JPH08510911A

JPH08510911A - 遺伝子治療に適するプラスミド

Info

Publication number: JPH08510911A
Application number: JP7501015A
Authority: JP
Inventors: ネイベル，ゲイリー，ジェイ．; ネイベル，エリザベス，ジー．; ルー，デニス; マークェット，マグダ
Original assignee: バイカルインコーポレイテッド; リージェンツオブザユニバーシティオブミシガン
Priority date: 1993-06-07
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1996-11-19
Anticipated expiration: 2020-03-02
Also published as: DE69434447D1; EP0702722A1; ATE301201T1; US5910488A; CA2164088C; EP0702722B1; WO1994029469A2; CA2164088A1; JP3626187B2; DE69434447T2; WO1994029469A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物の組織または細胞に、１つ以上の免疫原性または治療性のペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を導入するのに適合したベクターおよびその関連方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子治療に適するプラスミド発明の分野本発明は遺伝子治療に適するプラスミドおよびその関連方法に関する。発明の背景ヒトのガンにおいて、新生物転換および悪性腫瘍に関与する種々の遺伝子異常が起こる。ゲノムの不安定性によって、細胞の増殖、血管新生、転移および腫瘍免疫原性を変化させる変異が生じる。ガンの分子レベルでの理解が進んでいるとはいえ、多くの悪性腫瘍は、伝統的な形態の治療に対し抵抗性のままである。しかし、腫瘍関連遺伝子変異の特定は、遺伝子治療のターゲットとして、ガンにおいて重要性が増している。免疫療法は、悪性腫瘍の治療に基本的な方法として見込みがある。実際、黒色腫、腎細胞ガン腫などの特定のガンは、おそらく、免疫系がこれらの細胞の変異遺伝子産物を認識するよう誘導されるため、免疫機能の変化に比較的よく反応する。従来、免疫療法の方法は、動物モデル（B．Zbar，e tal.,J.Natl.Canc.Inst.46,831(1971)、Rosenberg,et al.,J.Exp.Med.16,1169(1 985)、S.ShuおよびS.A.Rosenberg,Cancer Res.45,1657(1985)、P.J.Spiess,et a l.,J.Natl.Canc.Inst.79,1067、T.Chou,et al.,J.Immunol.140,2453(1988)、H.Y oshizawa,etal.,J.Immunol.147,729(1991)）およびヒト（D.L.Morton,et al.,An n.Surg.180,635(1974)、S.A.Rosenberg,et al.，Ann.Surg.210,474(1989)、S.A. Rosenberg,et al.,N.Eng.J.Med.319,1676(1988)、R.L.Kradin,et al.,Lancet 57 7(1989)）で可能性の示されたバチルスカルメット−ゲラン菌(ＢＣＧ、Bacillus Calmette-Guerin)、サイトキニン、および／または、獲得Ｔ細胞導入(transfe r)のような非特異的免疫調節剤の投与によるものであった。さらに最近、分子遺伝学的干渉法が、免疫療法の効率を上げるため開発されている。ヒト遺伝子導入プロトコルが、リンパ球の黒色腫への移動量をモニターするため（S.A.Rosenber g,et al.,N.Eng.J.Med.323,570(1990))または残存腫瘍に対する宿主の免疫応答を刺激するため（S.A.Rosenberg,Hum.Gene Ther.3,57(1992)）に開発されている。最近、新たな分子遺伝学的干渉法がヒト悪性腫瘍に対して開発されている。この方法は、生体内(in vivo)の確立した腫瘍に組換え遺伝子を直接伝達し、それらがその場(in situ)で成長するように遺伝的に改変することに基づいている。動物モデルでは、生体内(in vivo)での外来主要組織適合（MHC）タンパク質（クラスＩ）をコードする遺伝子の導入により、免疫系に信号が伝わり、外来抗原に応答する（G.E.Plautz,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,4645(1993)、E.G.Nab el,et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA,89,5157(1992)）。より重要なことには、この遺伝子が生体内(in vivo)の確立された腫瘍に導入される場合、細胞溶解Ｔ細胞応答も非改変腫瘍細胞に対して生じる。ネズミのモデルで、この方法は、腫瘍成長を有意に減少させ、ある場合には完全に鎮静させている（G.E.Plautz,et al .,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,4645(1993)）。これらの実験に基づいて、悪性腫瘍の治療のためにヒト移植抗原の直接導入を用いるヒト臨床プロトコルを行う許可が、国立衛生研究所の組換えＤＮＡ諮問委員会から最近得られた。このプロトコルは、ヒトにおいて直接的遺伝子導入を行い、ウイルス性ベクターに関するいくつかの安全性の問題点を減らした非ウイルス性ベクターを利用することを提案した。この臨床試験は、皮下病変の転移性黒色腫を有する患者の治療に関するものであった。治療は、カチオン性リポソームであるDC−コレステロールと複合体化したヒトクラスＩMHC遺伝子であるHLA-B7の腫瘍内注射であった（G.J.Nabel,H um.Gene Ther.3,705(1992)、X.GaoおよびL.Huang,Biochem.Biophys.Res.Commun. 179,280(1991)）。患者には、段階的に増加する用量のＤＮＡリポソーム複合体が与えられた。組換え遺伝子発現、毒性および治療に対する免疫応答が評価されている。動物実験では、短期および長期の研究において、この方法の生体内(in vivo)直接遺伝子導入の使用に、毒性は認められなかった（G.J.Nabel,Hum.Gene Ther.3,399(1992)、G.J.Nabel,Hum.Gene Ther.3,705(1992)、M.J.Stewart,et al .,Hum.Gene Ther.3,267(1992)）。まとめて考えると、これらの研究は、直接遺伝子導入が悪性腫瘍の治療の適切な形態であるか否かを決定することが目的であった。直接遺伝子導入および免疫系の調節生体内(in vivo)でのカテーテルによる遺伝子デリバリーを利用することにより、組換え遺伝子含有分子を生体内(in vivo)で特定の場所に導入するためのモデル系が提供された。初期の研究は、特定のレポーター遺伝子が生体内(in vivo)で発現できることを証明することに集中した（E.G.Nabel,et al.,Science 249,1285( 1990)、E.G.Nabel,et al.,Science 244,1342(1989)）。その後の研究は、特定の生物学的応答が組換え遺伝子導入の部位で誘発されるか否かを決定するために計画された。この問題に関し、高免疫原性分子である外来主要組織適合複合体（MH C）が、ブタのモデルを用いて、腸骨大腿骨動脈において免疫応答を誘発させるために使用された。ヒトHLA-B7遺伝子が、レトロウイルスベクターまたはＤＮＡリポソーム複合体による直接遺伝子導入を用いて導入された（E.G.Nabel,et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5157(1992)）。いずれのデリバリー系でも、組換えHLA-B7遺伝子産物の発現が、管壁の特定の部位で証明することができた。より重要には、この外来主要組織適合抗原の発現が、遺伝子的改変の部位で免疫応答を誘発した。この応答は、組換え遺伝子の導入後１０日で始まる、肉芽腫単核細胞の浸潤を含んでいた。この応答は、遺伝子導入後７５日で消失したが、HLA-B7 分子に対する特異的細胞溶解Ｔ細胞応答は永続性であった。この研究により、特異的免疫応答を、生体内(in vivo)の特定部位での外来組換え遺伝子の導入によって誘発できることが示された。さらに、この研究は、特定の組換え遺伝子の直接遺伝子導入が、生体内(in vivo)でその遺伝子の産物に対する免疫応答を誘発できることを示す最初のものの一つであった（E.G.Nabel,et al.,Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 89,5157(1992)）。これらの研究により、適切な組換え遺伝子の導入が、生体内(in vivo)でその産物を認識する免疫系を刺激するのに使用できることが示唆された。さらに、この方法により、生体内(in vivo)の特定部位での誘発の一般的方法が提供された。直接遺伝子導入が疾患の治療に適切であるか否か評価するため、悪性腫瘍のネズミモデルが開発された。アロジェネイテック組織適合複合体遺伝子のネズミ腫瘍への直接遺伝子導入が、外来MHCタンパク質だけでなくそれまで認識されなかった腫瘍関連抗原にも免疫応答を誘発することが見い出された。これらの免疫応答はＴ細胞依存性であり、これらの腫瘍関連タンパク質は自己主要組織適合複合体に関係して認識された。特定のMHCハプロタイプに対して予備感作させた動物において、株化された腫瘍への直接遺伝子導入が、腫瘍成長を減少させ、ある場合には、完全な腫瘍退行を導くことができた（G.E.Plautz,et al.,Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 90,4645(1993)）。これらの研究により、外来MHC遺伝子の腫瘍への直接遺伝子導入が、悪性腫瘍の治療に適切である可能性のある治療効果を潜在的に有することが示された。悪性腫瘍の免疫療法一部の例では、免疫系が、細胞性または体液性免疫エフェクターの動員(mobil ization)により新生細胞のサーベイランスおよび破壊に関係するようである。抗腫瘍活性の細胞メディエーターには、MHC拘束細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞（R.K.Oldham,Canc.Metast.Rev.2,323(1983)、R.B.Herberman，Conce pts Immunopathol.1,96(1985)）およびリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞（S. A.Rosenberg,Immunol.Today 9,58(1988)）がある。腫瘍に浸潤する細胞溶解Ｔ細胞が単離され、特徴が明らかにされている（I.Yron,et al.,J.Immunol.125,238( 1980)）。これらの腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)は、それらが由来する腫瘍の細胞を選択的に溶解させる（P.J.Spiess,et al.,J.Natl.Canc.Inst.79,1067、S.A.Rose nberg,et al.,Science 223,1318(1986)）。マクロファージも、抗体依存性機構（J.MarcellettiおよびP.Furmanski,J.Immunol.120,1(1978)、P.Ralph,et al.,J .Exp.Med.167,712(1988)）、または、ＢＣＧのような物質によって誘発される活性化（P.Alexander,Natl.Cancer Inst.Monogr.39,127(1973)）により新生細胞を殺すことができる。サイトカインもまた、細胞成長への直接作用または細胞性免疫の活性化により、抗腫瘍応答に関与し得る。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（L.J.Old,Scienc e 230,630(1985)）およびリンホトキシン（M.B.Powell,et al.,Lymphokin Res.4 ,13(1985)）の細胞分裂抑制効果は新生細胞死を起こし得る。インターフェロン −γ（ＩＦＮ−γ）は、クラスＩMHC細胞表面発現を著しく増大させ（P.Lindahl ,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70,2785(1973)、P.Lindahl,et al.,Proc.Natl .Acad.Sci.USA 73,1284(1976)）、そして、その効果にはＴＮＦ−αとの相乗作用がある（L.J.Old,Nature 326,330(1987)）。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子は、好中球およびマクロファージを活性化し、腫瘍細胞を直接的に溶解させ（S.C.ClarkおよびR.Kamen,Sicence 236,1229(1987)）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）はLeu-19+NK細胞を活性化し、オートロガス、シンジェネイックまたはアロジェネイック腫瘍細胞を溶解させることができるが、正常細胞を溶解させないリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）を産生させる（S.A.Rose nberg,Immunol.Today 9,58(1988)、M.T.Lotze,et al.,Cancer Res.41,4420(1981 )、C.S.Johnson,et al.,Cancer Res.50,5682(1990)）。ＬＡＫ細胞は、予備感作またはMHC拘束なしに腫瘍細胞を溶解させる（J.H.PhillipsおよびL.L.Lanier,J. Exp.Med.164,814(1986)）。インターロイキン−４（ＩＬ−４）はまた、ＬＡＫ細胞を産生させ、腫瘍特異的キラー細胞の産生においてＩＬ−２と相乗的に作用する（J.J.Mule,et al.,J.Immunol.142,726(1989)）。ほとんどの悪性腫瘍は免疫能宿主で生じるので、おそらく、継承的に免疫原性の低いクローンの生成により、腫瘍細胞は宿主の防御を逃れる機構を発達させていると考えられる（G.KleinおよびE.Klein,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,2121(19 77)）。いくつかの研究により、MHC分子の発現の減少が、免疫系による検出から逃れる機構を提供する可能性が示唆されている。通常、クラスＩMHC糖タンパク質が多くの組織で高度に発現しており、β−２ミクログロブリンと関連して、CD 8／Ｔ細胞レセプター複合体との特異的相互作用によりCD8陽性Ｔ細胞に、内生的に合成されたペプチドフラグメントを提示する（P.J.BjorkmanおよびP.Parham,A nn.Rev.Biochem.59,253(1990)）。クラスＩMHC分子の発現の欠損は、腫瘍細胞の、抗原を細胞毒性Ｔ細胞に提示する能力を制限するであろう。天然存在腫瘍から単離されたばかりの細胞は、度々、クラスＩMHC抗原を完全に欠いているかまたは発現が減少している（C.A.Holden,et al.,J.Am.Acad.Dematol.9,867(1983)、N .Isakov,et al.,J.Natl.Canc.Inst.71,139(1983)、W.Schmidt,et al.,Immunogen .14,323(1981)、K.Funa,et al.,Lab Invest.55,185(1986)、L.A.Lampson,et al. ,J.Immunol.130,2471(1983)）。クラスＩMHC発現の減少は、また、これらの腫瘍の増殖を、シンジェネイック受容者に移植したときに促進する。クラスＩMHCタンパク質のレベルが低いいくつかの腫瘍細胞系は、関連するクラスＩMHC抗原をコードする発現ベクターを導入したときに発ガン性が低くなる（K.Tanaka,et al .,Science 228,26(1985)、K.Hui,et al.,Nature 311,750(1984)、R.Wallich,et al.,Nature 315,301(1985)、H-G.LjunggrenおよびK.Karre,J.Immunogenet. 13,141(1986)、G.J.Hammerling,et al.,J.Immunogent.13,153(1986)）。いくつかの実験では、クラスＩMHC遺伝子を発現する腫瘍細胞が、親腫瘍にさらされたことのない受容者における免疫を与えている（K.HuiおよびF.Grosve1d,H.Festen stein,Nature 311,750(1984)、R.Wallich,et al.,Nature 315,301(1985)）。しかし、クラスＩMHC発現の絶対的レベルは、腫瘍細胞の腫瘍原性または免疫原性に影響する唯一の因子ではない。一つの研究では、５−アザシチジンで処理され、クラスＩMHC発現のレベルの上昇で選択されたマウスの乳腺ガン細胞は、親系に比較して腫瘍原性の変化を示さなかった（D.A.Carlow,et al.,J.Natl.Canc.In st.81,759(1989)）。腫瘍細胞に対する免疫応答は、ＩＬ−２の全身投与（M.T.Lotze,et al.,J.Imm unol.135,2865(1985)）、または、ＩＬ−２とLAK細胞の全身投与（S.A.Rosenber g,et al.,N.Eng.J.Med.316,889(1987)、C.S.Johnson,et al.,Leukemia 3,91(198 9)）によって刺激され得る。腫瘍浸潤リンパ球を用いた臨床試験も進行している（S.A.Rosenberg,et al.,N.Eng.J.Med.323,570(1990)）。最近、いくつかの研究で、遺伝子的に改変した腫瘍細胞を用いてリンホカイン生成の腫瘍抑制効果が試験された。ＩＬ−２発現ベクターにトランスフェクトさせた腫瘍をシンジェネイックマウスに導入することにより、親腫瘍細胞系によるその後の再攻撃を防御するMHCクラスＩ拘束細胞溶解Ｔリンパ球応答が刺激された（E.R.Fearon,et al.,C ell 60,397(1990)）。形質細胞腫または乳腺ガン細胞によるＩＬ−４の発現は、好酸球およびマクロファージの浸潤によって媒介される潜在的な抗腫瘍効果を誘導した（R.I.Tepper,et al.,Cell 57,503(1989)）。これらの研究は、局所的に高濃度で発現したサイトカインが有効な抗腫瘍剤であることを証明する。最近、アロジェネイッククラスＩMHC遺伝子を株化したヒト腫瘍に導入することにより抗腫瘍応答を刺激する別の方法が提案されている（上出）。腫瘍細胞の抗原性は、以前は、腫瘍細胞のインフェクションによるウイルス抗原の発現（J. LindenmannおよびP.A.Klein,J.Exp.Med.126,93(1967)、Y.Shimizu,et al.,Eur.J .Immunol.14,839(1984)、H.Yamaguchi,et al.,Cancer Immunol.Immunother.12,1 19(1982)、M.Hosokama,Cancer Res.43,2301(1983)、V.ShirrmacherおよびR.Heic appell,Clin.Exp.Metastasis 5,147(1987)）、または、体細胞雑種形成により導入されたアロジェネイック抗原の発現（J.F.WatkinsおよびL.Chen,Nature 223,1 018(1969)、N.Kuzumaki,et al.,Eur.J.Cancer.15,1253(1979)）により変化させられている。アロジェネイッククラスＩMHC遺伝子が、試験管内(in vitro)でトランスフェクションとその後の選択により腫瘍細胞に導入されている。これらの実験では、いくつかの矛盾する結果が得られた。一つの例は、アロジェネイテッククラスＩMHC遺伝子（H-2L^d）をH-2^b腫瘍にトランスフェクションすることにより、導入した細胞の免疫拒絶をもたらし、親腫瘍細胞に対する移植抵抗も生じさせた（T.Itaya,et al.,Cancer Res.47,3136(1987)）。別の例では、H-2D^d遺伝子によるH-2^b黒色腫のトランスフェクションで拒絶が起こらなかった（J.E.Talmad ge,et al.,Proc.Amer.Assoc.for Cancer Res.26,59(1985)）。しかし、H-2D産物のH-2Kに対する差次的発現の増加により、腫瘍の転移可能性および免疫原性が影響される（J.Gopas,et al.,Adv.Cancer Res,53,89(1989)）。腫瘍細胞におけるアロジェネイテックH-2K遺伝子発現の効果は別の研究で試験された（G.A.Cole,e t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,8613(1987)）。試験管内(in vitro)で選択され、アロジェネイテック遺伝子を発現したいくつかのサブクローンが、親腫瘍系に対しシンジェネイテックなマウスで拒絶されたが、他のクローンは、腫瘍の生成に関して、形質導入をしていない親の系と異ならなかった。この知見から、生体内(in vivo)増殖および腫瘍生成能におけるクローン毎のばらつきにより、トランスフェクションおよびその後のサブクローニング処理で引き起こされ、腫瘍原性に影響を与える腫瘍の他の改変が生じ得ることが示唆される。この種のクローンの相違は、生体内(in vivo)で細胞の集団に直接形質導入することにより最小にすることができる。遺伝子療法免疫系はガンに対する防御を与えることができ、そして、悪性腫瘍のアジュバント治療において重要な役割を果たしている可能性がある。リンホカイン活性化キラー細胞（LAK）および腫瘍浸潤リンパ球（TIL）は、新生細胞を溶解させ、部分的ないし完全な腫瘍の拒絶を生じさせることができる。悪性腫瘍細胞におけるサイトカイン遺伝子の発現は、また、腫瘍の退行を促進する。腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激するという現在の計画は、しばしば、腫瘍を根治できないので、免疫療法の重要な目的は、現在の技術を改善し、免疫認識の機構を理解することである。ＤＮＡ／リポソームトランスフェクションにより生体内(in vivo)でヒト腫瘍に導入された、移植抗原であるアロジェネイッククラスＩ主要組織適合複合体（ MHC）抗原をコードする遺伝子を用いる悪性腫瘍の免疫療法のモデルが記載されている（G.J.Nabel,Hum.Gene Ther.3,399(1992)、G.J.Nabel,Hum.Gene Ther.3,7 05(1992)）。腫瘍細胞上でのアロジェネイックMHC抗原の発現は、形質導入された細胞のアロジェネイックMHC遺伝子および非改変腫瘍細胞の以前には認識されなかった抗原に対する免疫を刺激する（G.E.Plautz,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci .USA 90,4645(1993)）。アロジェネイックMHC遺伝子の、体内(in vivo)での腫瘍細胞への直接導入は、部分的腫瘍退行、および、他の抗原に対する特異的細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発した。最近のヒトでの試験では、この形態の治療に毒性は認められなかった。本発明の目的は、この遺伝子治療を最適化することである。発明の概要本発明は、生物の組織または細胞に、１つ以上の免疫原性または治療性ペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を導入するのに適合した、１つ以上のシストロンとバックボーンを含むベクターであって、バックボーンは、pBR322由来の複製開始点、抗生物質耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝物質、CMVまたはRSV LTRまたはRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来である、シストロンに調節可能に結合したプロモーター、および、ウシ成長ホルモン遺伝子またはSV40またはSV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来である、シストロンの発現を促進するポリアデニル化シグナルを含み、さらに、バックボーンは、任意に、EMCウイルス由来である、シストロンのメッセージの翻訳を促進するリボソーム結合部位、シストロンの発現を促進する翻訳開始配列、および、シストロンの転写物のスプライシングを促進する遺伝物質の１つ以上を含むことを特徴とする、ベクターを提供する。本ベクターでは、スプライシングを促進する遺伝物質が、SV40またはSV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来でもよい。本ベクターでは、ペプチドが、組織または細胞に対するＴ細胞免疫を刺激してもよい。ペプチドは、クラスＩ主要組織適合複合体(MHC)抗原、β−２ミクログロブリンまたはサイトカインを含んでもよい。MHC抗原は生物に対し外来(foreig n)のものでもよい。MHC抗原はHLA-B7でもよい。本ベクターでは、HLA-B7をコードするＤＮＡが、HLA-B7に本来あるイントロンを欠失していてもよい。本ベクターは配列番号１のヌクレオチド配列を有してもよい。本ベクターは配列番号２のヌクレオチド配列を有してもよい。本ベクターでは、導入は試験管(in vitro)で起こってもよい。導入は生体内(i nvivo)で起こってもよい。生体内導入はカテーテルによって行われてもよい。本ベクターでは、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、プロモーターが、RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSVLTR 由来であり、ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本ベクターは、複製開始点、選択マーカーをコードする遺伝物質、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、および、翻訳開始配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を有していてもよい。本ベクターは、ポリシストロン性転写単位に組織された複数のシストロンを有し、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、ポリシストロン性転写単位に制御可能に結合したプロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、ポリシストロン性転写単位のプロセッシングを促進するポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本ベクターは、ビシストロン性転写単位に組織された２つのシストロンを有し、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、ビシストロン性転写単位に制御可能に結合したプロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、ビシストロン性転写単位のプロセッシングを促進するポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本ベクターは、１つのシストロンを有し、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、シストロンに制御可能に結合したプロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、シストロンの発現を促進するポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本発明は、また、上記のベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。本医薬組成物では、ベクターを導入促進ビヒクルと組み合わせてもよい。ビヒクルはトランスフェクション促進カチオン性脂質組成物を含んでもよい。カチオン性脂質組成物はDMRIE-DOPEであってもよい。DMRIE-DOPEは５：５のモル比を有してもよい。ビヒクルは感染促進ウイルス性ベクターを含んでもよい。本発明は、さらに、ベクターを生物の組織または細胞に導入することを含む、Ｔ細胞免疫の刺激に応答性であることにより特徴づけられる生物の疾患を治療する方法であって、ベクターが、組織または細胞に対するＴ細胞免疫を刺激する１つ以上のペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を含み、ペプチドが発現して疾患の治療となる、方法を提供する。本方法においては、疾患は腫瘍疾患であってもよい。腫瘍疾患は黒色腫癌であってもよい。ベクターは上記のベクターのいずれを含んでもよい。導入は試験管内(in vitro)で起こってもよい。導入は生体内(in vivo)で起こってもよい。生体内導入がカテーテルにより行われてもよい。本方法では、ベクターは導入促進ビヒクルと組み合わされてもよい。ビヒクルはトランスフェクション促進カチオン性脂質組成物を含んでもよい。カチオン性脂質組成物はDMRIE-DOPEであってもよい。DMRIE-DOPEは５：５のモル比を有してもよい。ビヒクルは感染促進ウイルス性ベクターであってもよい。本発明は、また、さらに、生物の組織または細胞に、１つ以上の免疫原性または治療性ペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を導入するのに適合したＤＮＡカセットであって、pBR322由来の複製開始点、抗生物質耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝物質、CMVまたはRSV LTRまたはRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来である、シストロンに制御可能に結合したプロモーター、および、ウシ成長ホルモン遺伝子またはSV40またはSV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来である、シストロンの発現を促進するポリアデニル化シグナルを含み、さらに、任意に、EMCウイルス由来である、シストロンのメッセージの翻訳を促進するリボソーム結合部位、シストロンの発現を促進する翻訳開始配列、および、シストロンの転写物のスプライシングを促進する遺伝物質の１つ以上を含むことを特徴とするＤＮＡカセットを提供する。本ＤＮＡカセットでは、スプライシングを促進する遺伝物質が、SV40またはSV 40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てを欠失しているSV40 であってもよい。本ＤＮＡカセットでは、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、プロモーターが、RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異している RSV LTR由来であり、ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本ＤＮＡカセットは、複製開始点、選択マーカーをコードする遺伝物質、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、および、翻訳開始配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を有してもよい。本ＤＮＡカセットは、ポリシストロン性転写単位に組織された複数のシストロンを有し、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、ポリシストロン性転写単位に制御可能に結合したプロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、ポリシストロン性転写単位のプロセッシングを促進するポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本ＤＮＡカセットは、ビシストロン性転写単位に組織された２つのシストロンを有し、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、ビシストロン性転写単位に制御可能に結合したプロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、ビシストロン性転写単位のプロセッシングを促進するポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。本ＤＮＡカセットは、１つのシストロンを有し、選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、シストロンに制御可能に結合したプロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、シストロンの発現を促進するポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来であってもよい。さらに、本発明は、宿主生物と、pBR322由来の複製開始点、抗生物質耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝物質、ポリシストロン性、ビシストロン性またはユニシストロン性転写単位に組織された１つ以上のシストロン、CMV、RSV L TRまたはRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来である、転写単位に制御可能に結合したプロモーター、および、ウシ成長ホルモン遺伝子またはSV40またはSV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来である、転写単位のプロセッシングを促進するポリアデニル化シグナルを有する遺伝構築物とを含み、そして、任意に、EMCウイルス由来である、転写単位の内部のシストロンのメッセージの翻訳を促進するリボゾーム結合部位、シストロンの発現を促進する翻訳開始配列、および、シストロンの転写物のスプライシングを促進するイントロン配列の１つ以上を含む組換え発現系を提供する。本組換え発現系では、宿主生物がヒトであってもよい。好ましい実施態様の説明本発明は、悪性腫瘍を治療するためのヒト移植抗原の導入に関する。本発明は、(1)生体内(in vivo)での発現を増大させるベクター設計の改変、(2)遺伝子デリバリーの効率を改良するための、より効率の良いカチオン性リポソームおよび他のビヒクルの開発、(3)遺伝子デリバリーの最適化、および(4)異なる腫瘍細胞タイプへの応用を包含する。抗腫瘍免疫応答は、予備感作、および、主要壊死因子−αや、インターフェロン−γや、インターロイキン−２を含むサイトカインの投与により増大させることができ、または、養子導入若しくはTIL療法と組み合わせて用いることができる。本発明は、悪性腫瘍の免疫療法の別の方法、および、この治療に用いるのに最適化したベクターを提供する。この方法の修正により、他のヒト疾患の治療にも適用できる。ベクターの改変ベクターは、本明細書に記載した、効率および安全性を向上させるための改変の一部または全てを含むようにされる。このベクターの二つは、配列番号１および配列番号２の配列を有するプラスミドである。また、これらの２つのベクターの特徴を表１および表２にまとめて示す。さらに、これらの２つのベクターの調製法を実施例１および２に例示する。他の製造法は当業者に公知である。ベクターの最適化には、遺伝子発現を最大にするための、適切なペプチドをコードする配列の導入および部位の調整がある。ペプチドは、サイズや、例えばグリコシル化やリン酸化などの翻訳後修飾を受けているかどうかにかかわらず、全ての翻訳産物を意味すると理解されたい。或る実験では、HLA-B7の発現が、本来あるイントロンの除去およびコンセンサス翻訳開始配列の追加によって上昇することが観察された。実施例３を参照されたい。他の実験では、クラスＩMHC遺伝子をコードするものと同じベクターにβ−２ミクログロブリン遺伝子を含めることが、これら二つの遺伝子産物から成る完全な組織適合分子の合成のために研究された。通常、これらの二つの鎖は、細胞表面へ同時輸送される。ヒトのガン細胞には、内因性β−２ミクログロブリンを発現しないものがあり、従って、細胞表面にクラスＩを安定して発現する能力に限界がある。本発明者らは、同じプラスミドにβ−２ミクログロブリン遺伝子を含めることで、これらの抵抗性細胞での発現が可能になり、そして、他の細胞では発現が改善され、従って、耐性の潜在的な機構が克服されることを見い出した。実施例４を参照されたい。ベクターの更なる改変は、クラスＩMHCおよびβ−２ミクログロブリンに加えて、サイトカイン遺伝子を発現させることに関する。ＩＬ−２やＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの合成により、さらに、腫瘍に対するＴ細胞免疫を局所的に刺激し、腫瘍関連抗原の認識を改善できた。実験動物モデルでは、ＩＬ−２の導入により、抗腫瘍能の改良が可能となっている（E.R.Fearon,et al.,Cell 60,397( 1990)）。実施例５を参照されたい。従って、本発明の一態様では、ウイルス由来のベクターが提供され、好ましい態様では、それらは細菌プラスミド由来である。プラスミドベクターは、パッケージ細胞系に導入されず、他の組換え遺伝子産物のデリバリービヒクルへの組み込みが防止されるので、少なくとも、標準ウイルスベクターと同じくらいは安全であろう。さらに、デリバリービヒクルは宿主ゲノムに挿入されそうになく、挿入による突然変異の可能性が減少するので、プラスミドベクターは一層安全になり得る。また、外来組織適合抗原をコードする遺伝子を発現する細胞は、その場 (in situ)で数週間後には宿主の免疫系により排除され、これは、生体内(in viv o)に導入した遺伝子の永続的な発現に関する問題を最小限にする。安全性を最大にするため、サイトカインなどの免疫調節剤を、好ましくは、MHC抗原と同じ転写物に含め、サイトカイン遺伝子の発現を外来組織適合抗原の発現に連結し、他の外因性配列の一時的な発現だけを確実にする。プラスミドベクターの最適化は、プラスミドのライフサイクルの種々のステージ、すなわち、培養中および動物中の両方、遺伝子の転写およびペプチドへの翻訳の間の両方に関して行うことができる。本発明の一態様では、プラスミドＤＡＮは、例えば、患者での使用のための最終調製までは、DH5α、DH10B、HB101、J M109またはXL1-ブルーなどの標準大腸菌宿主株で増殖させる。プラスミドＤＮＡの大腸菌宿主細胞への導入は、例えば、塩化カルシウムトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって行われ、プラスミドは染色体外の形態で複製される。したがって、この態様では、プラスミドは、原核生物でのＤＮＡ合成を促進する複製開始点を含む。（真核生物でのＤＮＡ合成を促進する他の複製開始点は、例えば、ベクターが真核細胞で増殖する他の態様で用いられるであろう。）原核生物での増殖に適する複製開始点には、例えば、プラスミドpBR322、プラスミドColElおよびpUC系プラスミドにあるものがある。pBR322由来の複製開始点が好ましい。本発明の他の一態様では、ベクターは、形質転換体を選択するのに用いる、宿主細胞に選択容易な表現型の特徴を与える能力を有するようにされる。好ましい態様では、選択マーカーは、抗生物質耐性を与える。しかし、抗生物質は、例えば、遺伝子療法の間に残留する量にさらされ得る患者で、副作用を生じることがある。アンピシリンなどの抗生物質は、例えば、感受性の患者に投与されたときに、アナフィラキシーショックや他のアレルギー反応に関与することが分かっている。アンピシリンは、また、培養において分解する傾向があり、形質転換体の選択には向いていない。試験管内(in vitro)での増殖の間のプラスミドの損失を防ぐために、多量のアンピシリンが使用される傾向にある。従って、この好ましい態様では、選択マーカーが、安全で安価な抗生物質耐性を与えることが最も好ましい。このような抗生物質には、ネオマイシン、テトラサイクリン、ゲネチシン(geneticin)、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、および、特に好ましいカナマイシンがある。組換え遺伝子発現は、適切な遺伝子の転写およびメッセージの効率的な翻訳に依存している。これらの過程のいずれかが正確に行われないと、所与の遺伝子が発現しないことになり得る。クローンされた挿入物の転写は、宿主ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの存在を必要とする。このため、本発明の別の一態様では、ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用するプロモーター配列を導入し、クローンされた遺伝子の転写を開始させるにようにされる。好ましい態様では、プロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼと相互作用をする。このようなプロモーターには、CMVイメディエートアーリィ(immediate early )、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期のSV40、レトロウイルス由来LTR、ならびに、マウスメタロチオネイン−Ｉのものがある。CMVおよびラウス肉腫ウイルスの末端反復配列(RSV LTR)が好ましい。効率的な翻訳は、ｍＲＮＡがリボソーム結合部位を有することを必要とする。本発明のさらに別の一態様では、リボソーム結合部位が、発現された転写物の効率的な翻訳を生じるようにベクターに導入される。複数のシストロンが単一のプロモーターの制御下になく、それらを単一のメッセージとして転写しない真核生物においては、ポリシストロンの発現が問題である。従って、ポリシストロンプラスミドに関しては、リボソーム結合部位が脳心筋炎(EMC)ウイルス由来であることが好ましい。真核生物リボソームによる翻訳開始のためのインターナルエントリーポイントとして機能できるこの部位をベクターに導入する。翻訳効率は、ＲＮＡの５’非コードまたは非翻訳領域(5'UTR)の特異的配列要素によって調節されることが見い出されている。正の配列モチーフは、翻訳開始コンセンサス配列(GCC)^ACCATGG（Kozak,Nucleic Acids Res.15:8125(1987)）および５’7-メチルGpppGキャップ構造（Drummond et al.,Nucleic Acids Res.13: 7375(1985)）を含む。負の要素は、安定なイントラモレキュラー5'UTRステム− ループ構造（Muessing et al.,Cell 48:691(1987)）および5'-UTR中の適当なAUG が先行するAUG配列または短いオープンリーディングフレーム（Kozak,supra、Rao etal.,Mol.and Cell.Biol.8:284(1988)）を含む。翻訳を促進する正の配列モチーフを特徴とし、負の要素が除かれたベクターが、本発明の別の態様として提供される。これに関しては、コザック(Kozak)コンセンサス開始配列、特に、"CACCATG G"の配列が好ましい。不適当なポリＡ配列を変化させた、上述のRSV LTRが、遺伝子発現に対する負の効果を除くためには好ましい。転写および翻訳の点に加えて、ｍＲＮＡの安定性も考慮しなくてはならない。一般的には、キャッピングおよび３’ポリアデニル化が、ｍＲＮＡ安定性の主たる正の決定因子であり（Drummond et al.,Nucleic Acids Res.13:7375(1985)、Ro ss,Mol.Biol.Med.5:1(1988)）、それぞれ、ｍＲＮＡの５’および３’末端を分解から保護するように機能する。ｍＲＮＡの安定性に影響を与える他の調節因子も明らかになっている。これらの内、最もよく明らかにされているものは、ｍＲＮＡ非安定化を起こすだけの配列モチーフでないという証拠がある（Kabnickおよび Housman,Mol.and Cell.Biol.8:3244(1988)）けれども、多くのショートハーフライフｍＲＮＡにあるウリジンに富む３’非翻訳領域（3'UTR）デスタビライザー配列である（ShawおよびKamen,Cell 46:659(1986)）。例えば、クローンされた遺伝子に本来ある３’非翻訳領域を含むというように、ｍＲＮＡの非安定化を避けるように設計されたベクターが本発明の別の態様として提供される。ｍＲＮＡ安定性の正の決定因子を組み入れたベクターも提供され、この決定因子は、好ましくはポリＡ付加配列を構成する。非ウイルス起源のポリアデニル化部位は、ウイルス遺伝子産物の夾雑を避けるために好ましい。例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列が好ましい。また、ウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの本質的に全てを欠失させた、SV40などのウイルス由来のポリＡシグナルが容易に予想でき、そして好ましいものである。遺伝子発現はまたイントロン配列によって媒介される。この部位は、核でのＲＮＡプロセッシングおよびその後の翻訳のための細胞質へのｍＲＮＡの輸送に関係する。イントロンは、発現された転写物のスプライシングを促進することにより機能するようである。本発明の別の態様では、ベクターが、スプライシングを促進するイントロンを導入することによって最適化される。好ましいイントロンは、オープンリーディングフレームの本質的に全てを欠失させ、ウイルス遺伝子産物の夾雑を防ぐようにされたSV40由来のものである。これに関しては、ベクターはイントロンの除去により最適化されてもよい。本発明の好ましい態様では、 HLA-B7をコードするｃＤＮＡは、本来有するイントロンが除かれ、遺伝子発現を強める。本発明で提供される最適化されたベクターは、対象のシストロンまたはポリシストロンで、その発現が不要となったシストロンまたはポリシストロンを置き換えたカセットとして使用することもできる。 pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミド pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミド発現ベクターは、カナマイシン耐性タンパク質の発現を要求する選択培地で増殖した細菌細胞で生合成され得る、共有結合により閉じた環状ＤＮＡ高分子である。カナマイシン耐性遺伝子に加えて、本プラスミドＤＮＡはクラスＩ主要組織適合複合体(MHC)抗原の重タンパク質（ヒトHLA-B7）および軽タンパク質（β−２ミクログロブリン）をコードする。プラスミドは、ビシストロン性ｍＲＮＡにより真核細胞でこれらの２つのタンパク質を発現するように設計されている。ｍＲＮＡの転写の開始は、３’末端反復配列由来ラウス肉腫ウイルスプロモーター配列に依存する。転写の終結は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル配列に依存する。重鎖の真核細胞翻訳は、５’キャップ依存性タンパク質開始部位によって調節される。軽鎖の翻訳は、脳心筋炎ウイルス由来キャップ非依存性翻訳エンハンサー(CITE)配列により調節される。また、細菌細胞におけるプラスミドの複製は、細菌複製開始点の存在によって調節される。他の実質的なオープンリーディングフレームおよび公知の発ガン性配列は存在しない。本プラスミドは、ＤＮＡ配列決定により特徴付けられている（配列番号：１）。長さは４９６５塩基対、組成は、アデニン２３３５個、シトシン２６３０個、グアニン２６３０個、および、チミン２３３５個である。この結果により、分子量は、3.298437×10⁶g.m.u.である。 pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミドは、コピーナンバーの大きい細菌プラスミドＤＮＡ中にクローンしたＤＮＡの独立したセグメントを用いて構築することができる。プラスミドの構成要素は、細菌細胞で高いレベルの複製を促進し、細菌細胞の培養の間、優性の選択耐性タンパク質を発現し、そして、真核細胞に導入されたときに、２つのクラスＩMHC構成要素タンパク質すなわちHLA-B 7およびβ−２ミクログロブリンを高いレベルで発現させるように機能する。バックボーンプラスミドＤＮＡは、分子生物学の研究室で広く使用され、その複製開始点が天然に存在する細菌プラスミドであるColElから取得されたものであるpBR322というベクター由来である（Bolivar,R.,et al.,Gene 2,95(1977)）。本プラスミドで使用されたpBR322のこの９５２塩基対のフラグメントは、ユニークなEco R1制限エンドヌクレアーゼ部位をpBR322の塩基１としたとき、pBR322 塩基番号2244（Acc l制限エンドヌクレアーゼ部位、平滑末端））から塩基番号3 193（Bsp Hl制限エンドヌクレアーゼ部位）の領域に対応する。このバックボーンプラスミドフラグメントは、pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミドの塩基番号4014と4965の間にあり、細菌複製開始点を含む。細菌または動物細胞のいずれかで発現することが知られているオープンリーディングフレームは含まれていない。真核生物遺伝子発現は、トリラウス肉腫ウイルス（RSV）３’末端反復配列（L TR）プロモーター配列により調節される。この配列は、RSVのシュミット−ルッピン(Schmidt-Ruppin)株由来であり（Swanstrom,R.,et al.,Proc.Nat'l Acad.Sc i.U.S.A.78,124(1981)）、ウイルス塩基番号8673のPvu II部位とウイルス塩基番号9146のBfa I部位の間のＤＮＡを単離することによりクローンされた。このプロモーター配列を真核細胞において異種遺伝子の発現の調節に使用することは、１０年以上前にゴーマンら（Gorman,C.,et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.79, 6777(1982)）によって記載された。pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミドの構築に使用されたRSV ＤＮＡフラグメントは、pRSVβ−グロビンから取得された（Gorman,C.,et al.,Science 221,551(1983)）。この調節配列は、トリレトロウイルスに存在するが、この3'LTRは試験され、トリおよび哺乳動物の細胞のいずれでも内因性発ガン活性を有さないことが示されている（Westphal,C.,et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50,411(1985)、Mahon,M,et al.,Pro c.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.85,1165(1988)、Overbeek,U.,et al.,Science 231,157 4(1986)）。pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミド中のRSV LTRプロモータードメインは１から５２９の塩基対に対応する。これは、この調節配列を改変し、下流のコード配列の真核細胞での高いレベルでの発現をさせる、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドＤＮＡの５６塩基対の領域を含む。このオリゴヌクレオチドにより、RSV ＤＮＡ配列に本来存在するポリアデニル化シグナル配列が除かれる（すなわち、AATAAAを、Xba I制限エンドヌクレアーゼ部位であるTC TAGAで置き換える）。また、翻訳開始コドンであるA⁵³⁵TGの近傍に強い翻訳シグナル配列（Kozak,M.,et al.）が導入される。さらに、この合成オリゴヌクレオチドは、また、多数の制限エンドヌクレアーゼ部位（すなわち、Sal I、Hind II I、および、Nco I）を導入し、５’および３’ＤＮＡ要素のサブクローニングを容易にする。ヒトHLA-B7およびβ−２ミクログロブリンのタンパク質をコードする配列は、上記のRSV LTRの３’側に位置する。これらのタンパク質の２つの遺伝子はヒトゲノムの異なる場所に位置するが、遺伝子の発現および２つのタンパク質のアセンブリは相互依存性であると考えられる。従って、異種発現系における正しい表面HLA抗原の高いレベルの発現とアセンブリを得るために、２つのｃＤＮＡ配列を互いに近くに、そして、RSVプロモーターの３’側の近くにクローンした。単一のビシストロン性ｍＲＮＡ分子への両配列の転写は、RSVプロモータードメインから開始し、遠位のウシ成長ホルモン転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナル配列で終結する。このビシストロン性ｍＲＮＡの翻訳は、CAP依存（HLA-B 7）およびCAP非依存性（β−２ミクログロブリン）のリボゾーム認識配列によって影響を受ける。CAP非依存性シグナルは、ネズミ脳心筋炎(EMC)ウイルスゲノムから取得され、HLA-B7の重鎖と軽鎖をコードする配列の間に、ビシストロン性ｍＲＮＡの一部としてクローンされる。 HLA-B7ｃＤＮＡ配列は、ヒトＢリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものであり、ジーンバンク（HUMMHB7A）にある配列に近いものである。また、外来クラスＩ主要組織適合複合体抗原により特徴づけられる免疫応答を誘発することが示されている（Nabel,E.,et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.89,5157(1992 )）。ｃＤＮＡ配列は、A⁵³⁵TG（Nco I制限エンドヌクレアーゼ部位内）から始まり、塩基番号１８５３で終了する。この配列中のオープンリーディングフレーム（すなわち、A⁵³⁵TGからT¹⁶²¹GA）は、推測分子量４４，２００を有するタンパク質をコードする。残りの２３０塩基対は３’非翻訳ｍＲＮＡ配列の部分に相当する。塩基対１８５４から１８８８の配列は、最初は合成オリゴヌクレオチドに由来するマルチプルクローニング部位の部分である。これは、HLA-B7配列と、ネズミ脳心筋炎CAP非依存性翻訳エンハンサー(EMCV-CITE)配列との間の連結部であり、上流及び下流の両方の配列のサブクローニングを容易にするために使用されている。５８８塩基対のEMCV-CITE配列は、クローンされたEMCVゲノムＤＮＡの５’領域（２５５から８４３）の部分から取得される（Duke,et al,J.Virology 66,160 2(1992)）。これは、ｍＲＮＡ分子内に位置するとき、真核生物リボソームサブユニットのインターナルエントリーポイントとして機能する非コード調節配列である。従って、このビシストロン性ｍＲＮＡ上のHLA-B7終止コドンの下流の、 β−２ミクログロブリンの翻訳開始コドン(A²⁴⁸⁰TG)がリボソームによって認識されるようになる（Parks,G.,et al.,J.Virology 60,376(1986)）。ヒトβ−２ミクログロブリンの部分ｃＤＮＡ配列（クラスＩMHCヘテロデュプレックス表面抗原の軽鎖）は、最初はスッグスら（Suggs,S.et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci U.S.A.78,6613(1981)）によって公開された。アレジャンドロマドリガル(Alejandro Madrigal)（スタンフォード大学メディカルスクール、パロアルト、ＣＡ）によるその後の研究により、チンパンジーβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡは、ヒトの配列と４つの塩基で異なるのみであり、相同性β−２ミクログロブリンタンパク質をコードすることが示されている。従って、チンパンジーｃＤＮＡをＤＮＡ構築物において使用した。β−２ミクログロブリンオープンリーディングフレームは、上記の通り、A²⁴⁸⁰TGから始まり、T²⁸³⁷AAで終わる。チンパンジーの３’非翻訳ドメインの１０塩基は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来の異種３’非翻訳転写終末およびポリアデニル化シグナル配列への配列のスプライシングの前はこのオープンリーディングフレームの下流に残る。この連結部でのスプライシングは、Hind IIIおよびBam HI制限エンドヌクレアーゼによって認識される合成オリゴヌクレオチド（pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミド塩基対２８４７から２８７０）を用いて行われる。塩基対２８７１から３１１１は、ウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）遺伝子由来である（Gordon,et al.,Mol.Cell.Endocrinology 33,81(1983)）。これは、ｍＲＮＡコード配列の３’非翻訳領域内の平滑末端Bgl II部位から始まり、転写終結およびポリアデニル化のポイントの先約１１０〜１１５塩基のポイントまでに及ぶ。このドメイン内に位置するポリアデニル化シグナル配列(A²⁹⁷⁹ATAAA)が存在する。３１１２から３１５１の間の３９塩基対は、合成オリゴヌクレオチドフラグメントに相当し、クローニングを容易にする。 pHLA-B7／β−２ミクログロブリンプラスミドの最後のドメインは、細菌で発現されるカナマイシン耐性（カナマイシン^r）遺伝子配列を含む。遺伝子は、詳細に特徴決定がなされているトランスポーザブル因子Tn903（Oka,A.,et al.,J.M ol.Biol.147,217(1981)）から取得され、30,7000M.W.のアミノグリコシド３’ −ホスホトランスフェラーゼタンパク質の発現により薬剤耐性を与えることが示されている（Berg,D.et al.,(1987)In Microbiology-1978(Schlessinger,D.ed.) pp13-15 American Society,for Microbiology,Washington,D.C.）。カナマイシン^rコード配列は、真核生物HLA-B7およびβ−２ミクログロブリン配列をコードする鎖と反対の鎖に位置し、従って、真核生物遺伝子とは逆方向に読みとられる。カナマイシン^rのオープンリーディングフレームは、A³⁹⁶⁷TGから始まりT³¹⁵⁴A Aで終わる。この配列は、ノバゲン(Novagen)インコーポレイテッド（マディソン、ウィスコンシン）から市販されているプラスミドPET9aからクローンされた。遺伝子デリバリーのためのカチオン性リポソームおよびビヒクル本発明により提供される最適化ベクターの、生物の細胞または組織への導入は、裸のＤＮＡの注射により行ったり、例えば、ウイルスベクター、リガンド−ＤＮＡ複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、リン酸カルシウム、リポソームなどのビヒクルを使用することにより促進したりすることができる。導入方法は、この分野で公知であり、例えば、リポソームを用いるトランスフェクション法、および、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンドビスおよびその他のＲＮＡウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる感染プロトコルがある。本発明の一態様によれば、本発明により提供されるベクターは、カチオン性リポソームまたは脂質小胞と複合体を形成する。カチオン性すなわち正に荷電したリポソームは、他の脂質とカチオン性リピド（ＣＬ）の組成物である。この組成物は、正に荷電した脂質、負に荷電した脂質、中性脂質およびコレステロールまたは同様のステロールの混合物から調製される。正に荷電した脂質は、DMRIEのような、引用により本明細書に含める米国特許出願第０７／６８６，７４６号に記載されているカチオン性脂質の一つ、または、カチオン性脂質のDOTMA、DOTAP もしくはその類似体の一つ、または、これらの組み合わせでもよい。DMRIEは、1 ,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（例えば、J.Felgner,et al.,J.Biol.Chem.,269,(1994)参照）であり、好ましいものである。中性および負に荷電した脂質は、天然もしくは合成のホスホリピドまたはモノ −、ジ−もしくはトリアシルグリセロールのいずれでもよい。天然ホスホリピドは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、または、ホスファチジルイノシトールなどの、動物および植物源由来のものでよい。合成ホスホリピドは、これらに限定されるものではないが、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンならびに対応する合成ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールなどの、同一の脂肪酸基を有するものでよい。中性脂質は、ホスファチジルコリン、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、モノ−、ジ−、もしくはトリアシルグリセロール、または、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）などのそれらの類似体でよい。DOPEが好ましい。負に荷電した脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸または同様のホスホリピド類似体でよい。コレステロール、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、プロスタグランジン、ガングリオシド、ネオビー(neobee)、ニオソーム(niosome)、または、その他の天然もしくは合成アンホフィル(amphophile)などの他の添加物も、リポソームの調製に関し従来知られているように、リポソーム組成物で使用できる。リポソームのカチオン性脂質成分の置き換えにより、トランスフェクション効率を変えることができる。特に、カチオン性の種類のものの修飾はこのプロセスにおいて重要な因子になっている。異なるカチオン性脂質である1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)と共に使用される、カチオン性脂質の新規な組成物が好ましい。この組成物は、トランスフェクションに一層適した２つの特性を有する。第１に、試験管内(in vitro)で、DC-コレステロール／DOPE組成物に比べ、約７倍にまで改善されたトランスフェクション効率を示す。実施例６を参照。重要なことには、このDMRIE/DOPE組成物は、DC-Cholリポソームとは対照的に、高い濃度でも凝集しない。この特性により、毒性を与えずに、実験動物に導入するＤＮＡおよびリポソームを一層高い絶対濃度にできる。実施例７を参照。これらの特性により、１００〜１０００倍多いＤＮＡを導入することが可能になり、これにより、生体内(in vivo)での遺伝子発現が著しく改善されるであろう。実施例８を参照。 DOPEのDMRIEに対する好ましいモル比は、約９／１〜１／９であり、５／５のモル比が特に好ましい。従来のカチオン性脂質技術を用いて、脂質組成物を治療的または免疫原的に活性のペプチドをコードする遺伝物質の細胞内デリバリーを促進するのに使用できる。簡単に説明すると、このような方法は、カチオン性脂質からなる脂質小胞を調製し、この脂質小胞を治療的または免疫原的に活性の物質を細胞にトランスフェクションまたは輸送するのに用いることを含む。細胞内輸送は、物質を脂質小胞に組み入れ、すなわちカプセル化し、従来のリポソームの方法と同様に、その脂質小胞を細胞と接触させるか、あるいは、従来のトランスフェクション法と同様に、細胞に、カチオン性脂質組成物から成る空のリポソームと物質を同時に接触させることにより行うことができる。いずれの方法においても、物質が細胞に取り込まれる。接触工程は、試験管内(in vitro)でも生体内(in vivo)でもよい。カチオン性脂質組成物を、医薬的に有効な量の、生物における疾患の治療に特異的な治療活性物質と共に含む調製物を投与し、物質を細胞に導入することを含む、このような方法を生物における疾患の治療に適用することができ、これによって疾患が有効に治療される。物質は、試験管内(in vitro)または生体内(in vi vo)で生物の細胞にデリバリーすることができる。物質の試験管内(in vitro)デリバリーは、生物から取り出された細胞で行われる。細胞は、生物の体内に戻され、これによって生物が治療される。他方、生体内(in vivo)デリバリーは、生物の体内で細胞の直接形質転換が行われて、治療が行われることに関する。治療物質をコードするベクターのカチオン性脂質媒介デリバリーにより、デュシェーヌ(Duchenne)ジストロフィー（Kunkel,L.およびHoffinan,E.Brit.Med.Bull.45(3 ):630-643(1989)）および嚢性線維症（Goodfellow,P.Nature,341,(6238):102-3( Sept.14,1989)）などの、欠損遺伝子またはその産物が同定されている疾患の治療のために欠陥または喪失遺伝子産物を供給することにより遺伝子疾患の治療法を提供できる。上記のカチオン性脂質に媒介される細胞内デリバリーは、また、ペプチドの免疫化を提供する。上記のトランスフェクションの方法は、カチオン性脂質組成物を、免疫原をコードするベクターと共に生体内(in vivo)の動物細胞に直接注射するか、または、試験管内(in vitro)の動物細胞にトランスフェクションさせ、続いて形質転換した細胞を動物に再導入することにより適用できる。細胞をカチオン性脂質を用いて形質転換できることにより、免疫化の別方法が提供される。抗原の遺伝子が、動物の細胞へ、カチオン性脂質媒介デリバリーによって導入される。抗原を発現するトランスフェクトされた細胞は、動物に再注入されるか、または、すでに動物内に存在し、そこでは免疫系が抗原に応答できる。このプロセスは、アジュバントもしくはリンホカインなどのサイトカイン、または、アジュバントもしくはサイトカインもしくはリンホカインをコードする遺伝子を同時投与することにより強化され、リンパ系細胞および免疫応答を媒介する他の細胞をさらに刺激することができる。腫瘍疾患と診断された患者への、ＤＮＡリポソーム複合体の、新生物組織形成の治療のための投与は、好ましくは、注射筒および針またはカテーテル（下記参照）による複合体の腫瘍内注射による。約０．１５ｎＭ〜約１．５ｍＭのリポソーム溶液中の約０．１μｇ〜約５ｇの量のプラスミドＤＮＡ投与される。好ましいプロトコルでは、０．１ｍｌの乳酸添加リンゲル液中のプラスミドＤＮＡ（０．０５〜５０ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌのDMRIE／DOPEリポソーム溶液（０．１５〜１５μＭ）に加え、そして、０．８ｍｌの乳酸添加リンゲル液をそのリポソームＤＮＡ溶液に加える。この好ましいプロトコルでは、各０．２ｍｌの３アリコートを腫塊に注射し、または０．６ｍｌの１アリコートをカテーテルで投与する。この好ましいプロトコルでは、従って、患者に約３μｇ〜約３ｍｇのＤＮＡおよび約４．５ｎＭ〜約４．５μＭのDMRIE/DOPEが投与される。この用法を２週間の間隔で繰り返す。毒性や組成などに関する最適なトランスフェクションパラメーターは、実施例１２に記載する、および、他にも広く記載されている（例えば、Felgner,J.H.およびFelgner P.L.,"Lipofection," Protocols in Cell & Tissue Culture,1993, John Wiley & Sons）９６ウェルマイクロタイタープレートを用いる細胞のトランスフェクションにおいて、ＤＮＡ／カチオン性脂質組成物の効率を比較することにより決定でき、また、患者への投与前に実験動物で確認できる。実施例１４も参照。カテーテルによる遺伝子療法本発明の好ましい態様では、生体内(in vivo)の遺伝子デリバリーを最適化する方法として、腫瘍細胞などのターゲット細胞へのその場(in situ)での直接遺伝子導入が用いられる。伝統的に、遺伝子導入技術は、試験管内(in vitro)でのターゲット細胞の変性およびその後の変性細胞の導入に集中している。このような方法では、これらの細胞は、選択にさらされ、および、生体内(in vivo)とは異なる成長条件にさらされる。それらは、また、各適用について細胞系を確立することを必要とするので、ヒト疾患への適用は一層困難であり、一層時間を要する。直接細胞内注射により組換え遺伝子を導入することが好ましく、カテーテルを用いて行うことがより好ましい。カテーテルは、生体内(in vivo)で組換え遺伝子を導入するのに使用されている（例えば、E.G.Nabel,et al.Proc.Natl.Acad.S ci.USA 89,5157(1992)、E.G.Nabel,et al.,Sc1ence 249,1285(1990)、E.G.Nabel ,et al.,Science 244,1342(1989)、E.G.Nabel,et al,J.Clin.Invest.91,1822(19 93)、G,Plautz,et al.,Circ.83,578(1991)、E.Nabel,et al.,Nature 362,844(19 93)参照）。カテーテルを、遺伝子療法を用いる黒色腫の治療のプロトコルにより、肺転移を有する一患者に対してヒト臨床試験に使用した。カテーテルによる治療に、患者は寛容であった。合併症および毒性は認められなかった（実施例１３参照）。腫瘍内注射と比べ、この干渉法(intervention)は、腫瘍細胞の遠隔部位への悪影響のある顕微鏡的なシードリングの可能性を最小にすると同時に遺伝子発現のより大きな効率を得るために、腫瘍のマイクロサーキュレーション中にある細胞の多くの割合を形質転換することができる。上記の患者では、遺伝子を、酸素加血液で腫瘍を直接まき散らすことのない、肺動脈から導入した。別法としては、栄養(feeding)動脈から導入することもできる。例えば、ＤＮＡリポソーム複合体を、肝臓の原発性または続発性腫瘍へデリバリーするのに肝動脈を使用できる。この方法は、生体内(in vivo)での直接遺伝子導入を用いているため、単独、または、サイトカインもしくは養子リンパ球導入を含む他のアジュバント治療と組み合わせて、自発性腫瘍に対して臨床的に適用し、腫瘍免疫を増大させることができる。生体内(in vivo)での異なる腫瘍細胞型での発現 HLA-B7遺伝子が、いくつかの異なる腫瘍細胞で生体内(in vivo)において発現できることが以前に示されている（G.E.Plautz,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,4645(1993)）。本発明者らのデータにより、HLA-B7およびβ−２ミクログロブリン遺伝子がヒト黒色腫でうまく発現できることが示唆される（実施例４参照）。従って、本発明の一態様によれば、ヒト黒色腫疾患の治療が提供される。他のヒトのガン、例えば、直腸ガン、腎細胞ガン、乳ガン、肝ガン、肺ガンおよび膵ガンの治療法も提供される。本発明の具体的な態様を以下の実施例から容易に理解することができる。これら実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を、具体的に例示された具体例に制限するものではない。実施例１ HLA-B7およびβ−２ミクログロブリンを含むプラスミドの調製 HLA-B7およびβ−２ミクログロブリンを発現するベクターは、以下の一連のステップにより構築した。出発構築物は、プラスミドRSVβ−グロビン（C.Gorman, et al.,Science 221,551(1983)およびC.Gorman,et al.,Mol.Cell.Biol.2,1044(1 982)）であり、これに、HLA-B7遺伝子ｃＤＮＡが挿入されることになった。RSV β−グロビンプラスミドは、アンピシリン耐性シストロンおよびハイブリッド真核生物転写単位に結合したプラスミドpBR322由来の複製開始点から構成されていた。このプラスミドの転写単位は、RSV LTRプロモーター、ウサギβ−グロビンをコードする配列、ならびに、スモール−ｔイントロンおよび初期領域のポリアデニル化部位を含むSV40ｍＲＮＡプロセッシングシグナルから構築されていた。 β−グロビン遺伝子を、プラスミドから、Hind IIIおよびBgl IIにより消化して取り除いた。子ウシ小腸フォスファターゼ（ＣＩＰ）およびＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントで処理後、バックボーンを、クレノー酵素で処理したHLA-B7のBam HI-Sal Iフラグメントの挿入に使用した。このフラグメントは、pLJ HLA-B7ベクター（E.G.Nabel,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5157(19 92)）から得たものであった。得られたRSV HLA-B7プラスミドを、HLA-B7をコードする配列中のイントロンを除去して改良した。イントロンの除去により、培養細胞の一時的形質転換アッセイにおける発現レベルが高くなった。部位特異的突然変異誘発を、オリゴヌクレオチド特異的ギャップヘテロデュープレックス法（G.Nabel,D.Baltimore,Nature 326:711(1987)）によって行った。5'-CCG AGA CCT GGG CCG GCT CCC（配列番号：１の593-613の塩基）およびACT CCA TGA G-3'の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。プラスミドRSV HLA-B7（無イントロン）をさらに以下のように改変した。「コザック(Kozak)」コンセンサス翻訳開始配列（Kozak,Nucleic Acids Res.1 5:8125(1987)）をHLA-B7メッセージの翻訳効率を上げるために追加した。再度、オリゴヌクレオチド特異的ギャップヘテロデュープレックス法を用いた。コザック配列"CACC"を開始コドンの５’側に、5'-CAC CTC CAA GCT TCA CCA TGG（配列番号：１の518-538の塩基）およびTGG TCA TGG CGC-3'（配列番号：１の539-550 の塩基）を用いて挿入した。生成物をRSV HLA-B7(K)と名付けた。ベクターをビシストロン性にし、β−２ミクログロブリンペプチドを、HLA-B7 抗原に加えて発現するようにするため、インターナルリボゾーム開始部位を含め、第２のメッセージが翻訳されるようにする必要があった。このため、脳心筋炎（EMC）ウイルス由来の部位を含むフラグメントを、Eco RIおよびXba Iによる消化により、ノバゲン(Novagen)（マディソン、Wi.）から入手したpCITE-1から取り出した。このフラグメントを、Eco RIおよびXba Iにより消化した、ストラタジーン(Stratagene)（ラジョラ、Ca.）から購入したクローニングベクターであるpBluescript SKに連結させた。複数のクローニング部位が存在することにより有利な、インターナルリボゾーム開始部位を有するプラスミドをpBS CITE Iと名付けた。 β−２ミクログロブリン遺伝子を特徴とするプラスミドは以下のようにして構築した。β−２ミクログロブリン遺伝子は、スタンフォード大学のマドリガル (Madrigal)博士より提供されたｐＨβ Apr-1-Neoから、クレノ処理されたSal I/ Bam HIフラグメントとして得た。このフラグメントを、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化付加シグナルの上流に、そのシグナルを含むプラスミドへの連結反応によって結合させた。ケースウェスタンリザーブ大学のカルプ(C ulp)博士より提供されたプラスミドpRSV ADHをHind IIIおよびXba Iで消化し、そこに含まれているＡＤＨをコードする遺伝子を除去し、β−２ミクログロブリン遺伝子を含むフラグメントの挿入の前に、ＣＩＰおよびクレノーで処理した。 β−２ミクログロブリンの転写物の翻訳効率を上げるため、部位特異的突然変異誘発により、得られたプラスミドにコザック配列（CACC）を付加して改良した。ギャップトヘテロデュープレックスに特異的にするために用いたオリゴヌクレオチドは、5'-CAC CTC CAA GCT TCA CCA TGG CTCおよびGCT CCG TGG-3'（ACCA TGG CTC GCT CCG TGGは配列番号：１の2477-2495の塩基に対応）から成っていた。このように、コザック配列と、ウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナルとの間に位置するβ−２ミクログロブリン遺伝子を含むプラスミドが得られ、PRSVβ2(K)と名付けた。結果的に、pBS CITE Iのマルチプルクローニング部位が、β−２ミクログロブリン遺伝子をインターナルリボゾーム開始部位の下流に置くために使用された。これは、Nco I/Xba Iフラグメントを、先ず、Xba I消化およびクレノー処理をし、次いで、Nco I消化することにより除去したバックボーンとしてpBS CITE Iを使用することによって達成された。コザック配列とポリＡシグナルを有するβ− ２ミクログロブリン遺伝子は、PRSVβ2(K)をDra III消化し、クレノーで平滑化し、次いで、Nco I消化することによりフラグメントとして得られた。連結反応により、β−２ミクログロブリン遺伝子およびポリアデニル化シグナルが続くインターナルリボゾーム開始部位から成る単位を含むプラスミドが生成した。この単位は、上記のRSV HLA-B7(K)に下記のようにして挿入された。HLA-B7を含むプラスミドを、Bgl IIにより、HLA-B7遺伝子内部のBgl II部位よりもむしろ、HLA-B7をコードする配列の３’側のBgl II部位を切断するように部分消化した。このようにRSV HLA-B7(K)を線状にし、ＣＩＰで処理し、クレノーで平滑化した。β−２ミクログロブリンを含む単位は、Sal I/Not Iフラグメントとして取り出され、次いでクレノーで処理された。連結産物は、（転写方向に）HLA-B7遺伝子（コザック配列に結合）、インターナルリボゾーム開始部位、β−２ミクログロブリン遺伝子（これもコザック配列に結合）、ウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ部位およびSV40プロセッシング配列が続くRSV プロモーターを組み入れたビシストロン性転写単位を含んでいた。ウイルス由来の遺伝物質の混在を減らすためには、アンピシリン耐性シストロンが欠失せず、カナマイシン耐性遺伝子が挿入される限度で、SV40配列を除くことが望まれた。プラスミドの精製を容易にし、細菌宿主の増殖の際にアンピシリン選択を避けるために、アンピシリン耐性（β−ラクタマーゼ）をコードする遺伝子を、細菌トランスポゾンTn903由来のカナマイシン耐性（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子で置き換えた。先ず、上述のRSV HLA-B7(K) のAlw NI部分／Eco RI消化物を、カナマイシン耐性をコードするベクターｐＥＴ９ａ（ノバゲン(Novagen)、マデイソン、Wi.）のAlw NI/Eco RIフラグメントと連結した。次に、kRSV HLA-B7(K)と名付けた、得られた構築物を、Nde I/Hpa I カナマイシン耐性遺伝子含有フラグメントのドナーとして使用した。このフラグメントで、対象のプラスミドに存在するアンピシリン耐性をコードするNde I/Hp a Iフラグメントを置換した。抗生物質耐性遺伝子の交換の完了後、不要なSV40 配列の除去を行った。 SV40のプロセッシングおよびポリアデニル化配列は、Xho I/Eco RIフラグメントとして除いた。プラスミドをXho IおよびEco RIで部分消化することにより、ビシストロン性転写単位中のXho I部位および３つのEco RI部位での、カナマイシン耐性シストロンの切断を避けられた。続いてクレノー処理と連結反応により、一つの点を除いて好ましい構築物が得られた。 RSV LTR内には、プロモーターとして機能させるべき配列中に位置する点で不適切なポリアデニル化シグナル"AATAAA"がコードされている。部位特異的突然変異誘発を用いて、このポリＡ配列を変異させた。5'-CTA GCT CGA TAC TCT AGA C GC（配列番号：１の470-490の塩基）およびCAT TTG ACC-3'の配列を有するオリゴヌクレオチドはギャップトヘテロデュープレックスを効果的に誘発し、不要なポリＡシグナルの変異と、さらに、Xba I制限部位の創生を起こした。このようにして、多くの有利な性質を有するHLA-B7抗原およびβ−２ミクログロブリンペプチドをコードするプラスミドが得られた。例えば、この構築物は、pBR322由来の複製開始点、単一のプロモーターで制御されるビシストロン性転写単位、ポリＡ部位を変異させたラウス肉腫ウイルス末端反復配列由来のプロモーター、インターナルリボゾーム開始部位、HLA-B7シストロン（イントロン除去）およびβ−２ミクログロブリンシストロンの上流のコンセンサス翻訳開始配列、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化付加シグナル、ならびに、カナマイシン耐性をコードする遺伝物質を含んでいた。組換えプラスミドは、HLA-B7およびβ−２ミクログロブリンをコードすることが好ましいが、ビシストロン性転写単位中のいずれかのシストロンを取り除き、発現させたい他のシストロンを挿入するためのカセットとしてバックボーンを使用してもよい。記載したプラスミドのヌクレオチド配列をジーンバンク(Genebank)によりデータベース検索したが、予測オープンリーディングフレームには、ガン遺伝子に対するホモロジーはなかった。また、いくつかの論文は、このプラスミドで使用されたRSV＋pBR322配列が、トランスジェニックマウスでうまく使用され、内因的発ガン性のものではないことを示している（Westphal et al,Cold Spring Harb. Symp.Quant Biol.50:411-416,1985、Malon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85: 1165-1168,1988、Overbeek et al.,Science 231:1574-1577,1986）。さらに、ここに記載したプラスミドは、線維芽細胞トランスフォーメーションアッセイで分析され、バックグラウンド値を超えてコロニートランスフォーメーションを刺激することはなかった。実施例２ HLA-B7を含むプラスミドの調製本プラスミドは、上述のプラスミドkRSV HLA-B7(K)から調製された。kRSV HLA -B7(K)構築物は、RSV LTRを、イントロンを除いたHLA-B7遺伝子をコードしたｃＤＮＡのプロモーターとして含んでいた。コザックコンセンサス翻訳開始配列が存在した。転写単位は、また、ｃＤＮＡの3'末端でのスプライシングを可能にするSV40由米の領域と、ポリアデニル化シグナルを含んでいた。さらにベクターは、pBR322由来の複製開始点を含んでいた。さらにまた、組換え分子は、カナマイシン耐性の優性選択マーカーを提供した。 1612bpから384bpのSV40配列の全配列を除いた。この除去により、SV40ウイルスタンパク質、すなわち、スモールt抗原およびVPIの部分をコードする２つのオープンリーディングフレームが取り除かれた。ポリアデニル化領域は、最初は、SV40ウイルスゲノム由来のBcl IからEco Rl の９９３塩基対のフラグメントとしてクローンされた。この領域の外来配列は、ウイルス構造タンパク質VPIをコードしていた。SV40ポリアデニル化シグナルの外来領域の除去は、kRSV HLA-B7(K)から、ポリアデニル化部位を含む２３６塩基対の配列を残して、Eco RIからBam RIのフラグメントを欠失させることによって行った。 SV40スモールｔ抗原イントロンは、イントロン自体のサイズは６４塩基対であるけれども、最初は、６１０塩基対のフラグメントとしてクローンされた。イントロンを含む１４８塩基対の領域を残し、kRSV HLA-B7(K)のPflMIからBsa BI部位の４６２塩基対の部分が除去された。この除去により、スモールｔ抗原のオープンリーディングフレームの本質的に全てが除かれた。このようにして、HLA-B7抗原をコードするプラスミドが、多くの利点を有するように作り出された。例えば、薬剤耐性マーカーをアンピシリンからカナマイシンに変えることにより、例えば遺伝子療法中にプラスミドに暴露される患者が抗生物質関連アレルギー反応を起こすことが防がれる。また、アンピシリンは培養中に分解しやすく、そのため、プラスミドは試験管内(in vitro)での増殖の間に失われがちである。この問題は、カナマイシン選択マーカーの使用により除かれる。重要なことに、SV40のウイルスタンパク質の２つのオープンリーディングフレームをコードする部分を除いたことにより腫瘍発生の危険性が低下する。ベクターは、また、転写およびその後の対象のペプチドの翻訳のため、シストロンを任意に挿入および除去できるカセットとして機能できる。記載したプラスミドのヌクレオチド配列をジーンバンクによりデータベース検索したが、予測オープンリーディングフレームには、ガン遺伝子に対するホモロジーはなかった。また、ここに記載したプラスミドは、線維芽細胞トランスフォーメーションアッセイで分析され、バックグラウンド値を超えてコロニートランスフォーメーションを刺激することはなかった。実施例３改変HLA-B7発現ベクターを用いた発現プラスミドHLA-B7発現ベクターの改変をしないものと、イントロンを除き、β −グロビンコンセンサス翻訳開始配列を付加したものについてFACS分析を行ったところ、これら２つの改変により発現が増大することが判明した。実施例４ HLA-B7およびβ−２ミクログロブリン発現ベクターを用いた発現クラスMHC Ｉタンパク質はβ−２ミクログロブリンと細胞表面に同時トランスポートされる。黒色腫の１０％で、β−２ミクログロブリンおよびクラスＩMHC 発現が無い。クラスＩMHC発現に対するこの潜在的ブロックを克服するため、β −２ミクログロブリンをベクターに入れた。β−２ミクログロブリン陰性ヒト黒色腫系における、β−２ミクログロブリン遺伝子があるときと無いときのHLA-B7 の発現を調べた。FACS分析により、β−２ミクログロブリン遺伝子を含めることによって、そうでなければ発現しない、細胞表面でのHLA-B7タンパク質の発現が可能になることが判明した。実施例５サイトカインを用いる改良療法クラスＩMHC遺伝子を腫瘍に生体内(in vivo)で導入することによって外来MHC 遺伝子に対するＴ細胞応答が導かれ、これは腫瘍関連抗原の認識も導く。腫瘍の免疫原性は、さらに、この外来遺伝子に応答して局所的に産生したＴ細胞を伸長させることのできるサイトカインを入れることにより増強された。この応答がさらに増幅され得るか否かについては、腫瘍内注入において、HLA-B7と組み合わせて他のサイトカイン、例えば、IL-2を試験することができるであろう。さらに、ブタ動脈を生体内(in vivo)で用いるモデルにおいて外来MHC遺伝子発現に対する応答を調べることができるであろう（E.G.Nabel,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5157(1992)）。実施例６ DMRIE/DOPEのトランスフェクション効率 DC-コレステロール/DOPE（モル比５：５）およびDMRIE/DOPE（モル比５：５）を含むカチオン性脂質組成物を実施例１２に記載の手順により細胞をトランスフェクトするのに用いた。DC-コレステロール/DOPEカチオン性脂質とDMRIE/DOPEカチオン性脂質の試験管内(in vitro)でのトランスフェクション効率は、腎臓上皮細胞（293）、ヒト黒色腫細胞系（HMLL）またはマウス線維肉腫（MCA 205）のβ −ガラクトシダーゼ形質導入によって測定した。DC-コレステロール/DOPEに比べ、DMRIE/DOPEは、トランスフェクション効率において約７倍の増加を示した。実施例７ＤＮＡリポソーム複合体の毒性ＤＮＡリポソーム複合体の潜在的毒性を、ＤＮＡリポソーム複合体（下記のプラスミドHLA-B7＋DMRIE/DOPE）を、ヒトの試験に使用される量の約１００倍を超える量、尾の静脈に注射した動物で評価した。有意な変化はなく、主要器官毒性はないことが示唆された。潜在的な心臓毒性に関しては、CPKレベルを分析したところ、注射後の変化はなかった。心電図分析では心筋毒性が認められなかった。血清生化学パラメーターは、一回注射（１）の後、または、多数回注射（３× 、２週間間隔）の後でも正常範囲であった。BUN、クレアチニン、SGOT、SGPT、アルカリ性ホスファターゼ、ビリルビンに変化はなかった。アミラーゼ、リン、総タンパク質も、これらの処置後、急性的にも慢性的にも安定していた。さらに、全身安全性試験でも、これらのＤＮＡリポソーム複合体の使用後、体重の減少、全身性毒性の兆候は認められなかった。実施例８ＤＮＡDMRIE/DOPE複合体による改良療法新規なリポソーム組成物DMRIE/DOPEによる改良療法の可能性を調べた。C57/BL 6マウス(H-2K^b)へ、第０日に、マウス線維肉腫(H-2K^b)のMCA 205サブクローン由来の腫瘍細胞を左後足腿の側面に皮下注射して接種した。予備感作は、BALB/c(H -2K^d)脾臓細胞（５×１０⁶）を第−６日に、同じく（２×１０⁶）を第＋１日に皮下注射することによって行った。腫瘍は、74.7 nmolのDMRIEを乳酸添加リンゲル液中に含み、５μｇのCMVH-2K^bまたはCMVH-2K^dと複合体化したDMRIE:DOPEの５０：５０混合液０．１ｍｌと共に、第１５日、第１８日および第２０日に注射した。直交する２つの直径の積として計算した腫瘍サイズを、第１５日、第１８日、第２１日、第２３日、第２５日、第２８日および第３０日に測定した。結果は、DMRIE/DOPE組成物の濃度で用いたDC-Cholリポソームでは、マウス線維肉腫がトランスフェクトされにくいことを示した。DC-Cholでは見られなかった、著しい抗腫瘍効果が、外来MHC遺伝子（H-2K^d）の導入により得られた。実施例９１，２−ジミリスチルオキシプロピル-３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）の調製 DMRIEは、DOTMAの合成のために開発された方法（Felgner,P.L.et al.,PNAS84: 7413-7417(1987)）を若干修正して合成した。すなわち、３−ジメチルアミノ− １，２−プロパンジオールを、塩基性触媒を用いてミリスチルメシレートと縮合し、対応するジエーテルを得た。この脂肪親和性アミンをクロマトグラフィーで精製した後、高温において２−ブロモエタノールで処理することにより、四級化した。クロマトグラフィーで精製した生成物は、目的のヒドロキシアルキルアンモニウム塩について予測されるものと一致するIR、¹H-NMRおよび元素分析の結果を示した。実施例１０カチオン性リポソームの調製カチオン性リポソームは、フィートン(Wheaton)２ｍｌガラスセプタム(septum )バイアル中で脂質のクロロホルム溶液を混合し、ロータリーエバポレーションによりクロロホルムを除いて、乾燥脂質膜を得ることによって調製した。バイアルを真空下に一晩置き、痕跡量の溶媒を除いた。１ｍｌの脱イオン水を加え、バイアルをシールし、室温で１分間ボルテックスにより混合して、ラージマルチラメラビシクル(MSV)を得た。MLVを窒素下インバーテドキャップソニケーター（ヒートシステム(Heat Systems)）で、６０分間１０℃において超音波処理することにより、超音波処理スモールユニラメラビシクル(SUV)を調製した。実施例１１ポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体の作成ポリヌクレオチド複合体は、０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌポリヌクレオチド溶液を０．５ｍｌの４０〜１００μｇ／ｍｌリポソームと混合して調製した。希釈したポリヌクレオチドとリポソームの溶液は、高濃度ストック溶液を室温で希釈することによって調製した。これにより、自発的にポリヌクレオチドを細胞に送り込む正に荷電した複合体が得られる。正に荷電したリポソームのヌクレオチドに対する種々の比で必要にあわせて使用される。これらの方法は、本質的に、フレグナーら(Flegner,P.L.et al.,PNAS 84:7413-7417(1987)およびFlegner,P.and M.Holm,Focus 11(2)Spring,1989）により記載されたとおりである。また、実施例１４を参照。実施例１２トランスフェクションプロトコルトランスフェクションは９６ウェルのプレートで以下のようにして行った。（1）９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに、１ウェルあたり20,00 0〜40,000の細胞を入れた。（2）ストック溶液からの、カチオン性脂質調製物とヌクレオチド調製物の希釈を２つの別の９６ウェルのプレートで、２次元系列希釈により行った。（3）脂質およびヌクレオチドの対応する希釈液を、等容量のヌクレオチドを対応する脂質のマイクロウェルに移すことによって混合した。（4）血清含有培地を、細胞を含むウェルから蒸発させた。（5）カチオン性脂質／ＤＮＡ複合体の約１００μｌの量をマイクロタイタープレートの各ウェルの細胞に加えた。（6）プレートを３７℃（５％ＣＯ₂）でインキュベートした。トランスフェクション後４〜２４時間目に、Gibco/BRL(Gaithersburg,Md.)製オプティメン（商標）レデューストセラムメデイア(Optimen^TMReduced Semm Media)中１０％血清のアリコートを各ウェルに加えた。（7）インキュベーション終了時に、細胞のアッセイ培地または全細胞溶解物を発現活性についてアッセイした。 β−ガラクトシダーゼがレポータ遺伝子である場合には、２−ニトロフェニル −β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ONPG）またはクロロフェニルレッド−β−Ｄ− ガラクトピラノシド（CRPG）を基質として、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーを用いてプレートを測定し、発現を比色定量によりモニターした。実施例１３カテーテルによる遺伝子デリバリー外来MHC遺伝子の、黒色腫肺転移へのカテーテルによるデリバリー導入を、以前に遺伝子導入治療を受けた患者に用いた。この方法は、許容度が高く、遺伝子導入後の処置の前後（２３／１２平均＝１０対２２／１１平均＝１０）で、動脈血圧に変化はなかった。また、これらの処置後、急性または慢性の毒性は認められなかった。血液学的、化学的および免疫学的アッセイによれば、初回処置から６週間後までの間では、更なる異常は認められなかった。実施例１４ヒト遺伝子治療黒色腫と診断された患者は、臨床研究センターによって認められる者である。注射される塊が特定され、注射前にその境界が測定される。針生検を行い診断を確認する。組織を、さらに免疫組織化学的分析およびPCRのために凍結切片として保存する。さらにこの塊および他のコントロール（非処理）塊を、この処理の直前にＣＴで画像化し、サイズを測定する。腫瘍塊を覆う皮膚を消毒し、０．０１％リドカインで麻酔する。遺伝子導入には、２２ゲージの針を、以下のようにして調製されるＤＮＡリポソーム複合体を注射するのに用いる。デリバリー１０分前に、乳酸添加リンゲル液中のプラスミドＤＮＡ（０．０５〜５０ｍｇ／ｍｌ）の０．１ｍｌをDMRIE/DOPEリポソーム溶液（０．１５〜１５μＭ）の０．１ｍｌに添加する。各成分は、滅菌バイアル中に別々に保存し、FDAにより許容可能と認定されたものである。溶液は、室温に５〜１０分間置かれ、０．８ｍｌの滅菌乳酸添加リンゲル液をリポソームＤＮＡ溶液に加える。ＤＮＡ／リポソーム複合体の最適組成は、各バッチについて、ヒト黒色腫または腎臓細胞ガンの培養に対して独立にＤＮＡ濃度とリポソーム濃度の力価測定をすることにより確立され、使用前に実験動物の黒色腫または他の腫瘍に直接注射することにより確認される。各成分、すなわち、リポソーム調製物およびＤＮＡは夾雑物と毒性について試験され、FDAによりすでに確立されたガイドラインに従って使用される。リポソーム溶液およびＤＮＡは、別個の滅菌バイアルに小分けされ、滅菌条件で混合される。プラスミドの最適用量は、従来の実験的手法により容易に決定できる。例えば、HLA-B7プラスミドの直接注射の用量を最適にするには、用量を段階的に増加させて調べる。４グループの患者を、次のグループの評価の前に、少なくとも１ヶ月観察することによって連続して調べる。各グループの患者は腫瘍内注射を受ける。グループＩは、同じ塊内に０．２ｍｌの注射（３μｇＤＮＡ＋４．５ｎＭDM RIE/DOPE）を３回受ける。グループIIは、１０倍高い濃度のＤＮＡリポソーム複合体を用いて同じ処置を受ける。グループIIIは、１００倍高い用量を受け、グループIVは１０００倍高い用量を受ける。低用量のシトキサンによる前処置で、抑制Ｔ細胞を排除することにより抗腫瘍反応を高めることができる。カテーテルによる遺伝子デリバリーについて、単離した塊を灌流する動脈端への０．６ｍｌの単回注射が閉塞バルーンカテーテルと共に用いられることを除き、同様の用量の段階的増加を用いる。ネズミおよびブタのモデルでは、ここに示した用量の１００倍過剰の用量での処置がされ、十分に許容される。投与は、毒性処置がグレードII以下の患者について繰り返される。患者が、処置によりグレードIII未満の毒性を示す場合には、用量を段階的に増加する。３分の１の患者がグレードIIを超える毒性を示す場合、処置を別の患者で繰り返す。３分の１を超える患者がグレードIIを超える毒性を示す場合、用量を減らす。最大許容用量は、患者の３分の１以上がグレードIIIまたはIVの毒性を示す用量と規定される。処置用量は、最大許容用量未満のあるレベルとして確立される。処置用量が決定されると、別の患者がその用量の段階に入り、より広い適用に関し、この用量の安全性が確かめられる。針により適切な場所に注射をする前に、注射筒で穏やかに吸引して、物質が静脈内に注射されないことを確認する。注射後直ちに血液試料を取得し、血清酵素、化学物質、血球数を検査し、末梢血におけるプラスミドＤＮＡの存在をPCRによって分析する。患者は、臨床研究センターでさらに４８時間観察される。合併症がなければ、４８時間で解放される。異常があれば、患者はさらに観察下に置かれる。遺伝子の導入および発現の確認注射された塊の針生検を、処置後、注射の前に局所麻酔を施術して行う。この組織の一部を処理し、PCR分析用のＤＮＡを得る。残る組織は、病理学的分析、ならびに、免疫組織化学的分析および／または免疫蛍光染色用に処理する。十分な材料が得られない場合、RNA PCR分析も行う。内部器官に関しては、可能であれば、CTまたは超音波ガイド細針生検も行う。免疫応答の分析遺伝子導入の証拠は、また、HLA-B7に対する特異的免疫応答を試験することによっても間接的に得られる。分析は以下の通りに行う。初回処置の２週間前に血液試料を得、エプスタインバール(Epstein-Barr)ウイルスを用いて不死化したリンパ球を誘導する。これらの細胞のアリコートをさらにアンフォトロピックなHL A-B7レトロウイルスベクターに感染させ、発現を細胞表面で確認する。これらの細胞は次に細胞溶解Ｔ細胞アッセイのターゲット細胞として使用される。反復処置処置の副作用が観察されない場合、２週間の間隔をおいて反復注射を検討する。初回処置と同じ用量を、上記と同様のプロトコルと観察により繰り返す。組換え遺伝子発現の確認いくつかの独立した技術を、生体内(in vivo)の組換え遺伝子の存在および発現の評価に使用する。HLA-B7に対するモノクローナル抗体を用い、組換え遺伝子産物を生体内(in vivo)で免疫組織化学により検出する。新たに分散させた細胞の蛍光染色も調べられる。プラスミドＤＮＡの存在は、腫瘍組織、末梢血リンパ球または検死試料組織からのＤＮＡのPCRによって確認される。十分な組織が得られない場合、ＲＮＡを単離しHLA-B7のｍＲＮＡの存在をPCRまたはSlヌクレアーゼ分析により調べる。免疫応答の分析 HLA-B7遺伝子の直接遺伝子導入および発現は、患者をHLA-B7に対し感受性にし、この抗原に対する免疫応答の発生を導くことができる。限界希釈分析（LDA）を、直接遺伝子導入後の末梢血における、HLA-B7に対するヘルパーＴ細胞および細胞溶解Ｔ細胞の割合の変化を評価するのに使用できる。末梢血リンパ球（PBL ）を単離し、初回直接遺伝子導入の前およびその後４週間間隔の時点で低温保存する。処置の完了後、各時点のPBL試料を同時に、HLA-B7遺伝子で形質転換したオートロガスEBV-B細胞と共にLDA条件下でPBLを培養することによりHLA-B7に対する反応性について評価する。IL-2の抗原特異的合成またはHLA-B7陽性ターゲット細胞に対するCTLの生成がこの試験で評価される指標である。抗体の存在は、H LA-B7⁺またはHLA-B7^-細胞系のマッチドペアFACS分析により評価される。場合により、リンパ球は組織培養中に広がった腫瘍から直接単離され、細胞溶解機能について分析される。処置後７〜１４日目の腫瘍生検材料を免疫組織化学により分析する。細胞学的機能を試験するため、ドレイニングリンパ節Ｔ細胞またはTIL 細胞を伸長させてもよい。⁵¹Ｃｒ遊離アッセイにおけるターゲットとして用いるオートロガス細胞系を誘導することが可能である。診断、免疫組織化学分析および低温保存の前に腫瘍組織を摘出し、処置前後の、腫瘍に対する遅延型過敏反応を評価してもよい。本発明の具体的な態様について詳細に記載したが、当業者にはこれらの態様が制限的なものではなく例示的なものであることは明らかであろう。本発明の範囲は以下の請求の範囲で定義されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月２６日【補正内容】請求の範囲１．ＭＨＣクラスＩ鎖をコードする第１シストロンおよびβ−２ミクログロブリンをコードする第２シストロンを含むことを特徴とする、所望の表面抗原を制御可能にコードするプラスミドの、腫瘍への直接遺伝子導入を利用する遺伝子治療に使用するのに適合したポリシストロン性プラスミド。２．前記シストロンが単一のプロモーターの制御下の転写単位に組織されており、前記プラスミドが、前記シストロンの間に位置するインターナルリボソームエントリー部位をさらに含む請求項１に記載のプラスミド。３．前記プロモーターがRSV LTRプロモーターである請求項２に記載のプラスミド。４．前記RSV LTRプロモーターがオープンリーディングフレームもポリアデニル化シグナルも含まない請求項３に記載のプラスミド。５．前記インターナルリボソームエントリー部位がEMCVインターナルリボソームエントリー部位である請求項２に記載のプラスミド。６．前記シストロンが前記鎖をコードする遺伝子のイントロンを欠いている請求項２に記載のプラスミド。７．前記シストロンが、前記鎖をコードする遺伝子に制御可能に結合した翻訳開始コンセンサス配列を含む請求項２に記載のプラスミド。８．前記転写単位に制御可能に結合したウシ成長ホルモン遺伝子転写終結およびポリアデニル化シグナル配列をさらに含む請求項２に記載のプラスミド。９．カナマイシン耐性を制御可能にコードする選択マーカーをさらに含む請求項２に記載のプラスミド。１０．原核生物複製開始点を含みかつオープンリーディングフレームを欠いているpBR322配列をさらに含む請求項２に記載のプラスミド。１１．前記ＭＨＣクラスＩ鎖がHLA-B7である請求項２に記載のプラスミド。１２．（a）前記シストロンが単一のRSVLTRプロモーターの制御下に組織されている転写単位、（b）前記シストロン間に位置するインターナルリボソームエントリ一部位、（c）前記転写単位に制御可能に結合したウシ成長ホルモン遺伝子転写終結およびポリアデニル化シグナル配列、（d）カナマイシン耐性を制御可能にコードする選択マーカー、および（e）原核生物複製開始点を含むpBR322配列をさらに含む請求項１に記載のプラスミド。１３．配列番号：１に記載したＤＮＡ配列を有する請求項１に記載のプラスミド。１４．（a）２以上のシストロン、（b）前記シストロンが単一のRSV LTRプロモーターの制御下に組織されている転写単位、（c）前記シストロン間に位置するインターナルリボソームエントリー部位、（d）前記転写単位に制御可能に結合したウシ成長ホルモン遺伝子転写終結およびポリアデニル化シグナル配列、（e）カナマイシン耐性を制御可能にコードする選択マーカー、および（f）原核生物複製開始点を含むpBR322配列を含むことを特徴とする、所望の遺伝子産物を制御可能にコードするプラスミドの直接遺伝子導入を利用する遺伝子治療での使用に適合したポリシストロン性プラスミド。１５．請求項１に記載のプラスミドを含む医薬組成物。１６．導入促進ビヒクルをさらに含む請求項２０に記載の医薬組成物。１７．前記ビヒクルがトランスフェクション促進カチオン性脂質組成物を含む請求項２１に記載の医薬組成物。１８．前記脂質組成物がDMRIE-DOPEである請求項２２に記載の医薬組成物。１９．前記DMRIE-DOPEが５：５のモル比を有する請求項２３に記載の医薬組成物。２０．医薬的に有効な量の請求項１のプラスミドを、治療の必要のある患者に投与することを含むことを特徴とする、外来表面抗原を制御可能にコードするプラスミドの、腫瘍への直接遺伝子導入を利用する遺伝子治療方法。２１．前記投与がカテーテルによって行われる請求項２５に記載の方法。２２．前記投与が直接の腫瘍内注射を含む請求項２５に記載の方法。２３．前記腫瘍が黒色腫である請求項２７に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ネイベル，ゲイリー，ジェイ. アメリカ合衆国，48105 ミシガン，アンアーバー，アンドーバーロード 3390 番地 (72)発明者ネイベル，エリザベス，ジー. アメリカ合衆国，48105 ミシガン，アンアーバー，アンドーバーロード 3390 番地 (72)発明者ルー，デニスアメリカ合衆国，92024 カリフォルニア, エンシニタス，ワンダーリングロード 2191番地 (72)発明者マークェット，マグダアメリカ合衆国，92037 カリフォルニア, ラジョラ，アベニーダデラスオンダス 8540番地

Claims

【特許請求の範囲】１．生物の組織または細胞に、１つ以上の免疫原性または治療性ペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を導入するのに適合した、前記１つ以上のシストロンとバックボーンを含むベクターであって、前記バックボーンは、 pBR322由来の複製開始点、抗生物質耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝物質、 CMVまたはRSV LTRまたは前記RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異したRSV LTR由来である、前記シストロンに調節可能に結合したプロモーター、および、ウシ成長ホルモン遺伝子またはSV40または前記SV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来である、前記シストロンの発現を促進するポリアデニル化シグナルを含み、さらに、前記バックボーンは、任意に、 EMCウイルス由来である、前記シストロンのメッセージの翻訳を促進するリボソーム結合部位、前記シストロンの発現を促進する翻訳開始配列、および、前記シストロンの転写物のスプライシングを促進する遺伝物質の１つ以上を含むことを特徴とする前記ベクター。２．前記のスプライシングを促進する遺伝物質が、SV40または前記SV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てを欠失したSV40である請求項１に記載のベクター。３．前記ペプチドが、前記組織または細胞に対するＴ細胞免疫を刺激する請求項１に記載のベクター。４．前記ベプチドが、クラスＩ主要組織適合複合体（MHC）抗原、β−２ミクログロブリンまたはサイトカインを含む請求項３に記載のベクター。５．前記MHC抗原が前記生物に対し外来のものである請求項４に記載のベクター。６．前記MHC抗原がHLA-B7である請求項５に記載のベクター。７．前記HLA-B7をコードするＤＮＡが、HLA-B7に本来あるイントロンを欠失している請求項６に記載のベクター。８．前記ベクターが配列番号１のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のベクター。９．前記ベクターが配列番号２のヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のベクター。１０．前記導入が試験管内(in vitro)で起こるものである請求項１に記載のベクター。１１．前記導入が生体内(in vivo)で起こるものである請求項１に記載のベクター。１２．前記生体内導入がカテーテルによって行われるものである請求項１１に記載のベクター。１３．前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記プロモーターが、RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項１に記載のベクター。１４．前記複製開始点、前記の選択マーカーをコードする遺伝物質、前記プロモーター、前記ポリアデニル化シグナル、前記リボソーム結合部位、および、翻訳開始配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のベクター。１５．ポリシストロン性転写単位に組織された複数のシストロンを有し、前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記ポリシストロン性転写単位に制御可能に結合した前記プロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記ポリシストロン性転写単位のプロセッシングを促進する前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項１に記載のベクター。１６．ビシストロン性転写単位に組織された２つのシストロンを有し、前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記ビシストロン性転写単位に制御可能に結合した前記プロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記ビシストロン性転写単位のプロセッシングを促進する前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項１に記載のベクター。１７．１つのシストロンを有し、前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記シストロンに制御可能に結合した前記プロモーターがRSV LTR に本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記シストロンの発現を促進する前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項１に記載のベクター。１８．請求項１に記載のベクターを含む医薬組成物。１９．請求項１に記載のベクターを導入促進ビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。２０．前記ビヒクルがトランスフェクション促進カチオン性脂質組成物を含む請求項１９に記載の医薬組成物。２１．前記トランスフェクション促進カチオン性脂質組成物がDMRIE-DOPEである請求項２０に記載の医薬組成物。２２．前記DMRIE-DOPEが５：５のモル比を有する請求項２１に記載の医薬組成物。２３．前記ビヒクルが感染促進ウイルス性ベクターを含む請求項１９に記載の医薬組成物。２４．ベクターを生物の組織または細胞に導入することを含む、Ｔ細胞免疫の刺激に応答性であることにより特徴づけられる生物の疾患を治療する方法であって、前記ベクターが前記組織または細胞に対するＴ細胞免疫を刺激する１つ以上のペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を含み、前記ペプチドが発現して前記疾患の治療となる、前記方法。２５．前記疾患が腫瘍疾患である請求項２４に記載の方法。２６．前記腫瘍疾患が黒色腫癌である請求項２５に記載の方法。２７．前記ベクターが請求項１に記載のベクターを含む請求項２４に記載の方法。２８．前記導入が試験管内(in vitro)で起こるものである請求項２４に記載の方法。２９．前記導入が生体内(in vivo)で起こるものである請求項２４に記載の方法。３０．前記生体内導入がカテーテルにより行われる請求項２９に記載の方法。３１．前記ベクターが導入促進ビヒクルと組み合わされている請求項２４に記載の方法。３２．前記ビヒクルがトランスフェクション促進カチオン性脂質組成物である請求項３１に記載の方法。３３．前記トランスフェクション促進カチオン性脂質組成物がDMRIE-DOPEである請求項３２に記載の方法。３４．前記DMRIE-DOPEが５：５のモル比を有する請求項３３に記載の方法。３５．前記ビヒクルが感染促進ウイルス性ベクターである請求項３１に記載の方法。３６．生物の組織または細胞に、１つ以上の免疫原性または治療性ペプチドを発現できる１つ以上のシストロンをコードする遺伝物質を導入するのに適合したＤＮＡカセットであって、 pBR322由来の複製開始点、抗生物質耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝物質、 CMVまたはRSV LTRまたは前記RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来である、前記シストロンに制御可能に結合したプロモーター、および、ウシ成長ホルモン遺伝子またはSV40または前記SV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来である、前記シストロンの発現を促進するポリアデニル化シグナルを含み、さらに、任意に、 EMCウイルス由来である、前記シストロンのメッセージの翻訳を促進するリボソーム結合部位、前記シストロンの発現を促進する翻訳開始配列、および、前記シストロンの転写物のスプライシングを促進する遺伝物質の１つ以上を含むことを特徴とする前記ＤＮＡカセット。３７．前記のスプライシングを促進する遺伝物質が、SV40または前記SV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てを欠失しているSV40である請求項３６に記載のＤＮＡカセット。３８．前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記プロモーターが、RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項３６に記載のＤＮＡカセット。３９．前記複製開始点、前記の選択マーカーをコードする遺伝物質、前記プロモーター、前記ポリアデニル化シグナル、前記リボソーム結合部位、および、前記翻訳開始配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を有する請求項３６に記載のＤＮＡカセット。４０．ポリシストロン性転写単位に組織された複数のシストロンを有し、前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記ポリシストロン性転写単位に制御可能に結合した前記プロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記ポリシストロン性転写単位のプロセッシングを促進する前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項３６に記載のＤＮＡカセット。４１．ビシストロン性転写単位に組織された２つのシストロンを有し、前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記ビシストロン性転写単位に制御可能に結合した前記プロモーターがRSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記ビシストロン性転写単位のプロセッシングを促進する前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項３６に記載のＤＮＡカセット。４２．１つのシストロンを有し、前記選択マーカーがカナマイシン耐性を与えるものであり、前記シストロンに制御可能に結合した前記プロモーターがRSV LTR に本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来であり、前記シストロンの発現を促進する前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子由来である請求項３６に記載のＤＮＡカセット。４３．宿主生物と、pBR322由来の複製開始点、抗生物質耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝物質、ポリシストロン性、ビシストロン性またはユニシストロン性転写単位に組織された１つ以上のシストロン、CMV、RSV LTRまたは前記RSV LTRに本来あるポリアデニル化シグナルが変異しているRSV LTR由来である、前記転写単位に制御可能に結合したプロモーター、および、ウシ成長ホルモン遺伝子またはSV40または前記SV40に本来あるオープンリーディングフレームの本質的に全てが欠失しているSV40由来である、前記転写単位のプロセッシングを促進するポリアデニル化シグナルを有する遺伝構築物とを含み、そして、任意に、EMCウイルス由来である、前記転写単位の内部の前記シストロンのメッセージの翻訳を促進するリボゾーム結合部位、前記シストロンの発現を促進する翻訳開始配列、および、前記シストロンの転写物のスプライシングを促進するイントロン配列の１つ以上を含む組換え発現系。４４．前記宿主生物がヒトである請求項４３に記載の組換え発現系。