規な抗−ガン胎児性抗原キメラ抗体一族

Info

Publication number: JPH08510376A
Application number: JP6519130A
Authority: JP
Inventors: ゴーリー，ブライアン・ビー; リクソン，マーク・ダブリユー; メゼス，ピーター・エス; キヤプラン，ドナルド・エイ; シユロム，ジエフリー
Original assignee: ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー; ザ・セクレタリー・オブ・ザ・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒユーマン・サービシズ
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1994-02-16
Publication date: 1996-11-05
Also published as: HU9502026D0; EP0684994A1; US5808033A; AU6242694A; WO1994019466A2; AU679046B2; CA2155934A1; WO1994019466A3; SG45370A1; US5472693A

Abstract

(57)【要約】本発明はヒト癌腫抗原に対する抗原−特異的可変領域を有する新規キメラモノクローナル抗体を開示する。本発明の新規抗体を含んで成る軽鎖および重鎖可変領域のためのＤＮＡ構築物も開示する。キメラ抗体を発現でき、そして新規抗体−コーディングＤＮＡ構築物を含んで成る真核宿主細胞も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新規な抗−ガン胎児性抗原キメラ抗体一族本発明はヒトガン胎児性抗原に対する新規キメラ抗体、およびそのような抗体をコードするＤＮＡ構築物に関する。ガン胎児性抗原（CEA）は最もよく特性決定されたヒト腫瘍−関連抗原であり、そしてヒト結腸ガンのインビトロ診断のために最も広く使用されている腫瘍マーカーである。CEAは正常糞抗原、非−特異的交差反応性抗原、胎便抗原および胆汁糖タンパク質を含む遺伝子産物に親密に関連した一族である。例えばMuraro ら、Cancer Research,45:5769-5780（1985）;およびRodgers、Biochim.Biophys. Acta ,695:227-249（1983）を参照にされたい。インビトロおよびインビボ診断ならびに治療のための抗原−特異的モノクローナル抗体（MAbs）の開発により、CEAに対して約2.6X10¹⁰M^-1の親和性定数を有するMAbが生産された（米国特許第5,075,432号明細書:T84.666 ATCC寄託番号BH874 7）、そしてこれらは他のCEA遺伝子族の員との交差反応性が少ないか、または無い。しかし、最も利用しやすいMAbはネズミハイブリドーマ由来のものである。ネズミ抗体を免疫アッセイに使用するインビトロの応用では、血清成分とネズミ免疫グロブリンとの反応に起因する偽陽性を生じる潜在的な問題がある。しかし、より重要なことは、ヒトの医薬品においてネズミ抗体を生体内投与することが、しばしばそれらの固有の免疫原性故に制限されるということである。ネズミ抗体の投与は、多くの患者に多回の投薬を処方する間に抗体の効能の漸減をもたらす免疫応答を誘発するだろう。この効能の低下は少なくとも一部は患者の免疫応答によるネズミ抗体の、血液循環からの迅速なクリアランスまたは薬物動態の変化に起因している。したがって、このような免疫原性なより、ネズミモノクローナル抗体の長期間にわたる多回投与、あるいはすでに暴露されている場合には、単回投与でさえも不可能にし、そして抗体の潜在的な臨床値に相当の衝撃を与える。１つの種由来の抗体の結合または可変領域が別の種由来の抗体の定常領域と結合しているキメラ抗体が、組換えＤＮＡ法により構築されてきている。腫瘍−関連抗原に対するキメラ抗体を記載している。例えば、Sahagenら、J.Immunol.,13 7:1066-1074（1986）;Sunら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:214-218（1987）;Nis himuraら、Cancer Res.,47:999-1005（1987）;およびLieら、Proc.Natl.Acad.Sc i.USA ,84:3439-3443（1987）を参照にされたい。典型的にはネズミ抗体の可変領域がヒト抗体の定常領域に連結している。キメラ抗体それ自体は組成のほとんどがヒトであり、ネズミ抗体よりも実質的に免疫原性が低いように思われる。したがってキメラ抗体がインビボの投与にはきわめて望ましい。キメラ抗体の一般的概念は記載されているが、抗体分子の機能はその３次元構造に依存し、次にその一次アミノ酸構造に依存している。したがって抗体のアミノ酸配列の変化はその活性に悪影響を及ぼすかもしれない（例えばHorganら、J. Immunology ,149:127-135（1992）を参照にされたい）。さらに抗体をコードするＤＮＡ配列の変化は、抗体を発現、分泌または構成するためのＤＮＡ配列を含有する細胞能力に影響するかもしれない。腫瘍に対するキメラ抗体は記載されているが、ヒトCEA抗原に対し特異性を有する新規キメラ抗体の開発の必要性が存在する。本発明はネズミ可変領域およびヒト定常領域遺伝子を使用する、CEAに対するキメラCOL-1（ChCOL-1）またはキメラCOL-1 R'（ChCOL-1 R'）抗体およびその一部をコードするDNA配列を含有する発現ベクターを提供する。特に本発明は配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるものと実質的に同じ軽鎖可変領域を有するキメラネズミ−ヒトCOL-1またはCOL-1R'抗体である。別の態様では本発明は配列番号３のＤＮＡ配列によりコードされるものと実質的に同じ重鎖可変領域を有するキメラネズミ−ヒトCOL-1抗体、または配列番号５のＤＮＡ配列によりコードされるものと実質的に同じ重鎖可変領域を有するキメラネズミ-ヒトCOL -1R'抗体である。本発明はキメラCOL-1またはキメラCOL-1R'抗体をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターで形質転換された細胞も提供する。別の態様では、本発明は配列番号２のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んで成るChCOL-1またはChCOL-1 R'モノクローナル抗体を提供する。さらに本発明は配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んで成るChCOL-1またはChC OL-1R'モノクローナル抗体を提供する。さらに別の態様では本発明は配列番号２のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列と実質的に同じまたは配列番号６のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んで成るキメラモノクローナル抗体を提供する。さらに本発明はインビトロおよびインビボ診断アッセイならびにインビボ治療に使用するための新規キメラ抗体を提供する。図面の説明第１図はpCOL-1γ1のプラスミドマップを具体的に説明する。ネズミCOL-1重鎖可変領域は点棒で表し、そしてヒトγ1定常領域は黒棒で示す。第２図はpCOL-1γ4のプラスミドマップを具体的に説明する。ネズミCOL-1重鎖可変領域は点棒で表し、そしてヒトγ4定常領域は黒棒で示す。第３図はpRL1003のプラスミドマップを具体的に説明する。これはpRL1003の相当部位中にクローン化された任意のBamHI−HindIII V_L DNA断片がキメラ軽鎖ポリペプチドを与えることができるユニバーサル軽鎖発現ベクターである。第４図はpRL301のプラスミドマップを具体的に説明する。ネズミCOL-1軽鎖可変領域は中抜き棒で示し、ヒトκ定常領域は黒棒で示し、そしてヒトサブグループIVプロモーター領域は点棒で示す。第５図はDNA断片a-x、y-b1およびy-b2を作成するために使用したヒト重鎖定常領域およびオリゴヌクレオチドプライマー（ワッギングテイル：wagging tail を持つ）を具体的に説明する。本明細書で参照にするすべての文献の全教示内容は、引用により本明細書に編入する。モレキュラークローニングの方法はSambrookら、Molecular Cloning、コールドスプリングハーバー出版（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク、第二版（1989）およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology 、ジョンウィリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（19 92）に記載されている。核酸、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基等が略称される場合はIUPAC IUB （生物学命名法委員会）または関連する分野の慣習に従い略称される。本明細書で使用する“可変領域”という用語は抗原に対する結合認識特異性に関する決定基およびＭＡｂの全体の親和性を含む軽鎖（Ｖ_L）および重鎖（Ｖ_H）抗体分子の領域またはドメインを言う。各々の軽鎖および重鎖対のさまざまなドメインは抗原決定部位を形成する。軽鎖および重鎖のドメインは同じ一般構造を有し、そしてそれぞれのドメインは４つの枠組み構造（framework:FR）領域を有し、その配列は比較的保存され、３つの相補性決定部位（CDR）により結合している。FR領域は可変ドメインの構造的完全性を維持している。CDRは抗原の結合を媒介する可変領域内のポリペプチドセグメントである。本明細書で使用する“定常領域”という用語は、構造的安定性および他の生物的機能（抗体鎖結合、分泌、経胎盤移動および相補的結合のような）を提供するが、CEA結合には関与しない軽（Ｃ_L）鎖および重（Ｃ_H）鎖抗体分子のドメインを言う。定常領域のアミノ酸配列および遺伝子中の対応するエキソン配列はそれが派生した種に依存するであろうが、アロタイプを導くアミノ酸配列の変異は、種内で特定の定常領域に比較的限定されている。各々の鎖の可変領域は連結ポリペプチド配列により定常領域に結合している。連結配列は軽鎖遺伝子中の“Ｊ”配列、ならびに重鎖遺伝子中の“Ｄ”配列および“Ｊ”配列の組み合わせによりコードされる。本発明の目的のための“キメラ抗体”’とは、重および軽鎖中にネズミ免疫グロブリン遺伝子由来のヌクレオチド配列によりコードされる可変領域アミノ酸配列を有し、そしてヒト免疫グロブリン遺伝子由来のヌクレオチド配列によりコードされる定常領域アミノ酸配列を有する抗体を言う。本明細書で使用する“形質転換”という用語は、受容宿主細胞中にＤＮＡを導入することにより宿主細胞のゲノムに起こる変化を言う。“宿主細胞”という用語は組換えＤＮＡ法を使用して構築されたベクターで形質転換することができる細胞を言い、そのベクターは組換えタンパク質産物の発現のために細胞中に存続する。本明細書で使用する“抗体”または“免疫グロブリン”という用語は、抗体分子がタンパク質分解的に開裂または組換え的に調製された部分のセグメントを含み、これらは選択的に特定の抗原または抗原一族と反応することができる。そのようなタンパク質分解かつ／または組換え断片の例は制限するわけではないが、 Fab、F(ab')₂、Fab'、Fv、断片およびペプチドリンカーに結合したV_LおよびV_Hドメインを含有する単鎖抗体（scFv）を含む。このscFv'は共有的または非−共有的に結合して２つ以上の結合部位を持つ抗体を形成することができる。本発明のＤＮＡコード配列はCEAに特異性を有する軽鎖または重鎖可変ドメインをコードする第一ＤＮＡ配列、ならびにキメラ抗体の軽鎖または重鎖定常ドメインをコードする第二ＤＮＡを有する。本発明により、CEAに対するキメラ抗体の軽鎖のためのＤＮＡ構築物は配列番号１と実質的に同じ軽鎖可変領域をコードする第一ＤＮＡ配列を含んで成る。また、本発明によりCEAに対するキメラ抗体の重鎖のためのＤＮＡ構築物は配列番号３または配列番号５と実質的に同じ重鎖可変領域をコードする第一ＤＮＡ配列を含んで成る。本発明の新規キメラ抗体を含んで成るキメラポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に開示されたＤＮＡ配列から決定することができる。したがって、CEAに対する本発明のCOL-1およびCOL-1 R'キメラ抗体は、実質的に配列番号２と同じアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んで成る。さらに本発明の新規キメラ抗体は配列番号４または配列番号６と実質的に同じアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んで成る。 “実質的に同じ”とはCEAとの結合において実質的に均等である可変領域を生じる、本明細書に開示されたキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のわずかな修飾を意味する。これらの修飾はCEAに対する必須の特異性が保持されるかぎり本発明に包含される。 COL-1およびCOL-1 R'抗体の可変領域由来のCDRはヒトFR領域に移植することができる（例えば欧州特許出願公開第0239400号明細書を参照にされたい）。これらの新しい抗体はヒト化された抗体と呼ばれ、そしてネズミ抗体をCDRとヒトFR とを組み合わせることによりヒト抗体中に転換する方法はヒト化と呼ばれる。ヒト化抗体は、もとの抗体と同じ抗原に結合するが、その上、ヒトに注入されたときにはキメラ抗体のように免疫原性が低いので重要である。COL-1軽鎖可変ドメインのCDRは配列番号２に表され、CDR1は24位から38位のアミノ酸により、CDR2 は54位から60位、そしてCDR3は93位から100位のアミノ酸により表される。COL-1 およびCOL-1 R'重鎖可変ドメインは配列番号４に表され、そして配列番号６の31 位から35位のアミノ酸配列によりCDR1が、50位から66位によりCDR2が、そして99 位から113位によりCDR3が表される。好ましくは、軽鎖および重鎖可変領域に関する第−DNAコーディング配列は、ポリペプチドを発現そしてこれらの真核宿主細胞により分泌するためのリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る。リーダーペプチドのＤＮＡ配列は翻訳開始シグナル（即ち機能的ポリペプチドの翻訳を開始する転写ｍＲＮＡ配列の中にある配列）を含む。当業者はこのリーダーペプチドが成熟タンパク質中には存在せずCEAの結合には機能しないので、リーダーペプチドをコードする様々なＤＮＡ配列が本発明に適当に使用できることを認識するであろう。成熟ポリペプチドを分泌する前に、新生軽鎖および重鎖ポリペプチドはシグナルペプチド開裂部位で切断され、これにより各々の鎖からリーダーペプチドまたはシグナル配列を遊離する。当業者は、本発明のＤＮＡ構築物を含んで成る第一のＤＮＡコーディング配列を当該技術分野の多くの方法（例えば部位−特異的突然変異誘発法により実質的に均等なＤＮＡ構築物を提供する）により修飾することができると考えるだろう。これらの修飾ＤＮＡコーディング配列は、本明細書に記載されたものと実質的に同じキメラポリペプチドに翻訳されることができるかぎり本発明に含まれる。部位−特異的突然変異誘発法を使用すると、生成するキメラポリペプチドのCEA に対する親和性を改変できる場合がある。好ましくは本発明のＤＮＡ構築物の第一ＤＮＡコーディング配列は、CEAに対するモノクローナル抗体を発現しているネズミハイブリドーマのゲノムＤＮＡ由来であり、COL-1と命名されている（例えばMuraroら、同上を参照にされたい）。本発明に使用するゲノムＤＮＡは従来の技術および様々な方法により得、そしてクローン化することができる。そのような技術はBasic Methods in Molecular Biology 、Davisら編集、エルセビアー（Elsevire）、ニューヨーク（1986）;Sa mbrookら、Molecular Cloning、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク、第二版（1989）、およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology 、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク（1992）に記載されている。例えば、ハイブリドーマ細胞ＤＮＡを標準的手法により単離し、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで断片に消化し、そして生成した断片を適当な組換えＤＮＡクローニングベクター中にクローン化し、そして本明細書に開示されたＤＮＡ配列の存在を放射線標識または酵素的に標識したプローブでスクリーニングすることができる。キメラ抗体の軽鎖および重鎖可変領域であるポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ構築物の第一のＤＮＡ配列も、ハイブリドーマｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡから得ることができる。ｃＤＮＡを得、そしてクローン化する手法は周知であり、そしてSambrookら、同上およびAusubelら、同上により記載されている。したがってｃＤＮＡを標準的手法でクローン化することができ、そして生成クローンを本明細書で定めた可変領域をコードするｃＤＮＡ用の適当なプローブでスクリーニングする。所望のクローンを単離した後、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと本質的に同じように操作することができる。さらに配列は定常領域のプライマーを使用することによりｃＤＮＡからｍＲＮＡの配列を決定した後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得ることもできる。可変領域エキソンのｃＤＮＡ配列から、ＰＣＲプライマーを使用して可変領域エキソンを増幅させる。これらのＰＣＲプライマーは、適当な発現ベクター中に挿入できる非−ホモロガス伸長物を有するであろう。あるいはCEAに対する軽鎖および重鎖可変領域特異性に関して必須な遺伝情報を含む第一のＤＮＡ配列は、従来の方法により合成的に調製することができる。ベクター中のMAb ＤＮＡ配列の確認、真核宿主細胞中へのトランスフェクション、そしてキメラ抗体の発現後、上清をCEAの結合に関して抗体のヒト定常領域を検出することによりスクリーニングする。キメラ抗体の軽鎖および重鎖定常領域をコードする本発明のＤＮＡ構築物の第二のＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡからクローン化することができ、あるいは合成的に調製できる。ヒト定常領域をコードするＤＮＡ配列の使用は、免疫原性を最小にするキメラ軽鎖および重鎖ポリペプチドを生成するものと期待される。好適な使用はヒト軽（カッパおよびそのアロタイプ）鎖およびヒト重（ガンマまたは他のクラス；および様々なそのイソタイプまたはアロタイプ）鎖遺伝子である。さらに好適なのはヒトガンマイソタイプγ１およびγ４であり、それぞれが生成キメラ抗体に独自の生物学的特性を付与する。ヒトガンマイソタイプに関する総説は、例えば“ヒトＩｇＧサブクラス（Human IgG Subclasses ）”R.G.Hamilton,Doc.No.CB0051-289、カルビオケム社（Calbiochem Corporati on）（1989）を参照にされたい。本発明のキメラＤＮＡ構築物を調製し、そしてこれらの構築物を適当な組換えＤＮＡクローニングベクターおよびＤＮＡ発現ベクターに導入するために必要な組換えＤＮＡ技法は当該技術分野で周知である。例えばSambrookら、同上および Ausubel、同上を参照にされたい。軽鎖および重鎖キメラポリペプチドをコードする遺伝子を含む本発明のＤＮＡ構築物を、適当な真核宿主細胞に発現ベクターの一部として導入する。一般的にそのようなベクターは宿主細胞と適合性のある種由来の制御配列を含む。ベクターは通常、形質転換細胞の表現型の選択を提供することができる特定遺伝子（１つまたは複数）を持つ。これらの構築物は単一の真核発現ベクター上に含まれるか、あるいは各々が単一のキメラ遺伝子構築物を含んで成る別個の発現ベクターに、分離して維持されることができる。キメラポリペプチドの発現のためには、選択された真核宿主細胞で機能する転写および翻訳調節配列を含む必要がある。真核細胞用の広範な様々の組換え宿主−ベクター発現システムが知られており、そして本発明に使用できる。例えばサッカロミセスセルビシエ（Saccharomy ces cerevisiae ）または通常のパン酵母は、真核微生物の中で最も普通に使用されているが、例えばピチアパストリス（Pichia pastoris）のような他の多くの株も利用できる。ATCCから入手できるSp2/0またはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）のような多細胞生物由来の細胞系も宿主として使用できる。真核細胞の形質転換に適する典型的なベクタープラスミドは、例えばpSV2neoおよびpSV2gpt （ATCC）、pSVLおよびpSVK3（ファルマシア:Pharmacia）、ならびにpBPV-1/pML2 d（インターナショナルバイオテクノロジー社:International Biotechnology I nc.）である。本発明の有用な真核宿主細胞は、好ましくはハイブリドーマ、ミエローマ、プラスマ細胞腫またはリンパ腫細胞である。しかし哺乳類宿主細胞がキメラタンパク質の発現のための転写および翻訳ＤＮＡ配列を認識でき；リーダー配列の開裂によりリーダーペプチドをプロセッシングし、そしてキメラタンパク質を分泌でき；そしてキメラタンパク質の翻訳−後修飾（例えばグリコシル化）を提供することができれば、他の真核宿主細胞も適当に使用することができる。したがって本発明は本明細書に開示されたキメラ遺伝子構築物を含んで成る組換え発現ベクターにより形質転換され、かつ本発明のキメラタンパク質を発現できる真核宿主細胞を提供する。それゆえに本発明の形質転換宿主細胞は、本明細書に記載されたキメラ軽鎖および重鎖遺伝子ならびにこれらのキメラタンパク質の発現を支配するための軽鎖および重鎖−コーディングＤＮＡ配列に関連して位置する転写および翻訳配列を含んで成る少なくとも１つのＤＮＡ構築物を含んで成る。本発明で使用する宿主細胞は、当該技術分野で周知の標準的なトランスフェクション法による様々な方法で形質転換させることができる。使用できる標準的なトランスフェクション法には電気穿刺法、プロトプラスト融合法およびカルシウム−リン酸沈殿法がある。そのような技術は一般的にF.Toneguzzoら、Moll.Cell .Biol .,6:703-706（1986）;G.Chuら、Nucleic Acids Res.,15:1311-1325（1987 ）;D.Riceら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:7862-7865（1979）;およびV.Oiら、P roc.Natl.Acad.Sci.USA ,80:825-829（1983）に記載されている。本発明のキメラ構築物を含んで成る組換え発現ベクターは宿主細胞中で連続的にトランスフェクションされる。例えばキメラ軽鎖ＤＮＡ構築物を含んで成る発現ベクターは始めに宿主細胞中にトランスフェクトされ、そしてキメラ軽鎖ポリペプチドを発現している形質転換した宿主細胞を当該技術分野で周知の標準的手法により選択される。キメラ重鎖ＤＮＡ構築物を含んで成る発現ベクターは、その後に選択した軽鎖を発現している宿主細胞中にトランスフェクトされる。あるいはキメラ軽鎖および重鎖の両方の発現ベクターを同時に宿主細胞中に導入することもできる。本発明が提供する新規キメラ抗体はインビトロおよびインビボの両用途で有用である。例えば本発明のキメラ抗体は、CEAの検出および腫瘍−関連抗原（例えば治療中の）を検出するためのインビトロ免疫アッセイに利用できる。さらに免疫原性が相当に減少しているか、あるいは欠失されていると思われるので、本発明のキメラ抗体はインビボ診断および治療への応用にきわめてに望ましい。したがって本発明により提供されるキメラ抗体はインビボでの画像形成、ならびに結腸および乳癌腫ならびに消化管、肺、卵巣および膵臓に関連した腫瘍の治療に非常に有用である。本発明のキメラ抗体は非修飾抗体として使用でき、または適当な診断または治療薬と結合して使用することもできる。診断または治療薬の例としては¹²⁵Ｉ、¹ ³¹ Ｉ、¹²³Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁵³Ｓｍ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、¹⁶⁶Ｈｏ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、^99mＴｃ、⁹⁰Ｙおよび⁴⁷Ｓｃのような放射性核種；メトトレキセートおよびアドリアマイシンのような薬剤；インターフェロンおよびリンホカインのような生物反応モディファイアー；およびリシンのようなトキシン類である。抗体を放射性核種で標識する有用な方法は、二官能性キレート剤による。二官能性キレート剤は化合物であり、金属を封鎖またはキレート化することができる金属キレート部分、およびキレート剤がタンパク質に共有的に結合する反応基を有する。二官能性キレート剤は当該技術分野で周知であり、例えば欧州特許出願公開第292689号明細書、国際特許出願公開第WO89/12631号明細書（1989年12月18 日公開）、米国特許第4,678,667号、同4,831,175号および同4,882,142号明細書に開示されている。さらに、本発明のキメラ抗体の本質的な結合機能を保持する抗体断片、または抗体を含む混合物は本発明の特定の臨床的応用に応じて使用することができる。さらに本発明の新規キメラ抗体を、生理食塩溶液または無−毒性の緩衝液のような医薬的に許容できる、無−毒性の、滅菌キャリアー中に含んで成る医薬組成物も可能である。本発明はさらに純粋に本発明の例示を意図する以下の実施例を考察することにより一層明確になるであろう。実施例実施例１−COL-1中のマウス定常領域の置換Ａ．COL-1重鎖および軽鎖可変領域の調製１．COL-1重鎖可変領域の単離ａ．COL-1重鎖可変領域ＲＮＡの配列決定 COL-1細胞（ネズミIgG_2a,κ）［Muraroら、同上］由来の全ＲＮＡをChirgwin ら、Biochemistry,18:5294-5299（1979）のグアニジニウムイソチオシアネート／CsCl法により抽出した。PolyA＋RNAをoligo dT-セルロースカラムを通して精製した。ＲＮＡの配列決定はGeliebter、ベセスダリサーチラボラトリーズ（B ethesda Research Laboratories）FOCUS 9:5-8（1987）に従い行った。ＲＮＡの配列決定は始めに４つのすべてのＪ_H領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用して行ったが、Ｊ_H ¹だけは合成をプライムした。Ｊ_H ¹オリゴヌクレオチド（配列番号７）の配列は次のとおり：得られたＲＮＡ配列データは、５'非翻訳領域の41ヌクレオチド、全リーダーペプチドコーディング領域および全可変領域に対応した。このＲＮＡ配列データは可変領域をコードするゲノムＤＮＡクローンを獲得したことの陽性の確認として使用した。ｂ．COL-1重鎖可変領域のゲノムクローニング COL-1 DNAをCOL-1ハイブリドーマ系から、Sambrookら、同上に記載されたように精製した。EcoRIで消化したCOL-1 ＤＮＡのゲノムＤＮＡサザンブロットハイブリダイゼーションではネズミ重鎖J_H-C_μイントロンハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズする唯一の5.6kb断片を示した。ゲノムＤＮＡライブラリーを制限酵素−消化、サイズ−分画ＤＮＡから、ラムダバクテリオファージクローニングベクター、λ-ZAP（ストラタジーン：stratagene、ラジョラ、カリフォルニア州）をライゲーションおよびバクテリオファージパッケージングに関して製造元のプロトコールに従い使用して構築した。ゲノムライブラリースクリーニングはSambrookら、同上に記載されたように、同じ重鎖J_H-C_μイントロンハイブリダイゼーションプローブをゲノムブロットハイブリダイゼーションに使用して行った。このハイブリダイゼーションプローブは直接定常領域遺伝子配列に連結した免疫グロブリン中の生産的に再配置した可変領域遺伝子配列を検出する。90万個のプラークをスクリーニングし、そして３つの陽性にハイブリダイズしたプラークを精製した。λ-ZAPバクテリオファージからのプラスミドの回収はストラタジーンにより記載されたように行った。COL-1からの重鎖領域遺伝子を約5 .6キロベース対（kb）のEcoRI断片として単離した。すべての３つのラムダバクテリオファージが5.6kbのEcoRI断片を含有した。ｃ．COL-1重鎖可変領域遺伝子の配列プラスミドＤＮＡは、米国バイオケミカルズ（USB）（クリーブランド、オハイオ州）から得たSequenase（商標）DNAシークエンシングキットを製造元の手法に従い使用して配列決定した。陽性を確認するためにＤＮＡ配列は始めにＪ_H ¹オリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡシークエンシングにより得た配列との比較を通して行った。Ｊ_H ¹オリゴヌクレオチドに加えて、以下のオリゴヌクレオチドを使用してCOL- 1重鎖可変領域遺伝子（配列番号３）の配列を完全に決定した： COL-1重鎖可変領域はその生産的再配置においてSP2.2Dセグメント［Kabatら、免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest ）、第４版、米国健康およびヒューマンサービス部、国立健康研究所（U.S．Department of Health and Human Services,National Institutes of He alth（1991）］を利用した。COL-1の重鎖可変領域は、配列の基準がKabatら、同上によるマウス重鎖サブグループII（Ｃ）の構成員に、そしてDildrop,Immunol. Today ,5:85-86（1984）によるグループ1の構成員に適合して分類される。その予想されるアミノ酸配列は配列番号４である。上記に得られたｍＲＭＡ配列とＤＮＡ配列との間の比較を行った。この比較に基づき、プラスミドクローンはCOL-1重鎖可変領域をコードするために正しいＤＮＡ配列を含むことが確認された。 COL-1重鎖可変領域のヌクレオチド配列をGenBank（バージョン62）ＤＮＡ配列データベースと比較し、そして前駆体生殖系列遺伝子を同定した。この遺伝子はＶ_H2b-3と命名された［Schiffら、J.Exp.Med.,163:57 3-587（1986）］。Ｖ_H2b-3に由来する生産的再配置遺伝子はGenBank（商標）データベース（バージョン65）にはない。COL-1重鎖可変領域およびＶ_H2b-3の可変領域のヌクレオチド配列の比較では３つのアミノ酸置換を導く３つの体細胞突然変異があることを示す。２．COL-1軽鎖可変領域の単離ａ．COL-1軽鎖可変領域ｍＲＮＡの配列決定 COL-1細胞（ネズミIgG_2a,κ）由来の全ＲＮＡを上記１．Ａ．１．ａに記載したように調製した。 COL-1の軽鎖可変領域についての初めの配列データは、Ｃκと命名されたネズミκ特異的オリゴヌクレオチドを使用して集めた。Ｃκ（配列番号１２）のヌクレオチド配列は次の通りである：さらにデータを、ネズミＪ１に特異的なＪ１オリゴヌクレオチドおよび枠組み構造３領域から設計されたCOL1LFR3オリゴヌクレオチドを使用して得た。Ｊ１（− ）（配列番号１３）およびCOL1LFR3（−）（配列番号１４）のヌクレオチド配列は次の通りである：上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して得た配列は5'非翻訳配列の 19ヌクレオチド、全リーダーペプチドコーディング領域および全可変領域に対応した。このＲＮＡ配列データを可変領域をコードするＤＮＡクローンを得たことの陽性の確認として使用した。ｂ．COL-1軽鎖可変領域のＰＣＲ-媒介クローニング COL-1軽鎖可変領域ｃＤＮＡを単離するために、COL-1軽鎖ＲＮＡのシークエンシングから得た配列情報を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅［Saikiら、Science,239:487-491（1989）］に使用した。プライマー、COL1L5PCRと命名された5'プライマーおよびCOL1L3P CRと命名された3'プライマーは、ヒトκ定常領域遺伝子配列を含む発現ベクター中に直接クローン化できるＤＮＡ産物を作成するように設計した。使用したプライマーの配列は次の通りである：二重下線のヌクレオチドはイントロン中のスプライスアクセプターおよびドナー部位を示す。ＰＣＲ増幅の前に、始めに逆転写酵素ｃＤＮＡ合成工程を行った。簡単に説明すると、１マイクログラムのCOL-1 polyA⁺RNAをCOL1L3PCRおよび13.5単位のAMV 逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム：Boehringer Mannheim、インディアナポリス、インディア州）でプライムした（primed）。引き続きＰＣＲ増幅で397bp 断片を生成した。この断片をBamHＩおよびHindIIIで消化し、そしてヒトκ定常領域遺伝子発現ベクターpRL1003（以下の実施例I.B.3を参照にされたい）中にクローン化した。正しい制限酵素プロフィールを有する幾つかのクローンを得た。ｃ．COL-1軽鎖可変領域の配列ＤＮＡシークエンシングは、Sequenase（商標）DNAシークエンシングキット（米国バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ州）を製造元のプロトコールに従い使用してプラスミドＤＮＡを直接配列決定した。ＤＮＡ配列はプライマーHindIII Ｃ_k（-）およびCOL1LFR3（1-）を使用して2 つのクローンについて決定した。HindIII Ck（-）の配列（配列番号17）は次の通りである：２つのクローン配列は同一であった。 COL-1軽鎖可変領域のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および配列番号２に与えられている。この軽鎖可変領域配列はＲＮＡシークエンシングから決定した配列と一致し、そしてクローンがCOL-1軽鎖可変領域配列の生産的再配置を含むことを示した。 COL-1軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をGenBank（バージョン62）ＤＮＡ配列データベースと比較した。この比較によりCOL-1軽鎖可変領域が生殖系列Vk-21E 1.5Kb遺伝子（Heinrich,J.Exp.Med.,159:417-435（1984）から派生していることが明らかになった。データベースにはVk-21Eから派生した他の生産的再配置可変領域遺伝子は無かった。COL-1軽鎖可変領域およびVK-21E 1.5Kb遺伝子との間のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列の比較により、COL-1軽鎖可変領域中に５つのアミノ酸置換を導く５つの体細胞突然変異があることが示される。CO L-1の軽鎖可変領域は配列基準がKabatら、同上によるマウスカッパ軽鎖IIIの員に分類されることが適する。Ｂ．キメラCOL-1遺伝子構築物１．ヒト定常領域遺伝子ａ．ヒト重鎖定常領域遺伝子 γ１およびγ４ヒト重鎖定常領域（ｐγ１およびｐγ４）を含むプラスミド構築物はメリーランド州、ベセスダの国立ガン研究所のIlan R.Kirsch博士から提供された。制限酵素地図をこれらの遺伝子についてその同一性の確認するために作成した。 γ１の詳細はEllisonら、Nucleic Acids Res.,10:4071-4079（1982）およびTa kahashiら、Cell,29:671-679（1982）に説明されている。 γ４の詳細はEllisonら、DNA,1:11-18（1981）、KrawinkelおよびRabbits、EM BO J .,1:403-407ならびにTakahashiら、同上に説明されている。ｂ．ヒト軽鎖定常領域遺伝子ヒトＣ_k定常領域遺伝子を含むプラスミドpHumC_kをカナダ、オンタリオ州、トロントのMt．シナイ調査研究所（Mt.Sinai Research Institute）のJohn Rode r博士から得た。Ｃ_kの詳細はHieterら、Cell,22:197-207（1980）に説明されている。２．キメラCOL-1重鎖キメラ重鎖構築物を保持するために使用したプラスミドベクターをpSV2gptと命名し、MulliganおよびBerg,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,78:2072-2076（1981 ）に説明されている。pSV2gptは選択可能なマーカー遺伝子グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）を含有するプラスミド由来であり、これはマイコフェノール酸含有培地中での選択的成長のために使用することができる。pSV2gptをヒトＣγ１およびＣγ４エキソンの受容体として調製するために、EcoRIおよびBamHＩで消化した。この消化ＤＮＡを４パーセントポリアクリルアミドゲルで分画し、そして4.5kbベクター断片をゲルからSambrookら、同上に記載されたように電気溶離により回収した。この直線化プラスミドはEcoRI−BamHI末端化断片を受け入れることができる。 pSV2gptのEcoRI-BamHＩ部位に直接クローニングするために、ヒトγ１定常領域エキソン断片上に存在する5'HindIII部位をEcoRI部位にリンカー転換し、一方 γ１エキソンの3'に位置するPvul部位をBamHＩ部位にリンカー転換した。γ4定常領域エキソンについては、HindIII部位をEcoRI部位に、そして3'部位をBamHＩ部位にリンカー転換する代わりに、pBR322由来ベクター配列中に存在するEcoRI およびBamHＩ部位をPSV2gptのECoRI−BamHＩ部位に直接クローニングするために使用した。生成したプラスミドをそれぞれpSV2-gpt γ1-2.3およびpSV2-gptγ4 と命名した。 COL-1重鎖可変領域を含む約5.6kbのEcoRI断片をヒトγ1およびγ4定常領域発現ベクター、それぞれpSV2gpt γ1-2.3およびpSV2-gpt γ4のEcoRI部位に連結し、それぞれプラスミドpCOL-1 γ1（第１図）およびpCOL-1 γ4（第２図）に含まれるキメラCOL-1重鎖可変領域-ヒト定常領域遺伝子を生成した。電気穿刺の前に、これら両方のプラスミドを制限エンドヌクレアーゼPvuIにてキメラ遺伝子転写単位が妨害されない部位で直線化した。これらのプラスミドはプラスミドpSV2gp t（Mulliganら、同上）に由来し、そして形質転換哺乳動物細胞中のこれらの存在はマイコフォノール酸の存在下での成長により陽性として選択できる。３．キメラ軽鎖 COL-1軽鎖可変領域のクローニングは第３図に表す“ユニバーサル”軽鎖クローニング／発現ベクター（上記Ａ．２．ｂを参照にされたい）を使用して行った。このプラスミドをpRL1003と命名する。このベクターは抗体軽鎖可変領域を迅速にクローニングできるだけでなく、ヒト軽可変領域プロモーター（サブグループIV由来）、ヒト_Kイントロンエンハンサーおよびヒト_K定常領域を利用して転写的に完全なキラメ軽鎖遺伝子を生成することもできる。この“ユニバーサル”軽鎖クローニング／発現ベクターはpSV2neo［SouthernおよびBerg,J.Mol.App.Gen. ,1:327 341（1982）］から派生したものであり、そしてその形質転換した哺乳動物細胞中の存在はネオマイシンの類似体、G-418（ニューヨーク州、グランドアルランドのライフテクノロジーからGeneticinという商品名で市販されている）の存在中での成長により陽性として選択できる。キラメCOL-1軽鎖を含有するプラスミドはpRL301と命名され、そして第４図に表されている。電気穿刺の前にこのプラスミドを制限酵素Clalでキラメ軽鎖遺伝子が完全性を保つように消化した。Ｃ．キメラ遺伝子プラスミドのマウスミエローマ細胞中への形質転換１．標的形質転換法標的形質転換（targeted transformation）と命名された方法を使用して、軽鎖および重鎖キメラ免疫グロブリン遺伝子を含む構築物をSp2/Oマウスプラスマ細胞腫細胞中に連続的に形質転換した。この方法は、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo^r ）のような薬剤−耐性遺伝子を含むキメラ軽鎖ベクターで細胞を形質転換し、そして次に遺伝子を包含した細胞を薬剤（この場合はジェネテシン（Geneticin）を１mg ／mLの濃度）を含有する培地を使用することにより選択することを必要とする。第二形質転換はキメラ重鎖ベクターに別の薬剤耐性遺伝子、gptを組み込む。次に選択はジェネテシン（Geneticin）および0.3μg/mLマイコフェノール酸、250 μg/mLキサンチンならびに10μg/mLヒポキサンチンを含有する培地をneo^r およびgpt の選択に使用して行う。２．キメラCOL-1軽鎖遺伝子構築物を保持するneo耐性形質転換Sp2/O細胞系の調製 Sp2/Oマウスプラスマ細胞腫細胞（ATCC番号 CRL 1581、ロックビル、メリーランド州）を、初めに軽鎖−含有ベクター（pRL301）で以下のように形質転換した。細胞を5パーセントウシ胎児血清を含むRPMI1640培地（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、N.Y.）中で増殖させた。細胞をリン酸緩衝化生理食塩液（PBS）で洗浄し、そして1X10⁷生存可能細胞/mL PBS濃度に懸濁した。約0.8mLの細胞を20μgの軽鎖-含有ClaI線状化pRL301を含有する電気穿刺キュベット（氷上）に移した。氷上で15分後、キャパシタンスエクステンダー（バイオラッド： BioRad、リッチモンド、カリフォルニア州）を付加したジーンパルサーエレクトロポレーション装置（Gene Pulser Electroporation apparatus）を使用して0.2 キロボルトおよび960μFで電気穿刺を行った。形質転換後、細胞を15分間、氷上に回収し、不安定化した膜を弛緩させた。その後、細胞を5パーセントのウシ胎児血清を含有する24mLのRPMI 1640培地に懸濁し、そして96または24ウェルの組織培養プレートに移した。細胞を37℃および5 パーセントCO₂雰囲気でインキューベーションした。 48時間後（薬剤耐性遺伝子の発現を可能にする）、培地を取り出し、そして1mg/mLのジェネテシンを含有する培地と交換した。 10-14日後、ジェネテシン−耐性クローンをκ軽鎖の生産について、_K酵素結合免疫アッセイ（ELISA）により評価した。キメラ軽鎖発現の検出はヤギ抗-ヒト_K （GAHK）トラップおよびGAHKプローブを使用して行った。ELISAの検出に使用した抗体はサザンバイオテックアソシエイツ（Southern Biothech Associates）（バーミンガム、アラバマ州）から購入した。アルカリホスファターゼ基質系はカーケガート＆ペリーラボズ（Kirkeg gard & Perry Labs、ゲチスバーグ、メリーランド州）から得た。２つの別個のκELISAでの一定した高い値に基づいたサブクローンを確認した。サブクローンCOL-1_KD4/F2をキメラ重鎖遺伝子を受容する標的細胞系として選択した。３．キメラCOL-1軽鎖および重鎖遺伝子構築物を保持するneoおよびgpt耐性の形質転換されたSp2/O細胞系の調製 COL-1kD4/F2をキメラ重鎖構築物の標的として使用した。COL-1kD4/F2細胞を直線化pCOL-1 γ1およびpCOL-1 γ4で別個に電気穿刺した。電気穿刺の条件は上記と同じであるが、電気穿刺後に細胞を5パーセントのウシ胎児血清および1mg/mL のジェネテシンを含有する24mLのRPMI 1640培地に懸濁し、そして96または24ウェルの組織培養プレートに移したことが異なる。細胞を37℃で、かつ5パーセントCO₂雰囲気下でインキューベーションした。 48時間後（新しく導入された薬剤耐性遺伝子gptの発現を可能とする）、培地を取り出し、そしてさらに0.3μg/mLのマイコフェノール酸、250μg/mLのキサンチンおよび10μg/mLのヒポキサンチンを含有する同じ培地と交換した。 10から14日後、非−マイコフェノール酸感受性コロニーをIgG ELISAを使用して抗体産生についてアッセイした。全キメラ免疫グロブリンの検出はヤギ抗−ヒトIgG（GAHIgG）トラップおよびGAHIgGプローブを使用して行った。トラップ抗体はヤギ抗−ヒトIg（GAHIg）の場合もあった。サブクローンが一定して高いIgG ELISA結果を与えるように維持した。キメラCOL-1抗体を発現するChCOL-1 γ1と命名された細胞系を確認した。Ｄ．キメラCOL-1のインビトロ特性決定１．ChCOL-1 γ1タンパク質の精製研究用タンパク質を精製するための抗体を生産するために細胞系ChCOL-1 γ1 を選択した。選択可能薬剤を含有するRPMI1640を含む1リットルのスピナーフラスコに約10⁸細胞を植菌し、そして５日間増殖させた。増殖期間の終了時に、スピナーフラスコにはおよそ6パーセントの生存能力の約2×10⁹個の細胞が含まれた。キメラ抗体を含有する培養物上清を8,000×gで20分間遠心することにより得た。最後に0.2μm Gelman（アン:Ann、アーバー、ミシガン州）ディスクフィルターを通して清澄化した。ChCOL-1をNygene（ヨンカーズ:Yonkers、ニューヨーク州）プロテインＡカートリッジ（50mg IgG容量）に製造元のプロトコールに従い結合させた。抗体を0.1Mクエン酸ナトリウム（pH3.0）で溶離し、そして回収した画分のpHをpH9.0の1M Trizma塩基（シグマ：Sigma、セントルイス、モンタナ州）を加えて直ちに中性に上げた。抗体画分をプールし、そしてCentriprep 3 0マイクロ濃縮デバイス（アミコン:Amicon、ダンバース、マサチューセッツ州）を使用して約200μLに濃縮した。最終的な精製はファルマシア（Pharmacia）のS uperose 12 HR16/50ゲル濾過カラム（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を 0.2M リン酸をカラム緩衝液として使用して行った。約6.8mgの精製タンパク質を得た。２．ChCOL-1 γ1のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および等電点電気泳動（IEF）ゲル分析 ChCOL-1 γ1（7.5μg）のタンパク質試料をレムリー、Nature,277:630-685（1 970）の方法による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。勾配ゲル（3-12パーセントポリアクリルアミド）はインテグレイティッドセパレーションシステムズ（Integrated Separation SystemS、ハイドパーク、マサチューセッツ州）から購入した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーR-250（バイオラッドラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州）で染色した。非-変性条件下での精製COL-1 γ1のSDS-PAGE分析では、約150,00ダルトンの分子量が得られた。還元条件下では重鎖に対応するChCOL-1は約50,000ダルトンのバンドを、そして軽鎖に対応する約25,000ダルトンのバンドを生じた。これらの結果はキメラ軽鎖および重鎖（γ1）ポリペプチドに対して期待される大きさによく匹敵する。SDS-PAGE分析では重鎖および軽鎖を持つ完全な抗体が形質転換したSp2/O細胞系ChCOL-1 γ1により発現したことを示した。等電点電気泳動については、タンパク質試料（15から20μgの間）をCentricon -30（アミコン、ダンバーズ、マサチューセッツ州）を１パーセントグリシン緩衝液を3回交換して使用し脱塩した。脱塩タンパク質試料を、pH勾配が3-10であるFMCバイオプロダクツ（Bioproducts、ロックランド、メリーランド州）のアガーロスIEFゲルに添加した。等電点電気泳動は始めの10分は10ワットの一定電力で、そして次にさらに90分間、10ワットで続行した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーR-250で染色し、そしてバイオメッドインスツルメンツ（Biomed Instruments、フラートン、カリフォルニア州）走査デンシトメーターを使用して等電点を決定した。タンパク質標準はバイオラッドラボラトリーズ（リッチモンド、カリフォルニア州）およびシグマ（セントルイス、モンタナ州）から得た。このChCOL-1 γ1のIEFゲル分析は、ネズミCOL-1 MAbと比較して独自なバンドパターンを表した。クーマシーブリリアントブルーで染色したゲルのデンシトメータースキャンニングは、ChCOL-1 γ1試料の主要バンドが全体の約81パーセントを表し、そしてすぐ上のかすかな、少ないバンドが全体の約18パーセントを表すことを示した。タンパク質標準に与えられた既知のpI値に基づき、２つの主要 ChCOLO-1 γ1等電点状態は7.8および7.6と算出した。pH7.6の少ない形態は、哺乳動物細胞で生産されたタンパク質に起こるグルタミンまたはアスパラギン残基の翻訳後の脱アミド化の結果と思われる［Wilsonら、J.Biol.Chem.,257:14830-1 4834（1982）］。３．ChCOL-1 γ1 NH₂末端タンパク質配列 80マイクログラムのChCOL-1 γ1を還元、アルキル化し、そして重鎖および軽鎖を逆相高圧液体クロマトグラフィーで分離した。分離した重鎖および軽鎖を、 G.Tarr（1986）により“手動エドマンシークエンシングシステム（Manual Edma n Sequencing System）”、ポリペプチドの微細特性決定：実験マニュアル（Mic rocharacterization of Polypeptides:A Practical Manual ）（John E.Shively 編集、ヒューマナ（Humana）出版社、クリフトン、ニュージャージー州、第155- 194頁）に変更されたようなエドマン分解法を使用するアミノ末端アミノ酸配列分析に供した。 10アミノ酸残基を軽鎖および重鎖から決定した。この配列は成熟タンパク質について予想される配列をコードするＤＮＡに一致し、キメラタンパク質が両方の鎖中で正しくプロセス（process）されることを実証している。４．CEAおよびLS174T ELISAs ChCOL-1 γ1がCEAに結合する能力を2つの異なるELISA法により試験した。第一のELISAはCEA ELISAであった。この場合、精製CEA（ケミコン:Chemicon、E1セガンド、カリフォルニア州）をトラップとして、そしてGAHIgGをプローブとして使用した。さらにChCOL-1 γ1抗体もLS174T 細胞への結合に関して試験した。LS17 4T細胞（ATCC番号 CL 188）はCEAおよび他の腫瘍抗原を発現するヒト結腸ガン細胞系である［Muraroら、CancerRes.,45:5769-5780（1985）;Muraroら、CancerRe s. ,48:4588-4596（1988）］。両方のELISAでChCOL-1 γ1がそれぞれCEAおよびLS 174T細胞に結合し、そして抗-ヒト免疫グロブリン試薬により認識されることが示された。Ｅ．キメラCOL-1抗体のインビボ特性決定以下の表ＩおよびIIに表した動物実験に使用したキメラ抗体を、ヨウ素化試薬として、1,3,4,6-テトラクロロ-3a-6a-ジフェニルグリコラウリル（IODO-GEN（商標）、ピアス化学社、ロックホールド、イリノイ州）を使用してNa¹²⁵Ｉで標識した。さらに詳細には約0.5-2mgのキメラ抗体を約0.5mL-0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）に調整し、そして50μgのIODO-GEN（商標）で被覆した12cm ×75cmのガラス管に加えて、続いて0.1-0.5mCiのNa¹²⁵I（ニューイングランドヌクレアー、ボストン、マサチューセッツ州）を添加した。室温でインキューベーションした2分後、タンパク質を不溶性IODO-GEN（商標）から取り出し、そして取り込まれなかった¹² ⁵ Ｉを、PBSを緩衝液として使用して10mLのSephadexG-25カラムを通してゲル濾過することにより抗体から分離した。ヨウ素化法により0.05-0.2μCi/μgの比活性を持つ放射性標識IgGキメラ抗体を生成した。 CD1経歴を持つ、およそ４週齢のメス無胸腺マウス（nu/nu）をチャールズリバーから得た。９日後、マウスにLS174T細胞（1×10⁶細胞／動物）を皮下接種（0. 1mL/マウス）した。体重が70-400mgの癌腫を有する無胸腺マウス（LS174T細胞接種後およそ12-13 日後）に、PBS中に0.5-2.0μCi（10-50μgタンパク質）のキメラ抗体（すでに上記のようにヨウ素化した）を静注した。５兎のマウス群を放血により時間を変えて屠殺した。癌腫および正常組織を切除し、そして重量を測定し、分あたりのカウント（cpm）をガンマカウンターで測定した。各組織のcpm/mgを次に測定し、そして癌腫に見いだされたものと比較した。 ChCOL-1 γ1に関する生物分布結果を表ＩおよびIIに表す。表Ｉに表されるように、注入後約120時間で腫瘍に対するChCOL-1 γ1の１グラム当たりの注入用量は26.44パーセントであった。ChCOL-1 γ1はヒト腫瘍をインサイチューで標的とするのに有効であった。これは本発明のキメラ抗体がインビボ癌腫標的法に有効であることを実証するものである。表IIに示されるように、注入後120時間で腫瘍の器官当たりのChCOL-1 γ1の注入用量は4.54パーセントであった。キメラモノクローナル抗体はヒト腫瘍をその場で標的にするのに有効であった。これは本発明のキメラモノクローナル抗体がインビボ癌腫標的法に有効であり、すなわち癌のインビボ治療に有用であることを実証するものである。Ｆ．キメラ抗体を産生細胞系の寄託上記実施例で作成した両方ともカッパ軽鎖を有するキメラ抗体を分泌する２つの細胞系を、1992年12月9日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。具体的には以下の細胞系を寄託した：（１）ChCOL-1 γ1：COL-1 V_H、COL-1 V_LおよびヒトIgG1の定常領域を有する細胞系（ATCC番号CRL 11217）；ならびに（２）ChCOL-1 γ4：COL-1 V_H、COL-1 V_L およびヒトIgG4の定常領域を有する細胞系（ATCC番号CRL 11214）。寄託した態様は本発明の１の態様の単一の具体例の説明を意図しているので、本発明は寄託された細胞系により範囲を制限されるものではなく、そして機能的に均等であるすべての細胞系は本発明の範囲内にある。実施例２−キメラCOL-1の遺伝的変性体Ａ．重鎖遺伝子構築物の短縮キメラCOL-1の短縮された重鎖遺伝子構築物、FabおよびF(ab')₂を、γ1または γ3ヒト重鎖のC-末端ドメインを連続的に除去することにより遺伝的に生成した。このF(ab')₂−様構築物はヒトγ1重鎖のＣγ2およびＣγ3の両ドメインを除去し、ヒンジおよびＣγ1ドメインを残こすことにより生成した。このγ1イソタイプをF(ab')₂分子の構築に使用した。しかしFabの大きさの分子を設計する場合（この大きさは完全な抗体の1/3である）、ヒンジドメインの除去は軽鎖の結合部位を除去するであろう。それゆえにヒトγ3重鎖をFab構築物に使用した。ヒトγ 3重鎖のＣγ１ドメインはヒトγ1重鎖のＣγ１ドメインとは98アミノ酸のうちの 4つが異なるだけである。γ1Ｃγ1のSer-127をγ3中のCys-127（これは軽鎖の結合部位を提供する）に交換する。γ1とγ3の間の他の３つのアミノ酸差異のうち、２つが保存的置換（LysからArg）である（Huckら、Nucleic Acids Res. ,14:1779-1789（1986））。１．ＰＣＲおよびＳＯＥ法 PCRはSaikiら、Science,239:487-491（1988）に記載された方法により、そしてスプライシングはHoら、Gene,77:51-59（1989）およびHortonら、Gene,77:61- 68（1989）により記載された方法による重複伸長（overlap extension :SOE）により行った。鋳型およびプライマー濃度はそれぞれ0.1mL中に0.1-1.0ng/mLおよび1nmole/mL であった［Saikiら、同上］。PCRおよびSOE条件は、変性:92℃−96℃で2分間、アニーリング：50℃で3分間、そして伸長：71°-74℃で10分間（30サイクル）。２．PCR/SOEのオリゴヌクレオチドプライマーの設計 VDJエキソン、γ3のCγ1エキソンおよびγ1のヒンジおよびCγ2エキソンは、すべてそれらの3'末端に次のエキソンの第一コドンの第一ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するときにはこの部分コドンは省略した。短縮された重鎖遺伝子構築物の生成に使用したプライマーは次の通りである：プライマーｙの配列はPSV2gptのEcoRI部位の5'DNA配列に由来するものであった［Mulliganら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072-2076（1981）］。プライマーｘの配列はpSV2gptのBamHＩ部位の3'DNA配列に由来するものであった（Mullig anら、同上）。これらの配列が派生した領域はもともとpBR322からクローン化された。プライマーａはヒトγ１のＣγ3エキソンの最後の２つのコドン（Gly-Lys ）から始まる。プライマーb1およびb2の配列は、5'半分が非-アニーリングとなり、そしてプライマーaの5'18ヌクレオチドに正確に相補的であるように設計された。プライマーb1の3'半分はヒトγ3のCγ1エキソンの6つの完全なC-末端のコドンに相補的である。プライマーb2の3'半分はヒトγ1のヒンジエキソンの6つの完全なC-末端のコドンに相補的である。１．キメラCOL-1軽鎖および短縮化重鎖遺伝子構築物（FabおよびF(ab')₂を保持するneoおよびgpt耐性形質転換Sp2/O細胞系の調製 SOEを利用して本発明の短縮化された重鎖を構築するための一般法を第５図に図示する。断片ａ−ｘ（〜404塩基対（bp））を、オリゴヌクレオチドプライマー、ａおよびｘ、ならびにNdel−直線化鋳型、ｐγ1−gpt（これはヒトγ1遺伝子を含む）を使用してPCRにより作成した。断片ｙ−ｂ１（544bp）を、pSV2gpt のγ3鋳型上のプライマーｙおよびｂ１、pSV2gpt γ3およびpSV2gptγ4（これはヒトγ3遺伝子をヒトγ1またはγ4遺伝子の代わりに有する）と同様なプラスミド構築物を使用してPCRにより作成した。断片ｙ−ｂ2 （977bp）は、プライマーｙおよびｂ2を使用してpSV2gptγ1-2.3鋳型上に作成した。断片ｙ−ｂ1−ｘ（〜948bp）およびｙ−ｂ２−ｘ（〜1381bp）は、SOE 法により断片ｙ−ｂ１およびｙ−ｂ２をそれぞれ断片ａ−ｘとアニーリングさせ、そして続いてプライマーｙおよびａでPCR伸長により作成した。精製後、２つのＤＮＡ断片を混合、変性および非−アニーリングセグメント由来の重複領域を再−アニール化する。より外側のオリゴヌクレオチドプライマー（ａおよびｂ）を使用してもう１回のPCRを行った後、重複断片を単一断片として伸長させ、そして増幅させる。重鎖構築物領域の遺伝子はすべてグリシンの後、かつ終止コドンの前に最終アミノ酸としてリシンをコードする［Dunnickら、Nucleic Acids Res.,8:1475-148 4（1980）;Kabatら、免疫学的に興味深いタンパク質の配列、米国ヘルスおよびヒューマンサービス部、国立健康研究所、第５版（1991）］。しかし、分泌された成熟重鎖タンパク質のＣ−末端はグリシンであると判明し（Kabatら、同上）、末端リシンの翻訳後プロセッシングを指示している。この翻訳後プロセッシングが効率的な発現に必須であるかもしれないという可能性から、各々の短縮化構築物をヒトγ１重鎖のＣγ3ドメインの最後の２つのアミノ酸で終結した。すなわち404bpDNA断片ａ−ｘはGly-Lysおよび終止コドンから始まり、そしてポリアデニレーションシグナル配列を含む。この断片をすべての構築物の3'連結断片として使用した。この190bp断片のもっとも3'-のDNA配列は未知なので、PCRは既知であり、かつ断片のBamHＩ制限部位を含む隣接ベクター配列由来の3'プライマーから行った。第一の２つのPCRの初めの生成物、断片ｙ−ｂ１およびａ−ｘを精製し、Fabベクター構築物のｙ−ｂ１−ｘ断片を生じるSOE反応に供した。遺伝的F(ab')₂断片を3'プライマーｂ２およびヒトγ1鋳型を使用して同様な方法で構築し、ｙ−ｂ２ −ｘ断片をSOE反応後に得た。SOE反応のフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後、断片をEcoRIおよびBamHIで消化し、そしてゲル精製した。各断片をpSV2-gptベクターのEcoRI/BamHＩ断片と連結した。 COL-1重鎖可変領域を含むEcoRI断片を各々の短縮化重鎖ベクターのEcoRI部位に実施例１に記載したように正しい方向で連結した。実施例１のようにCOL-1重鎖可変領域を含むEcoRI断片を短縮化した各々の重鎖ベクターのEcoRI部位に、正しい方向で連結した。４．選択および発現各々のキメラCOL-1短縮化重鎖ベクターをPvulで直線化し、そしてCOL-1軽鎖を発現する標的細胞（COL-1κD4/F2）中に電気穿刺した。短縮化重鎖COL-1抗体の発現については、マイコフェノール酸−耐性コロニーをELISAによりCEAを被覆したプレート（AMAC社、ウェストブロック、メリーランド州）に結合し、そしてアルカホスファターゼ-結合ヤギ抗-ヒトカッパ抗体（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ社、バーミンガム、アラバマ州）で検出したものについて選択した。Ｂ．キメラCOL-1 FabおよびF(ab')₂のインビボ特性決定培養物上清から精製した後、ChCOL-1 FabをNa¹²⁵Iで放射性標識して動物実験に使用し、そしてその生物分布を実施例１に記載したように検出した。 ChCOL-1 Fabに関する生物分布の結果は表IIIおよびIVに表す。表IIIに示すように、注入後およそ24時間に腫瘍に対するChCOL-1 Fabグラム当たりの注入用量は0.98パーセントであった。ChCOL-1 Fabはヒト腫瘍をその場で標的するのに効率的である。結果は本発明のキメラ抗体断片がインビボ癌腫標的法に効果的であることを実証する。表IVに示されるように注射24時間後に腫瘍に対するChCOL 2D1 Fabの器官当たりの注入用量は0.17パーセントであった。キメラ抗体断片はヒト腫瘍をその場で標的するのに効率的である。これらの結果は本発明のキメラ抗体断片がインビボ癌腫標的法に効果的であることを実証する。Ｃ．突然変異体キメラCOL-1（ChCOL-1 R'）１．Ｊ_Hの遺伝的突然変異 COL1x-R'（3'）と命名されたオリゴは、COL-1重鎖からのmRNA配列データに基づき設計された。このオリゴのヌクレオチド配列は遺伝系J_H1配列との差異が無いという仮定に基づく。COLlx-R7（3'）（配列番号２３）のヌクレオチド配列は次の通り：ブラケット中のヌクレオチドは遺伝系J_H1配列からのクローン化COL-1 V_HゲノムＤＮＡ配列の差異を示す。はじめのＴの違いはサイレント突然変異であるが、二番目のＴの差異はAla¹¹⁰からTr¹¹⁰への突然変異の結果である。二重下線のヌクレオチドはイントロンのスプライスドナー部位を示す。ａ．mRNA由来のCOLlx-R'重鎖のPCR増幅逆転写酵素反応は（90μL中）1μgのCOL-1 polyA＋mRNA、10pmoleのCOL1x-R' （3'）および9μLの10X緩衝液（1X＝50mM Tris（pH=8.2）、6mM MgCl₂、100mM N aCl）、0.22mM dNTPsを使用した。試料を80℃に3分間加熱し、次に45℃に冷却した。次に0.5μL（12.5単位）のAMV逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム:Boehri nger Mannheim、インディアナポリス、イリノイ州）を加え、30分間伸長させた。PCRを１μL 10X緩衝液、100pmoleのCOL1-y、90pmoleのCOL1x-R'、0.5μL（2.5 単位）のTaqポリメラーゼ（ストラタジーン:stratagene、ラジョラ、カリフォルニア州）を加えることにより続行した。COL1-yのヌクレオチド配列（配列番号２４）は次の通りである：二重下線のヌクレオチドはイントロン中のスプライスアクセプター部位を示す。２滴の鉱物油で被覆した後、94℃、37℃および72℃（それぞれ30秒）間の熱循環を100μLの反応容量を使用して25回行った。405bp のPCR産物をゲル精製した。このＤＮＡ挿入物の末端をSalIおよびNotI制限酵素で整えた後、断片をホスファターゼ処理した、ゲル−精製pV−γ1 ベクター（すでにSalIおよびNotIで消化したもの）に連結した。２．キメラCOL-1軽鎖および突然変異体（R'）重鎖遺伝子構築物を有するNeo およびGpt耐性形質転換SP2/O細胞系の調製キメラpCOL1-R'重鎖ベクターをChCOL-1軽鎖（COL-1kD4/F2）を発現する細胞系中に、PvuIで直線化した後に電気穿刺した。 96ウェルプレート中の薬剤耐性コロニーを、CEΛ抗原トラップおよびヤギ抗- ヒトカッパまたはヤギ抗-ヒトIgG抗体トラップ（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ、バーミンガム、アラバマ州）を使用してELISAでスクリーニングした。これらのトラップに結合したキメラ抗体をアルカリホスファターゼを結合したヤギ抗−ヒトカッパ抗体で標準的なELISAアッセイにより検出した。すべての３つのトラップで陽性の個々の主要クローンをサブクローン化し、最高の抗体を発現している細胞系をそれぞれ冷凍容器中て凍結した。ChCOL-1 R'抗体をカルチャー上清からプロテインAクロマトグラフィーを使用して実施例１に記載されたように精製した。Ｄ．ChCOL-1 R'のインビボ特性決定動物実験に使用するために、ChCOL-1 R'をNa¹²⁵Iで標識し、そして実施例１に記載したように癌腫組織を検出するために使用した。ChCOL-1R'の生物分布の結果を表ＶおよびVIに表す。表Ｖに示すように、注入後およそ120時間に腫瘍に対するChCOL-1 R'グラム当たりの注入用量は42.34パーセントであった。ChCOL-1 R'はヒト腫瘍をその場で標的するのに効率的であり、本発明のChCOL-1 R'がインビボ癌腫標的法に効果的であることを実証する。表VIに示されるように、ChCOL-1 R'について注入120時間後の器官当たりの注入用量は5.63パーセントであった。ChCOL-1と比較してChCOL-R'は注入120時間後におよそ50パーセントより高い蓄積を示した。Ｅ．遺伝学的に変化したキメラ抗体を生産する細胞系の寄託上記実施例で作成した、すべてカッパ軽鎖を有する遺伝学的に変化したキメラ抗体を分泌する３つの細胞系を、1992年12月8日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。具体的には以下の細胞系を寄託した：（１）ChCOL 2D1 Fab：COL-1 V_H、COL-1 V_LおよびヒトIgG3 Fabの定常領域を有する細胞系（ATCC番号CRL 11218）；（２）ChCOL 2D1 F(ab')₂：COL-1 V_H、COL- 1 V_LおよびヒトIgG1 F(ab')₂の定常領域を有する細胞系（ATCC番号CRL 11216）、そして；（２）ChCOL-1 R'：唯一のアミノ酸突然変異を含むCOL-1 V_H、COL-1 V_LおよびヒトIgG1の定常領域を有する細胞系（ATCC番号CRL 11215）。寄託した態様は本発明の１の態様の単一の具体例の説明を意図しているので、本発明は寄託された細胞系により範囲を制限されるものではなく、そして機能的に均等であるすべての細胞系は本発明の範囲内にある。本発明を詳細に説明したが、そしてその特別な態様に関しては今後記載する請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者は様々な変更および修飾を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者リクソン，マーク・ダブリユーアメリカ合衆国ミシガン州48640ミドランド・キヤツスルドライブ4110 (72)発明者メゼス，ピーター・エスアメリカ合衆国コネチカット州06371オールドライム・シルレイン25 (72)発明者キヤプラン，ドナルド・エイアメリカ合衆国オハイオ州45202シンシナテイ・セイントポールプレイス1106 (72)発明者シユロム，ジエフリーアメリカ合衆国メリーランド州20854ポトマク・タイラーテラス10525

Claims

【特許請求の範囲】１．第一のＤＮＡ配列が配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列をコードする、キメラモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする第一のＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築物。２．第一のＤＮＡ鎖コーディング配列が実質的に配列番号１の配列と同じである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構築物。３．ＤＮＡ構築物がキメラモノクローナル抗体の軽鎖定常領域をコードする第二のＤＮＡ鎖配列をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構築物。４．第一のＤＮＡ配列が配列番号４または配列番号６と実質的に同じアミノ酸配列をコードする、キメラモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする第一のＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築物。５．実質的に配列番号４の配列と同じアミノ酸配列をコードする請求の範囲第４項記載のＤＮＡ構築物。６．第一のＤＮＡ鎖コーディング配列が実質的に配列番号３の配列と同じである請求の範囲第５項記載のＤＮＡ構築物。７．ＤＮＡ構築物がキメラモノクローナル抗体の重鎖定常領域をコードする第二のＤＮＡ鎖配列をさらに含んで成る請求の範囲第５項記載のＤＮＡ構築物。８．実質的に配列番号６の配列と同じアミノ酸配列をコードする請求の範囲第４項記載のＤＮＡ構築物。９．第一のＤＮＡ鎖コーディング配列が実質的に配列番号５の配列と同じである請求の範囲第８項記載のＤＮＡ構築物。１０．ＤＮＡ構築物がキメラモノクローナル抗体の重鎖定常領域をコードする第二のＤＮＡ鎖配列をさらに含んで成る請求の範囲第８項記載のＤＮＡ構築物。１１．実質的に配列番号２の配列と同じアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んで成るキメラモノクローナル抗体。１２．実質的に配列番号４または配列番号６の配列と同じアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んで成るキメラモノクローナル抗体。１３．実質的に配列番号４の配列と同じアミノ酸配列を有する請求の範囲第１２項記載のキメラモノクローナル抗体。１４．実質的に配列番号６の配列と同じアミノ酸配列を有する請求の範囲第１２項記載のキメラモノクローナル抗体。１５．実質的に配列番号２の配列と同じ軽鎖可変領域および実質的に配列番号４または配列番号６の配列と同じアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んで成るキメラモノクローナル抗体。１６．軽鎖可変領域が実質的に配列番号２の配列と同じであり、そして重鎖可変領域が実質的に配列番号４の配列と同じである請求の範囲第１５項記載のキメラモノクローナル抗体。１７．抗体が細胞系ATCC No.CRL 11214、ATCC No.CRL 11216、ATCC No.CRL 1121 7およびATCC No.CRL 11218により生産される請求の範囲第１６項記載のキメラモノクローナル抗体。１８．軽鎖可変領域が実質的に配列番号２の配列と同じであり、そして重鎖可変領域が実質的に配列番号６の配列と同じである請求の範囲第１５項記載のキメラモノクローナル抗体。１９．抗体が細胞系ATCC No.CRL 11215により生産される請求の範囲第１８項記載のキメラモノクローナル抗体。２０．医薬的に許容できる無−毒性の滅菌キャリアー中の請求の範囲第１５項記載の抗体を含んで成る組成物。２１．抗体中、配列番号２の軽鎖可変領域または配列番号４の重鎖可変領域からのＣＤＲがヒト抗体の枠組み構造部位中に移植される変更抗体。