JPH08510910A

JPH08510910A - ヒトゲノムの延長ヌクレオチド反復配列の直接検出

Info

Publication number: JPH08510910A
Application number: JP7500938A
Authority: JP
Inventors: シャーリング，マーチン; ジェイ．ハドソン，トーマス; イー．ハウスマン，デイビット
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 1996-11-19
Also published as: US5695933A; EP0804611A1; WO1994028175A1; CA2163740A1

Abstract

(57)【要約】生物試料に含まれるゲノムＤＮＡ中に存在する延長ヌクレオチド反復配列を検出する方法および延長ヌクレオチド反復配列の存在を検出することに基づく、個体中の病的状態および病的となる可能性のある状態を診断する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトゲノムの延長ヌクレオチド反復配列の直接検出明細書はじめに最近、ゲノムＤＮＡ中の単純ヌクレオチド反復配列が延長したものなど不安定ＤＮＡ配列の存在が遺伝性の障害や状態を招く機構として考えられるようになってきた。家族性精神発育遅延の最も普通の形である脆弱Ｘ染色体症候群（ＦＸ）［ウエッブら（Webb，T.P.，et al．）、Am．J．Med．Genet.，23:573-580（198 6）；グスタフソンら（Gustavson，K.H.，et al．）、Am．J．Med．Genet.，23: 581-588（1986）］、遺伝性筋力低下の主因となっている常染色体優性疾患である筋緊張性ジストロフィー（ＭＤ）［ハーパー（Harper，P.S.）、MYOTONIC DYS TROPHY，2d Ed.，London，England，W.B．Saunders Co．（1989）］、脊髄延髄筋萎縮症（ＳＢＭＡ、またはケネディー病）［ラスパダら（LaSpada，A.R.，et al．）、Nature，352:77-79（1992）］、および進行性神経変性障害であるハンチントン病［マクドナルドら（MacDonald，M.E.，et al．）、Cell，72:971-983 （1993）］においてトリヌクレオチド反復配列の延長が起こることが知られている。反復配列延長が臨床疫学的に重要な役割を果たしているこれらの状態を同定することができれば、これら以外にも反復配列延長によると思われる病的状態が見つかる可能性がある。しかしながら、このような状態の同定には技術的問題が大きい。ＭＤ、ＦＸ、ＳＢＭＡ、およびＨＤでは、特定の状態と関連する遺伝子が位置クローニングで位置決めされた場合には、反復配列延長の同定に数通りの方法が用いられてきた。ＰＣＲを利用した診断測定法も有用であるが、反復配列に隣接するユニークＤＮＡ配列があらかじめ決定されている場合に限られる［ブルークら（Brook，J.D.，et al．）、Cell，68:905-914（1992 ）］。さらに、反復配列サイズが数百ヌクレオチド以上になるとＰＣＲは無効である。サザーンブロッティングを利用して数百ヌクレオチドより大きい延長反復配列を含む対立遺伝子を検出することができるが、その反復配列に隣接するプローブを利用できることが前提となる。したがって、簡便かつ迅速な手順で臨床的に重要な反復配列延長を直接同定する新しい方法が求められている。さらに、これらの状態において延長ヌクレオチド反復配列の存在が認められると、遺伝的状態の疫学においてこの現象がどの程度普遍的であるかという問題が生じる。ヒトゲノム中のヌクレオチド反復配列延長を直接検出する一般的方法があれば、医遺伝学上重要なこの問題を解明する直接的なアプローチとなる。発明の概要本発明は、生物試料に含まれるゲノムＤＮＡ中に存在する延長ヌクレオチド反復配列を検出する方法に関する。具体的には、本方法は、ゲノムＤＮＡ中の延長トリヌクレオチド反復配列の検出に関する。本発明はさらに、延長ヌクレオチド反復配列の存在を検出することに基づく、個体中の病的状態および病的となる可能性のある状態（すなわち遺伝的状態）を診断する方法に関する。本発明の方法は以下のようにして実施される。生物試料に含まれるゲノムＤＮＡが相補オリゴヌクレオチドとアニーリング（ハイブリダイゼーション）可能となるようにする。具体的には、ゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡ中で検出すべきヌクレオチド反復配列に対して相補的なヌクレオチド反復配列（すなわち核酸配列）を有する単純配列反復オリゴヌクレオチド（たとえば、ジ、トリ、またはテトラヌクレオチド）と混合（combined）する。生じたゲノムＤＮＡと単純配列反復ヌクレオチドの混合物（combination）を、該単純配列反復オリゴヌクレオチドが該単離されたゲノムＤＮＡに対してアニーリング可能となるのに十分な条件下に保つ。ゲノムＤＮＡが検出すべきヌクレオチド反復配列（すなわち単純配列反復ヌクレオチドに対して相補的な配列）を含んでいれば、これら２つの相補配列のアニーリングが起き、ゲノムＤＮＡとアニーリングされた単純配列反復オリゴヌクレオチドとの複合体ができる。すなわち、検出すべき反復配列がゲノムＤＮＡ中に存在する場合、単純配列反復オリゴヌクレオチドはアニーリングの支持体または鋳型として機能するゲノムＤＮＡに対してアニーリングする。次いで、アニーリング過程で形成されたゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチドの複合体を、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを連結させるのに十分な条件下に保つ。延長ヌクレオチド反復配列がゲノムＤＮＡ中に存在する場合は、ゲノムＤＮＡ支持体上で互いに近接する位置でアニーリングされた単純配列反復オリゴヌクレオチドが連結され、アニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーができる。連結は、適当な耐熱性連結酵素の作用によって起こる。連結過程により、検出すべきヌクレオチド反復配列（すなわちゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体）を含むゲノムＤＮＡ領域に対してアニーリングされた単純配列反復オリゴヌクレオチドのマルチマーができる。本明細書では、上記のようにして生じた産物をゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体と呼ぶ。連結過程で作成されたゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を、該ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を変性させるのに十分な条件下に保つと、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体からアニーリングされたマルチマーが遊離し、アニーリングされていないマルチマーができる。これらのアニーリング、連結、および変性の過程は、十分なコピー数のアニーリングされていないマルチマーが検出できるようになるまで繰り返す。アニーリングされていないのマルチマーの存在は、ゲノムＤＮＡ中に延長ヌクレオチド反復配列が含まれていることの証拠である。すなわち、マルチマーは診断すべき遺伝的状態に特有のものである。１つの態様においては、アニーリングされていないマルチマーの存在は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるなどしてサイズの違いによりアニーリングされていないマルチマーを分離することによって、測定または検出される。次いで、ゲルをハイブリダイゼーション過程での使用に適した膜または濾紙上に電気的に移動またはブロッティングすることによって、検出すべきアニーリングされていないマルチマーを膜上に移す。ハイブリダイゼーションでは、検出すべきアニーリングされていないマルチマーに対して相補的な核酸配列を有する標識化オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、膜上にブロッティングされた（膜上に存在する）アニーリングされていないマルチマーの存在を検出する。ハイブリダイゼーション後、膜上に存在するアニーリングされていないマルチマーとハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドプローブのパターンを可視化する。生じたパターンは、特定サイズのマルチマーの存在の証拠である。たとえば、延長ＣＴＧヌクレオチド反復配列がゲノムＤＮＡ中に存在し、かつ本方法で使用される反復オリゴヌクレオチドが（ＣＴＧ）₁₇単純配列反復オリゴヌクレオチドである場合は、アニーリングされていないマルチマーは１７の倍数（すなわち、１７、３４、５１、１０２、１１９など）で存在するはずである。マルチマーのサイズ（すなわち長さ）は、ゲノムＤＮＡ中に存在する延長ヌクレオチド反復配列の長さを示している。特定の遺伝的状態の場合、マルチマーの長さはその状態に特有である。たとえばＭＤの場合、１００を超えるＣＴＧ反復を有するマルチマーを含むＣＴＧ反復配列はＭＤに特有である。１つの態様においては、ハイブリダイゼーションに使用する標識化オリゴヌクレオチドプローブは（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀ 、および（ＣＡＧ）₁₀である。アニーリング過程で１つのタイプの単純配列反復オリゴヌクレオチドを使用した場合は、１つのタイプの標識化オリゴヌクレオチドプローブ（すなわち使用するすべてのプローブが同一の核酸配列を有する）を使用する。あるいは、単純配列反復オリゴヌクレオチドの混合物をアニーリング過程に使用した場合は（たとえば、異なる単純配列反復を有する４種類の反復オリゴヌクレオチドを使用）、複数の標識化オリゴヌクレオチドプローブの混合物をハイブリダイゼーション過程に使用する。ハイブリダイゼーションに使用する標識化オリゴヌクレオチドプローブは、³² Ｐなどの放射性標識で標識することができる。この場合、検出可能マルチマーはオートラジオグラフィーで可視化される。あるいは、標識化オリゴヌクレオチドは、ペルオキシダーゼ、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの非放射性標識剤で標識することもでき、マルチマーは酵素活性または化学発光による発色によって可視化される。１つの態様においては、本発明の方法は延長トリヌクレオチド反復配列を検出するが、この場合、単純配列反復オリゴヌクレオチドは、トリヌクレオチド反復配列である。このような反復配列は、たとえば（ＣＧＧ）₁₁、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄、および（ＣＴＧ）₁₇の配列を有する。１つのタイプのオリゴヌクレオチド（すなわち同一の核酸配列を有するすべてのオリゴヌクレオチド）をアニーリング過程に使用することができるが、複数のタイプ（すなわち異なるタイプの混合物）のオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本発明の方法の別の態様においては、ゲノムＤＮＡの特定部位を調べて延長ヌクレオチド反復配列の存在を検出することができる。この態様においては、ゲノムＤＮＡ中の検出されるべき延長ヌクレオチド反復配列に対して相補的な単純配列反復オリゴヌクレオチドを、該ゲノムＤＮＡ上の特定部位にある既知隣接配列に対して相補的なプライマー配列（単純配列反復オリゴヌクレオチドでないもの）と混合する。したがって、アニーリング／連結混合物は、ゲノムＤＮＡ中に存在するヌクレオチド反復配列に対してアニーリングする単純配列反復オリゴヌクレオチドと、さらに該ゲノムＤＮＡの特定部位にある隣接配列に対してアニーリングするプライマーすなわち隣接配列とを含む。この部位特異的配列を単純配列反復オリゴヌクレオチドに連結すると、反復配列オリゴヌクレオチドと部位特異的配列のマルチマーを含むハイブリッド分子ができる。これらのハイブリッド分子を部位特異的マルチマーと呼ぶ。部位特異的マルチマーの検出は、ゲノムＤＮＡの特定部位にヌクレオチド反復配列が存在することの証拠である。本発明はまた、個体における病的反復配列延長および病的となる可能性のある反復配列延長を直接同定する方法に関する。延長ヌクレオチド反復配列は、いくつかの遺伝的状態、とくに予期（責任遺伝子が親から子供に伝達され、後世代においてその状態の発生時期が早まり、障害度も悪化する遺伝的状態）と関連する遺伝的状態に存在することが示されている。最近の研究で、ＦＸ、ＭＤ、ＳＢＭＡ、およびＨＤなどの状態の場合、ヌクレオチド反復配列サイズ（すなわち、反復配列の長さまたは数）と状態症候の発症年齢および状態の重篤との相関があることが証明されている。したがって、本明細書で説明する方法は、特定の遺伝的状態に特有な臨床的に重要な反復配列延長を検出する技術を提供するものである° 本発明の方法（以下「反復配列延長検出法」またはＲＥＤという）は、染色体上の位置があらかじめわかっていなくても延長（すなわち延びたり広がったりしたもの）ヌクレオチド反復配列が検出される一般的に応用可能な新規方法である。本明細書で使用する場合、「延長」という用語は、ゲノムＤＮＡ中に存在する単純ヌクレオチド反復配列の増幅またはその反復数の増加をいう。たとえば、ＦＭＲ−１遺伝子転写物の５’未翻訳領域にあるＣＧＧトリヌクレオチド反復配列は通常は多型性であって６〜５４個の反復配列を有し、平均コピー数は２９である［リギンスら（Riggins，G.J.，et al．）、Nature Genetics，2:186-191（19 92）］。この反復は脆弱Ｘ染色体症候群家系においては不安定であり、影響を受けた個体では反復配列の長さが５２〜２００反復あり、場合によっては約１０００コピーに及ぶことがある［リギンスら（Riggins，G.J.，et al．）、Nature Genetics，2:186-191（1992）］。ＲＥＤは、脆弱Ｘ染色体症候群や筋緊張性ジストロフィーの患者に見られるものなど既知ヌクレオチド反復配列を同定する高感度の手段であると同時に、新規反復配列の同定と研究の手段ともなる。ＲＥＤは、遺伝的状態に特有のヌクレオチド反復配列を同定する目的で大規模サンプル集団をスクリーニングする手段としても有用である。ＲＥＤは、反復配列特異的オリゴヌクレオチドのアニーリングと連結の支持体としてゲノムＤＮＡを利用するものである。したがって、ＰＣＲに基づく方法のように隣接配列情報や単一コピープローブを必要とはしない。さらに、ＲＥＤを利用すれば、異なるタイプの単純配列反復オリゴヌクレオチドを同じ反応に含ませることによってコア配列の異なる複数種の反復配列を検出することもできる。本明細書に示したデータで示されるように、ＲＥＤはゲノム中のあらゆるタイプの単純ヌクレオチド反復配列延長の検出に適用可能な迅速かつ簡便な方法である。したがって、本方法は、上記以外の遺伝性障害、とくに予期を特徴とする遺伝性障害を研究する独特の手段といえる。図面の簡単な説明図１は、ＲＥＤの全段階の概要を示した模式図である。図２は、ＲＥＤマルチマーの検出の全段階の概要を示した模式図である。図３は、部位特異的ＲＥＤの全段階の概要を示した模式図である。図４は、部位特異的マルチマーの検出の全段階の概要を示した模式図である。図５は、軽度に影響を受けた筋緊張性ジストロフィー患者に由来する１４１ｂｐのＣＴＧ反復配列を検出した電気泳動ゲルパターンを示す。図６は、親類関係にない１６８の個体で検出された分子量産物のグラフ図である。図７は、マルチプレックスＲＥＤを用いて脆弱Ｘ染色体症候群患者における延長トリヌクレオチド反復配列を検出した電気泳動ゲルパターンを示す。図８は、（ＣＴＧ）₁₇オリゴヌクレオチドを用いてＣＥＰＨ家系由来のゲノムＤＮＡ中の延長反復配列トリヌクレオチドを検出した電気泳動ゲルパターンを示す。発明の詳細な説明本発明は、反復配列の染色体上の位置があらかじめ判っていなくてもゲノムＤＮＡ中の病的反復配列ヌクレオチド延長および病的となる可能性のある反復配列ヌクレオチド延長を同定する「反復延長検出法」（以下ＲＥＤという）という新規な、一般的に適用可能な方法または技術に関する。ＲＥＤの全過程の概要を示した模式図を図１に示す。本明細書で詳細に説明され、実施例１で説明されるようにして実施されるＲＥＤ法は次のとおりである。マルチマーの製造組織、プラスミド、細胞、または血液などの生物試料に含まれるゲノムＤＮＡを、オリゴヌクレオチドとのアニーリング（ハイブリダイゼーション）および引き続き行なわれる連結に利用できるようにする。ゲノムＤＮＡは、市販品（たとえばQiagen社のゲノムＤＮＡキット）を用いるか、既報［サムブロークら（Samb rook，J.，et al.）、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］に記載のものなどの標準的実験室手法を用いて単離される。単離されたゲノムＤＮＡは、実施例１で詳細に説明するようにして、ゲノムＤＮＡ中で検出されるべきヌクレオチド反復配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する単純配列反復オリゴヌクレオチド（たとえばジ、トリ、またはテトラヌクレオチド）と混合（combimed）する。実施例１では、単純配列反復オリゴヌクレオチドは、トリヌクレオチドＣＴＧであったが、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＣＣＴ、およびＣＧＴなどその他の単純配列反復オリゴヌクレオチドもＲＥＤに使用することができる。実施例１では、１７個の単純配列反復を有する単純配列反復オリゴヌクレオチド（ＣＴＧ）₁₇を使用した。しかし、オリゴヌクレオチドのサイズは反復数１１未満から１７以上までの間で変化させることができる。たとえば、トリヌクレオチドＣＴＧの１７マー（すなわち１７コピーを含むもの）である（ＣＴＧ）₁₇を実施例１で使用したが、ＲＥＤ測定はオリゴヌクレオチド中のＣＴＧ反復数が７と少ないものから１７と多いものまでの長さ範囲のＣＴＧトリヌクレオチドを用いて実施されている。長さが８〜１７のものを用いたときに好結果が得られたが、これらより長い単純配列反復オリゴヌクレオチドも効果的に使用することができる。生じたゲノムＤＮＡと単純配列反復オリゴヌクレオチドの混合物（combinatio n）を、該単純配列反復オリゴヌクレオチドが単離ゲノムＤＮＡに対してアニーリングできるのに十分な条件下に保つ。ゲノムＤＮＡが検出すべきヌクレオチド反復配列（すなわち単純配列反復オリゴヌクレオチドに対して相補的なもの）を含んでいれば、２つの相補配列のアニーリングが起きて、複合体（すなわちゲノムＤＮＡ／アニーリングされた単純配列反復オリゴヌクレオチド複合体またはゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体）ができる。すなわち、ゲノムＤＮＡは、検出すべき反復配列がゲノムＤＮＡ中に存在する場合に単純配列反復オリゴヌクレオチドのゲノムＤＮＡへのアニーリングすなわちハイブリダイゼーションを可能にする鋳型または支持体として作用する。該アニーリング反応に使用する温度は、使用する単純配列反復オリゴヌクレオチドおよび検出すべき延長反復配列ヌクレオチドによって異なる。一般に、アニーリング過程はゲノムＤＮＡの融点またはその付近の温度で起こる。通常、アニーリング過程は５０〜９０℃、最も普通には５０〜８５℃の温度で行なわれる。たとえば、実施例１のように（ＣＴＧ）₁₇ 単純配列反復オリゴヌクレオチドを使用した場合、アニーリング温度は８０℃ であった。次いで、アニーリング過程で形成されたゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体を、連結が起きるのに十分な条件下に保つ。延長ヌクレオチド反復配列がゲノムＤＮＡ中に存在すれば、ゲノムＤＮＡ支持体上の互いに近接する位置でアニーリングされた単純配列反復オリゴヌクレオチドどうしが連結され、アニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーができる。隣接するオリゴヌクレオチド（すなわち、互いに近接するもの）のみを共有結合する耐熱性リガーゼを使用する［バラナイ（Baranay，F．）、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA ，88:189-193（1991）］。したがって、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体ができる。連結過程は、使用する酵素の活性によって広い温度範囲で実施することができる。一般に、３７〜９０℃の範囲が使用可能であり、使用温度は通常、アニーリング過程で使用する温度と同じである。たとえば、実施例１で説明するように、（ＣＴＧ）₁₇反復配列オリゴヌクレオチドを連結させてマルチマーとする連結過程もアニーリング過程と同じ温度の８０℃で実施された。連結酵素の濃度は使用する酵素の活性に応じて変更することができる。実施例１で説明するように、５単位のアンプリガーゼ（Ampligase）を使用したが、好結果が得られたのは１．０Ｕという低濃度から２５Ｕという高濃度までの範囲であった。結果から、連結酵素の濃度を上げると連結反応の効率も上がることが示唆される（たとえば、より短時間でより多数のマルチマーができる）。次いで、連結過程で形成されたゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体をマルチマー複合体を変性させるのに十分な条件下に保つと、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体からアニーリングされていたマルチマーが遊離し、アニーリングされていないマルチマーができる。変性は通常は、ゲノムＤＮＡ支持体からのマルチマーの遊離に十分な温度までゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を加熱することによって達成される。変性過程に使用される温度範囲は、使用するゲノムＤＮＡと単純配列反復オリゴヌクレオチドによって異なる。ＤＮＡの熱変性用の標準的実験条件を使用する。通常、変性温度は約９４℃である。本発明の方法の「１サイクル」は、アニーリング、連結、および変性から成る。本法は、検出に十分な数の目的の長さのアニーリングされていないマルチマーが得られるまで繰り返す（十分な回数のサイクルを起こさせる）。目的の長さとは、特定の遺伝的状態に特有であることが判っているか疑われている延長ヌクレオチド反復配列など対象となる、延長ヌクレオチド反復配列の存在を証明する長さである。通常、十分な数のマルチマーを得るためには、数百サイクルを繰り返す。本明細書で説明するように、検出に十分な数のマルチマーはわずか２５サイクルで形成されている。通常、２５〜４００サイクルを使用するが、１００〜４００サイクルがとくに効果的であることが示さた。１０００サイクルという多数のサイクル数でも、検出可能産物の分解は起きなかった。したがって、２５〜１０００のサイクル数範囲で検出に十分な数のマルチマー（すなわち検出可能なマルチマー）が形成されるはずである。上記サイクリング過程は、パーキン・エルマー・シータス社（Perkin Elmer/C etus）のＰＣＲシステム９６００、ＭＪリサーチ社（MJ Research）のサーモサイクラーＰＴＣ１００−９６Ｖ、またはエリコンプ社（EriComp）のサーモサイクラーなど市販の熱サイクラーでの実施にとくに適している。加熱フタ付きのオイルフリーのサーモサイクラーを使用するのが好ましい。マルチマーの検出形成されたアニーリングされていないマルチマーの長さは、使用したオリゴヌクレオチドのマルチマーと同様に、測定対象ゲノムＤＮＡ中に存在する単数または複数の反復配列の長さによって異なる。これらのアニーリングされていないマルチマーは、図２に示したものなど数種類の方法で検出可能である。１つの態様においては、本方法には、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）などによるサイズ分離によって、より短くより普通の連結産物をより長い延長マルチマーと識別する手段が含まれる。実施例１で説明する方法では、ゲルをハイブリダイゼーション反応に適した濾紙に電気的に移動（ブロット）させることによって、アニーリングされていないマルチマーを濾紙上に移動させている。次いで、アニーリングされていないマルチマーを含んだこの濾紙を、検出すべきマルチマーに対して相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせた。たとえば、（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀、および（ＣＡＧ）₁₀から選ばれたプローブを使用することができる。産物検出効率を最大にするために、実施例１の標識化プローブを³²Ｐ（３’末端のｄＡＴＰ分子）で多重標識した。次いで、ハイブリダイゼーション産物（すなわち標識化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしたアニーリングされていないマルチマー）を、標準的実験室手法に従って実施したオートラジオグラフィーによって可視化させた。ハイブリダイゼーション産物のパターン（たとえば、はしご状構成で見られるものなど数反復のものから数百反復までサイズが異なるアニーリングされていないマルチマーのパターン）を可視化させることができる。あるいは、遺伝的状態に特有な特定の長さのハイブリダイゼーション産物を可視化させることもできる。いずれの場合も、ハイブリダイゼーション産物の可視化はアニーリングされていないマルチマーの存在の証拠となる。あるいは、プローブは、ペルオキシダーゼ、ビオチン、およびジゴキシゲニンなどの非放射性分子種によって標識することができる。これらの非放射性プローブを用いて行なわれる検出可能マルチマーの可視化は、酵素試験、標識化ストレプトアビジンへの結合、または化学発光法による発色によって達成できる。ＲＥＤの別の態様においては、アニーリング／連結／変性サイクルで蛍光標識単純配列反復オリゴヌクレオチドを使用する。次いで、サイズ別分離の後で蛍光検出スキャナによってマルチマー産物を検出することができる。この態様はマルチマーの自動検出にとくに適している。好ましい態様においては、ＲＥＤは増大（expanded）または延長トリヌクレオチド反復配列を検出する。しかし、ＲＥＤはトリヌクレオチド以外の延長反復配列の分析にも有用である。ジヌクレオチドならびにテトラヌクレオチドの反復配列はゲノム中に豊富に存在する［ベックマンら（Beckman，J.S.，et al．）、Ge nomics ，12:627-631（1992）］。ＲＥＤはこれらの反復配列の長大延長の検出にも使用することができる。遺伝子中に位置する延長ジ、テトラ、ペンタ、またはこれら以上の長さの単純配列反復も遺伝子の機能不全を引き起こす可能性があり、おそらくは病的状態につながるものである。ジ、テトラ、ペンタ、またはこれら以上の長さのヌクレオチド反復配列をＲＥＤで検出することができる。いずれの場合も、ジ、トリ、テトラ、またはこれら以上の長さの延長反復配列ヌクレオチドのどれをＲＥＤで検出するにせよ、使用すべき単純配列反復オリゴヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ中で検出されるべき延長ヌクレオチド反復配列のら旋の１本に対して相補的なものが適当である。１つの態様においては、ＲＥＤに使用される単純配列反復オリゴヌクレオチドは以下のいずれかの配列を有する。すなわち、（ＣＧＧ）₁₁ 、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄、および（ＣＴＧ）₁₇である。ただし、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＣＴなどその他の単純配列反復もＲＥＤに使用することができる。ゲノムＤＮＡ中で検出されるべき延長ヌクレオチド反復配列のら旋の１本に対して相補的なものであれば、ジ、トリ、テトラ、またはその他の単純配列反復ヌクレオチドをどのように組み合わせたものでもＲＥＤに使用することができる。本発明の別の態様においては、異なるタイプの単純配列反復オリゴヌクレオチドの混合物が使用されている。実施例３で詳細に説明するように、（ＣＧＧ）₁₁ 、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄、または（ＣＴＧ）₁₇から選ばれた４つの単純配列反復オリゴヌクレオチドの混合物を使用した。ＲＥＤのこの態様は「マルチプレックスＲＥＤ」と呼ばれるもので、１個のゲノムＤＮＡサンプルについて複数の異なるタイプの延長反復配列の存在を１度に調べることができる。また、単純配列反復オリゴヌクレオチドの長さを変えることで、ヌクレオチド反復配列延長物の分解度を高めることができる。たとえば、筋緊張性ジストロフィーなどの遺伝的状態においては、１０個のＣＴＧ反復を含むマルチマー（たとえば影響を受けていない個体における場合）と９０個のＣＴＧ反復を有するマルチマー（たとえば、影響を受けた個体）を識別することが重要である。この場合、（ＣＴＧ）₁₇オリゴヌクレオチドではなく、むしろ（ＣＴＧ）₁₀のような単純配列反復オリゴヌクレオチドの方を使用することができる。したがって、１７の倍数のマルチマー（たとえば１７、３４、５１、または１０２）よりも１０の倍数のマルチマー（たとえば１０、３０、９０、または１００）を検出することができる。部位特異的ＲＥＤＲＥＤの別の態様においては、特定の部位について延長反復配列の有無を調べることができる（図３）。この態様では、単純配列反復オリゴヌクレオチドでない部位特異的オリゴヌクレオチド（たとえば、ゲノムＤＮＡ中に存在する延長反復配列ヌクレオチドの領域に隣接することが知られている核酸配列）および検出すべきヌクレオチド反復配列に対して相補的な単純配列反復オリゴヌクレオチドを使用する。これらのものを、試験すべきゲノムＤＮＡと混合する。延長ヌクレオチド反復配列がゲノムＤＮＡ中に存在すれば、上記したように単純配列反復オリゴヌクレオチドはゲノムＤＮＡに対してアニーリングする。また、延長反復配列ヌクレオチドが、部位特異的オリゴヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列によって隣接されている特定の部位に存在する場合（たとえば特定の染色体上に存在する場合）、その部位特異的オリゴヌクレオチドもゲノムＤＮＡに対してアニーリングする。したがって、延長反復配列ヌクレオチドがゲノムＤＮＡの特定の部位に位置するのであれば、アニーリング過程で単純配列反復オリゴヌクレオチドと部位特異的オリゴヌクレオチドの両者がゲノムＤＮＡに対してアニーリングし、その結果、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされた単純配列反復オリゴヌクレオチド−部位特異的オリゴヌクレオチド複合体ができる。隣接配列だけが存在する場合は、部位特異的オリゴヌクレオチドだけがアニーリングするはずである。延長反復配列ヌクレオチドは存在するものの、存在部位が隣接配列によって規定される（限定される）部位以外である場合（たとえば異なる染色体上にある場合や、同じ染色体上でも遺伝子座が異なる場合）、単純配列反復オリゴヌクレオチドはアニーリングするが、部位特異的オリゴヌクレオチドに近接する部位でのアニーリングは起きない。次いで、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを有するゲノムＤＮＡを耐熱性リガーゼを用いて上記のように連結する。部位特異的オリゴヌクレオチドと単純配列反復オリゴヌクレオチドの両者がゲノムＤＮＡに対してアニーリングすると、連結過程でアニーリングされたオリゴヌクレオチドの部位特異的マルチマー（部位特異的部位を含む単純配列反復マルチマー）がゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体中で形成される。生じた産物をゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的マルチマー複合体と呼ぶ。隣接配列だけが存在するときは連結は起こらない。延長反復配列ヌクレオチドだけが存在するものの、その部位が予想部位（すなわち隣接配列によって限定される部位）でない場合、連結は起きるが、生じたマルチマーは部位特異的配列を含んでいない。次いで、連結過程の産物をゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体を変性させるのに十分な条件下に保って、アニーリングされていないマルチマーを遊離させる。部位特異的配列が単純配列反復オリゴヌクレオチドに連結されると、遊離するマルチマーは部位特異的マルチマーとなる。十分な数の部位特異的マルチマーが検出可能となるまでサイクルを繰り返す。これらの部位特異的マルチマーは、部位特異的オリゴヌクレオチドに対して相補的な標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって検出される。部位特異的マルチマーの存在は、ゲノムＤＮＡ中の特定部位に延長反復配列ヌクレオチドが存在することの証拠である。これらの部位特異的マルチマーは、図４に示したようにして検出することができる。１つの態様においては、部位特異的マルチマーはＰＡＧＥによってサイズ分離される。別の態様においては、部位特異的マルチマーは、ＰＡＧＥ、ハイブリダイゼーション、および可視化の段階に先立ち、特定の部位特異的隣接配列に対応するプライマーを用いて目的物のマルチマーの検出性能を上げる直線的ＰＣＲ法によって増幅される（図４）。いずれの態様においても、ハイブリダイゼーシヨン段階で部位特異的隣接配列に対して相補的な標識化プローブを用いることで、特定部位に特有のゲル上の位置で可視化させることができる。あるいは、ＰＣＲ過程で使用されるプライマーは、たとえば³²Ｐや蛍光標識剤などで標識することで検出可能にすることができる。ＲＥＤは、ヒトゲノムＤＮＡ中の（ＣＴＧ）延長ヌクレオチド反復配列を検出する目的で、筋緊張性ジストロフィー隣接配列を有する（ＣＴＧ）₁₇トリヌクレオチドを用いて実施されてきた。部位特異的マルチマーはＰＡＧＥによってサイズ分離され、ブロッティングされ、部位特異的プライマー配列に対して相補的な³² Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションさせた。次いで、このマルチマーをオートラジオグラフィーで可視化させた。ゲル上の予想位置に弱いバンドが見られたので、部位特異的マルチマーが形成されたことがわかる。既報［サムブロークら（Sambrook，J.，et al.）、MOLECULAR CLO0NING：A LA BORATORY MANUAL，3d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）」の記載に従い、ＰＣＲと適当な配列特異的プライマーを用いるなどして目的物マルチマーを増幅することにで、部位特異的マルチマーの検出性能を上げることができる。数回の増幅を繰り返した後、これらの分子のコピー数を増加させて、放射活性、化学発光、および蛍光などの手段による検出感度の向上を図る。したがって、ＲＥＤは染色体上の位置があらかじめ判っているか否かに関わらず、簡便かつ迅速な延長反復配列ヌクレオチド検出手段を提供するものである。本発明はまた、個体における病的な反復配列延長および病的となる可能性のある反復配列延長配列を直接同定する方法にも関する。表現型が遺伝子転写物内のトリヌクレオチド反復配列の延長に起因している４種類の状態が同定されている。脆弱Ｘ染色体症候群（ＦＸ）では、影響を受けた個体において、脳で発現される遺伝子に見られる５’（ＣＣＧ）_n反復配列が増幅される。筋緊張性ジストロフィー（ＭＤ）では、筋肉で発現される遺伝子が単離されており、筋緊張性ジストロフィー患者において３’未翻訳領域中に延長（ＣＴＧ）_n反復配列が含まれていることが示されている。いずれの障害も、後世代が前世代よりも障害の程度が大きくなる可能性があることが予想されること（脆弱Ｘ染色体症候群でシャーマンパラドックスと呼ばれるもの）を特徴とするものである。いずれの場合も、反復配列サイズと疾患程度の間に相関がある。疾患に関与する反復配列のサイズはヌクレオチド反復数約３４個から数百までの幅があり、とくに大きなサイズ範囲にある対立遺伝子では体細胞モザイクの証拠が認められている［リチャードとスザーランド（Rich ards，R.I．and Sutherland，G.R．）、Nature Genetics，1:7-9（1991）］。たとえば、筋緊張性ジストロフィーでは、影響を受けていない個体におけるトリヌクレオチド反復ＣＴＧの反復数は５〜２７である（すなわち１５〜８１ｂｐ）。筋緊張性ジストロフィー患者でもほとんど障害を示さない者は少なくとも５０個の反復を有するが、障害の程度が高い患者は数キロベースペアもの長大な反復配列含有セグメントが延長している［ブルークら（Brook，J.D.，et al．）、Cell ， 68:799-808（1992）］。また、脊髄延髄筋萎縮症（ＳＢＭＡまたはケネディー病）はアンドロゲン受容体の第１エキソン中に存在する（ＣＡＧ）反復配列と関係がある。この反復配列は２００個未満のヌクレオチドの反復であり、遺伝時および同一個体内においてもサイズ変化が起こりうる［ビアンカラナら（Biancalana,F .，et al.）、Human Mol．Genet.，1:255-258（1992）］。さらに最近、ハンチントン病の遺伝子が（ＣＡＧ）_n反復配列を含んでいることが示された［マクドナルドら（MacDonald，M.E.，et al．）、Cell，72:971-983（1993）］。トリヌクレオチド配列を検出するｃＤＮＡクローンのスクリーニングを用いて、機能的に重要な反復延長配列の標的部位にできる部位を同定することができる［リギンスら（Riggins，G.J.，et al.）、Nature Genetics，2:186-191（1992 ）］。ただし、このアプローチは多大な労力を要する。ＲＥＤ法は、この労力のかかるアプローチに替わって臨床的に重要な反復延長配列を同定する手段を提供するものである。この方法は、延長が起きたゲノム部位をあらかじめ同定しておかなくても延長反復配列を直接可視化させることができるので、病的になる可能性のある遺伝子を直接同定することが可能となる。さらに、上記した病的状態の場合のように、反復延長配列の位置があらかじめわかっているときは、部位特異的ＲＥＤをこれらの状態の診断手段とすることができる。たとえば、個体における筋緊張性ジストロフィー（ＭＤ）を診断する目的で、ＭＤ患者の３’未翻訳領域にある延長ＣＴＧ反復配列に隣接する配列に対して相補的な既知の隣接配列とともに（ＣＴＧ）₁₇オリゴヌクレオチドをＲＥＤに使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドを個体から単離したゲノムＤＮＡと混合し、アニーリングさせ、連結させる手順を繰り返すことで、上記のような（ＣＴＧ）₁₇の部位特異的マルチマーを作成し、これをＰＡＧＥで分離する。ＰＡＧＥ分離後、部位特異的プライマーに対して相補的な標識化プローブを部位特異的マルチマーのハイブリダイゼーションとその後の可視化に使用することができる。好ましい態様においては、産物マルチマーの検出性能を上げる目的で、ＰＡＧＥ、ハイブリダイゼーション、および可視化過程に先立ち、部位特異的マルチマーを直線的ＰＣＲ法で増幅させる。いずれの態様においても、マルチマーが検出されれば、３’未翻訳領域に延長ＣＴＧヌクレオチド反復配列が存在することの証拠となる。延長ＣＴＧ反復配列の長さの測定値は、その個体がＭＤの影響を受けているか否か、および状態の重篤度の目安となる。たとえば、部位特異的ＣＴＧヌクレオチド反復配列の数が１０個未満であれば、その個体はＭＤの影響を受ける可能性は非常に低い。ところが、反復数が３００個を超えると、その個体はＭＤの影響を強く受ける可能性が高い。反復配列延長が生物学的表現型につながる機構については、上記場合では完全には解明されていない。ＦＸの場合、反復延長がＦＭＲ−１遺伝子の転写の阻害と周辺ＤＮＡのメチル化につながる可能性があると思われる［ベルケルクら（Ve rkerk，A.J.，et al．）、Cell，65:905-914（1991）］。ｍＲＮＡとして発現される遺伝子部分の外側に位置する場合でも、反復延長配列が臨床上重要な影響を遺伝子機能に及ぼすという可能性が残っている。ＲＥＤ法はそのような延長配列の検出を可能にするものであるが、ｃＤＮＡを利用する測定法ではこのようなことは不可能である。ＲＥＤ法によって多数の個体における反復配列延長が同定されている。実施例２で説明するように、既知のトリヌクレオチド反復配列延長を有する筋緊張性ジストロフィー患者３名から得たゲノムＤＮＡをＲＥＤ法で測定した（図５、レーン４〜６）。すべてのレーンにおいて、１０２ｂｐから７００ｂｐを超えるものまでの範囲で元のオリゴヌクレオチドのマルチマー形成と一致する産物が観察された。やはり実施例２で詳細に説明するように、合計１６８の親類関係のない個体から採取したゲノムＤＮＡについても、ＲＥＤおよびＣＴＧ反復配列オリゴヌクレオチドを用いて調べられている。長いＣＴＧ反復配列を有する５名の個体が観察された（全サンプル数の３％）。中間サイズの反復配列も観察され、調査対象者のうち２３％は１５３〜３５７ｂｐの産物を有し、大多数は２０４ｂｐに集中していた（図６）。別の態様（「マルチプレックスＲＥＤ」と呼ばれるもの）においては、実施例３で詳細に説明するように、複数タイプの反復配列オリゴヌクレオチドを用いた。異なるタイプの単純配列反復を混合して１度に測定することによって、異なる延長ヌクレオチド反復配列を同時にスクリーニングすることが可能になる。単一の反復配列オリゴヌクレオチドの長さは、各タイプのオリゴヌクレオチドが特有のサイズをもつように選んだので、生じた産物のサイズに基づいて各反復配列を同定することができた（図７）。現在では、脆弱Ｘ染色体ＤＮＡをＣＣＧ連結反応の有効性試験の対照として、また筋緊張性ジストロフィーＤＮＡをＣＴＧ連結試験の対照として使用することができる。コア配列としてのＴＧＧ、ＣＣＴ、またはＣＧＴについては延長反復配列は未だ同定されていないが、１６８の個体から成る集団について、実施例３で説明し図７に示すようにして、５つの反復配列すべてを検出するスクリーニングを行なった。単一の連結物に相当するものより大きなサイズを有する産物としては、ＣＴＧ、ＣＣＧ、およびＣＣＴ産物だけがこれまでに検出されている。実施例４で説明するように、ＣＥＰＨ（Centre d'Etude du Polymorphisme Hu main）を示す３家系に由来する２つの非常に長い反復配列と１つの中間サイズの反復配列の分離パターンから、染色体番号１８に存在する単一の遺伝子座（ＲＥＤ−１）における対立遺伝子と一致した遺伝パターンが３家系すべてにおいて判明した。この結果から、創始染色体が３家系に上記反復配列をもたらしたか、染色体番号１８の反復増幅がとくに起きやすい遺伝子座が存在するのか、いずれかの可能性があることが推察される。おもしろいことに、各家系で検出された最長産物のサイズに違いがあった。図８に示したように、父親は５０９ｂｐを有しているが、５名の子供は５６０ないし４５８ｂｐの範囲の最長産物を有している。筋緊張性ジストロフィー、脆弱Ｘ染色体症候群、および脊髄延髄筋萎縮症でも、家系内の延長トリヌクレオチド反復配列の長さに同様の違いがあることが記載されている。これらの状態では、家系内だけでなく、同一個体内（体細胞モザイク）でもコピー数の不安定性が観察された。実施例４で測定したＤＮＡ試料は株化細胞から得たものであった。したがって、調べた家系においてイン・ビボと同様に、イン・ビトロでサイズ変化が起きたという可能性は排除できない。ＤＮＡの質の違いも検出される最長バンドのサイズに影響を及ぼすかもしれないが、異なるＤＮＡ調製品を用いた場合でも、すべての個体において見られた最長バンドは異なる実験間で一定であった。したがって、ＲＥＤはゲノムＤＮＡ由来の延長単純配列反復の検出に使用することができる。ＲＥＤは、ゲノム中にあるその他の形の反復配列の存在を調べる目的にも使用することができる。本明細書に示したデータは、健常な個体においては長いトリヌクレオチド反復配列の出現頻度が低いことを示しているが、トリヌクレオチド反復配列を示す少なくとも１つの新しい遺伝子座がＲＥＤによって同定されている。長いＣＴＧ反復配列を遺伝する３つのＣＥＰＨ家系の分析で、これらの家系ではこの対立遺伝子は、染色体番号１８の上にある遺伝子座（ＲＥＤ−１）に対応することが証明されている。したがって、ＲＥＤはこのタイプの機構によって引き起こされるその他の疾患、とくに予期と関係のある疾患を同定するための強力な手段となる。本発明は、個体のゲノムＤＮＡ中の延長ヌクレオチド反復配列を検出することによる個体の病的状態または病的となる可能性のある状態を診断するキットにも関する。このキットは、対照として機能する既知の延長ヌクレオチド反復配列から成るゲノムＤＮＡを入れた容器を含むことができる。たとえば、ＭＤの影響を受けた個体に由来するゲノムＤＮＡ（すなわち、延長ＣＴＧヌクレオチド反復配列を有するもの）を入れた容器も、ゲノムＤＮＡ中に延長ＣＴＧヌクレオチド反復配列を有する個体を同定するための対照として用いることができる。キットは、ゲノムＤＮＡ中の検出されるべき延長反復配列ヌクレオチドに対して相補的な単純配列反復オリゴヌクレオチドを入れた容器、該単純配列反復オリゴヌクレオチドに対して相補的な標識化オリゴヌクレオチドプローブを入れた容器、適当な濃度のＤＮＡリガーゼ酵素を入れた容器、およびＤＮＡリガーゼ緩衝液を入れた容器を含んでいてもよい。キットに含まれる上記単純配列反復オリゴヌクレオチドは、単一タイプのものであってもよいし、複数タイプのものであってもよい。たとえば、それらは（ＣＧＧ）₁₁、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄、（ＣＴＧ）₁₇、またはゲノムＤＮＡ中の検出されるべき延長反復配列ヌクレオチドに対して相補的なその他の適当な単純配列反復オリゴヌクレオチドであってよい。上記標識化オリゴヌクレオチドプローブは単一タイプのものであってもよいし、複数タイプのものであってもよい。たとえば、これらは（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀、（ＣＡＧ）₁₀、または検出されるべき単純配列反復オリゴヌクレオチドに対して相補的なその他の適当なオリゴヌクレオチドプローブであってよい。該プローブは、たとえば³²Ｐや蛍光標識物質で標識することができる。以下の実施例により本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。実施例１：ＤＮＡクローン由来の延長ＣＴＧ反復配列のＲＥＤ検出方法論ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの起源筋緊張性ジストロフィー患者由来のヒトゲノムＤＮＡはＤ．ブルック博士から恵与された。脆弱Ｘ染色体症候群患者のＤＮＡはＤ．ネルソン博士から、ＣＥＰＨのＤＮＡはＮ．ドラコポリおよびＶ．スタントン両博士から恵与された。１４１ｂｐＣＴＧ反復配列を有するＨ７プラスミドはＤ．ブルック博士から恵与された。オリゴヌクレオチド類はリサーチ・ジェネティクス社（Huntsville，Alabam a）およびＭＩＴバイオポリマース・ラボラトリーにより合成された。オリゴヌクレオチド（ＣＧＧ）₁₁、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄および（ＣＴＧ）₁₇は、さらに８％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上で精製した。これらのオリゴヌクレオチドはすべて、連結反応に用いる前に、ｄＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）ビーバリー、ＭＡ）でリン酸化した（Sambrook，J ．et al.，M0LECULAR CL0NING：A LAB0RATORY MANUAL，3d Ed.，Cold Spring Ha rbor Press（1989））。オリゴヌクレオチドの³²Ｐ標識化（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀、および（ＣＡＧ）₁₀は、ショーリング，Ｍ．，ジーンエクスプレションインニューラルティシューズ（Ed.Conn，P．M.），Academic Press，Inc.，New York，pp.231-255 （1992）に記載された方法に従い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Bethesda Research Laboratories）と³²ＰｄＡＴＰ（ＮＥＮ０１２Ｚ）を用いて比活性２−９×１０⁹cpm/μｇまで３’末端を標識化した。ＲＥＤ反応条件すべての反応は、下記の諸条件を用いて、ジーンアンプＰＣＲシステム９６００（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT）上で行われた：１．０μｇのゲノムＤＮＡ、５０ngのリン酸化されたオリゴヌクレオチドおよび５Ｕのアンプリガーゼ（Epicentre Technologies，Madison，Wisconsin）を含み、アンプリガーゼ溶解用緩衝液を加えた反応液（１０または２０μｌ）を９４℃で５分間インキュベートした。当業者に知られた他の標準的な熱安定なリガーゼ／緩衝液系も使用することができる。その後、この試料を８０℃で９０秒間および９４℃で１０秒間のサイクルを１９８回行った。ただし、９９サイクル後に５Ｕのアンプリガーゼの第２回目の添加を行った。一部の実験では、８０℃での処理をより短時間（３０または６０秒間）とし、サイクル数を増加（４００回）して産物形成を行わせた。このアンプリガーゼは５００サイクルまであるいは１６時間のサイクリングまで安定である。電気泳動とハイブリダイゼーション５０％ホルムアミドを含む試料（２０μｌ）は、５分間熱変性させた後、変性ポリアクリルアミドゲル上に乗せた。電気泳動は、７０Ｗの定電力で、ｐＨ８の１００ｍＭトリスーボレート緩衝液中６Ｍ尿素及び１ｍＭＥＤＴＡを含む６％ポリアクリルアミドゲルの中で２〜３時間実施した。このゲルを３ＭＭ濾紙に移し、１×ＴＢＥ中４５分間、２Ａを用いて、ＤＮＡをハイボンドＮ＋膜上に電気的に移行させた。ＵＶにより固定化した後、この膜を５８℃で１６時間³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、１×ＳＳＣ中、次いで０．１％ＳＤＳ中で５６℃で１〜２時間洗浄し、そして増強スクリーンを用いてフジＸ線フィルム上で３〜１０日オートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡクローン由来の延長ＣＴＧ反復配列の検出ＲＥＤを用いて長大反復配列を検出した一例を図５に示す。初め、この方法は延長（ＣＴＧ）反復配列由来のプラスミドＨ７を用いてテストされた。軽度に影響を受けた筋緊張性ジストロフィー患者由来の１４１ｂｐＣＴＧ反復配列のそれぞれ１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇを担体としてのゲノムＤＮＡ１μｇと混合し、ブルースクリプト中でクローニングした。（図５、レーン１〜３）。すべての試料には５０ngのリン酸化された（ＣＴＧ）₁₇オリゴヌクレオチドを加え、初めと９９サイクル後に５Ｕのアンプリガーゼを添加して、９４／８０℃で１９８回のサイクルを行った。図５のレーン１（Ｈ７クローンの１０ｐｇ）には、それぞれ２個および３個のオリゴヌクレオチドが共連結したものに相当する１０２および１５３ｂｐの両方の位置に産物が観察された。１ｐｇ（レーン２）または１００ｆｇ（レーン３）を用いると、この反応では検出される産物が次第に減少する。これは、この反応が基質依存性であることを示す（図５の矢印は、１５３ｂｐ産物を示し、矢頭は１０２ｂｐ産物を示す）。連結法も、３０塩基ＣＴＧ反復オリゴヌクレオチドと１ｐｇＨ７クローンを用いてテストした。８０℃および９５℃の１９８サイクル後に、それぞれ２個、３個および４個の連結に相当するサイズの９０、１２０および１５０ヌクレオチドのバンドがみられた（データは示していない）。Ｈ７の高濃度（１００ｐｇ）を用いると、１５０ヌクレオチドのバンドに比べると遥かに弱い強度ではあるが、１８０、２１０および２４０ヌクレオチドのバンドが更に生じた（データは示していない）。これは、１４１ｂｐであるＨ７クローン中に含まれる反復配列のサイズに照らして興味深い。すなわち、使用した鋳型より大きなサイズの産物（すなわち、アニーリング済みマルチマー）は、既に連結された分子の第二のアニーリングによる可能性が最も高いが、限られたものだけが形成され得るようにみえる。実施例２：ゲノムＤＮＡ中の延長ＣＴＧ反復配列の検出筋緊張性ジストロフィーにかかっており、ＭＤ−１遺伝子内にトリヌクレオチド延長のあることが知られている３名の患者由来のゲノムＤＮＡ（１μｇ）も、実施例１に記載した方法を用いて試験した（図５、レーン４〜６）。すべてのレーンで、１０２ｂｐから７００ｂｐ以上の範囲の、元のオリゴヌクレオチドのマルチマー形成と一致するサイズのマルチプル産物が観察された。サザンブロッティングおよびＭＤ−１部位に特異的なプローブを用いて、３名の個体すべてにおいて反復配列サイズが８００ｂｐより大きいことが示された。親類関係のない個体の試料（図５、レーン７〜１１）から、すべての場合に１０２ｂｐの産物が証明される。さらに、１個体（レーン１０）は１５３および２０４ｂｐの産物を示す。総数１６８の親類関係のない個体由来のゲノムＤＮＡを、ＲＥＤおよびＣＴＧ反復オリゴヌクレオチドを用いて試験した。これらの個体中に検出された最大分子量産物の概要を図６に示す。時には１０００ｂｐのサイズまで分離可能な産物のはしごでは、すべての個体に３５７ｂｐグループが含まれる。１０２ｂｐ産物は、各反応で連結が起こったという指標として用いることができる。これは、サイズ上１個の連結しか許容されないゲノム中で短いマルチプルＣＡＧ反復配列へのオリゴヌクレオチドのアニーリングにより生じた可能性が最も高い。継続的連結のサインとして明瞭な１０２ｂｐ産物を有する個体のみが図６に含められた。１６８の個体のうちの１２３の個体（７３％）では、高分子量の産物は観察されなかった。これはそれらのゲノム中には長大なＣＡＧ反復配列が存在しないことを示唆する。５個体では、筋緊張性ジストロフィー患者のＤＮＡで観察されたものと類似のマルチプル産物のはしごを形成し、３５０ｂｐより長い産物が見られた（図５、レーン４〜６）。３９の個体（２３％）で、中間サイズの産物が観察された（図６）。このような個体の一例を図５、レーン１０に示す。実施例３：マルチプレックスＲＥＤ他の反復配列方式における延長を明らかにし得るようＲＥＤの能力を拡大する目的で、異なるトリヌクレオチド反復配列のためのマルチプレックスＲＥＤ試験法の技術を考案した。連結反応において、４種の異なる反復オリゴヌクレオチドを一緒に使用した。反復のタイプによって形成された産物間を識別するために、オリゴヌクレオチドを異なるサイズで合成した：すなわち（ＣＧＧ）₁₁、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄および（ＣＴＧ）₁₇である。上記のオリゴヌクレオチドの４個のそれぞれの熱サイクリング、電気泳動の後、膜を各３０ヌクレオチド長の４個の相補的オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズした。マルチプレックスＲＥＤ試験法の陽性対照として、脆弱×精神発育遅延患者由来のＤＮＡを使用した（図７、レーン１）。産物は９９、１３２、１６５および１９８ｂｐに観察され、（ＣＧＧ）₁₁の倍数の形成と一致した。このオリゴヌクレオチドは、試験された脆弱×患者のＦＭＲ−１遺伝子中に存在する反復配列内の螺旋の一方に相補的である。対照個体１０について、図７、レーン２〜１１に示すが、９９ｂｐに僅かなバンドを認めるにすぎず、正常個体では限定的にしかトライマー形成が起こらないことと一致する（矢印は９９ｂｐ産物を示す）。１５０以上の個体について、ＲＥＤを用いて長大ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＣＣＴ、およびＣＧＴ反復配列の存在の有無を試験した。試験された個体のいずれも、９９ｂｐを超えるＣＣＧ産物を全く示さなかった。ＣＣＴオリゴヌクレオチドを用いて、４個体に１１７、１５６および１９５ｂｐの産物が観察された。ＴＧＧおよびＣＧＴでは、産物は全く見られなかった。全体では、親類関係のない１０個体において、それぞれのゲノム中の長いトリヌクレオチド反復の存在と一致するマルチプルＲＥＤ産物が同定された。これらの反復配列が遺伝的疾患と相関しているか否かについては、更なる解析が必要である。実施例４：ヒト染色体１８上の新規な延長ＣＴＧ反復マルチプル産物を持つ３個体はCentre d'Etude du Polymorphisme Humain（ＣＥＰＨ）の家系の両親であり、遺伝解析が可能であった。単一遺伝子座の遺伝のメンデル則と一致したパターンが３家系のすべてで観察された。図８では、ＣＴＧオリゴヌクレオチドを用いたＲＥＤにより、ＣＥＰＨ家族１３３４が試験された。レーン１には、参考として筋緊張性ジストロフィー患者由来のゲノムＤＮＡが含められている。ＣＥＰＨ家族１３３４の血統をレーン２〜１４の上部に図示し、３０６ｂｐより大きな産物を生ずる個体は黒色に塗ってある（矢印は１０２ｂｐを示す）。はしごは、父親と７人の子供のうちの５人に観察される。最大産物のサイズは同一家族のメンバー内でも変わっていた。例えば、レーン７の男子は４５９ｂｐの最長産物を示すが、レーン８の男子は更に２個の産物を有し、５６１ｂｐに及ぶ。他の２つのＣＥＰＨ家族（１３４４と１４２０）は、長いＣＴＧ反復配列の遺伝を示した（図は示していない）。最長産物のサイズにおける多様性も、これらの家族の両方で観察され、家族１３４４では３０６と３５７ｂｐの間で、家族１４２０では３０６と８１６ｂｐ以上の間で変動した。これらの家族内で分離しているこの長いＣＴＧ反復配列が単一の遺伝子座を表すものか否かを研究するために、連関分析を行った。キャリアは３００ｂｐまたはそれより大きな最長産物を有する個体と定義した。ＣＥＰＨデータベース（バージョン５）中のマーカーに対し、二点連関分析を行った。正のＬＯＤスコアが染色体１８上に位置するマーカーについて見られた。これらの３つの家族の別な遺伝子型の分類を、テトラヌクレオチド反復配列ＭＩＴ−Ｔ３８を用いて実施した。ＭＩＴ−Ｔ３８は、ＮＩＧＭＳヒト／けっ歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネル１を用いて、予め染色体１８にマップされた。このマーカーは３家族すべてにおいて有益であった。２点連関分析は、１０ｃＭにおいて３．４１のＬＯＤスコアを示し、これらの３家族における延長反復配列が実際に染色体１８上にあることを示唆した。ＭＤ−１遺伝子座は、プライマー１０１と１０２でのＰＣＲを用いて、正常なサイズの対立遺伝子が証明されたことから、これらの家族における反復配列延長の部位としては排除された（ブルック、J．D．et al.，Cell ，68：799-808（1992））。均等物当該技術分野における熟練せる者は、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/566 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ハウスマン，デイビットイー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02159 ニュートン，ホーマーストリート 64

Claims

【特許請求の範囲】１．生物試料中のゲノムＤＮＡに存在する延長ヌクレオチド反復配列を検出する方法であって、下記の工程を含む方法：（ａ）生物試料中に含まれるゲノムＤＮＡを供給し、それによって単離されたゲノムＤＮＡを調製し、（ｂ）工程（ａ）で得られたゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ中の検出されるべきヌクレオチド反復配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単純配列反復オリゴヌクレオチドと混合し、それによってゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドの混合物を調製し、（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、単純配列反復オリゴヌクレオチドが単離されたゲノムＤＮＡにアニーリングするのに十分な条件の下に維持し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体を作成し、（ｄ）工程（ｃ）で作成された複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体中でアニーリングされたオリゴヌクレオチドが連結するのに十分な条件の下に維持してアニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーを作成し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を作成し、（ｅ）工程（ｄ）で作成されたマルチマー複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体が変性されるのに十分な条件の下に維持し、それによってアニーリングされたマルチマーをマルチマー複合体から遊離させてアニーリングされていないマルチマーを作成し、そして（ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを繰り返し、検出に十分な数のアニーリングされていないマルチマーを得る工程、これによってアニーリングされていないマルチマーが存在すればゲノムＤＮＡ中に延長ヌクレオチド反復配列が存在することの証拠となる。２．工程が下記の工程をさらに含んでなるものである、請求項１記載の方法：（ｇ）検出し得るマルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｈ）工程（ｇ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜へ電気的に移行させ、（ｉ）検出されるべきマルチマーに相補的な核酸配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｊ）工程（ｈ）で得られた膜と標識化オリゴヌクレオチドプローブを、標識化オリゴヌクレオチドプローブが膜とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、そして（ｋ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドのパターンを可視化させる工程、これによって可視化パターンが得られればマルチマーの存在の証拠となる。３．生物試料中のゲノムＤＮＡに存在する延長ヌクレオチド反復配列を検出する方法であって、下記の工程を含む方法：（ａ）生物試料中に含まれるゲノムＤＮＡを単離し、それによって単離されたゲノムＤＮＡを作成し、（ｂ）工程（ａ）で得られたゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ中の検出されるべきヌクレオチド反復配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単純配列反復オリゴヌクレオチドと混合し、それによってゲノムＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの混合物を作成し、（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を、単純配列反復オリゴヌクレオチドが単離されたゲノムＤＮＡにアニーリングするのに十分な条件の下に維持し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体を作成し、（ｄ）工程（ｃ）で作成された複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体中でアニーリングされたオリゴヌクレオチドが連結するのに十分な条件の下に維持してアニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーを作成し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を作成し、（ｅ）工程（ｄ）で作成されたマルチマー複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体が変性されるのに十分な条件の下に維持し、それによってアニーリングされたマルチマーをマルチマー複合体から遊離させてアニーリングされていないマルチマーを作成し、そして（ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを繰り返し、検出に十分な数のアニーリングされていないマルチマーを得る工程、これによってアニーリングされていないマルチマーが存在すればゲノムＤＮＡ中に延長ヌクレオチド反復配列が存在することの証拠となる。４．方法が下記の工程をさらに含んでなる請求項３記載の方法：（ｇ）検出し得るマルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｈ）工程（ｇ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜へ電気的に移行させ、（ｉ）検出されるべきマルチマーに相補的な核酸配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｊ）工程（ｈ）で得られた膜と標識化オリゴヌクレオチドプローブを、標識化オリゴヌクレオチドプローブが膜とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、そして（ｋ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドのパターンを可視化させる工程、これによって可視化パターンが得られればマルチマーの存在の証拠となる。５．工程（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが放射活性標識で標識化され、そして工程（ｋ）の可視化がオートラジオグラフィーによるものである、請求項４記載の方法。６．放射活性標識が³²Ｐである、請求項５記載の方法。７．工程（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが非放射活性標識で標識されたものである、請求項４記載の方法。８．非放射活性標識がペルオキシダーゼ、ビオチンまたはジゴキシゲニンである請求項７記載の方法。９．工程（ｂ）で供給される単純配列反復オリゴヌクレオチドが蛍光標識剤で標識されたものである請求項３記載の方法。１０．該方法が下記の工程をさらに含んでなるものである請求項９記載の方法：（ｇ）蛍光で標識された検出可能なマルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｈ）蛍光標識オリゴヌクレオチドの存在を蛍光検出スキャナーを用いて検出する工程。１１．生物試料中のゲノムＤＮＡに存在する延長トリヌクレオチド反復配列を検出する方法であって、下記の工程を含む方法：（ａ）生物試料中に含まれるゲノムＤＮＡを単離し、それによって単離されたゲノムＤＮＡを作成し、（ｂ）工程（ａ）で得られたゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ中の検出されるべきヌクレオチド反復配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単純配列反復オリゴヌクレオチドと混合し、それによってゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドの混合物を調製し、（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、単純配列反復オリゴヌクレオチドが単離されたゲノムＤＮＡにアニーリングするのに十分な条件の下に維持し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体を作成し、（ｄ）工程（ｃ）で作成された複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体中でアニーリングされたオリゴヌクレオチドが連結するのに十分な条件の下に維持してアニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーを作成し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を作成し、（ｅ）工程（ｄ）で作成されたマルチマー複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体が変性されるのに十分な条件の下に維持し、それによってアニーリングされたマルチマーをマルチマー複合体から遊離させてアニーリングされていないマルチマーを作成し、そして（ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを繰り返し、検出に十分な数のアニーリングされていないマルチマーを得、（ｇ）検出し得るマルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｈ）工程（ｇ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜へ電気的に移行させ、（ｉ）検出されるべきマルチマーに相補的な核酸配列を有する放射標識化オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｊ）工程（ｈ）で得られた膜と放射標識化オリゴヌクレオチドプローブを、標識化オリゴヌクレオチドプローブが膜とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、そして（ｋ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドのパターンをオートラジオグラフィーにより可視化させる工程、これによって可視化パターンが得られればマルチマーの存在の証拠となる、そしてマルチマーが存在すればゲノムＤＮＡ中に延長トリヌクレオチド反復配列が存在することの証拠となる。１２．放射活性標識が³²Ｐである請求項１１記載の方法。１３．工程（ｂ）で供給された単純配列反復オリゴヌクレオチドが（ＣＧＧ）₁₁ 、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄および（ＣＴＧ）₁₇からなる群より選択される１種以上であり、そして工程（ｉ）の標識化オリゴヌクレオチドプローブが（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀および（ＣＡＧ）₁₀からなる群より選択される１種以上である、請求項１１記載の方法。１４．生物試料中のゲノムＤＮＡに存在する部位特異的延長ヌクレオチド反復配列を検出する方法であって、下記の工程を含む方法：（ａ）生物試料中に含まれるゲノムＤＮＡを単離し、それによって単離されたゲノムＤＮＡを調製し、（ｂ）工程（ａ）で得られたゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ中の検出されるべきヌクレオチド反復配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単純配列反復オリゴヌクレオチドおよびゲノムＤＮＡ上の特定部位のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドと混合し、それによってゲノムＤＮＡ、単純配列反復オリゴヌクレオチドおよび部位特異的オリゴヌクレオチドの混合物を調製し、（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、単純配列反復オリゴヌクレオチドおよび部位特異的オリゴヌクレオチドが単離されたゲノムＤＮＡにアニーリングするのに十分な条件の下に維持し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的オリゴヌクレオチド複合体を作成し、（ｄ）工程（ｃ）で作成された複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的オリゴヌクレオチド複合体中でアニーリングされたオリゴヌクレオチドが連結するのに十分な条件の下に維持してアニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーを作成し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的マルチマー複合体を作成し、（ｅ）工程（ｄ）で作成されたマルチマー複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的マルチマー複合体が変性されるのに十分な条件の下に維持し、それによってアニーリングされた部位特異的マルチマーをマルチマー複合体から遊離させてアニーリングされていない部位特異的マルチマーを作成し、そして（ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを繰り返し、検出に十分な数のアニーリングされていない部位特異的マルチマーを得る工程、これによってアニーリングされていない部位特異的マルチマーが存在すればゲノムＤＮＡ中の特異的部位に位置する延長ヌクレオチド反復配列が存在することの証拠となる。１５．該方法が下記の工程をさらに含んでなるものである請求項１４記載の方法：（ｇ）検出し得る部位特異的マルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｈ）工程（ｇ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜へ電気的に移行させ、（ｉ）検出されるべき部位特異的マルチマーに相補的な核酸配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｊ）工程（ｈ）で得られた膜と標識化オリゴヌクレオチドプローブを、標識化オリゴヌクレオチドプローブが膜とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、そして（ｋ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドのパターンを可視化させる工程、これによって可視化パターンが得られれば部位特異的マルチマーの存在の証拠となる。１６．工程（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが放射活性標識で標識され、そして可視化工程（ｋ）がオートラジオグラフィーによるものである、請求項１５記載の方法。１７．放射活性標識が³²Ｐである請求項１６記載の方法。１８．工程（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが非放射活性標識で標識されたものである請求項１５記載の方法。１９．該非放射活性標識がペルオキシダーゼ、ビオチンまたはジゴキシゲニンである請求項１８記載の方法。２０．工程（ｂ）で供給される単純配列反復オリゴヌクレオチドが蛍光標識剤で標識されたものである、請求項１４記載の方法。２１．該方法が下記の工程をさらに含んでなる請求項２０記載の方法：（ｇ）蛍光標識剤で標識された検出し得るマルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｈ）蛍光検出スキャナーを用いて蛍光標識オリゴヌクレオチドの存在を検出する工程。２２．下記の工程をさらに含んでなる請求項１４記載の方法：（ｇ）直線ＰＣＲおよびプライマーを用いて部位特異的マルチマーを増幅し、（ｈ）増幅された部位特異的マルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｉ）工程（ｈ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜へ電気的に移行させ、（ｊ）検出されるべき部位特異的マルチマーに相補的な核酸配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｋ）工程（ｉ）で得られた膜と標識化オリゴヌクレオチドプローブを、標識化オリゴヌクレオチドプローブが膜とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、そして（ｌ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドのパターンを可視化させる工程、これによって可視化パターンが得られれば部位特異的マルチマーの存在の証拠となる。２３．工程（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが放射活性標識で標識され、そして可視化工程（ｌ）がオートラジオグラフィーによるものである、請求項２２記載の方法。２４．放射活性標識が³²Ｐである請求項２３記載の方法。２５．工程（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光標識剤で標識され、そして可視化工程（ｌ）が蛍光標識プライマーの存在を蛍光検出スキャナーを用いて検出することによるものである、請求項２２記載の方法。２６．生物試料中のゲノムＤＮＡに存在する延長トリヌクレオチド反復配列を検出する方法であって、下記の工程を含んでなる方法：（ａ）生物試料中に含まれるゲノムＤＮＡを単離し、それによって単離されたゲノムＤＮＡを調製し、（ｂ）工程（ａ）で得られたゲノムＤＮＡを異なるタイプの単純配列反復オリゴヌクレオチド類と混合し、その各タイプのオリゴヌクレオチドはゲノムＤＮＡ中の検出されるべきヌクレオチド反復配列に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、それによってゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドとの混合物を作成し、（ｃ）工程（ｂ）の混合物を異なるタイプの単純配列反復オリゴヌクレオチド類が単離されたゲノムＤＮＡにアニーリングするのに十分な条件下に維持し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体を作成し、（ｄ）工程（ｃ）の複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされたオリゴヌクレオチド複合体中でアニーリングされたオリゴヌクレオチドが連結されるのに十分な条件下に維持してアニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーを作成し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされたマルチマー複合体を作成し、（ｅ）工程（ｄ）のマルチマー複合体を、ゲノムＤＮＡ／マルチマー複合体が変性するのに十分な条件下に維持し、それによってアニーリングされたマルチマーを遊離させ、そしてアニーリングされていないマルチマーを作成し、（ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを繰り返して検出に十分な数のアニーリングされていないマルチマーを得、（ｇ）検出可能なマルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサイズに基づき分離し、（ｈ）工程（ｇ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜へ電気的に移行させ、（ｉ）検出されるべきマルチマーに相補的な核酸配列を有する放射標識オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｊ）この放射標識オリゴヌクレオチドプローブを、放射標識オリゴヌクレオチドプローブが膜とハイブリダイズするのに十分な条件下に、工程（ｈ）の膜と接触させ、そして（ｋ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドをオートラジオグラフィーによって可視化する工程、これにより可視化されたパターンが得られればアニーリングされていないマルチマーの存在の証拠となり、そしてマルチマーの存在はゲノムＤＮＡ中に延長トリヌクレオチド反復配列が存在する証拠となる。２７．該放射活性標識が³²Ｐである請求項２６記載の方法。２８．工程（ｂ）で供給された単純配列反復オリゴヌクレオチドが（ＣＧＧ）₁₁ 、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄および（ＣＴＧ）₁₇からなる群より選択される１種以上であり、そして工程（ｉ）の標識化オリゴヌクレオチドプローブが（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀および（ＣＡＧ）₁₀からなる群より選択される１種以上である、請求項２６記載の方法。２９．個体のゲノムＤＮＡ中の延長ヌクレオチド反復配列を検出することにより、個体中における病的状態になる可能性のある状態または病的状態（pathologic al condition）を診断する方法であって、下記の工程を含んでなる方法：（ａ）生物試料中に含まれるゲノムＤＮＡを単離し、それによって単離されたゲノムＤＮＡを調製し、（ｂ）工程（ａ）で得られたゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ中の検出すべきヌクレオチド反復配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単純配列反復オリゴヌクレオチドおよびゲノムＤＮＡ上に位置する特異的部位に相補的なヌクレオチド配列と混合し、それによってＤＮＡ、単純配列反復オリゴヌクレオチドおよび部位特異的オリゴヌクレオチドの混合物を作成し、（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を、単純配列反復オリゴヌクレオチドおよび部位特異的オリゴヌクレオチドが単離されたゲノムＤＮＡにアニーリングするのに十分な条件下に維持し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的オリゴヌクレオチド複合体を作成し、（ｄ）工程（ｃ）で得られた複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的オリゴヌクレオチド複合体中でアニーリングされたオリゴヌクレオチドが連結されるのに十分な条件下に維持してアニーリングされたオリゴヌクレオチドのマルチマーを作成し、それによってゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的マルチマー複合体を作成し、（ｅ）工程（ｄ）で得られたマルチマー複合体を、ゲノムＤＮＡ／アニーリングされた部位特異的マルチマー複合体を変性させるのに十分な条件下に維持し、それによってアニーリングされた部位特異的マルチマーを遊離させ、そしてアニーリングされていない部位特異的マルチマーを作成し、（ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを繰り返して検出に十分な数のアニーリングされていない部位特異的マルチマーを得、（ｇ）直線ＰＣＲおよびプライマーを用いて部位特異的マルチマーを増幅し、（ｈ）増幅された部位特異的マルチマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに基づき分離し、（ｉ）工程（ｈ）で得られたゲルをハイブリダイゼーションに適する膜に電気的に移行させ、（ｊ）検出すべき部位特異的マルチマーに相補的な核酸配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを供給し、（ｋ）該標識化オリゴヌクレオチドプローブを、標識化オリゴヌクレオチドプローブが工程（ｉ）の膜にハイブリダイズするのに十分な条件下で該膜と接触させ、（ｌ）膜にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドのパターンを可視化する工程、これにより可視化されたパターンが得られれば部位特異的マルチマーが存在することの証拠となる。３０．工程（ｇ）のオリゴヌクレオチドプローブが放射活性標識で標識され、そして可視化工程（ｌ）がオートラジオグラフィーによるものである請求項２９記載の方法。３１．放射標識が³²Ｐである請求項３０記載の方法。３２．個体のゲノムＤＮＡ中の延長ヌクレオチド反復配列を検出することにより、個体の病的状態になる可能性のある状態または病的状態を診断するためのキットであって、下記のものを含むキット：（ａ）既知の延長ヌクレオチド反復配列からなるゲノムＤＮＡを入れた容器、（ｂ）単純配列反復オリゴヌクレオチドを入れた容器、（ｃ）標識化オリゴヌクレオチドプローブを入れた容器、（ｄ）ＤＮＡリガーゼ酵素を入れた容器、および（ｅ）ＤＮＡリガーゼ緩衝液を入れた容器。３３．個体のゲノムＤＮＡ中の延長ヌクレオチド反復配列を検出することにより、個体の病的状態になる可能性のある状態または病的状態を診断するためのキットであって、下記のものを含むキット：（ａ）既知の延長ヌクレオチド反復配列からなるゲノムＤＮＡを入れた容器、（ｂ）（ＣＧＧ）₁₁、（ＴＧＧ）₁₂、（ＣＣＴ）₁₃、（ＣＧＴ）₁₄および（ＣＴＧ）₁₇からなる群より選択される単純配列反復オリゴヌクレオチドの１種以上を入れた容器、（ｃ）（ＣＣＧ）₁₀、（ＣＣＡ）₁₀、（ＡＧＧ）₁₀、（ＡＣＧ）₁₀および（ＣＡＧ）₁₀からなる群より選択される標識化オリゴヌクレオチドプローブの１種以上を入れた容器、（ｄ）ＤＮＡリガーゼ酵素を入れた容器、および（ｅ）ＤＮＡリガーゼ緩衝液を入れた容器。３４．標識化オリゴヌクレオチドプローブが³²Ｐで標識されたものである請求項３３記載のキット。３５．標識化オリゴヌクレオチドプローブが蛍光標識剤で標識されたものである請求項３４記載のキット。