JPH08510641A

JPH08510641A - マーカー遺伝子

Info

Publication number: JPH08510641A
Application number: JP6524981A
Authority: JP
Inventors: コールネリセン，マルクス; レイナエルト，アルレッテ; ゴセール，ベロニク; アールセン，ロエルファン
Original assignee: プラントジェネティックシステムズ，ナームノゼフェンノートシャップ
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-11
Publication date: 1996-11-12
Also published as: PT698106E; EP0698106B1; GR3036731T3; CA2162481A1; CA2162481C; AU6797294A; AU684785B2; EP0698106A1; DE69427857T2; ES2161245T3; DE69427857D1; WO1994026913A3; US5962768A; ATE203772T1; WO1994026913A2; DK0698106T3

Abstract

(57)【要約】アミノグリコシド抗生物質の存在下で植物細胞においてアミノグリコシド−６′−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをエンコードするキメラ性遺伝子を発現させることによる形質転換植物細胞を選別及び同定するための方法。

Description

【発明の詳細な説明】マーカー遺伝子本発明は植物発現性プロモーター、アミノグリコシド−６′−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをエンコードするDNA（「AAC（６′）」）並びに３′末端構成及び植物細胞において活性なポリアデニル化領域を含んで成るキメラ性の選別可能マーカー遺伝子に関する。本発明は更に植物細胞におけるAAC（６′）をエンコードするキメラ性マーカー遺伝子の発現により形質転換化植物細胞を選別又は同定するための方法に関する。このキメラ性マーカー遺伝子は植物細胞に、その細胞においてこのAAC（６ ′）により効率的に解毒される通常は致死的又は成長抑制的な濃度の抗生物質に対する耐性を授ける。本発明はまたAAC（６′）をエンコードするキメラ性マーカー遺伝子により安定的に形質転換された植物細胞及びこの植物細胞から再生した植物にも関連する。発明の背景植物の遺伝子操作技術はこの10年の間に著しい進歩を遂げている。外来遺伝子を安定的に植物に導入することが可能となってきている。これは近代農業にとっての剌激的な機会を供している。植物細胞の形質転換におけるキメラ性選別可能マーカー遺伝子の利用は形質転換化植物細胞の選別をかなり簡略化した。例えば、かかるマーカー遺伝子の発現により、その形質転換植物細胞は、非形質転換化細胞に対して細胞障害性又は成長抑制的である抗生物質に対して耐性となりうる。一般的に利用されているキ.メラ性マーカー遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ−II又は nptIIコード領域を含む（Bevan ら（1983）Nature 304，184-187；Fraleyら（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80 ，4803-4807）。 nptII遺伝子は、この遺伝子を発現する植物細胞にカナマイシン、ネオマイシン及びG-418抗生物質に対する耐性を授ける（Reynaertsら（1987）Plant Mol.Bi ol.Manual，Gelvin，S.B.& Schilperoot，R.A．（編）、Kluwer，Dordrecht、第 A9章、pp １-16）。キメラ性マーカー遺伝子は一般に：植物発現性プロモーター（５′非翻訳領域を伴う）；選択マーカーをエンコードするDNA（例えば nptII遺伝子）；並びに３′末端構成及び植物において活性なポリアデニル化領域；を含む。 nptII遺伝子の多様性はこの数年間でいくつかの植物系におけるキメラ性マーカー遺伝子において確証されているが、かかるキメラ性選別可能マーカー遺伝子における用途にとっての別の抗生物質耐性遺伝子の開発を必要とする点でその利用は制約されている（Hayfordら（1988）Plant Physiol．86，1216）。更に、数多くの状況において、第二の補助的な抗生物質耐性遺伝子が抗生物質耐性遺伝子により既に形質転換されている植物への導入にとって必要である。かかる別の抗生物質耐性遺伝子は既にあるが、しかしそれらは往々にして非常に毒性な物質の利用を必要とする及び／又は全ての植物の種における効率的な選別を可能にしない。明らかに日常的に生長力をもって再生するポテトの如くの種にとっては、各別の特異的基性をもつ各別の選択マーカーをエンコードする抗生物質耐性遺伝子が、植物の中に各別の時間において各別の遺伝子を操作するときに必要とされる。公知の抗生物質耐性遺伝子はとりわけアミノグリコシド抗生物質アセチル化性（AAC）酵素をエンコードするものであり、そのうちの４タイプが特性化されている（２−デオキシストレプトアミン誘導型アミノグリコシドの修飾アミノ基の位置に基づく）：AAC（１），AAC（２′），AAC（３）及びAAC（６′）。Shawら（1989）Antimicrob.Agents & Chemotherapy 33，205 2-2062を参照のこと。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）分析は、これら４タイプの酵素のアセチル化生成物間での相違を示し、そしてある宿主株におけるこれらのタイプの酵素それぞれの存在は同定するのにアミノグリコシド耐性プロフィールを利用できることを示している（Shawら（1939）前掲）。ヨーロッパ特許公報（「EP」）第0,289,478号（Rogersら（1988）、Hayfordら（1988）前掲及びCarrerら（1991）Plant Mol. Biol.17，301-303はアミノグリコシド−３−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ・エンコード遺伝子（「 acc（３）遺伝子」）で形質転換された植物のゲンタマイシンに基づく選別を述べている。この aac（３）−IV遺伝子は（ペチュニア〔Petunia］における）カナマイシンに対する耐性を授けることが見い出されてはいるが、その耐性のレベルは、最大でもぎりぎりの選別に足りにすぎない（Hayfordら（1988）前掲）。これらの公開物は更に、 nptII遺伝子により形質転換されたタバコの aac（３）遺伝子による超形質転換体の、ゲンタマイシン含有培地に基づく選別を述べている。EP第 0,289,478号はまた acc（３）遺伝子により形質転換されたペチュニア、ダイズ、ナタネ（oilseed rape）及びアルファルファの形質転換における基質としてのゲンタマイシンの利用を述べている。Carrerら（1991）前掲はまた、 aac（３） −Ｉ遺伝子によるタバコ植物の形質転換はゲンタマイシンに対する耐性のみを授り、従って、ゲンタマイシン耐性植物はカナマイシンに対するその感受性を維持していることを述べている。Carrerら（1991）前掲に従うと、あるケースにおいては幅の狭い基質特異性をもつ選別可能マーカー遺伝子を利用することがより好都合でありうる。 AAC（６′）−エンコード遺伝子（「 aac（６′）遺伝子）はいくつかのアミノグリコシド抗生物質の５′アミノ基をアセチル化する異なりはするが近縁している遺伝子のクラスを構成する。いくつかの細菌性 aac（６′）遺伝子がクローン及び配列決定されている。Davis（1986）のAmtibiotics in Laboratory Medic ine ，pp 474-489（編）Lorian V.，Williams & Wikins，Baltimore，Maryland a nd Phillips & Shannon（1984）British Med.Bull．40，28-35によると、AAC（６′）はトブラマイシン、カナマイシン、アミカシン、ネオマイシン、ゲンタマイシンＣ_1A及びＣ₂、シゾマイシン及びネチルマイシンをアセチル化するか、AAC （６′）の種類に応じて効率は変わる。２つのサブタイプの aac（６′）遺伝子がそのアミノグリコシド耐性プロフィールにより特性化されている： aac（６′ ）−Ｉ遺伝子及び aac−（６′）−II遺伝子；その前者のサブクラスは aac（６ ′）−IV及び−４遺伝子を含んで成り、そして後者のサブクラスは aac（６′） −III遺伝子を含んで成る（Shawら（1989）前掲）。しかしながら、これらの遺伝子のその他の分類もなされている。その他のアセチルトランスフェラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼも選択可能な表現型（即ち、殺虫剤耐性）を植物細胞に授けることができることが見い出されている（De Blockら（1987）EMBO J．６，2513-2518）。 EP第0,248,207号（Wohllebenら、1987）はストレプトマイシス（Streptomyces ）において活性であり、且つＳ．ガネンシス（S.ghanaensis）の株からBgl IIによる全消化により得られるゲンタマイシン耐性遺伝子を述べている。フランス国特許公報第2,601,965号（Courvalin，1988）はAAC（６′）及びAPH （２″）活性をエンコードする二価遺伝子、この遺伝子のクローニング及び配列決定、並びに細菌培養物における抗生物質耐性発達を検出するためのDNAプローブとしてのこの遺伝子の一部の利用を述べている。発明の概要本発明に従うと、同一の遺伝子座の中の以下の作用連結要素、即ち、植物発現性プロモーター；このプロモーターのコントロール下にあるAAC（６′）をエンコードするDNA配列（「 aac（６′）DNA」）、特にSEQ ID No.１の配列を有する aac （６′）DNA;並びに３′末端構成及び植物細胞において活性であるポリアデニル化領域；を含んで成るキメラ性選択可能マーカー遺伝子（「キメラ性 aac（６′）遺伝子」）を提供する。また、本発明に従うと、形質転換された植物細胞を選別又は同定するための方法であって：この細胞をキメラ性 aac（６′）遺伝子により形質転換させる；次いでその細胞を非形質転換植物細胞にとっては致死的又は成長抑制的な濃度のアミノグリコシド抗生物質と接触させる；ことによる方法を提供する。更に本発明に従うと、このキメラ性 aac（６′）遺伝子により安定的に形質転換された植物細胞、この植物細胞から再生させた植物細胞培養物及び植物、並びにこのキメラ性 aac（６′）遺伝子を含む植物形質転換用ベクター、プラスミド及びアグロバクテリウム（Agrobacterium ）株を提供する。発明の詳細な説明本明細書で用いている「 aac（６′）DNA」なる語は、アミノグリコシド抗生物質の６′アミノ基のアセチル化を触媒するタンパク質（「AAC（６′）」）をエンコードするDNAコード配列を意味する。この語は、AAC（６′）をエンコードする部分的もしくは完全合成DNA配列及び天然DNA配列を含む。本発明に係る好適な aac（６′）DNAにはSEQ ID No.１のDNA及び実質的に類似のDNA 、例えばNobutaら（1988）J.Bacteriol.170 ，3769，Tolmaski（1990）Plasmid 24 ，218-226及びTran van Nhieu and Collatz（1987）J.Bacteriol.169 ，5708 に記載されている aac（６′）DNAが含まれる。本発明のその他のDNAには、Davi es and Smith（1978）Ann.Rev.Microbiol.32，469-518、Morohoshiら（1984）J. Antibiotics 37，1687-1691、Tenoverら（date）J.Bacteriol.170 ，471、Ferre ttiら（1986）J.Bacteriol.167 ，631及びShawら（1989）Antimicrob.Agents an d Chemotherapy 33，2052に記載のものが含まれる。本明細書で用いている「キメラ性 aac（６′）遺伝子」なる語は、植物発現性プロモーター（５′非翻訳領域を含む）並びに３′末端構成及び植物において活性なポリアデニル化領域に作用連結された aac（６′）DNAを含んで成るキメラ性選別可能マーカー遺伝子を意味する。 aac（６′）DNAは所望のゲノタイプの選別力を高めるため、別の形質転換用DNAとのキメラ性遺伝子融合体における融合タンパク質としても発現されうる。このキメラ性遺伝子融合体の構築は公知のマーカーを含んで成るキメラ性遺伝子を構築するために現状用いられている方法に由来する技術に従って実施できる。本明細書で用いている「選別可能マーカー遺伝子」なる語はDNA配列であって植物細胞におけるその発現がその植物細胞に対して選別可能な表現型（例えば抗生物質耐性）を授けるDNA配列を意味する。本明細書で用いている「翻訳的にニュートラルな修飾」なる語は、遺伝子又はDNA配列の修飾であってその遺伝子又はDNA配列によりエンコードされるアミノ酸配列に何ら影響を及ぼさない修飾を意味する。かかる翻訳的にニュートラルな修飾の好適な例は、同一のアミノ酸をエンコードする別のコドンに至るコドンのヌクレオチド置換による変更である。本明細書で用いている「適切な基質」又は「適切な基質抗生物質」なる語はAA C（６′）により効率的に改変されるアミノグリコシド抗生物質（例えばカナマイシン）であり、従って植物細胞における aac（６′）DNAの発現はその植物細胞にその抗生物質に対する耐性を授けるものである。それ故、本明細書で用いている「AAC（６′）の基質」なる語は aac（６′）遺伝子生成物により改変、即ちアセチル化されうる任意のアミノグリコシド抗生物質を意味する。本発明の aac（６′）DNAは例えばNobutaら（1988）J．Bacteriol．170 ，376 9に記載の通り、通常の阻害レベルのアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシンを含む適切な基質に基づく培養を経て、“日常の手順により細菌から容易に単離できうる。AAC（６′）活性は慣用の方法によりアッセイできうる（Davie s（1986）前掲；Shawら（1989）前掲）。好ましくは、本発明の aac（６′）DNAを、植物細胞において遺伝子の発現を指令できうるプロモーターの下流（即ち、３′側）、且つそのコントロール下にある植物ゲノムの中に挿入する。好適なプロモーターには、限定することなく、カリフラワーモザイクウィルスの強力な構成的35Sプロモーター（Odellら（1985 ）Nature 313 ，810）又は二本鎖35Sプロモーター（Kayら（1987）Science 23 6 ，1299）が含まれる；35Sプロモーターは様々な単離体から得られる（Hull & Howell（1987）Virology 86，482-493）。その他の好適なプロモーターにはTR1 ′プロモーター及びTR2′プロモーターが含まれる（Veltenら（1984）EMBO J．３，2723）。更に好ましいのは単子葉類プロモーター、例えばEPO第0,342,926号又はEP第0,459,643号に記載のプロモーターである。他方、構成的ではなく、むしろ１又は複数の植物組織又は器官に対して特異的であるプロモーターを利用できうる。例えば、 aac（６′）DNAは植物の生きのよい（green）組織において、そのDNAをEP第0,193,259号に記載のリブロース−１，５−ビスホスフェート−カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子の如くの光誘発性プロモーターのコントロール下に置くことによって、選択的に発現されうる。他の方法は温度もしくは化学因子により発現が誘発されるプロモーター又は細胞が選択される時期もしくは発育段階において優先的もしくは選択的に発現されるプロモーター、例えば従来からその他のマーカーと共に利用されているカルス特異的プロモーターを利用することにある。どのような状況においても、本発明において使用するためのプロモーターは、少なくとも植物細胞に抗生物質耐性を授けるよう、植物細胞の中での aac（６′）DNAの十分なる発現を可能とするものでなければならないことが明らかである。 aac（６′）DNAは適切な３′転写調節シグナル（即ち、３′末端構成及びポリアデニル化シグナル）の上流（即ち５′側）に挿入することが好ましい。好ましい３′転写調節シグナルにはカルコンシンターゼ遺伝子（Sommer & Saedler（ 1986）Mol.Gen.Genet.202，429）、カリフラワーモザイクウィルス（Mogenら（1 990）The Plant Cell ２，1261）、オクトパインジンターゼ遺伝子（Gielenら（1984）EMBO J．３，835）又はT-DNA遺伝子の（Velten & Schell（1985）Nucl ．Acids Res．13，6981）のものが含まれる。本発明に従うと、本発明の aac（６′）DNAの全体又は一部を慣用の方法で植物細胞の核ゲノムの中に安定的に挿入でき、そしてこのようにして形質転換させた植物細胞はアミノグリコシド抗生物質に対する耐性を示す遺伝子導入植物を作り上げるのに利用されうる。これに関連して、アグロバクテリア（Agrobacterium ）（例えば、A．トウメファシエンス〔A.tumefacie ns 〕）におけるこのキメラ性 aac（６′）遺伝子を含む無毒化Ti−プラスミドを、例えばEP第0,116,718号及びEP第0,270,822号、PCT公開W084／02913、EP第0, 242,246号、De Block（1988）Theor.Appl.Genet．76，767-774及びGouldら（199 1）Plant Physiol.95，426（引用することで本明細書に組入れる）におけるような前述の手順を利用して植物細胞を形質転換するのに利用できる。好ましいTi− プラスミドベクターはTi−プラスミドのT-DNAのボーダー配列の間に、又は少なくともその右ボーダー配列の左側の位置に、このキメラ性 aac（６′）遺伝子を含む。むろん、その他のタイプのベクターも、例えば直接遺伝子搬送（例えばEP 0,233,247に記載）、花粉媒介形質転換（例えば、EP0,270,356、PCT公開W085／0 1856及び米国特許4,684,611に記載）、植物RNAウィルス媒介型形質転換（例えば EP0,067,553及び米国特許4,407,956に記載）、リポソーム媒介形質転換（例えば米国特許第4,536,475）及びその他の方法、例えばPCT公開W092／09696に記載の単子葉類（例えばトウモロコシ、コメ、ムギ、オオムギ及びライムギを含む主要穀類）を形質転換するための方法の如くの手順を利用して植物細胞を形質転換するのに利用できうる。形質転換すべき植物がトウモロコシの場合、他の最近開発された方法、例えばFrommら（1990）Bio/Tech．８，833、Gordon-Kammら（1990 ）The Plant Cell ２，603及びGouldら（1991）前掲によるトウモロコシの一定の系列について述べられている方法も利用されうる。形質転換すべき植物がコメである場合、他の最近開発された方法、例えばShimamotoら（1989）Nature 338 ，274、Dattaら（1990）Bio/tech．８，736及びHayashimotoら（1990）Plant Physiol．93，857 に記載の方法も利用されうる。植物における本発明のキメラ性 aac（６′）遺伝子の発現性を高めるため、 a ac （６′）DNAは例えば同等の人工的な aac（６′）DNAを形成するようにそのニュートラルコドン用語を変えることによって修飾できうる。かかる修飾はPCT特許出願PCT／EP92/02547に記載の如くのこの細菌DNAに存在している有害なDNA配列を排除するために aac（６′）DNA配列に機能性イントロン及び／又は翻訳的にニュートラルな修飾を導入することが含まれうる。これはかかる有害なDNA配列を（翻訳的にニュートラルな手法で）修飾することにより、植物細胞の中での発現を阻害すること等により直接的に改変を施すことにより、又は例えばMurray ら（1989）Nucleic Acids Res，17，477に記載の通りにして aac（６′）DNAのコドン用語をその植物により好適とされるものにすることにより改変を施すことにより行われうる。更に、単子葉植物、例えばシウモロコシにおける十分なる発現を達成するため、、効率的にスプライされたトウモロコシの adh遺伝子をキメラ性 aac（６′）遺伝子に付加してよい（Kozielら（1993）Bio/Tech．11，194- 200）。該キメラ性 aac（６′）遺伝子により形質転換された植物細胞から再生した本発明の形質転換植物はその植物細胞におけるAAC（６′）活性の発揮により、適切な基質抗生物質に対する耐性を示す。かかる植物は、同一のアミノグリコシド抗生物質耐性特性を有するより多種の形質転換植物を生産するために慣用の繁殖手法において、又は標準の繁殖技術によって同一もしくは近縁の植物種のその他の変種にこのキメラ性 aac（６′）遺伝子を導入するために利用できうる。形質転換植物から得られる種子は安定なゲノムインサートとしてこのキメラ性 aac（６′）遺伝子を含む。本発明の aac（６′）DNAの発現により化学修飾されうる抗生物質のスペクトルは nptIIコード領域のそれとは異なるため、２種類の外来遺伝子を植物に導入する場合、この aac（６′）DNAは別のキメラ性選択可能マーカー遺伝子の中の npt IIコード領域と共に利用することができ、ここで各外来遺伝子はそれ自身のキメラ性マーカー遺伝子と一体化している。植物の中で複数のキメラ性マーカー遺伝子を操作するとき、一定のアミノグリコシド抗生物質群に対してのみ耐性を授けるキメラ性 aac（６′）遺伝子を利用することが好都合でありうる（Carrer ら（1991）前掲）。しかしながら、一種のキメラ性マーカー遺伝子のみを使用するなら、キメラ性 aac（６′）遺伝子を植物細胞にとって適切な基質としてカナマイシンと一緒に利用することが好ましい。これに関連して、アセチルトランスフェラーゼ活性を検出するための酵素アッセイは往々にして、 nptII活性を検出するのに利用するホスホトランスフェラーゼアッセイよりも迅速、且つ簡単である。 aac（６′）DNAによる植物の有効な形質転換について試験するため、種々の方法が有用である。例えば、抗生物質耐性はカルス誘発試験又はドット塗布アッセイにおいて検査できる。AAC（６′）の存在及び活性は酵素アッセイによっても分析できうる。ウェスタンブロットは簡単な免疫学的試験を担うが、しかし感度があまりよくない。更にカナマイシン耐性はカナマイシン含有培地上での種子の植え付けによる遺伝子導入植物の子孫において追尾できうる。以下の実施例は本発明を説明する。何らかのことわりのない限り、組換DNAを作る及び操作するための手順は全てSambrookらMolecular Cloning-Alaboratory Manual，Second Ed. ，Cold Spring Harb or Laboratory Press，NY（1989）又は AusubelらCurrent Protocols in Molecular Biology，vols.１及び２，Current Protocols，USA （1994）に記載の標準手順により実施する。実施例実施例１．キメラ性 aac（６′）DNAのクローニング及びキメラ性 aac（６′）遺伝子の構築 aac（６′）DNAをmini−SaプラスミドpGV1106から得た（Leemansら（1982）G ene 19，361-364）。 aac（６′）DNAを含むpGV1106の1.5kbのPvuII／HindIIIフラグメントをクレノウ処理を経たScaＩ−線形化プラスミドpGSC1600（Corneliss en & Vandewiele（1989）Nucl．Acids Res．17，19-29）にリゲートした。得られるプラスミドpFD1002Aを、SEQ ID No.３及び４それぞれのプライマーRVA61及びOFD15を用いるPCRのための鋳型として用いた。RVA61は aac（６′）DNAの非コード鎖及びp FD1002Aにおけるその非翻訳配列に対して相補性である。pFD1002AのSalＩ／BamH I aac（６′）PCRフラグメントをキメラ性遺伝子P35S− nptII−３′g7を含むプラスミドpGSJ290の7.2kbのSalＩ／BamHIフラグメントにリゲートして、SEQ ID N o.５のプラスミドPTRVA3を得た。 pGSJ290は、キメラ性P35S− nptII−３′g7の遺伝子構築体がT-DNAボーダーリピートの間にクローンされているpGV825（Deblaereら（1985）Nucl．Acids Res ．13，4777-4787）に由来する。このT-DNA遺伝子７の３′非翻訳末端（即ち、３ ′g7）はVelten & Schell（1985） aac（６′）前掲に記載の通りであり、 nptI I遺伝子はpKM109／90（Reissら（1984）EMBO J．３，3317-3322）に由来し、そしてCaMV35Sプロモーター（即ちP35S）はEP 0,193,259及びGardnerら（1981）Nu cl．Acids Res．９，2871-2888に記載のカリフラワーモザイクウィルス35S−2プロモーターである。キメラ性p35S- nptII−３′g7遺伝子構築体をpGV825の右及び左側ボーダーリピートの間のT-DNAのHpaＩとBglII部位の間にクローンした。翻訳開始部位の下流へのBamHI制限部位の導入により、pTRVA3における aac（６′）DNA配列は、SEQ ID No.５に示している通り、アミノ酸位置２及び３のそれぞれにおいてアミノ酸Asp及びProを含み、そしてSEQ ID No.１の配列を有する aac （６′）DNAを含むキメラ性 aac（６′）遺伝子P35S− aac（６′）−３′g 7を含む。実施例２．カナマイシンに基づく aac（６′）−形質転換タバコ細胞の選別。プラスミドpTRVA3及びpGSJ290をＥ．コリ（E.coli）からＡ．トウメファシエンス株C58C1-Rif^R（pGV2260；Deblaereら（1985）前掲）へと、Deblaereら（1985）前掲及びEP 0,193,259に記載の三重親株交配によって移した。得られるアグロバクテリアを最少Ａ培地（Miller（1972）Experime nts in-Molecular Genetics ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Sp ring Harbor，NY）に基づいて選別した。タバコcvペチト・ハバナ（Tobacco cv Petit Havana）SR１細胞をこれらのアグロバクテリアと一緒に栽培し、そして形質転換されたタバコ細胞をDe Blockら（1984）EMBO J．３，1681-1689に従い抗生物質耐性を利用して選別した。タバコのプロトプラストの感染のために用いたアグロバクテリア株は：陰性コントロールとしてのC58C1-Rif^R（pGV2260）、 aa c （６′）DNAを含むC58C1-Rif^R（pGV2260::pTRVA3）及び nptII遺伝子を含むC58 C1-Rif^R（pGV2260::pGSJ290）とした。感染させてから一週間後、これらのプロトプラストを下記のいくつかの濃度の硫酸カナマイシン（Km）のいづれかを含む選択培地に移した：０−25−50−100−6200μｇ／ml。感染させてから７週間後、全てのKm濃度においてC58C1-Rif^R（pGV2260::pTRVA 3）及びC58C1-Rif^R（pGV2260::pGSJ290）と一緒に栽培した細胞からカルスが成育し始めた。pGV2260（陰性コントロール）で感染始めたプロトプラストはKmを有さない培地上でのみカルスを形成した。200μｇ／mlのKmを含む菌条誘発培地にこのカルスを移した後、菌条が容易に形成された。カナマイシン耐性タバコ植物から抽出したDNAのサザン分析は aac（６′）DNAの安定な組込みを確証せしめた。実施例３．カナマイシンに基づく aac（６′）−形質転換ポテトの選別。ポテト変種エスミナ（Yesmina）の葉のディスクを、 aac（６′）DNA又はDe B lock（1988）前掲）に記載の nptII遺伝子のいづれかを含む実施例２のキメラ性遺伝子を担持するアグロバクテリアートウメファシエンス株C58C1-Rif^R（pGV2260::pTRVA3）及びC58C1-Rif^R（pGV2260::pGSJ290）と一緒に栽培した。これらの葉のディスクを50μｇ／mlの硫酸カナマイシンを含むカルス誘発培地に移した。アグロバクテリアC58C1-Rif^R（pGV2260::pGSJ290）と一緒に栽培した葉のディスクのうちの約30％がカナマイシンの存在下で成育カルスをもたらし、一方アグロバクテリアC58C1-Rif^R（pGV2260::pTRVA3）と一緒に栽培した葉のディスクのうちの約70％がカナマイシン培地で６週間栽培した後に成育カルスをもたらした。 aac（６′）−形質転換カルスを菌条再生培地に移した後、菌条は容易に形成された。再生したポテト植物のカナマイシン耐性表現型を保持していることが見い出せた。カナマイシン耐性ポテト植物及びその子孫から抽出したDNAのサザン分析は aac（６′）DNAの組込みを確証せしめた。実施例４． aac（６′）−形質転換植物における酵素活性についてのアッセイ。キメラ性 aac（６′）遺伝子を含む実施例２のタバコのカルス及び葉組織はカナマイシンについての薄層クロマトグラフィー（TLC）−アセチルトランスフェラーゼアッセイにおいて試験したときにAAC（６′）活性を示した。De Blockら（1987）EMBO J．６，2513-2518に従うホスフィノトリシン−アセチルトランスフェラーゼ活性を決定するアセチルトランスフェラーゼアッセイを利用したが、ただしホスフィノトリシンの代わりの基質として硫酸カナマイシンを、De Block ら（前掲）により利用されているホスフィノトリシンの濃度の２倍の濃度で用い、そして酵素の放射能形態及び非放射能形態の両方を含む混合物の代わりに２μ ｌの¹⁴Ｃ−アセチル補酵素Ａを加えた。37℃で30分インキュベーション後、その反応混合物をTLC プレート上に点着し、そしてその反応生成物を１−プロパノール／NH₄OH（３／２）の中でクロマトグラフィーにより分けた。キメラ性 aac（６′）遺伝子を含むカルスの抽出物はカナマイシンこのアセチル化を触媒し、一方、非形質転換SR １植物由来のカルス及び nptII−発現性カルスの抽出物では何の反応も認められなかった。更に、再生した aac（６′）−形質転換タバコ植物の葉組織由来の抽出物もカナマイシンを効率的にアセチル化することが見い出せた。言うまでもなく、本発明は aac（６′）DNAにより形質転換されたタバコ又はポテト植物に限定されない。これは aac（６′）DNAで形質転換された任意の植物、例えばトマト、綿、ナタネ、アルファルファ、ヒマワリ、トウモロコシ、コメ、ダイズ、アブラナ、サトウキビ及びその他の野菜類を含む。更に本発明は植物細胞がAAC（６′）を発現するようにそれらを形質転換させるためのSEQ ID No.５のキメラ性 aac（６′）遺伝子又はSEQ ID No.１の aac（６′）遺伝子の利用に限定されない。その他の天然及び人工的なキメラ性遺伝子及びDNAが利用できる。これに関連して、SEQ ID No.１及び５の aac（６′）DNA 配列は、１）あるコドンを同一もしくは異なる、好ましくは同一のアミノ酸をコードする別のものと置き換える；及び／又は２）あるコドンを欠失もしくは付加する；ことにより修飾されうるが、ただしかかる修飾はAAC（６′）の特性、特にそのアミノグリコシド抗生物質を解毒する能力を実質的に改変しないことが条件とされる。本願において言及している公開物は全て引用することで本明細書に組入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ゴセール，ベロニクベルギー国，ベー―9000 ゲント，ヨット．プラトーシュトラート７ (72)発明者ファンアールセン，ロエルベルギー国，ベー―9000 ゲント，ツビユナールドセシュテーンベク 35

Claims

【特許請求の範囲】１．植物をアミノグリコシド抗生物質（例えばカナマイシン）に対して耐性にするようにその植物を形質転換するためのキメラ性選択可能マーカー遺伝子であって：順番にａ）植物発現性プロモーター；ｂ） aac（６′）DNA；並びにｃ）３′末端構成及び植物細胞において活性なポリアデニル化領域；を含んで成るマーカー遺伝子。２．前記 aac（６′）DNAが：ａ）SEQ ID No.１のAAC（６′）をエンコードするか、又はｂ）ｉ）SEQ ID No.１のDNA配列もしくはii）SEQ ID No.１のAAC（６ ′）と実質的に同一の抗生物質解毒特性を有するAAC（６′）をエンコードするその変異体を有する、請求項１記載のマーカー遺伝子。３．形質転換植物細胞を選別又は同定するための方法であって、次の工程：植物細胞を請求項１又は２記載のマーカー遺伝子を含んで成る外来DNAで形質転換させる；次いでこの形質転換細胞をその非形質転換植物細胞に対して致死的又は成長抑制的な濃度のアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシンの中で成育させる；を含んで成る方法。４．植物細胞であって核ゲノムが請求項１又は２記載のマーカー遺伝子を含む細胞。５．複数の請求項４記載の植物細胞を含んで成る植物、種子又は植物細胞培養物。６．請求項１又は２記載のマーカー遺伝子を含む植物ゲノム。７．請求項１又は２記載のマーカー遺伝子を含む、植物形質転換用ベクター、特にTiプラスミド。８．請求項７記載のベクターを含むアグロバクテリアトウメファシエンス。９．植物細胞をアミノグリコシド抗生物質（例えばカナマイシン）に対して耐性にする方法であって、この細胞の核ゲノムを請求項１又は２記載のマーカー遺伝子で形質転換する工程を含んで成る方法。 10．植物細胞においてアミノグリコシド抗生物質を解毒する方法であって、請求項１又は２記載のマーカー遺伝子をこの細胞の核ゲノムに供ずる工程を含んで成る方法。