JPH08511157A

JPH08511157A - Ｘａファクター阻害活性を有する新規ポリペプチド

Info

Publication number: JPH08511157A
Application number: JP6523326A
Authority: JP
Inventors: ジーロン、エリシャ・ピー; ワーバー、モシェ・エム; レバノン、アビグドア
Original assignee: バイオ − テクノロジー・ジェネラル・コーポレーション
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 1996-11-26
Also published as: PT696198E; GR3035722T3; IL109259A0; DE69426598D1; EP0696198B1; DK0696198T3; EP0696198A4; AU6629194A; ES2155472T3; DE69426598T2; WO1994023735A1; NZ265507A; ATE198710T1; AU682361B2; EP0696198A1; CA2159218A1; KR960701649A; HK1013315A1

Abstract

(57)【要約】蛭のHirudo medicinalisから誘導された新規なポリペプチドは、Ｘａ因子を阻害することにより、血液凝固の程度を低下させ得ることが見出された。このポリペプチドは、過剰な血液凝固症状の治療に有用である。該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む組換え生物が、受付け番号第69134の下にＡＴＣＣに寄託された。当該ポリペプチドを産生できる組換え微生物は、受付け番号第69135号、第69137号および第69269号の下にＡＴＣＣに寄託された。

Description

【発明の詳細な説明】ＸＡファクター阻害活性を有する新規ポリペプチド〔発明の背景〕止血は、哺乳類血管系を構成する閉じた高圧の循環系を通しての適切な血流を確保することを目的とした、複雑な一連のプロセスの相互作用である。止血の一つの側面は、損傷後の血管の一体性維持に関与する凝血カスケードである。この凝血カスケードは、血管損傷部位でのフィブリン塊の形成に至る複雑な一連のプロセスである。凝血塊の異常形成は、血栓および塞栓のような病理学的症状の原因である。凝血カスケードは、内因性経路（全てのタンパク成分が血液中に存在している）または外因性経路（組織ファクター、細胞膜タンパクが重要な役割を果たす）の何れかを介して開始され得る。凝血塊の形成に導く凝血カスケードの最後の二つのステップは、両方の経路に共通している。これら二つのステップのうちの最初のステップは、血小板膜表面上のプロトロンビン（トロンビンの酵素前駆体）、Ｘａ因子（ＦＸａ）およびＶａ因子で構成される「プロトロンビナーゼ複合体」の形成である。ＦＸａは、プロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する酵素である。続いて、トロンビンはフィブリノーゲンのフィブリン（凝血塊の主成分である不溶性ポリマー）への変換を触媒する。例えば深静脈血栓症（ＤＶＴ；deep venous thrombosis）のような血栓症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、ならびに心臓血管系および脳血管系疾患のような広範な臨床症状において、抗凝血剤を用いた治療が指示されている。他の適用症には、術後トラウマに伴う病態生理学的症状、肥満、妊娠、経口避妊薬の副作用、特に老齢者における続持性運動抑制（pr olonged immobilization）、並びに血液凝固および血栓症を含む他の公知の臨床症状が含まれる。種々の参照文献が、括弧内のアラビア数字によって参照される。これらの参照文献は請求の範囲の前の明細書末尾に数字の順序で列記されており、その内容は、本件出願に関連する技術の状態を更に説明するための参考として、本願明細書に組み込まれる。抗凝血剤の使用は、ＤＶＴおよびＤＩＣにおいて生じるような静脈血栓症（１４）、および血栓溶解後の再閉塞の際に生じるような動脈血栓症（１５）の治療に有益であり得る。急性冠動脈血栓症における抗凝血剤の使用は、血小板に富む動脈性血栓においても、凝血カスケードが血栓発生の主要な原因であるという確立された事実（１６）に基づいている。過剰な凝血塊形成の病的症状において、凝血は、ヘパリン（その作用は血漿性インヒビターである抗トロンビンIII、即ちヒルジンに媒介される）によりトロンビンの触媒活性をブロックすること、或いは凝血カスケードの初期ステップを阻害することによって阻害され得る。例えば、ヘパリノイド類（ヘパリンの低分子量誘導体）は、トロンビンに先立つ工程の選択的阻害剤であること、即ち、これらはＦＸａへの抗トロンビンIIIの結合を優先的に高めて、ＦＸａに触媒されたプロトロンビンのトロンビンへの変換を阻害することが知られている。Ｘ因子の血中濃度はプロトロンビンの血中濃度よりも略１０倍低いので、凝血を阻害するために必要とされるＦＸａインヒビターの量は、トロンビン阻害剤よりも著しく少量である。更に、ＦＸａは通常はプロトロンビナーゼ複合体中に存在し、その活性は該複合体中で阻害されなければならないであろう。しかしながら、これら抗トロンビンのヘパリン誘導体との複合体による阻害は、血漿中の遊離のＦＸａに対してのみ有効であり、ＦＸａがプロトロンビナーゼ複合体中に組み込まれているとき（これは血栓形成の際のＦＸａの存在部位である）には有効でないように思える。これは、プロトロンビナーゼ複合体中のＦＸａがヘパリン／抗トロンビンIII複合体による阻害に影響され得ないとの開示（６）と類似している。現在のところ、ヘパリンは最も広範に使用されている抗凝血剤および抗血栓性薬剤であるが、これには二つの欠点がある。第一は、これがトロンビン阻害のレベルで作用するので、相対的に大量の阻害剤を必要とすることである。また、第二には、正常な止血に必要なトロンビンの全身的な阻害による過剰出血を生じ易いことである（７）。ヒルジンおよびその低分子量類縁体（ヒルローグ）の使用には、おそらく同様の欠点が伴う。これらの欠点によって、治療的使用に適した新たな抗凝血剤および抗血栓性物質についての研究が促進された。ＦＸａの選択的阻害剤の抗凝血剤としての使用は、ヘパリン、ヒルジンおよびその類縁体のような、現在使用されている抗血栓性薬剤により生じる出血の問題を軽減するかもしれない。ＦＸａインヒビターは既に存在するトロンビンには影響せず、従って正常な止血を完全には中和しないから、上記の予想される利点は、ＦＸａインヒビターが凝血の調節剤として作用するとの事実に起因するものである。これは、存在しているトロンビンがフィブリン塊中に活性形でトラップされ、血栓溶解の際に放出されるからである（１７）。メキシコ蛭のヘメンテリア・オフィシナリス（Haementeria officinalis）（アンチスタシン（antistasin）-参照１および２）およびジャイアントアマゾン蛭（giant Amazonian leech）のヘメンテリア・ジリアーニ（Haementeria ghili ani）（３，４）から、二つの密接に関連したＸａインヒビターが単離された。ダニのオルニトドラス・ムバタ（Ornithodorous moubata）（５，９）から単離された、ダニ抗凝血剤ペプチドと称する第三のＦＸａインヒビターがクローン化され、発現され、精製され、特性が調べられた（１０）。黒蝿のシムリウム・ビッタツム（Simulium vittatum）から単離された、第四の強力なＦＸａインヒビターもまた特徴が調べられている（１１）。イン・ビトロでの研究およびイン・ビボでの研究の両者によって、これら二つの阻害剤（アンチスタシンおよびＴＡＰ）を用いたＦＸａ媒介性の凝血阻害は、静脈血栓症の予防においてヘパリンと同様に首効であることが示されている（１２）。加えて、リグビ（Rigbi）等（１３）は、ヨーロッパ蛭のヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis）の唾液から単離されたＸａ因子インヒビターを開示している。この出願は、公知のＦＸａインヒビターの何れのとも異なる配列をもった、新規なＸａ因子インヒビター（「ＦＸａＩ」）の驚くべき且つ予期し得ない発見を開示する。〔発明の概要〕ここで用いる「ＦＸａＩ」の用語は、ヨーロッパ蛭のヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis）中に存在し、公知のＦＸａインヒビターの何れのとも異なる配列を有する、ＦＸａ阻害活性をもった新規ポリペプチドを意味する。「組換えＦＸａＩ」、「ｒｅｃＦＸａＩ」および「ｒＦＸａＩ」は全て、組換えＤＮＡによって発現されるＦＸａ阻害活性を有する新規ポリペプチドを意味する。また、「ＦＸａＩ」の用語はしばしば、両意を表す曖昧さが存在する可能性のない組換えＦＸａＩを意味するために用いられる。本発明は、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。上記において、Ｘは、ＭＥＴまたは不存在を意味する；Ｙは、下記配列ＬＹＳ・ＭＥＴ・ＣＹＳ・ＴＲＰ・ＡＳＮ・ＬＹＳ・ＧＬＹ・ＣＹＳ・ＰＲＯ・ＣＹＳ・ＧＬＹ・ＧＬＮ・ＡＲＧ・ＣＹＳ・ＡＳＮ・ＬＥＵ・ＨＩＳ・ＡＲＧ・ＡＳＮ・ＧＬＵ・ＣＹＳ・ＧＬＵ・ＶＡＬ・ＩＬＥ・ＡＬＡ・ＧＬＵ・ＡＳＮ・ＩＬＥ・ＧＬＵの０〜２９アミノ酸である。但し、該配列の一部のみ存在するならば、それは該配列のカルボキシ末端部分であり、Ｖａｌ²⁴ はＧｌｙによって先行されている；Ｚは、不存在であるか、或いは図７に示した配列Ｐｒｏ¹¹⁰−Ｌｙｓ¹⁵⁶の全部または一部である。但し、該配列の一部のみ存在するならば、それは該配列のアミノ末端部分である。また、本発明によれば、バクテリア中で上記ポリペプチドを製造する方法、およびバクテリア中で産生された上記ポリペプチドを回収する方法が提供される。更に別の側面において、本発明は、過剰な血液凝固および血栓症の発生によって特徴付けられる状況または症状に適用される治療方法および診断方法における、上記ポリペプチドの使用を提供する。更なる側面において、本発明は上記ポリペプチドに対する抗体を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１：蛭唾液中のＦＸａインヒビターの精製および同定この図は、アミノ酸配列の決定、並びに得られた製剤の同一性および均一性を確証するために行なう種々の実験のために、ＤＬＳからＦＸａインヒビターを精製するために用いる二つの異なったプロトコールを要約している。操作IIにおいては、Ｑ−セファロースの代りにモノ−Ｑが用いられた。図２：プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＥＧ−ＸａＩ−１３“ｍ”の構築実施例１０に記載した、プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＥＧ−ＸａＩ−１３“ｍ ”の構築が示されている。プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＥＧ−ＸａＩ−１３“ｍ” は、λＰ_Lプロモータの制御下に、修飾Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列の６３アミノ酸と、図７に示した配列ｇｌｕ²³−ｌｙｓ¹⁵⁶を有するＦＸａＩ−１３“ｍ”ポリペプチドとを含む融合蛋白を発現する。この１３“ｍ”ポリペプチドは、ＳＯＤ部分とＦＸａＩ部分との間の加工された開裂部位におけるヒドロキルアミン開裂によって得ることができる。プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＥＧ−ＸａＩ−１３“ｍ ”は、受付番号第69269号の下に、大腸菌（E.coli）4300中に形質転換した形でＡＴＣＣに寄託されている。図３：ＦＸａインヒビター単離物およびアンチスタシンのアミノ酸配列比較この図は、クローンＰＣＲ４、ｃＤＮＡクローン類によって発現される天然に存在するＦＸａインヒビターと、アンチスタシンとのアミノ酸配列を比較している。これらの配列は、「進歩した整列方法の単純化」（Feng & Doolittle，J．Mol．Evol，35:351 -356（1987））に基づいて、整列プログラムであるパイルアップ（Pileup）により整列された。ＰＣＲ４は、ＤＬＡ中に存在するＦＸａインヒビターをコードするＰＣＲで誘導されたＤＮＡ配列であり、天然に存在するＦＸａインヒビターの配列を発現する。（第四位置のメチオニンは明らかにＰＣＲ反応のエラーであり、このエラーによって、蛭の唾液から単離された天然に存在するインヒビターで得られるＮ末端アミノ酸配列の第四位置にあるイソロイシンとは異なることが説明される。）ＰＣＲ４は、ＰＣＲで誘導されたクローン類と、蛭の唾液から単離された天然に存在するＦＸａインヒビターの最初の９アミノ酸をコードするヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションによって、実施例３に記載したようにして得られた。１３は、ｃＤＮＡ由来のクローン１３の配列を表し、推定の延長ペプチドを含んでいる（実施例４を参照のこと）。Ａｓは、アンチスタシンの配列を表している。「＜Ｅ」は、ピログルタメートを表す。番号付けはＰＣＲ４の配列に従っている。最良の整列を得るために、ギャップが導入されている。整列されたシステイン残基は強調されている。図４：ＰＣＲによるＦＸａインヒビターＤＮＡのクローニング実施例３に記載したように、１２０匹の蛭から抽出した全ＲＮＡからポリＡ⁺ ｍＲＮＡが単離された。こうして得たポリＡ⁺ ｍＲＮＡの一部（５μｇ）を、下記の合成プライマーＡおよび４ｄＮＴＰｓの存在下において、逆転写反応のテンプレートとして用いた。単鎖の相補型ＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）の合成に続いて、室温において一晩、０．３モルのＮａＯＨでアルカリ処理することによりｍＲＮＡを分解した。中和されたｓｓ−ｃＤＮＡは、Ｔａｃポリメラーゼ、４ｄＮＴＰ類および逆プライマーとしての下記の合成縮重ＤＮＡオリゴマーＢを用いてＰＣＲ増幅された。このＰＣＲ増幅生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。次いで、このゲル精製したフラグメントをプラスミドｐＳ６５のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III大フラグメント中にサブクローン化した。このライゲーション混合物を用いて、大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した。得られた形質転換体を、精製した蛭由来ＦＸａインヒビターのＮ末端アミノ酸１４〜１９に対応する、放射能ラベルされた合成プローブＣ（実施例３に開示）を用いて、その場でのハイブリダイゼーション（in-situ hybridization）によってスクリーニングした。図５：クローンｐＳＰ６５−ＸａＩ−４のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列放射能ラベルしたプローブＣを用いたその場でのハイブリダイゼーションにより同定した陽性クローンから、プラスミドＤＮＡを製造した。クローンｐＳＰ６５−ＸａＩ−４の精製したプラスミドＤＮＡを、サンガーのジデオキシ法によって配列決定した。得られた配列を、ＬＫＢ 2020 ＤＮＡＳＩＳソフトウエアシステムを用いて処理した。図６：ｃＤＮＡからのＦＸａインヒビターｃＤＮＡのクローニング実施例４に記載したようにして、１２０匹の蛭から抽出した全ＲＮＡから得ポリＡ⁺ ｍＲＮＡを、ストラタジーン社のＺＡＰ^TMｃＤＮＡ合成キットを用いた二本鎖相補型ＤＮＡ（ｄｓ−ＣＤＮＡ）の合成のために使用した。こうして得られたｄｓ−ｃＤＮＡをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩで消化されたpBluescriptＳＫと称するUni-ZAPベクター中にサブクローン化した。こうして得られたｃＤＮＡライブラリーを、プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−４の放射能ラベルしたＤＮＡを用い、高い厳格さ及び低い厳格さのハイブリダイゼーション条件下で、ＦＸａインヒビターをコードするクローンについてスクリーニングした。６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：0.15M NaCl，0.015Mクエン酸Na）、0.1％ＳＤＳ、５×デンハート（Denhardt）（0.1％フィコール400，0.1％ポリビニルピロリドン，0.1％ＢＳＡ，0.5％ＳＤＳ）、および100μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡ中でフィルターの予備ハイブリダイゼーションを行い、続いて６０℃で４８時間、放射性プローブとのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを二つの異なった条件で洗浄した。即ち、厳格さの高い条件を得るためには、0.2％ＳＤＳを含有する0.2 -0.5×ＳＳＣを用い、溶液を数回変えながら、６５℃で２時間、フィルターを洗浄した。厳格さの低い条件を得るためには、0.2％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣを用い、溶液を数回変えながら、６０℃で２時間、フィルターを洗浄した。低い厳格さで得られたクローン類の一つのプラスミドを、ｐＳＫ−ＸａＩ−１３で消化した。図７：ｃＤＮＡクローンｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列プラスミドｐＳＫ−ＸａＩ−１３から得た、ＦＸａＩをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３の構築が、実施例６に記載されている。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３の精製ＤＮＡは、サンガーのジデオキシ法によって配列決定された。得られたデータは、ＬＫＢ2020・ＤＮＡＳＩＳソフトウエアシステムを用いて処理された。図８：組換えＦＸａＩをコードするｃＤＮＡのサブクローニングこの図は、実施例６に記載したプラスミドｐＳＫ−ＸａＩ−１３から得たＦＸａＩをコードするＤＮＡを含んだ、プラスミドｐＳＰ−ＸａＩ−１３の構築を示している。プラスミドｐＳＫ−ＸａＩ−１３を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ＦＸａのコーディング領域を含むＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離し、これをＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＳＰ６５中にサブクローン化した。得られたプラスミドは、ｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３と命名された。図９：プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ”の構築プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３は、成熟タンパクの予想Ｎ末端にＡＴＧ開始コドンを含んでいない。この図は、部位指向性突然変異による、アミノ酸Ｖａｌ²⁴に隣接したＡＴＧ開始コドンのプラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３への導入を示している。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３を、ＥｃｏＲＩと、ＦＸａコーディング領域内で開裂するＣｌａＩとで消化した。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３の第二のアリコートを、ＸｍｎＩと、Ａｍｐ^Rコーディング領域内で開裂するＳｃａＩとで消化した。両方のアリコートから、大きい方のフラグメントを単離し、これを下記の合成オリゴマーＤの存在下で変性およびアニールさせて、開始コドンＡＴＧを導入した。次いで、４ｄＮＴＰ類の存在下でＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ）反応を行い、続いてＴ₄ＤＮＡリガーゼでライゲーションを行った。アンピシリン耐性で、且つオリゴマーＤとのハイブリダイゼーションに対して陽性のクローンを、ｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ”と命名した。図１０：発現プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”の構築この図は、λＰ_Lプロモータの制御下において、クローンｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ”によってコードされる、成熟した（“ｍ”）ＦＸａＩポリペプチドの発現のためのプラスミドの構築を示している。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ”を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。ＦＸａＩポリペプチドをコードする該ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIIIＤＮＡフラグメントを単離し、これを、λＰ_LプロモータおよびλｃIIリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を含むプラスミドｐＭＡＬ−183/191のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII消化後に単離された大きい方のフラグメントにライゲートした。このライゲーション混合物を用いて、大腸菌43 00を形質転換した。得られたＦＸａＩを発現するプラスミドは、ｐλ−ＸａＩ− １３−“ｍ”と命名され、ＡＴＣＣ受付番号第69135号として寄託された。図１１：ＳＯＤ−ＦＸａＩ融合タンパクの発現のための、プラスミドｐＤｅｏ −Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”の構築この図は、修飾Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列に由来する５８アミノ酸を含んだポリペプチドフラグメントに融合された、クローン１３により産生される組換えＦＸａポリペプチドの発現するための、ｄｅｏＰ₁Ｐ₂プロモータの制御下にあるプラスミドの構築を示している。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３を、ＳｓｐＩおよびＰｓｔＩで消化した。このＳｓｐＩ−ＰｓｔＩのＤＮＡフラグメントを単離し、プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒの大きい方のＳｃａＩ−ＰｓｔＩフラグメントにライゲートした。得られたプラスミドはｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”と命名され、受付番号第69137号でＡＴＣＣに寄託された。図１２：ＦＸａＩポリペプチド（延長ペプチドに続くＦＸａＩ配列）の発現のためのプラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｌ”の構築この図は、ＦＸａＩの「プレペプチド」の発現のための、λＰＬの制御下にあるプラスミドの構築を示している。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３は、ＰＣＲ技術を利用した部位指向性突然変異によるｍｅｔ³でのＮｄｅＩの導入によって修飾された。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３のＤＮＡは、下記の５ ’合成プライマーと、下記の合成オリゴマーとの存在下において、ＰＣＲ増幅された。その生成物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。次いで、その小さい方のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを、λＰ_LプロモータおよびλｃIIＲＢＳを含むプラスミドｐＭＡＬ−183/191の大きい方のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントにライゲートした。得られたプラスミドはｐλ−ＸａＩ−１３“ｌ”と命名された。図１３：プラスミドｐＤＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”の構築実施例１０に説明したプラスミドｐＤＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ” の構築が示されている。プラスミドｐＤＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”は、ｄｅｏプロモータの制御下に、修飾されたＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列の６３アミノ酸と、図７に示した配列ｇｌｕ²³−ｌｙｓ¹⁵⁶を有するＦＸａＩ１３“ｍ” ポリペプチドとを含んだ融合タンパクを発現する。この１３“ｍ”ポリペプチドは、ＳＯＤ部分とＦＸａＩ部分との間の加工した開裂部位における、ヒドロキシルアミン開裂によって得ることができる。オリゴマーＫおよびオリゴマーＬは、次の配列を有している。図１４：発現プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３−“ｍ”−０５Ｍの構築プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”（ＡＴＣＣ受付け番号第69135号）をＮｄｅＩエンドヌクレアーゼで消化した。線形の大きい方のフラグメントを単離し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼの存在下で、下記の配列を有する合成ＤＮＡフラグメントにライゲート（連結）した。１４℃で一晩ライゲートした後、このライゲーション混合物をＡａｔIIエンドヌクレアーゼで消化し、大きい方のＤＮＡフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントを、予めＡａｔIIおよびＳｓｐＩエンドヌクレアーゼで消化したプラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”の別のアリコートから誘導された小さい方のＡａｔ II−ＳｓｐＩフラグメントにライゲートした。この新たに得られたプラスミドをｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−０５Ｍと命名した。図１５：プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−０５Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂の構築プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−０５ＭをＨｉｎｄIIIエンドヌクレアーゼで消化し、線形のＤＮＡを単離して、これをＤＮＡプラスミドｐＨＧ４４（ 1984年８月20日にＡＴＣＣ受付番号第39806号で寄託された）のＨｉｎｄIIIエンドヌクレアーゼ消化によって得られた小さい方のＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII・Ｔ₁ Ｔ₂ＤＮＡフラグメントにライゲートした。この新たに得たプラスミドは、ｐλ −ＸａＩ−１３“ｍ”− ０５Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂と命名された。図１６：ウサギにおけるＦＸａＩの薬物動態学ＦＸａＩを放射性ヨウ素（¹²⁵Ｉ）でラベルし、ラベルしない材料（比活性：0.13×１０⁶ｃｐｍ／μｇ）と混合し、ウサギに注射した（１０μｇ／ウサギ）。図中で指示した時間間隔で、２時間に亘って血漿サンプルを分析することによって、ラベルした材料はいつでも完全にＴＣＡ沈殿可能であり、またそのレベルは約９６分の半減期で減少することが明らかになった。図１７：ウサギにおけるＦＸａＩの薬力学図中に指示した時間間隔で、２時間に亘ってＡＰＴＴのEx vivo投与に対する応答を測定することによって、ウサギでは、血漿中のＦＸａＩの半減期は約70 -78分であることが明らかになった。図１８：ラットコイルモデル（Rat Coil Model）のための、ＦＸａＩの３回注射レジメＦＸａＩの連続的な血漿レベルを得るために、ex vivoのＡＰＴＴ測定によってＦＸａＩの血漿レベルを評価した。この評価によって、時間ゼロでの最初の静脈投与に続いて、４５分の間隔で最初の投与量の３５％を２回投与することにより、ＦＸａＩの満足すべき血漿プロファイルを得られることが明らかになった。図１９：ラットコイルモデルにおける凝血塊の形成に対するＦＸａＩの効果鋼コイル上に形成された凝血塊の重量を、図に指示したＦＸａの三つの投与量について、（実施例１５に記載したようにして）ラットコイルモデルにおいて測定した。図２０：マウスの尾出血に対するＦＸａＩの影響図に示した種々の投与量のＦＸａＩを静脈注射したマウスにおいて、ＦＸａＩの注射後５分間、尾出血を測定した。図２１：マウスの尾出血に対するヘパリンの影響図に示した種々の投与量のヘパリンを静脈注射したマウスにおいて、ヘパリンの注射後５分間、尾出血を測定した。図２２：ラットにおける急性動脈血栓症に対するＦＸａＩの影響ラットの急性動脈血栓症モデルにおいて、体温変化の是正後に、（実施例１７に記載したようにして）動脈温度の低下（％）を測定した。0.133ｍｇ／ｋｇのＦＸａＩの投与量では、対照との相違は統計的に有意ではなかったが、二つの高投与量については、対照との相違は統計的に有意であった（２０分および４０分でｐ＜0.01-0.05、６０分でｐ＜0.001-0.01）。図２３：ヒヒの動脈血栓症のＦＸａＩによる阻害３頭の異なったヒヒの夫々に、３種類の異なった投与量のＦＸａＩを注射した。１頭のヒヒにはＰＢＳを注射し、これを対照とした。図に指示した時間間隔で、ダクロングラフト（dacron graft）上の¹¹¹Ｉｎ−血小板沈着をガンマカメラで測定した。図２４：ヒヒの静脈血栓症のＦＸａＩによる阻害３頭の異なったヒヒの夫々に、３種類の異なった投与量のＦＸａＩを注射した。１頭のヒヒにはＰＢＳを注射し、これを対照とした。図に指示した時間間隔で、チャンバー内での¹¹¹Ｉｎ−血小板沈着をガンマカメラで測定した。図２５：動脈−静脈シャント系実施例１８で用いた結成発生装置の模式図が記載されている。図２６：発現プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−Ｔ₁Ｔ₂の構築プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”（図１０）をＨｉｎｄIIIエンドヌクレアーゼで消化して線形ＤＮＡを単離し、これを、ＤＮＡプラスミドｐＨＧ４４（1984年８月20日にＡＴＣＣ受付け番号第39806号で寄託された）のＨｉｎｄIII エンドヌクレアーゼ消化によって得た小さい方のＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII・Ｔ₁ Ｔ₂ＤＮＡフラグメントにライゲートした。この新たに得たプラスミドは、ｐλ −ＸａＩ−１３“ｍ”−Ｔ₁Ｔ₂と命名された。〔発明の詳細な説明〕アミノ酸の指定として、下記の略号が用いられる。ＡＡｌａアラニンＣＣｙｓシステインＤＡｓｐアスパラギン酸ＥＧｌｕグルタミン酸ＦＰｈｅフェニルアラニンＧＧｌｙグリシンＨＨｉｓヒスチジンＩＩｌｅイソロイシンＫＬｙｓリジンＬＬｅｕロイシンＭＭｅｔメチオニンＮＡｓｐアスパラギンＰＰｒｏプロリンＱＧｌｎグルタミンＳＳｅｒセリンＲＡｒｇアルギニンＴＴｈｒスレオニンＶＶａｌバリンＷＴｒｐトリプトファンＹＴｙｒチロシン本件特許出願は、蛭の一種であるHirudo medicinalisから誘導された、今まで知られていなかった新規なポリペプチドの同定および特性決定を開示する。この組換えポリペプチドはＦＸａのインヒビターであり、ここでは「ＦＸａＩ」と称する。組換えＦＸａＩはヤギン（Yagin）とも言う。他の側面において、本件出願は、この新規なポリペプチドの完全な遺伝子配列ならびに推定アミノ酸配列を開示する。さらに別の側面において、本件出願は、バクテリア中でのこの新規ポリペプチドの産生とその折り畳みによる、ＦＸａの酵素活性に対する阻害活性をもった生物学的に活性なタンパクの生成を開示する。本発明は、下記のアミノ酸配列を持ったポリペプチド（タンパク）を提供する。上記において、Ｘは、ＭＥＴまたは不存在を意味する；Ｙは、下記配列ＬＹＳ・ＭＥＴ・ＣＹＳ・ＴＲＰ・ＡＳＮ・ＬＹＳ・ＧＬＹ・ＣＹＳ・ＰＲＯ・ＣＹＳ・ＧＬＹ・ＧＬＮ・ＡＲＧ・ＣＹＳ・ＡＳＮ・ＬＥＵ・ＨＩＳ・ＡＲＧ・ＡＳＮ・ＧＬＵ・ＣＹＳ・ＧＬＵ・ＶＡＬ・ＩＬＥ・ＡＬＡ・ＧＬＵ・ＡＳＮ・ＩＬＥ・ＧＬＵの０〜２９アミノ酸である。但し、該配列の一部のみ存在するならば、それは該配列のカルボキシ末端部分であり、Ｖａｌ²⁴ はＧｌｙによって先行されている；Ｚは、不存在であるか、或いは図７に示した配列Ｐｒｏ¹¹⁰−Ｌｙｓ¹⁵⁶の全部または一部である。但し、該配列の一部のみ存在するならば、それは該配列のアミノ末端部分である。このポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドの同族体であるポリペプチド類をも包含すると解釈されるべきである。好ましい態様において、当該ポリペプチドはアミノ酸配列Ａ−Ｌｙｓ²−Ｌｙｓ¹⁵⁶、Ｉｌｅ²⁹−Ｌｙｓ¹⁵⁶、Ｇｌｕ²³−Ｌｙｓ¹⁵⁶またはＡ−Ｖａｌ²⁴−Ｌｙｓ¹⁵⁶（Ｌｙｓ²−Ｌｙｓ¹⁵⁶、Ｉｌｅ²⁹−Ｌｙｓ¹⁵⁶、Ｇｌｕ²³−Ｌｙｓ¹⁵⁶およびＶａｌ²⁴−Ｌｙｓ¹⁵⁶は、図７に示した配列と同一である）を有し、ＡはＭＥＴまたは不存在であり、Ｖａｌ²⁴はＧｌｙに先行されている。別の側面において、本発明は、生物学的に活性な組換えＦＸａＩを提供する。生物学的に活性なＦＸａＩは、実施例２に記載した生物学的活性試験によって測定されるＸａ因子の酵素活性を阻害するような活性を有するＦＸａＩとして定義される。阻害活性は、上記の生化学的試験によって測定されるＸａ因子の酵素活性を低下させる活性として定義される。ＦＸａの酵素活性が低下する結果として、血液凝固の程度は減少する。本発明のポリペプチドは、ＦＸａの阻害剤であることの代わりに、またはこれに加えて、別のまたは追加の生物学的活性を有し得ると思われる。特に、凝血カスケードの他の因子に対する阻害活性を有し得る。ここで用いる場合、本発明のポリペプチドの同族体とは、当該ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列および生物学的活性を有するポリペプチドである。従って、この同族体は、結果として得られるポリペプチドが本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持する限り、１以上の本質的でないアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって、本発明のポリペプチドとは異なってもよい。当業者であれば、確立された周知の方法を用いて、如何なるアミノ酸残基を付加、欠失または置換（何れのアミノ酸で置換するかを含めて）し得るかを容易に決定することができる。この周知の方法には、例えば、主題ポリペプチドに関する同族体ポリペプチドのバクテリアでの発現をコードするＤＮＡ配列の設計および製造、部位指向性突然変異技術によるｃＤＮＡおよびゲノム配列の修飾、組換えタンパクおよび発現ベクターの構築、ポリペプチドのバクテリアでの発現、および従来の生化学的試験によるポリペプチドの生化学的活性の測定のための従来の方法が含まれる。同族体の例には、主題ポリペプチドで特定された全残基よりも少ない残基を有する欠失同族体、１以上の特定の残基が他の残基で置き換えられた置換同族体、および１以上のアミノ酸残基が当該ポリペプチドに加えられた付加同族体がある。これらすべての同族体は、本発明のポリペプチドの生物学的活性を共有している。実質的に同じアミノ酸配列とは、ここでは、ＦＸａＩのアミノ酸配列のＮ末端において、４アミノ酸未満の付加または欠失を含むものとして定義される。更に、当該タンパクの生物学的活性を失わないような、配列における置換および／または欠失が存在し得る。このような置換は、当業者には公知である。例えば、Le hninger，Biochemistry, 2nd ed．Worth Pub.，N.Y．（1975）；Creighton，Protein Structure，a Practical Approach ，IRL Press at Oxford Univ．Press，Oxford，England（1989）；and Dayhoff ，Atlas of Protein Sequence and Structure 1972，National Biomedical Rese rchFoundation，Maryland（1972）に記載された同族体または均等基（equvalent groups）に従って、置換には１０残基までが含まれ得る。実質的に同じ生物学的活性とは、同じ生物学的活性になることが当業者に知られている程度に、僅かに異なり得るポリペプチドの活性と同じ生物学的活性をいう。本出願は、ヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis）のｃＤＮＡライブラリーに由来するｍＲＮＡから単離されたＤＮＡを開示する。このＤＮＡまたはその一部によってコードされるポリペプチドはＦＸａのインヒビターであるが、該ＤＮＡヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、リグビ（Rigbi）（１３）によって開示された公知の天然に存在するＦＸａインヒビターの配列とは実質的に異なっている。この新規なポリペプチドの存在は従来開示されていない。本発明のポリペプチドは、延長ペプチドもしくは融合ペプチドが存在しない「成熟した」タンパクとして、リーダーペプチドもしくは延長ペプチドを含むプレペプチドとして、または他のタンパクもしくはポリペプチドの全部もしくは一部を含む融合ペプチドとして得ることができる。成熟タンパクは、直接の発現によって、または融合ポリペプチドもしくはプレペプチドの開裂によって得ることができる。特定の態様において、組換えＦＸａＩは、λＰ_Lプロモータの制御下にあるプラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”、プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−Ｔ₁ Ｔ₂、またはプラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”-0.5Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂を含む大腸菌（E．coli）4300によって、成熟ポリペプチド（即ち、リーダーペプチドもしくは融合タンパクのような、アミノ末端もしくはカルボキシ末端の延長部をもたない）として発現される。他の態様において、この組換えＦＸａＩは、修飾されたＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列のＮ末端の最初の５８アミノ酸に融合された組換えＦＸａＩを発現する、ｄｅｏプロモータの制御下にあるプラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”を含む大腸菌733によって、融合ポリペプチドとして産生される。Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤは、一緒に譲渡された米国特許第4,742,004号に記載されており、またSteinma n，H.M.，Superoxide Dismutase，（Oberley，ed.）CRC Press，Florida，p.p.1 1-68，1982に記載されている。更に別の態様においては、この組換えＦＸａＩは、プラスミドｐλ−ＸａＩ− １３“ｌ”を含んだ大腸菌4300により発現された、推定延長配列を含むプレペプチドとして得られる。より好ましい態様において、この組換えＦＸａＩは、修飾Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列の６３アミノ酸フラグメントと、ヒドロキシルアミン開裂部位と、図７に示した配列ｇｌｕ²³−ｌｙｓ¹⁵⁶を有するＦＸａＩ−１３“ｍ”ポリペプチドとを含む融合ポリペプチドをコードするプラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”によって、融合ポリペプチドとして産生される。当業者は、該融合タンパクを加工開裂部位で開裂させることによって、容易にＦＸａＩ−１３“ｍ”ポリペプチドを得ることができる。こうして、成熟組換えＦＸａＩは、公知の方法により、直接発現または融合タンパクもしくは融合ポリペプチドの開裂によって得ることができる。更に、当業者は、公知かつ容易に利用可能な材料および方法を用いて、他の融合タンパクおよびＦＸａＩ−ＤＮＡをコードするＤＮＡの他の操作から、成熟ＦＸａＩを得る方法を熟知している（例えば、Nilsson et al.，Current Opinion in Structura l Biology，2:569-575（1992） and Hopp et al.，BioTechnology 6:1204-1210 （1988））。本発明は更に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含んだ発現プラスミドを提供する。当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させるために用い得るベクターとしては、バクテリオファージ（例えばλファージ）のようなバクテリアウイルス、コスミド、プラスミド、およびその他のベクターが挙げられる。問題のポリペプチドをコードする遺伝子は、当該技術で周知の方法によって、適切なベクターに挿入される。例えば、従来の制限エンドヌクレアーゼを用いることにより、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡの双方を開裂させて、相互に相補的な末端対を生じさせ、次いでＤＮＡリガーゼで連結することができる。或いは、ベクター中の制限部位に対して相補的な塩基配列を含む合成リンカーを挿入ＤＮＡに連結し、次いで当該部位で切断する制限酵素を用いて消化することができる。他の手段もまた利用可能であり、これら手段は当業者に公知である。当該ポリペプチドをコードする配列を含んだベクターは、広範な原核ホスト細胞または真核ホスト細胞、例えばバクテリア、真菌、酵母、植物、昆虫、並びにＣＨＯ、ニワトリ胚、繊維芽細胞、腎よび他の公知の細胞系のような哺乳動物細胞における発現に適用され得る。これらのベクターは更に、前記ホスト中において該ポリペプチドを発現するように、当該ポリペプチドをコードする配列に対して位置づけられた、クローン化遺伝子の発現に必要な調節要素を含んでいる。発現に必要な調節要素の例には、プロモータ、オペレータ、およびリボゾーム結合部位が含まれる。例えば、バクテリア発現ベクターは、λＰ_LＯ_Lまたはｄｅｏプロモータおよびオペレータのような、プロモータ／オペレータ系を含み得る。翻訳の開始には、λＣ₁₁またはｄｅｏリボゾーム結合部位のようなリボゾーム結合部位が用いられ得る。また、リップレッサおよびエンハンサのような適切な要素が存在していてもよい。種々の発現系に適した調節要素を用いる方法は、当業者が熟知するところである。上記の調節要素は、適切なホスト細胞において当該ポリペプチドを発現するように、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関連してプラスミド内に配置される。本発明の好ましい態様において、調節要素は当該ポリペプチドをコードするＤＮＡに近接して、その上流に配置される。他の適切な調節要素は当業者に公知である。このようなベクターは商業的に得られ、或いは当該技術において周知の方法により、刊行物に記載された配列から構築され得る。このような刊行物としては、例えば、λＰ_Lに関する方法を開示している１989年５月16日に発行された米国特許第4,831,120号および1992年９月１日に発行された米国特許第5,143,836号、並びにｄｅｏプロモータに関する方法を開示している1989年２月22日に発行されたヨーロッパ特許出願公開第303,972号が挙げられる。本発明は、上記組換えタンパクの何れかをコードするプラスミドを提供する。一つの好ましい態様は、1992年12月１日にＡＴＣＣ受付け番号第69134号の下に寄託されたプラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３である。スミドｐＳＰ６５− ＸａＩ−１３は、適切な調節要素を欠いているから、何れのタンパクをも発現しない。しかし、組換えＦＸａＩの発現を得るために、プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３を操作する方法は当業者の熟知するところである。より好ましい態様において、これらのプラスミドは、1992年12月１日にＡＴＣＣ受付け番号第69137号で寄託されたｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”と称する発現プラスミド、1992年12月１日にＡＴＣＣ受付け番号第69135号で寄託されたプラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”および1993年３月23日にＡＴＣＣ受付け番号第69269号で寄託されたプラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ ”である。更なる別の好ましい態様において、前記発現プラスミドは、プラスミドｐλ− ＸａＩ−１３“ｍ”−Ｔ₁Ｔ₂、ｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−05Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂、およびｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”−05Ｍである。当業者であれば、この出願に関連して寄託されたプラスミド類が、公知の方法（例えば部位指向性突然変異またはリンカーの挿入）によって、関連ポリペプチド類（同族体）の発現をコードするように容易に変更され得ることを理解するであろう。このような技術は、例えばSambrook，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis ，T．（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manula，2nd edition，Cold S pring Harbor Laboratory Pressに記載されている。本発明の発現プラスミドは、適切なホスト細胞、好ましくはバクテリアホスト細胞に導入され得る。しかし、当業者であれば、本発明の発現プラスミドが、既述の広範な原核細胞および真核細胞へ導入するために適切に修飾され得ることを理解するであろう。ホストとして用いるバクテリアは、栄養要求性株（例えばE ．coli A1645）、原栄養株（例えばE.coli A4255）および溶菌株；Ｆ⁺株およびＦ^-株；λプロファージのｃＩ⁸⁵⁷リプレッサ配列を含む株（例えばE．coli A164 5およびA4255）；およびｄｅｏリプレッサおよび／またはｄｅｏ遺伝子（1989年２月22日に公開されたヨーロッパ特許出願公開第0303972号を参照のこと）の何れであってもよい。大腸菌（Esche richia coli ）A4255はＡＴＣＣ受付け番号第53468号で寄託されており、また大腸菌Ｓφ930はＡＴＣＣ受付け番号第67706号で寄託されている。好ましい態様において、E．coli 4300はλＰ_Lの制御下でのプラスミド発現のためのホストとして用いられ、E．coli 733はｄｅｏプロモータの制御下でのプラスミドの発現のためのホストとして用いられる。好ましいバクテリアホスト細胞は、Escherichia coli細胞である。適切なEsch erichia coli 細胞の例は、733株および4300もしくは4300(F)株であるが、他のEs cherichia coli 株および他のバクテリアもまた、プラスミドのホストとして使用することができる。真核細胞の一例は昆虫細胞である。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現系を含むＳｆ−９細胞である。本発明は、上記の発現プラスミドの何れれかと共にバクテリア細胞を含んだ、ホスト／プラスミド系を提供する。上記全てのE．coliホスト株は、当該技術において周知の方法、例えばR.P．No vick（1969年）によってBacteriol.Review 33，210に開示された臭化エチジウム法により、該ホスト株が有するプラスミドを「除去（cure）」され得る。ここに開示したポリペプチドを、異なったプラスミドおよび／または遺伝子コードの縮重に起因して同じアミノ酸配列をコードする異なったヌクレオチド配列から製造する方法は、当業者の了知するところである。また、当業者は、当該ポリペプチドの構造または特異的な生物学的活性に影響しない程度の、アミノ酸の微少な変更を有する実質的に同一な同族体を製造することができる。このような同族体もまた、本発明に包含されるものである。加えて、本発明は生物学的に活性な組換えＦＸａＩの製造方法であって、当該ポリペプチドをコードする発現プラスミドでホスト細胞を形質転換する工程と、この形質転換されたホスト細胞を、該細胞が前記プラスミドによってコードされるポリペプチドを産生するように培養する工程と、こうして産生されたポリペプチドを回収する工程とを具備した方法を提供する。別の側面において、本発明は、生物学的に活性な組換えＦＸａＩポリペプチドを製造する方法であって、前記ホスト細胞がバクテリア細胞であり、また前記回収工程は、（a）前記細胞を破壊して、前記ポリペプチドを含む溶解物を製造する工程と、（b）前記溶解物を処理して、前記ポリペプチドを含む包接体（inclusion b ody）を得る工程と、（c）該包接体を処理して、可溶形の前記ポリペプチドを得る工程と、（d）得られた可溶性ポリペプチドを処理して、生物学的に活性なポリペプチドを形成する工程と、（e）こうして形成された生物学的に活性なポリペプチドを回収する工程と、（f）こうして回収された生物学的に活性なポリペプチドを精製する工程とを具備する方法を提供する。好ましい態様において、工程（c）の処理工程には変性剤の添加が含まれ、工程（d）の処理工程には前記ポリペプチドをチオール含有化合物およびジスルフィドに接触させることが含まれ、工程（f）の精製工程にはカラムクロマトグラフィーが含まれる。より好ましい態様において、前記変性剤は塩化グアニジニウムまたは尿素であり；前記チオール含有化合物はグルタチオン、チオレドキシン、β−メルカプトエタノールまたはシステインであり；前記ジスルフィドは酸化されたグルタチオン、シスチンまたはメルカプトエタノールの空気酸化生成物であり；前記カラムクロマトグラフィーには、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーおよびヘパリン −セファロースクロマトグラフィーの何れか一方もしくは両方、またはＱ−セファロースクロマトグラフィーおよびＳ−セファロースクロマトグラフィーの何れか一方もしくは両方が含まれる。本発明は更に、前記生物学的に活性なポリペプチドからもたらされる望ましい治療効果を得るために有効な上記何れかのポリペプチドと、適切なキャリアとを含有する組成物を提供する。好ましい態様において、前記望ましい治療効果は、血液凝固および血栓症の程度を低下させることである。血液凝固の程度は、ＡＰＴＴのようなイン・ビトロでの凝固試験によって表すことができる。本発明はまた、血液凝固の程度を低下させる方法であって、血液を、血液凝固の程度を低下させるのに有効な量の請求の範囲に記載したポリペプチドと接触させることを具備する方法を提供する。好ましい態様において、前記の接触は、患者においてイン・ビボで行われる。もっとも好ましい態様において、患者は過剰な血液凝固に罹患している。特定の態様において、過剰血液凝固に罹患している患者は、血管疾患、術後外傷、並びに肥満、妊娠、経口避妊薬の使用および続持性運動抑制（prolonged im mobilization）に付随した静脈血栓塞栓症の傾向からなる群から選択される症状を有している。従って、本発明は、卒中または他の脳血管障害のような脳血管障害における、血液凝固および血栓症の程度を低下する方法を提供する。本発明は、血栓症、特に静脈血栓症、より特定的には深静脈血栓症または散在性血管内凝血で生じる過剰な血液凝固の症状において、血液凝固の程度を低下させるための方法を提供する。本発明は更に、冠動脈の血栓症のような動脈血栓症で発生する過剰な血液凝固の症状において、過剰な血液凝固の程度を低下させる方法を提供する。上記のように、血栓症はしばしば血栓溶解に続いて発生する。従って、本発明は血栓溶解の後の血液凝固の程度を低下する方法を提供する。好ましい態様において、血栓症は血栓溶解剤で生じる。特定の態様において、該血栓溶解剤は組織プラスミノーゲン活性化剤またはストレプトキナーゼである。当該ポリペプチドは、血栓溶解剤を投与している間またはその投与の後に、或いは血栓溶解剤に結合させて投与すればよい。本発明はまた、Ｘａ因子の活性を阻害する方法であって、Ｘａ因子を、Ｘａ因子の活性を阻害するのに有効な量のポリペプチドと接触させることを具備した方法を提供する。更なる態様において、本発明のポリペプチドは、再発性インフルエンザ感染の予防に用いてもよい。インフルエンザ感染は、ウイルスによる細胞の感染および再感染を含むダイナミックなプロセスである。Ａ型インフルエンザ感染に関連する活性化酵素は、ニワトリ血液凝固因子Ｘａに極めて類似していることが示されている（Gotoh B．el al．（1992），EMBO J．9:4185-4190 and Ogasawara T．e t al（1992），EMBO J．11:467-472）。従って、対応するヒトＦＸａは、ヒトに生じるインフルエンザ感染に関与する可能性がある。ＦＸａ阻害剤は、再発性インフルエンザ感染の予防に有用であると思われる。特定の態様において、ＦＸａ阻害剤は本発明のポリペプチドである。また、当該ポリペプチドは、追加の治療剤との組み合わせにおいて投与され得ると思われる。特定の態様において、この追加の治療剤は、酸素フリーラジカル消去剤（oxyg en free radical scavenger）が含まれる。好ましい態様において、この酸素フリーラジカルは、スーパーオキシドジスムターゼである。更に好ましい態様においては、このスーパーオキシドジスムターゼはＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ（米国特許第4,742,004号）またはＭｎＳＯＤ（一緒に譲渡された1992年２月2 7日出願の米国特許出願第842,740号および英国特許第GB 2,183,658号）である。このような治療は、インフルエンザ感染を扱う現在利用可能な治療法および予防法を凌駕する多くの利点を有するであろう。現在使用されているインフルエンザ予防法は、インフルエンザウイルスに対する免疫感作に基づいている。この方法は、インフルエンザウイルスの突然変異の頻度が高いこと、並びにウイルス株が多いことに起因して、信頼性がないことが立証されている。従って、感染メカニズムを阻害する薬剤の使用は、ウイルス粒子の免疫学的性質に依存せず、従って特定の株には限定されない点において極めて有利である。更に、インフルエンザは気管支肺疾患であるから、治療薬は好ましくはエアロゾルとして投与されるであろうから、単純な投与方法が提供される。更なる側面において、本発明は当該ポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体を提供する。特別の態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。本発明はまた、当該抗体の特異的な反応を拮抗的に阻害するポリペプチドを包含する。本発明に関連して寄託されたプラスミドおよび株本発明による方法の実施に有用な種々のプラスミドおよびE．coli株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、且つこれを満たすために、メリーランド州20852、ロックウイル、12301パークローンドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。これらプラスミドには、E．coli MC1061中に導入された形でＡＴＣＣ受付け番号第69134号の下に寄託された、プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３（これは、クローン１３のＦＸａＩをコードするｃＤＮＡを含む）；E．coli 733中に導入された形でＡＴＣＣ受付け番号第69137号の下に寄託された、プラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”（これは、ヒトＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤの修飾配列の５８Ｎ末端アミノ酸に融合されたｄｅｏプロモータの制御下に、ＦＸａＩ阻害剤を発現する）；E．coli 4300中に導入された形でＡＴＣＣ受付け番号第69135号の下に寄託された、プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”（これは、成熟ＦＸａＩポリペプチドを発現する）が含まれる。これらのプラスミドは1992年12月１日に寄託された。1993年３月24日に、E．coli 4300（F）の中に導入された形で、ＡＴＣＣ受付け番号第69269号の下に寄託されたプラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ −ＸａＩ−１３“ｍ”は、修飾Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列の６３アミノ酸フラグメントと、ヒドロキシルアミン開裂部位と、ＦＸａＩ−１３“ｍ”ポリペプチドとを含む開裂可能な融合タンパクを発現する。寄託されたバクテリア株は、上記で述べたようにＡＴＣＣ受付け番号第69135号の下に寄託された、λＰ_Lプロモータによって制御されるプラスミドのホスト細胞であるE．coli 4300と；上記のようにＡＴＣＣ受付け番号第69137 の下に寄託された、ｄｅｏプロモータによって制御されるプラスミドのホスト細胞であるE．coli 733である。更に、λＰ_Lプロモータを含むベクターであるプラスミドｐＭＬＫ−１００は、E．coli 4300に導入された形で、ＡＴＣＣ受付け番号第68605号の下に、1991 年２月６日に寄託された。また、Ｔ₁Ｔ₂転写停止配列を含むベクターであるプラスミドｐＨＧ４４は、E．coliに導入された形で、ＡＴＣＣ受付け番号第39806号の下に、1984年８月20日に寄託された。以下に述べる種々の実施例は、本発明を理解する上での一助とする事を目的とするものであり、本発明の範囲をこれらの例だけに限定しようとする意図はなく、そのように解釈されてはならない。これら実施例には、相補的ＤＮＡの単離、ベクターの調整、ポリペプチドをコード化している遺伝子のそれらベクターへの挿入する、或いは細菌宿主中への調製済みプラスミドの導入に関する詳細な説明は含まれていない。これらの方法は、当該分野の技術者にとって公知であり、また、Sambrook，FrischおよびManiatis著、MolecularCloning:A laboratory Manu al ，第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版局、米国（１９８９）等、数多くの刊行物に記載されている。実施例１及び２においては、Hirudo medicinalisの唾液に由来する天然のＦＸａ阻害物質の分類及び特性分析のための方法に関して説明がなされている。実施例３〜１８においては、上記方法により得られたポリペプチドを、本発明の新規ポリペプチドをコードする新規なＤＮＡ配列の同定に用いる方法、並びに新規で且つ発明性を有する本発明の他の実施例について説明がなされている。実施例１：Ｈ．ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓに由来する天然のＦＸａ阻害物質の精製 Hirudo medicinalis由来のヒル唾液希釈液（ＤＬＳ）からＦＸａ阻害物質を精製した。ＤＬＳは、Rigbi et al.，Comp．Biochem．Physiol．87B：567-573（19 87）の方法に従って調製した。簡単に説明すると、生理食塩水中に0.001Ｍアルギニンを含む摂食本能刺激性溶液（phagostimulatory solution）を、円筒の両端開口部を覆って張り付けられた洗浄済みの膜（ソーセージ用外被、Nippi Gelatin Casting，東京、日本から入手）面に注いだ。次に、飢餓状態においたヒルの、極度に大きい前腸膨脹部内にＤＬＳを吸い込ませて、これを飽満状態にした。給飼液は撹拌しなかったので、この溶液中に分泌された唾液は大部分が再吸入されたと思われる。給飼を中断した後、ヒルの後端側から前方に向かって扱き、口部から、その唾液を含んだ消化液を強制的に吐き出させた。この希釈ヒル溶液（ＤＬＳ）と称する無色の液体を採集した。ＤＬＳから各種タンパク質を精製する方法を以下に述べる。これら二つの方法は類似しており、４級アミノエチルカラム（Mono-QまたはQ-Sepharose）による陰イオン交換クロマトグラフ処理後、Superose 12によるゲル濾過クロマトグラフ処理またはヘパリン・セファロースによるアフィニティー（親和性）クロマトグラフ処理を用いる方法である。いずれの場合にも、調製された物質の正体およびその均一性を確認する為に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ポリアクリルアミド電気泳動法］及び、これを補強する意味で、少なくとも一つ以上の別の方法を用いる。本精製方法については、図１にその概要を示した。１．Ｍｏｎｏ−Ｑ担体による処理に続いてSuperose12担体処理を用いる精製方法２５匹前後のヒルから採集したＤＬＳ（150ｍｌ）を等量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.9）で希釈した後に、FPLC Mono-Qカラム（５×５０ｍｍ）にかけた。同緩衝液（８０ｍｌ）に溶解させた0-0.5M ＮａＣｌの線形濃度勾配溶出法（流速＝１ｍｌ／分）を用いて溶離した。この際に、280ｍｍでの吸光度を監視した。その後、再度、同緩衝液（２０ｍｌ）中に溶解した0.5M-1M ＮａＣｌによる濃度勾配溶出法を用いてカラムを洗浄した後、同一流速で、５ｍｌの1M ＮａＣｌを用いて、ダメ押し洗浄を行った。画分は１ｍｌずつ収集した後、ＦＸａ阻害活性およびヒルジン活性を測定した。ＦＸａ阻害活性に対するピークは、ほぼ0.35M ＮａＣｌ濃度の位置において、ヒルジンのピークに対して分離した形で溶離されたので、ＦＸａ阻害活性を示す画分を集めて、Supeose 12充填カラム（10×900ｍｍ；即ち、10×300ｍｍカラム３連）にかけた。150mM ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を、毎分０．３ｍｌで流しながら、室温下で溶出させた。２８０ｎｍでの吸光度を監視した。上記の条件の下で、ＦＸａ阻害活性は、見掛け上、４ｋＤの分子量を持つ単一のピークとして溶離された。これとは対照的に、精製処理を施したＦＸａ阻害活性を含む画分を、トリシン・ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて電気泳動させた場合には、ほぼ１４ｋＤの分子量に対応する単一バンドが出現した。実施例２で述べる事になるが、該分子量決定に関する矛盾の原因は、Superose 12がＦＸａ阻害物質と相互作用を行った結果、ＦＸａ阻害物質のカラムからの溶離が遅延した為であるとも考えられる。この精製済みポリペプチドは更に、逆相ＨＰＬＣ［高速液体クロマトグラフ法］（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、分析された。即ち、阻害物質をSuperose 12カラムにかけて精製し、凍結乾燥した後、１ｍｌの0.1％三臭化酢酸に溶解させ、最後にKontronモデル420/422 HＰＬＣ装置に組み込んだ７μＲＰ-300充填カラム（Aquapore，Brownlee Labs製）に、かけた。線形濃度勾配下、アセトニトリルを含む０．０１％三臭化酢酸溶液（６０ｍｌ）を毎分１ｍｌで流す事によって、溶出処理を行った。この際、２２０ｎｍでの吸光度を監視した。保持時間38.51 分の単一ピークが観察された。これによってＦＸａ阻害物質は精製されて、１００％均一化された事が実証された。２．Ｑ−セファロースカラム処理後、ヘパリン−セファロースカラム処理による精製５０匹前後のヒルから得られたＤＬＳ（320ｍｌ）を、等量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.9）で希釈し、Ｑ−セファロースカラム（１０×５０ｍｍ）にかけた。カラムからの溶出処理は、同緩衝液（７０ｍｌ）に溶解させた0-0.5M ＮａＣｌによる線形濃度勾配下で、毎分１ｍｌの流速で行った。その間、280ｎｍでの吸光度を監視した。次に、同緩衝液に溶解させた1M ＮａＣｌを、同流量で流してカラム洗浄を行った。画分を、各々１ｍｌずつ採取してから、ＦＸａ阻害活性およびヒルジン活性について分析した。その結果、ＦＸａ阻害活性のピークは、確実に、ヒルジンのピークに対して分離された事が裏付けられた。このＦＸ阻害物質は、ほぼ0.3mM ＮａＣｌ濃度の位置で、溶離されたが、この事は、前述したMono-Qによる溶離位置とほぼ同一の位置であった。ＦＸａ阻害活性を示す画分は、一つに纏めて、20mM トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8. 9）中で透析した。次に、その７ｍｌをヘパリン・セファロースカラム（１０× ５０ｍｍ）にかけた。0-0.5M ＮａＣｌによる線形濃度勾配で、同緩衝液（70ｍｌ）に溶解させたＮａＣｌ溶液を、毎分１ｍｌの流速で流して溶出処理を行った。そして、同時に280ｎｍでの吸光度を監視した。引き続いて、このカラムを、同一の緩衝液に溶解した1M ＮａＣｌ溶液を用いて同一流速で洗浄処理した。１ｍｌずつ採取した各画分のＦＸａ阻害活性を分析した。精製率の極めて高い、ＦＸａ阻害活性を示す物質は、ほぼ0.35MのＮａＣｌ濃度位置に単一ピークとして溶離された。本方法を使用した場合、ＦＸａ阻害物質は約６００倍に濃縮精製され、総合収率は１４％であった。後述するように、この調製物をトリシン・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したところ、分子量１４ｋＤに相当する単一バンドとして現れた。この方法で精製したＦＸａの均一度については、更に、変性ゲル条件下でゲル浸透クロマトグラフ試験を行う事によって確認された。実施例２：ＤＳＬから分離された医用ヒル由来のＦＸａ阻害物質の特性分析１．分子量１．１トリシン・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ドデシル硫酸ナトリウム・電気泳動法］均一度およびタンパク質の分子量を測定する為、実施例１で述べた方法によって調整された、種々のＦＸａ試料を分析した。採用した方法は、Schagger等の方法（Anal.Biochem.166:368-379,1987）の改変版である。ＦＸａ阻害物質に相当するバンドは略１４ｋＤの位置まで泳動し、単一バンドとして現れた。場合によっては、略12-14ｋＤの、比較的幅広いバンドとなって現れた。１．２ＢｉｏＧｅｌＰ−６０によるゲル浸透クロマトグラフ法更に、ＦＸａ阻害物質の粗調製試料のゲル浸透クロマトグラフ法にかけたところ、ＦＸａ阻害活性は、分子量１４ｋＤに相当する保持時間の位置に溶離された。前項でも触れたが、トリシン・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて、変性条件下で測定した場合のＦＸａ阻害物質の分子量も、やはり１４ｋＤであった。従って、これらの事実は、ＦＸａ阻害物質は１４ｋＤのモノマーに外ならない事を明瞭に物語っている。２．Ｎ−末端配列実施例１で述べた二通りの方法を用いて、医用ヒル唾液から精製されたＦＸａ阻害物質試料は、トリシン・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて更に細分別してから、ＰＶＤＦ膜面にエレクトロブロットした。ＦＸａ阻害物質を含有する膜の小片を自動配列決定装置（Applied Biosystems Microsequencer，４７５Ａモデル）にかけて、連続２０の繰り返し処理をした。以下のアミノ酸配列は、前項で述べた二つの方法を用いて、精製した試料から得られたものである。引き続き、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理を施した場合にも同一の結果が得られた事から、Ｎ末端がピログルタミン酸でブロックされた形のイソ型ＦＸａ阻害物質は、全く存在しない事が明らかになった。３．生化学的活性の分析ＦＸａ阻害活性のＭ測定は、以下に述べる通り、発色性物質、即ちMethoxycar bonyl-D-cyclohexylglycyl−glycyl-arginyl p-nitroanilide（CHG）の、ＦＸａに媒介された加水分解に対する阻害率に基づいて行われた。即ち、４０５ｎｍでの吸光度（ε_M＝9920Ｍ^-1ｃｍ^-1）の増加として、ＦＸａを観測した。この基質のＦＸａによる加水分解に関す、反応速度論的パラメータは以下の通りであった。即ち、触媒定数＝１３０ｓｅｃ^-1、Ｋ_m＝１５μＭである。基質濃度として適切な値については、３４２ｎｍにおける分子吸光係数（8210）から決定した。反応液には50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.2），5mM ＣａＣｌ₂、200mM ＮａＣｌ，0.1％ＰＥＧ，40μＭの基質及び、約２ｎＭのＦＸａを含んでいる。ＦＸａ濃度は、前述の反応速度論的パラメータに基づいて、阻害物質の非存在下において、４０μＭのＣＨＧの初期加水分解速度（最初の２０秒間）から更に正確に決定された。本発明のＦＸａＩのようなＦＸａ阻害剤によるＦＸａ阻害活性が存在する場合には、吸光度増加の抑制が観測され得る。当該阻害物質の濃度は、阻害物質が存在する場合の反応と存在しない場合の反応との間での吸光度の差に、ＦＸａ濃度を乗じた値である。この測定法においては、酵素−阻害物質複合体の組成モル比＝１：１であると仮定し、また解離定数（Ｋ_i）は、実質的に当該阻害物質（ＦＸａ阻害剤）の全てが当該酵素（ＦＸａ）に結合することを可能とするほど充分に低い（即ち、親和性の高い結合）ことを仮定している。しかしながら、ヒル唾液から分離した天然のＦＸａ阻害物質の用量反応曲線（抑制度vs抑制物質濃度）における飽和部分の形状を分析することによって、前記条件下では、阻害物質・酵素複合体が実測可能で且つ無視できない解離定数を有することが証明されている。ＦＸａ−ＦＸａ阻害物質複合体の解離度は解離定数（Ｋ_i）によって特徴づけられ、また、発色性基質ＣＨＧの抑制された加水分解速度から測定され得る。これらの結果は、Dixon及びWebb著の酵素学（第３版）,Academic Press，ニューヨーク（1979）に記載されているのと実質的に同様の、酵素・阻害物質複合体についての拮抗阻害の反応速度論的スキームに従って解析し得る。従って、上記の方法で測定された阻害物質濃度は過少評価されている可能性もある。それ故、こうした場合には、一定の阻害（通常は５０％）を得るために必要とされる濃度としてＦＸａ阻害剤濃度を定義し、これらの反応条件下で５０％阻害（ＩＣ₅₀）を生じる量を１ミリユニット（ｍｕ）ないし１ｐｍｏｌと定義することが有用である。精製および特徴決定の際の濃度測定のために用いたＦＸａ阻害活性分析は、El isa Titertek Twin Reader 380型（EF LAB製）またはPhillips（PU 8720モデル）ＵＶ／Ｖｉｓ走査型測光計において行った。ＦＸａ阻害剤の阻害活性は、プロトロンビナーゼとの複合体形成時における、ＦＸａに及ぼす効果として測定する事も可能であろう。リン脂質としては、ウサギ脳由来セファリン（Sigma社製）を用いた。１ｍｌの15M ＮａＣｌ１ｍｌ中に試薬一瓶分を懸濁させた後、反応液に対して１：４０の比、即ち、2.5μｌ／100 μｌとなるように希釈した。反応液中の他の諸成分の濃度は以下の通りである。即ち、トリス塩酸緩衝液pH7.4／150mM NaCl／0.1％のポリエチレングリコール6000中に、ＦＸａが 250ｐＭ，プロトロンビンが2.67μＭ，ＦＶａが4.2ｎＭおよびＣａ^2+が１ｍＭ含まれる。予め３９℃で１０分間反応させた後、プロトロンビンを添加して反応を開始させた。様々な時間間隔を置いて、各々、一定量の試料を採取した。反応停止は、10mM ＥＤＴＡによって行った。また、採取後の試料は、分析にかけるまで氷上に静置した。ＦＸａ阻害物質（例えば該発明のＦＸａＩ）によるＦＸａ阻害活性は、３７℃でプロトロンビンがトロンビンに変化する反応に及ぼすＦＸａＩの影響として測定した。生成したトロンビン量は、８０μｇのトロンビン−ｐニトロアニリド塩（合成物質）Ｓ−2238（KabiVitrum，スエーデン製）を基質に用いて２３℃で測定した。その結果、天然のＦＸａ阻害物質に対しては、Ｋｉ＝７２ｐＭ及び、ＩＣ₅₀＝１９０ｐＭという数値が得られた。その後実施した実験（例えば実施例１４）では、プロトロンビナーゼ複合体に対する測定方法に若干の改変を加えた。即ち、測定用反応液中に、250ｐＭのＦＸａ及び2.67μＭのプロトロンビンに代えて、５０ｐＭのＦＸａ及び1.35μＭのプロトロンビンを添加した。その結果、Ｋｉ＝１２０ｐＭを得た。実施例３：ＰＣＲによる、ＦＸａ阻害物質のｃＤＮＡのクローニング下記の方法は、図４に図式的に示した。ＲＮＡは、全量とも１２０匹のヒル（Hirudo medicinalis）から抽出した。全量のＲＮＡから３５μｇのｐｏｌｙＡ^+・ｍＲＡＮを単離（この際、Fast Trach（商標）メッセンジャーＲＮＡ単離用キット、Invitrogen社製を使用）した。こうして得られたｐｏ１ｙＡ^+・ｍＲＮＡの５μｇを、次に示す合成プライマーの存在下における逆転写反応の際、鋳型として使用した。この１５量体のオリゴｄＴ配列は、種々のｍＲＮＡ中のポリＡ配列に対して相補性をもたらす配列である。単鎖状相補ＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）の合成に引き続いて、ｍＲＮＡを、アルカリ処理（0.3M ＮａＣｌ溶液中に室温で一晩）によって分解した。次に、下記の合成縮重ＤＮＡオリゴマーを逆転写用プライマーに用いて、この水解処理後の一定量をＰＣＲ増幅した。この合成プライマーは、天然のＦＸａ阻害物質（実施例２）のＮ末端部における９個のアミノ酸配に対応して調製され、次のアミノ酸配列をコード化している。 NH2-Tyr-Glu-Val-Ile-Tyr-Val-Asp-Asp-Pro-（COOH）ＰＣＲ増幅条件は次の通りである。１．プライマーＡ０．２μｇ２．プライマーＢ０．２μｇ３．ｓｓ−ｃＤＮＡ５μｌ（全量の５％）４．５ｍＭｄＮＴＰ４μｌ５．１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ６．Taqポリメラーゼ 0.2μｌ（8U／μl（USB））７．Ｈ₂Ｏ８１μｌ８．４０サイクル×［９４℃で１分間；３７℃で３分間；７２℃で４分間］ＰＣＲ増幅反応による生成物を分析する為、１００μｌの反応溶液の内、１０ μｌをアガロースゲルにかけた。同時に、非増幅処理の対称群および数種類の分子量マーカーを同一ゲルにかけた。略３５０ｂｐ、４５０ｂｐ及び７００ｂｐに相当する３種類のバンドが観察された。これら３種類のバンドはニトロセルロース紙上にブロッティングされ、次いで放射性標識化された合成ＤＮＡプローブ（プローブＣ）とのハイブリダイズされた。このＤＮＡプローブは、実施例２に開示したＮ末端部配列の内、１４ないし１９のアミノ酸配列部分に相当するものであり、下記の配列を有している。これら３種のＰＣＲ産物は、厳密度の高いハイブリダイズ条件下において、プローブＣとハイブリダイズする事が見出された。しかしながら、７００ｂｐに相当するバンドの場合、３５０ｂｐ断片及び４５０ｂｐ断片に相当するバンドに比べると、ハイブリッド形成能力が比較的弱いものである事が観察された。ＰＣＲ増幅に続いて、該反応液に対して、クロロフォルム及びフェノール抽出、並びに、エタノール沈殿処理を行う事により、目的のＤＮＡ純度を高めた。次いで、このＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ゲル精製処理にかけた後、得られたＤＮＡ断片群を、プラスミドｐＳＰ６５に由来する大きい方のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片中にサブクローニングした（図４）。この連結反応後の溶液を、大腸菌（ＭＣ1061株）の形質転換用に用いた。形質転換株は、前述の放射性標識化されたプローブＣを用いたin-situハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。プラスミドＤＮＡは、陽性クローンから調製した。期待される大きさのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII断片を有するこれらプラスミドに対して、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定法を用いて、ＤＮＡ配列の決定を行った。この方式の場合、二群のクローンが得られた。即ち、（Ａ）約２９０塩基対の挿入部分を持つクローン群（クローン３、８及び１２）並びに（Ｂ）約４５０塩基対の挿入部分を持つクローン群（クローン１、４、５、及び１６）である。クローン３及び４を含むプラスミドを、それぞれｐＳＰ６５−ＸａＩ−３及びｐＳＰ６５−ＸａＩ−４と命名した。クローンｐＳＰ６５−ＸａＩ−４（クローン４）のＤＮＡ配列及びその推定アミノ酸配列が、図５に示してある。小麦胚ライゼートを使用した、イン・ビトロ転写によって明らかになったのは、両群のクローンが共に、同じ大きさのタンパク質をコード化しているという事である。従って、クローン３の比較的短いＤＮＡ配列（290ｂｐ）の由来は、クローン４のＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡの３’−非翻訳領域での、ポリＡに富んだ配列による内部プライミングに起因するものかもしれない。尚、このクローン４のＤＮＡは、本実施例の冒頭で述べた逆転写反応において、鋳型として用いられたものである。実施例４：Hirudo medicinalis・ｃＤＮＡライブラリー由来のＦＸａＩをコード化しているＤＮＡの単離及びクローニング精製された天然のタンパク質のＮ末端配列に由来する一種類のプローブとのハイブリダイゼーションを用いて、実施例３で開示したＰＣＲ由来のｃＤＮＡ（クローン３及び４）を単離した。クローン４のＤＮＡは、Hirudo medicinalisのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いた。図６に、本方法の図式が示されている。全ＲＮＡを１２０匹のヒルから抽出した。Fast Track（商標）ｍＲＮＡ単離用キットを用いて、全ＲＮＡからポリＡ⁺ｍＲＮＡを単離した。こうして得たポリＡ⁺ｍＲＮＡの一定量（４μｇ）から、ＺＡＰ（商標）ｃＤＮＡ合成用キット（S tratagene社製）を用いてｄｓ−ｃＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を合成した。得られたｃＤＮＡを、ラムダＺＡＰ（商標）II／大腸菌クローンニング用キットを使ってサブクローンニングした。本キットは公知のクローンニング方法を利用しており、ｃＤＮＡをラムダ・ファージ中にサブクローンニングする手段、並びにそのｃＤＮＡを大腸菌々体内で増幅する手段を提供するものである。次に、このファージを分離し、ファジミドをヘルパーファージを用いて切り出す。こうして得られたプラスミドは、一般的方法を使って更に操作を加える事も可能である。得られたｄｓ−ｃＤＮＡの２０ｎｇをＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩを用いて消化した後、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化したＵｎｉ−ＺＡＰ（商標）ベクター中にサブクローンニングした。この組換えファージを、E.coli XL1-Blue（商標）プレート上に均一に塗り付けると、ほぼ、1.5×１０⁵個のプラークから成るｃＤＮＡライブラリーが得られる（図６）。このｃＤＮＡライブラリーを、低い厳密性および高い厳密性の両方のハイブリダイゼーション条件下において、ＰＣＲで誘導されたプラスミド、即ちｐＳＰ６５−ＸａＩ−４（実施例３）由来の放射能ラベルしたＤＮＡをプローブに用いることにより、ＦＸａ阻害物質をコード化しているＤＮＡを含んだクローンについてスクリーニングした。濾紙のハイブリダイゼーションに際し、以下の反応液中において、先ず６０℃ で８時間の予備ハイブリダイゼーションを行った。即ち、６×ＳＳＣ［標準食塩 −クエン酸緩衝液］、０．１％ＳＤＳ［ドデシル硫酸ナトリウム］，５×Denhar dt［デーンハート］溶液及び、100μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡから成る反応液である。次いで、放射性プローブと、６０℃、４８時間のハイブリダイゼーションを行った。濾紙洗浄は、異なる２通りの条件下で行った。即ち、厳密性の高い条件を得る場合には、0.2％ＳＤＳを含む0.2-0.5×ＳＳＣを用いて、溶液を数回換えながら、６５℃で２時間洗浄した。これに対し、低い厳密性を得る場合には、オートラジオグラフィーにかける前に、２×ＳＳＣ−0.2％ＳＤＳを用いて数回、６０℃で２時間フィルターを洗浄した。陽性プラークを摘出し、単離した後、同じハイブリダイゼーション条件下で、再度スクリーニングを行った。次いで、Sangerのジデオキシ法に従って、幾つかの陽性クローンのプラスミドＤＮＡの配列決定を行った。厳密性の低い条件下で得られた数種類のクローンに由来するプラスミドを、ｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３と命名し（ここでは「クローン１３」ないし「１３」と称する）、更なる遺伝子操作及び分析用のために選定した。また、異なる配列を有する他のクローンも得られた。クローン１３は、ＰＣＲ由来のクローン４とは実質的に異なる塩基配列を含有しており、従って、クローン４とは異なるタンパク質をコードする。クローン４及びクローン１３が指定するアミノ酸配列は、比較した形で、図３に示してある。クローン４のＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、クローン１３のＤＮＡが同定されるのは、おそらく、予想活性領域におけるアミノ酸配列の相同性によるものである。クローン１３は、１５５アミノ酸（Ｎ末端メチオニンは数えない）から成る新規なポリペプチドをコードしている。そして、このポリペプチドは２７個のシステイン残基を含み、その中の５個は、２２個のアミノ酸から成る外延ペプチドと目されている領域内に位置している。クローン１３のポリペプチド産物は、本明細書中では「ＦＸａＩ」と称されている。また、クローン１３由来の組換えＦＸａＩ産物は、ヤギン（Ｙａｇｉｎ）と命名されている。ＦＸａＩのアミノ酸配列は、成熟タンパク質および推定延長ペプチドを含んでいると思われる。この推定延長ポリペプチドがそのように呼ばれている理由は、一見したところ、成熟タンパク質の一部であるとは思えない（実施例５のアラインメントの項および図３に示した、ＦＸａＩ及び他のＦＸａ阻害物質におけるシステイン残基の整列に基づいて）にもかかわらず、以下で議論するように、リーダーペプチドに典型的な組成をもっていないからである。この推定リーダー配列の存在について、ＦＸａＩのＮ末端アミノ酸配列（図７）の分析を行った。その際、Von Heijne（Nucleic Acids Res．14:4683-91,1986 ）のアルゴリズムを用いた。このアルゴリズムは、所与のアミノ酸配列がリーダー配列範囲内の所定の位置を占める可能性を予測し、従って、問題のペプチド配列がリーダー配列のペプチド配列に一致するか否かを決定する事ができる。更に、そのペプチドに沿った「結合アミノ酸評価値（combined amino acid score）」をk決定することによって、先導配列と成熟タンパク質との開裂位置についても予測する事が可能である。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３の生産物のＮ末端配列分析に適用したときには、このアルゴリズムは、リーダー配列のアミノ酸パターンと一致するアミノ酸パターンを同定することができず、最初の４０残基の範囲内における開裂部位は発見されなかった。上記の解析に基づけば、プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３がコードするタンパク質にはリーダー配列が欠如していると結論することができる。こうして、ｍｅｔ¹で始まりｃｙｓ²²ないしｇｌｕ²³で終わる配列は延長ペプチドであり、ｇｌｕ²³ないしｖａｌ²⁴で始まり、ｌｙｓ¹⁵⁶で終わる配列は成熟タンパク質であると思われる。より詳しくいえば、クローン１３がコード化しているポリペプチドは、図７に示すように、ｍｅｔ¹〜ｌｙｓ¹⁵⁶に亘っている。ｇｌｕ²³またはｖａｌ²⁴からｃｙｓ¹⁰⁹迄のセグメント（配列の一部）は、機能単位を形成し得る。何故なら、全てのシステインのアラインメントを含めて、このセグメントは、図３に示したクローン４のｔｙｒ²⁶からｇｌｙ¹¹⁰迄の配列、またはアンチスタシンの持つｃｙｓ¹⁰からｃｙｓ⁹⁴迄の配列と類似しているからである。クローン１３がコード化している、先頭の２２個のアミノ酸を含む延長ペプチドの性質は現時点では知られていない。従って、この延長ペプチドは「推定上の」外延ポリペプチドと称されている。クローン１３の読取り枠（オープンリーディングフレーム）の実在を確認するために、また、仮に存在するとすれば、これによりコードされるポリペプチドの大きさがどの程度のものなのかを確認するために、イン・ビトロ翻訳実験によって、該ポリペプチドのサイズを測定した。Stratagene社のイン・ビトロ翻訳用キットを使用して、ＳＰ６・ＲＮＡを調製した。こうして得られたＲＮＡをイン・ビトロで翻訳し、そのポリペプチド生成物を、還元的状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分析した。クローン１３がコード化しているｍＲＮＡのイン・ビトロでの翻訳により生成したポリペプチドは、ゲル上を泳動して、およそ２０ｋＤに相当する位置まで移動した（これは大腸菌中で発現されたＦＸａＩの分子量と同一であった）。この方法で測定された分子量は、アミノ酸配列に基づいて算出された分子量に比べてかなり大きかった。理論に拘泥する積りはないが、こうした現象の原因の一部は、ゲル上でのタンパク質の泳動に影響する多数のシステインが、クローン１３ポリペプチド中に存在することによると仮定される。実施例５：推定アミノ酸配列の比較ＰＣＲで誘導されたＦＸａの阻害物質のｃＤＮＡ、即ちＦＸａＩ・ｃＤＮＡ（推定延長ペプチドを含むクローン１３）と、アンチスタシンとの推定アミノ酸配列を種々の観点、即ち、最大相同率、相同性一致（identical homology）およびシステインアラインメントの観点からから比較した。Ｉ．相同性表１は、2020 PROSISプログラム（ＬＫＢ社製）の6.00版を用いて明らかにされた最大相同率（％）を示している。この最大相同率は、表１の脚注部に記載した等価基を使用し、Needlmano及びWunsch著，J.Mol.Biol.48:443（1970）に基づいて行われたものであり、推定延長ペプチドを含む全配列ついて算出したものである。表２は、等価基を用いずに得られた相同性である相同性一致（パーセンテージで表す）の程度を示している。上記の相同率の算定に当たっては、「延長ペプチド」を含めて、クローン１３によってコードされるポリペプチドの完全配列をも考慮に入れた。 II．配列配列の類似性を解析するに当たって、相同性に対する精度を犠牲にするのであれば、配列中のシステインを並べる（アラインメントする）という別の方法もある。Feng及びDoolittle，J．Mol．Evol．35:351-360（1987）の仕事に基づくコンピュータ・プログラムであるパイルアップ（Pileup）を用いれば、このようなアラインメントを実行できる。上記で比較したのと同じ一配列について、間隙評価値（gap weight）＝3.00と、間隙距離評価値（gap length weight）＝0 .10とをパラメータに用いたアラインメントの結果を、図３に示す。図３は、何れの配列においても、顕著な間隙を導入することなく、１４個のシステインがアラインされ得ることを示している。このパイルアプ・プログラムでは、配列の類似度を現わす評価値を、0-1.5の評価尺度（スケール）内に割り当てる。こうして得られた該配列群の類似度を、１．５を基準としたパーセントとして表３に示した。上記にみられるように、アンチスタシンとクローン４及クローン１３由来の産物との間には、殆ど類似性が存在していない。これは、相同性に従う比較および類似性指数に従う比較の両者によって示されている。実施例６：組換えＦＸａＩの発現組換えＦＸａＩの大腸菌内発現用プラスミドを得るためには、ＦＸａＩタンパク質をコードしているＤＮＡ断片に対して更なる操作を加える必要がある。プラスミドｐＳＫ−ＸａＩ−１３（実施例４）を、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。このＦＸａＩ指定配列を含むＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離して、プラスミドｐＳＰ６５由来のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ消化断片中にサブクローニングした。このプラスミドはｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３（図８）と命名され、受付番号第69134号としてＡＴＣＣに供託された。本プラスミドは、コード化しているタンパク質を発現しないが、発現性プラスミドの構築用に利用する事ができる。例示のために、クローン１３がコード化している組換えＦＸａＩが、種々のプラスミド構築用のｃＤＮＡ断片を利用して、バクテリア内で発現された。Ａ）λｐ₁またはｄｅｏプロモータの支配下における成熟（”ｍ“）組換えＦＸａＩの発現クローン１３が指定しているＦＸａＩの成熟ポリペプチドの発現が可能となるように、開始コドンであるＡＴＧを含むＮｄｅＩ部位を、以下に示す手順を用いた部位指向性特異的突然変異誘発によって、ｃＤＮＡ配列中のアミノ酸Ｖａｌ²⁴ に隣接する部位に導入した。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３の一定量の試料を、ＦＸａＩのコード領域を切断するＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩを使って消化した。別途、同プラスミド試料の一定量を、ＸｍｎＩ及びＳｃａＩを使って、Ａｍｐ（商標）のコード化領域を切断した。いずれの試料からも、ベクターＤＮＡを単離した後、これに下記のオリゴマーＤの存在下で、変性及びアニーリング処理を施した。次いで、ＤＮＡポリメラーゼであるクレノウ（Klenow）フラグメントと反応させてから、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ（図９）を用いて連結させた。このライゲーション反応液を用いて、大腸菌MC 1061の形質転換を行った。アンピシリン耐性で、且つ放射性標識化されたオリゴマーＤに対してハイブリダイズし得る数種のクローン群が同定された。この様なクローンの一つは、ｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ ”と命名された。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ”は、発現性プラスミドではない。そこで、発現を保証する目的で、次のようにして適切な調節要素が与えられた。即ち、プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３“ｍ”をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄIII を使って切断する。ＦＸａＩポリペプチドをコードするＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離し、λＰ_L及びλｃIIリボゾーム結合部位を有するλＰ_L発現性ベクターｐＭＡＬ−１８３／１９１のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII消化物から単離した大きい方断片に連結する。こうして得られたプラスミドはｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”（図１０）と命名され、受付番号第69135としてＡＴＣＣに寄託された。該プラスミドｐλＸａＩ−１３“ｍ”を用い、高温感受性リプレッサーを持つ大腸菌4300株の形質転換を行った。４２℃で誘導すると、この形質転換細胞は約２０ｋＤ分子量のポリペプチドを発現することが確認された。このポリペプチドの配列は、Ｖａｌ²⁴からＬｙｓ¹⁵⁶までの、図７に示すクローン１３ポリペプチド配列になるように設計された。当業者であれば、該プラスミドと同様のプラスミドを、次に例示する様なプラスミドを用いて構築する事ができるであろう。即ち、大腸菌を宿主として、ＡＴＣＣ受付番号第68605の下に供託されているｐＭＬＫ−１００である。該プラスミドは、その調節要素を含む領域に関して、ｐＭＡＬ−１８３／１９１と殆ど同等のものである。更に、これ以外でも、当業者は、公知かつ入手の容易なベクターを使って同等の発現能を持つプラスミドを構築する方法を熟知している。Ｂ）組換えＤＮＡによるヒトＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤＮ末端アミノ酸（58個）融合タンパク質の発現プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３を、ＳｓｐＩ及びＰｓｔＩで切断した。ＦＸａＩをコード化しているＳｓｐＩ断片を単離した後、これを、ｄｅｏプロモータの制御下にあるＳＯＤ発現性ベクターｐＢＡＳＴ−ＲをＳｃａＩ−ＰｓｔＩで消化して得た大きい方の断片に連結した。このプラスミドは、ｐＤｅｏ−Ｓ −ＸａＩ−１３“ｆ”（図１１）と命名され、大腸菌733株を宿主としてＡＴＣＣ登録番号第69137号として寄託された。プラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”が指定する融合タンパク質には、修飾されたＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列に相当する５８個のアミノ酸配列と、図７に示したＦＸａＩ配列のうちのＩｌｅ²⁹からＬｙｓ¹⁵⁶までの部分とを含んでいる。修飾されたＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列は、以下の通りである。プラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”を用いて、大腸菌７３３株の形質転換を行った。分子量２１ｋＤのＳＯＤ−ＦＸａＩ組換え融合タンパク質は、形質転換細胞をペレット状に沈降させた後、これに溶菌処理を加えて得られる不溶性画分から得られた。Ｃ）予測される外延ペプチドを含むプレペプチドとしてのＦＸａＩの発現ＦＸａＩの発現をより効率的に行わせる為に、推定延長ペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入してやれば、その発現能が増強されるであろうと予測された。そこで、ＰＣＲ法を使って、ＮｄｅＩ部位をＭｅｔ³相当の位置に導入した（図７）。ＰＣＲによる部位特異的突然変異を誘発する目的で、次の５′及び３′端用プライマーを用いた。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１３に、プライマーＩ及びＪの存在下でＰＣＲ増幅処理を施した。次に、その産物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄIIIを使って切断した。ＦＸａＩをコード化している断片を単離してから、λＰ_Lの発現性ベクターであるｐＭＡＬ１８３／１９１をＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIIIで切断して得られた大きい方の断片に連結した。この結果得られたプラスミドは、ｐλ−ＸａＩ−１３“ｌ”（図１２）と命名された。このプラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｌ”を、大腸菌4300株の形質転換に用いた。形質転換細胞を増殖し、目的の産物が誘発された後、細胞ペレットを溶解して得られる不溶性画分に存在する包摂物からＦＸａＩを採取した。このポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｌｙｓ²からＬｙｓ¹⁵⁶ までの延長ペプチド含む、クローン１３由来の生成物の配列（図７）となるように設計された。これまでのところ、Ｎ末端メチオニン（Ｍｅｔ¹）が存在するか否かは判明していない。当業者であれば、大腸菌4300株を宿主としてＡＴＣＣ受付番号第68605として寄託されている、プラスミドｐＭＬＫ− １００を用いることにより、同等のプラスミドを構築する事が可能であろう。更に、該ベクター以外の公知かつ入手可能なベクターを用いて、同様の同等の発現プラスミドを構築する方法もまた、当業者が了知するところである。実施例７：プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”によって産生される組換えＦＸａＩの折り畳み構造及び、部分精製プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”を含有する大腸菌4300株について、欧州特許公報第173,280（1986年３月５日発行）に開示されているような当業者に公知の標準的な方法に従って、増殖およびタンパク質の誘発を行った。その培養体は３０℃において対数増殖期の半ばまで培養され、４２℃で２時間、タンパク質発現を誘発させた。この細胞はペレット化けされ、そのケーキは処理するまで凍結貯蔵した。１．包接体（inclusion body）の単離菌体ペレットを、１０倍量のバッファー１（10mM EDTAを含む150mM Tris-HC l pH8）に懸濁させる。懸濁処理後、リゾチーム（2500単位／ｍｌ）を添加し、室温で２時間、間欠的な撹拌を加えながらインキュベートすることによって、菌体の破壊を行った。次に、この懸濁液を超音波破壊装置にかけ（３×３０分間）、更に４℃で３０分間、遠心分離機にかけた（12,000ｒｐｍ）。上澄を廃棄した後に、１％Nonidet P-40（ＮＰ−４０）を含む１０倍量のバッファー１中に再懸濁させることにより、ペレットを洗浄剤で洗浄し、間欠的に攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。４℃で３０分間の遠心分離（12,000ｒｐｍ）して得られたペレットを、１０倍量の蒸留水で再洗浄し、室温で１５分間、間欠的に撹拌を加えながら室温で４５分間インキュベートし、４℃において４５分間、遠心分離（15,000ｒｐｍ）にかけた。ペレット洗浄により、大腸菌のタンパク質は大部分が除去された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を利用する事によって、上記の処理条件下において、組換えＦＸａＩポリペプチドがペレット中に残留している事が確認された。２．可溶化及び還元処理ＦＸａＩポリペプチドは、その大部分が包接体、即ち菌体破壊後に得られる不溶性ペレット中に存在する。次いで、この封入物をバッファー２（１mM EDTA, 100mM NaClを含む20mMトリス塩酸緩衝液［pH8］）に溶した２０倍量の６Ｍ塩化グアニジニウム（ＧｕＣｌ）で可溶化した。１５分後に、窒素雰囲気下で１０ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加することにより還元反応を開始させ、その後１時間継続させた。次いで、ＧＳＨを含むバッファー２を添加することによりタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整し、更に、窒素雰囲気下で１−３時間インキュベートした。３．再折り畳み／再酸化こうして得た還元状態のＦＸａＩを含む可溶性ポリペプチドを、バッファー２（最終的なＣｕＣｌ及びＧＳＨ濃度は、各々０．６Ｍ及び１ｍＭ）で１０分の１まで希釈し、タンパク質濃度を100μｇ／ｍｌとした。酸化状態のグルタチオン（ＧＳＳＧ）を最終濃度0.1ｍＭまで添加し、この溶液を４ ℃で１６時間インキュベートした。実施例２で述べた発色分析による阻害活性測定の前に、酸化状態にあるタンパク質を、ＥＤＴＡを含まないバッファー２対して、３回の液交換を行いつつ透析させた。４．再折り畳みされた組換えＦＸａＩタンパク質の種々のバッチの阻害活性透析に続いて、再折り畳みされたＦＸａＩタンパク質の阻害活性を、実施例２で述べた発色法を用いて測定した。ｍｇタンパク質当たりのミリ単位（ｍｕ）、即ち、ｍｕ／ｍｇで表現した結果を表４に要約した。２ｎＭのＦＸａＩを含む測定液において５０％阻害を誘発するタンパク質量を、１ｍｕとして定義している。更に、再折り畳みされたポリペプチドは、トロンビン、並びに血液凝固カスケード反応に関与する別の酵素に対する阻害活性についても測定された。後者の測定はLottenberg et．al，Methods Enzymol．80:341-361（1981）の方法に従った。この場合、ＦＸａＩによる有意なレベルのトロンビン阻害効果は何ら認められなかった（＜１ｍｕ／ｍｇ）。要約すると、ここに開示された方法により製造された組換えＦＸａＩは、生物学的に活性である。更に、ＦＸａＩによるＦＸａに対する阻害活性は、トロンビンに対する阻害活性に比べて略２００倍も高いことから、ＦＸａＩは、ＦＸａに対して選択的であることが実証された実施例８天然に存在するＦＸａ阻害剤に対する抗体の誘導および組換えＦＸａＩ実施例６に記載のＳＯＤ−ＦＸａＩ融合ポリペプチドに対する抗体と、ＤＬＳから単離された天然に存在するＦＸａ阻害剤に対する抗体の両者を産生した。Ａ．抗原の調整１．組換えＦＸａＩ融合タンパクプラスミドpDeo-S-XaI-13“f”（実施例６）を、12.5μｇ／ｍｌテトラサイクリンを配合したＬＢ中において、３７℃で一晩生育させた大腸菌733中で発現させることによって免疫用抗原を調整した。バクテリアを遠心分離によってペレット化し、1mM EDTA、50μｇ／ｍｌのリゾチームを配合した５０ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣｌ（ｐＨ８）中に再懸濁し、室温にて３０分間インキュベートし、一回あたり５分の超音波を二回かけて粘度を減少させた。組換えタンパクを含む不溶解性の顆粒画分を遠心分離によって収集した。該ペレットを水に懸濁し、同量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（30% グリセロール、0.19M Tris-HCl pH6.8，10 % SDS）15%β−メルカプトエタノールおよび0．004%ブロムフェノールブルー）で希釈した。該サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に電気的に転移し、可逆ポンソ−染色剤（reversible Ponceau s tain）で染色した。みかけ分子量２９ｋＤを持つタンパクを、該膜より抽出し、免疫用抗原として使用した。２．ＤＬＳ由来の天然に存在するＦＸａ阻害剤免疫用抗原は、実施例１に記載したように、Ｑセファロース及びヘパリン− セファロースクロマトグラフィーによってＤＬＳから精製された。タンパクのアリコットを、同量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝剤（30% グリセロール、0.19 M Tris-HCl pH6.8，10% SDS、15%β−メルカプトエタノールおよび0．004%ブロムフェノールブルー）で希釈した。次いで、サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に電気的に転移させ、可逆ポンソ− 染色剤で染色した。みかけ分子量１４ｋＤを持つタンパクを該膜より抽出し、免疫用抗原として使用した。Ｂ．抗体の誘導精製組換え抗原または天然に存在する発生抗原（20-60μｇ）が、１ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解され、完全フロイトアジュバンドと混合されて、1.8-2.3ｋｇのウサギの脚肢に注入された。３週間後にまたウサギに注射したが、今度は、不完全フロイトアジュバンドと混合した同量の抗原を皮下に注射した。この手順をさらに二回、同様の間隔で繰り返した。組換えＳＯＤ配合ＦＸａＩ融合タンパクに対する抗血清中に存在すると予想される、抗ＳＯＤ抗体を除去するために、セファロースに結合された組換えヒトＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤを含むアフィニテ−カラムに抗血清を通した。Ｃ．ウエスタン・ブロット分析による抗体の確認抗体は、還元条件下で行われた１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の種々のタンパクのウエスタン・ブロットで確認された。抗血清と反応させた後、¹²⁵Ｉ標識されたタンパクＡによってウエスタン・ブロットを現像した。Ｄ．結果抗−１３“ｆ”抗体は、１３“ｆ”ポリペプチドおよび１３“ｍ”ポリペプチドと反応したが、ＤＬＳから単離した天然に存在するＦＸａ阻害剤のアミノ酸配列を持つ組換えタンパクとは反応しなかった。更に、天然に存在するＦＸａ阻害剤に対する抗体は、（ＤＬＳから単離した）天然に存在するＦＸａ阻害剤と反応したが、（再折り畳みされ、且つ部分的に精製された）１３“ｍ”とは反応しなかった。Ｅ．結論我々は、二つの抗血清を得た。すなわち、クローン１３由来の１３“ｍ”組換えポリペプチドに対する抗体を含む精製された抗−１３“ｆ”と、ＤＬＳから単離された天然に存在するＦＸａ阻害剤に対する抗血清である。両血清による結果に基づいて、ＤＬＳから単離された天然に存在するＦＸａ阻害剤と組換え１３ “ｍ”ＦＸａＩポリペプチドとの間の免疫交差反応は無いと推論できる。これらの結果は、クローン１３が、ＤＬＳ中に存在する天然のＦＸａＩタンパクとは実質的に異なるタンパクをコードしていることを明瞭に示している。Ｆ．Ｈ．medicinalisにおける天然に存在するＦＸａＩの同定クローン１３がｃＤＮＡライブラリーから得られたので、コードされたタンパクはＤＬＳ中に存在するであろうことが合理的に予想される。しかし、上記の抗−１３“ｆ”抗体を使用した場合、かなり多量のタンパク存在下（70μｇ）であってもバンドは検出されなかった。上記の分析によっては、ＤＬＳ中でタンパクが検出されなかったので、この新規ＦＸａＩは、ヒルの唾液中には存在しないかも知れない。これによって、ＤＬＳの精製過程においてＦＸａが観察されないことが説明されるであろう。しかしながら、ウエスタンブロット上では、ＦＸａＩ組換えタンパクに対する抗体と反応する約２０ｋＤの分子量を持つタンパクバンドが、ヒル体のホモジナイズ断片の上澄液中に存在することが立証された。これによって、クローン１３（Yagin）の産生物に対応するタンパクがヒル中に存在することが確認された。実施例９：再折り畳みされたＦＸａＩの精製及び生物学的活性本質的に実施例７に記載したようにして産生され、再折り畳みされた、プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”によって発現された組換えＦＸａＩを均一に精製し、生物学的活性について分析した。再折り畳みされたタンパクは、５０Ｋ分離膜上における限外濾過によって精製され、さらに、10mM Tris-HCl、ｐＨ８中のＮａＣｌ勾配を使用したヘパリン− セファロース及びＱ−セファロースクロマトグラフィーで処理された。約300mM ＮａＣｌにおいてヘパリン−セファロースから溶出された活性ピークは、次いでＱ−セファロースにかけられた。この活性ピークは、約100mM ＮａＣｌにおいて、Ｑ−セファロースから溶出された。こうして得られたタンパクの純度は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認され、みかけ上の分子量２０ｋＤを示した。また、スーパーローズ（Superrose ）１２ゲル濾過クロマトグラフィー上では、約１５ｋＤと同等の滞留時間で溶出される事が確認された。精製されたＦＸａＩは、実施例２に記載した色素産生分析において、約2500ｍｕ／ｍｇの生物学的活性を有していた。Ｋ１は、色素産生分析において約１３ｎＭ、実施例２に記載のプロトロンビナーゼ複合体分析では１６０ｐＭと決定された。ＩＣ₅₀は、色素産生分析では20-40ｎＭ、プロトロンビナーゼ分析では約540 ｐＭと決定された。精製されたタンパクのＡＰＴＴ（部分トロンボプラスチン活性化時間（activa ted partial thromboplastin time）は、本質的にはSpaethe，Haemostasis，AHS /Deutschland GmbH，Munich（1984）に記載されているようにして、ＸII因子およびＸＩ因子のための活性化用エラグ酸を含むアクチンＦＳ（Dade）、並びに大豆リン脂質を試薬として使用して、ヒト及びネズミ血漿で測定された。これらの条件下で且つ２０ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下では、凝固に固有の経路のみが活性化される。この結果によって、２３ｎＭ（343ｎｇ／ｍｌ）でヒト血漿におけるＡＰＴＴの倍増を生じることが示された。これと比較して、同様の分析において、ＡＰＴＴを倍増させるためには５０ｎＭのヘパリンが必要であった。生物学的実験：ＦＸａＩの薬物動態学研究循環器系からのＦＸａＩのクリアランス速度を評価するために、予備的な薬物動態学実験を行なった。雌のBalb/cマウス（体重20-25ｍｇ）に、精製されたＦＸａＩを静脈注射した。注射後１、３、１０、３０分の時点において、液サンプルが1/10 v/v 3.8％クエン酸中に採取された。次いで血漿を分離し、ＡＰＴＴについて分析した。各マウスからは夫々一つの血液サンプルしか得られなかったので、各時点での結果は別々のマウスから得たものである。ＦＸａＩ濃度は、ＡＰＴＴ対ＦＸａＩ濃度の検量線から計算された。該検量線は、未処理マウスからの血漿プールに様々な量のＦＸａＩを添加することによって、イン・ビトロ（in vitro）で作成されたものである。こうして、血液半減期は約8.1分であることがわかった。実施例１０開裂可能融合タンパクから得られた成熟ＦＸａＩポリペプチド実施例６に記載したようにして、プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ”（図１０）から、成熟ＦＸａＩポリペプチドの低レベルでの発現が得られた。実施例６に記載したように、プラスミドpDeo-S-XaI-13“f”（図１１）はかなりな量のＦＸａＩ融合ポリペプチドを産生するけれども、ＳＯＤ部分とＦＸａＩ部分間には開裂部位がないので、１３“ｍ”ポリペプチドを得る事はできなかった。多量の１３“ｍ”ポリペプチドを得るために、開裂可能な融合ポリペプチドを発現するプラスミドを構築した。Ｉ．プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”の構築下記の手順は、図１３及び図２に概略的に示してある。プラスミドｐλ−ＸａＩ−１３“ｌ”（図１２）をＳｓｐＩで消化した。ＦＸａＩをコードしている断片を単離し、さらにＡａｔＩＩで消化し、大きい方の断片を単離した。プラスミドｐＢＡＳＴ−Ｒ（図１１）をＡａｔＩＩおよびＰｐｕＭＩで消化し、大きい方の断片を単離した。ＦＸａＩをコードしているＤＮＡを含んだＡａｔ II−ＳｓｐＩ断片を、下記二つの合成オリゴマーの存在下において、ｐＢＡＳＴ−Ｒの大きい方の断片に繋いだ。その結果得られるpDSOD-NGE-XaI-13“ｍ”（図１３）と命名された、ｄｅｏプロモータの制御下のプラスミドを使用して大腸菌（E．coli）733を形質転換したが、ＦＸａＩ融合タンパクの良好な発現体ではないことがわかった。発現を改良しようとして、非耐熱性のλＰ_Lプロモータの制御下でＦＸａＩ融合タンパクを発現するプラスミドを構築した。プラスミドｐＤＳＯＤ−ＮＧＥ− ＸａＩ−１３“ｍ”が、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで消化された。ＦＸａＩをコードする領域を含む小さい方の断片を単離し、プラスミドｐλABのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII消化物から単離された大きい方の断片に繋げた（図２）。その結果得られたｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”を、λＰ_L プロモータの制御下で使用して大腸菌（E.coli）4300（Ｆ）を形質転換したところ、これはＦＸａＩ融合タンパクの良好な発現体であることがわかった（図２）。プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”は、修飾Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列の６３アミノ酸断片と、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（水酸化アミン開裂部位Ａｓｎ−Ｇｌｙを含む）の三つアミノ酸と、および図７に示す配列Ｖａｌ²⁴− ｌｙｓ¹⁵⁶を有するＦＸａＩ−１３“ｍ”ポリペプチドを含む融合タンパクを、５′から３′の順にコードする。該ＳＯＤ部分は下記のアミノ酸配列を有する。ＩＩ．プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”由来の１３“ｍ” ポペプチドの生産プラスミドｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”を含む大腸菌（E．col i ）4300（Ｆ）を３０℃で中期対数増殖期まで増殖させ、４２℃で２時間誘導した。包接体画分中に蓄積されたＦＸａＩ融合タンパクは、実施例７に記載したようにして単離し、洗浄した。洗浄された包接体画分を、5.5M チオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）を含んだ２０体積の窒素洗浄緩衝液３（20mM Tris-HCl pH8，50mM NaCl，1mM ED TAおよび20mM GSH）中で溶解した。溶解後に、該融合タンパクを、1.75M GuCl、 2.75M GuSCN、10mM Tris、25mM NaCl、0.5M EDTAおよび10mM GSHを含有する１Ｍの水酸化アミン（pH9、ＬｉＯＨで調整）中において、室温で１６時間、0.7ｍｇ／ｍｌ濃度でインキュベートすることによって開裂させた。インキュベーションの後、該溶液を3.5M ＧｕＣｌを含む緩衝液３に対して透析した。次いで、該ＦＸａＩは、ＧＳＨを欠くが0.3mMのＧＳＳＧを含む緩衝液３中において、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でインキュベーションすることによって再折り畳みされた。こうして得られた未精製の再折り畳みされたタンパクは、色素産生分析による測定では150-300ｍＵ／ｍｇの特異的活性をもってＦＸａを阻害した。実施例１１：真核細胞における組換えＦＸａＩの生産ＦＸａＩ等のような多くのシステイン含む分子の再折り畳みを行って、生物学的に活性なポリペプチドを得ることには固有の複雑性が伴うことに起因して、このようなポリペプチドを真核細胞中で産生すると、幾つかの困難が排除され得ることが仮定される。これによって、多量の適切に再折された生物学的に活性な組換えタンパクの生産が可能になるであろう。予備実験では、成熟した１３“ｍ”ＦＸａＩタンパクが、Ｓｆ−９昆虫細胞中のバキュロウイルスの発現系を使用して発現された（１８）。該細胞は、例えば１３“ｌ”タンパクをコードするＤＮＡ、即ち、ＦＸａＩポリペプチドおよびその延長配列をコードしているＤＮＡ（プラスミドＰＳＫ−ＸａＩ−１３（図６）に含まれているような）で形質転換された。ウエスタンブロット分析では、得られるポリペプチドは昆虫細胞に蓄積され、プロセッシングされず且つ培地中に分泌さもしないことがわかり、これは、ポリペプチドのＮ末端に（分泌を可能にする）リーダーペプチドが欠如している事と符合する（実施例４）。該ポリペプチドは、実施例８に記載したように、生産された組換えＦＸａＩに対する抗体と交差反応した。実施例１２発現が改良されたプラスミドおよびＦＸａＩの生育条件Ａ．プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”−Ｔ₁Ｔ₂ 強力なラムダＰ_Lプロモータによって駆動されるβラクタマーゼの過剰生産を排除するために、Ｔ₁Ｔ₂転写停止ＤＮＡ断片をプラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３ “ｍ”（図１０）に導入して、プラスミド−ｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”Ｔ₁Ｔ₂（図２６）を得た。プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”Ｔ₁Ｔ₂を使用して、非耐熱性リプレサ− ＣI857を含む大腸菌（E．coli）4300を形質転換した。４２℃で誘導すると、形質転換された細胞が、プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”で得られたのと同様の発現レベルで、分子量が約２０ｋＤのポリペプチドを発現することが分かった。しかし、βラクタマーゼタンパクは過剰に生産されないので、プラスミドｐλ− Ｘａｌ−１３“ｍ”Ｔ₁Ｔ₂中のＦＸａＩタンパクのパーセンテージは、プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”中のＦＸａＩタンパクのパーセンテージよりも高い。Ｂ．プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”−０５Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂ ＦＸａＩの発現レベルを改善するために、並びに開始コドンＡＴＧ（メチオニンをコードする）に隣接して、アミノ末端の余分なアミノ酸であるグリシン（発現後、ホストバクテリア中でメチオニンの完全除去を促進する）を導入するために、プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”−０５Ｍ（図１４）が構築された。新たに導入されたＭｅｔ−Ｇｌｙは、図７中のＶａ¹²⁴の直前に配置された。強力なラムダＰ_Lプロモータによって駆動されるβラクタマーゼの過剰生産を排除するために、Ｔ₁Ｔ₂転写停止ＤＮＡ断片をプラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ ｍ”−０５Ｍに導入して、プラスミド−ｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”−０５Ｍ−Ｔ₁ Ｔ₂（図１５）を得た。プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”−０５Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂を使用して、非耐熱性リプレサ−ＣI857を含む大腸菌（E.coli）4300を形質転換した。４２℃で誘導すると、形質転換された細胞が、プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”で得られる２から３倍の発現レベルで、約２０ｋＤの分子量を持つポリペプチドを発現することが分かった。Ｃ．バクテリア生育および誘導の改良条件プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”Ｔ₁Ｔ₂およびｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ ”−０５Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂由来のＦＸａＩの発現レベルは、生育倍地として０．１％グルコースを補給した１ｘＬＢを使用した場合は低かった。生育および誘導を至適化するために、一連の実験を行った。生育倍地として0. 1％グリセロールを補給した５ｘＬＢを使用した場合、また熱誘導の温度を（４２℃の代わりに）３９℃にかえて４時間行った場合には、ＦＸａＩの発現レベルは数倍高くなった。実施例１３：純粋かつ活性なＦＸａＩの生産改良実施例１２において記載したプラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”Ｔ₁Ｔ₂によって発現されたＦＸａＩの再折り畳みおよび精製は、ＦＸａＩの生産を改良するために行った下記の変更とは別に、実施例７および９に記載したようにして実施された。処理はスケールアップされ、処理された包接体画分の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されたように、４０％まで増加した。再折り畳みおよび精製は、表１に示すようにスケールアップされた。還元剤ＧＳＨの濃度は、１０ｍＭから２０ｍＭに増加された。ヘパリン・セファロースカラムは、Ｓ−セファロースカラムに置き換えられた。濃度および透析はスケールアップされ、１０ｋＤａ分離膜を備えた、約５時間以内でそれら工程を完了できるペリカン（Millipore）またはプロダクション・ウルトラフィルトレーション（ＰＦＵ、M illipore）等の限外濾過系で行われた。さらに、ＦＸａＩ生産プロトコルに幾つかの細かい変更を施し、これらの全ての改善は、スキーム１に記載する該改良生産プロトコルに取り入れた。スキーム１：プラスミドｐλ−Ｘａｌ−１３“ｍ”Ｔ₁Ｔ₂によって発現されるＦＸａＩのプロセッシング、再折り畳み、および精製要約すると、バクテリアのケーキ1.5gから、約180ｍｇのＦＸａＩ（純度９５％以上）が産生された。実施例１４：ＦＸａＩの特性決定ＦＸａＩ（実施例１３に記載の様に生産された）は、下記のように特性が決定された。ＦＸａＩは、計算分子量１５．４ｋＤを持つバリン（図７のｖａｌ¹²⁴）で始まる１３３アミノ酸を含むタンパクである。ＦＸａＩは２２のシスチン残基を含んでおり、該２２シスチン残基はおそらく対になって１１のジスルフィド結合となる。１．生物化学および安定性ＦＸａＩは均一なタンパクであり、還元条件下での、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価したところ、９５％以上純度を有している（スキーム１）。ＦＸａＩは、スーパーローズ１２上でのゲル濾過によって測定したところによると、１％未満のダイマーを含み、凝集している。内毒素レベルは、リムルスアメロサイトライセート（LAL:limulus amelocyte lysate）試薬を使用したゲル凝集技術（Yin，E.T． et al．（1972），Biochem．Biophys．Acta．261:284-289）によって測定したところ、4EU/mg未満である。ＦＸａＩは、凍結乾燥状態ならびにＰＢＳ中で凍結した形（好ましくは-７０ ℃）において、タンパク濃度1-2ｍｇ／ｍｌ（Bradford-SDS）で安定である。２．ＦＸａＩの阻害活性ＦＸａＩは、ＦＸａおよびトリプシンを阻害するが、トロンビンおよびプラスミンを阻害しない。（ｉ）ＦＸａの阻害ＦＸａＩのＦＸａ阻害活性を、二つの分析でテストした。（ａ）溶解性ＦＸａ（15,000ｍＵ／ｍｇ）の阻害を（実施例２に記載のような）in vitroの色素産生分析で測定した。本分析では、２ｎＭの活性ＦＸａを含む１ｍｕが、該分析で５０％阻害を引き起こす物質の量と同等であった。該分析の結果は、下記の表５に示されている。この表から、ＦＸａＩがＦＸａの親和性の高い阻害剤である事が明らかである。（ｂ）再構成されたプロトロンビナーゼ複合体分析（実施例２に記載）において、トロンビンの生成は下記表５に示すように阻害された。（ii）トリプシンの阻害ＦＸａＩによる牛のトリプシン阻害が、下記の古典的な用量応答法に従って計算された。（下記に記載の色度測定分析で測定した）ＦＸａＩ活性のパーセンテージを、阻害剤および酵素の濃度の割合に対してプロットすることによって、Ｋｉ値を得た。色素測定分析は、牛のトリプシン3.83または4.27nMの存在下で、２５℃において、１０mM Tris -HCl，10 mM Hepes（pH 7.8），100 mM NaCl，0. 1% PEG 6000中の８０μMクロモザイムＴＨ（Pentapharm，switzerland）を基質に用いて行なった。阻害剤および酵素は、基質を添加する前に、予め２５℃で１０分間、インキュベートされた。本分析では、ＦＸａＩの２つのバッチのＫｉ値は、夫々７．６および６．０ｎＭであった。（iii）プラスミンおよびトロンビンの阻害プラスミンおよびトロンビンは、トリプシンについて上記に記載した同じ分析においては、ＦＸａＩによって阻害されなかった。トロンビンの場合、使用された基質は、トリプシン用に使用したと同じであった。プラスミンの場合、S2251 （KabiVitrum，Sweden）が基質として使用された。３．抗体実施例１３に記載したようにして産生された純粋ＦＸａＩに対して、抗体が産生された。（ｉ）抗体の誘導再折り畳みされたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の完全なＦＸａＩ（1. 9ｍｇ／ｍｌ）と、変成ＦＸａＩ（15％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用され、ニトロセルロースに移転され、0.5ｍｌＤＭＳＯ中に溶解されたもの）の両者をウサギに注射した。ＰＢＳ中の抗原（800μｇ／ｍｌ）は、同量（0.5ｍｌ）のRibiアジュバント（Ribi adjuvant system-RAS-Ribi ImmunoCohem Research Inc.，Hamilton，MT，USA）と混合したが、ＤＭＳＯ溶解抗原については混合することなく、Ribiアジュバントと共にウサギに注射した。抗原（１ｍｌ）を、次のようにしてウサギ（2.5-4.5ｋｇ）に投与した。即ち、0.05mlを皮内６部位に；0.2mlを各後肢筋肉内に；0.1mlを皮下首領域に；および0.2mlを腹腔内に投与した。ウサギは28日毎日投与され、注射後10日して試放血された。ブースター注入を10回繰り返した。（ii）ウエスタンブロット分析による抗体の確認抗体の特異性が、還元下１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせた特異的および無関係なタンパクのウエスタンブロット上で確認された。抗血清と反応させた後、特異的反応を無放射活性の光ベース系（ＥＣＬ系、Amersham Internation al P/C，Amersham，England）を使用して検出した。（iii）結果再折り畳みされたＦＸａＩに対する抗体は、再折り畳みされたＦＸａ折および変ＦＸａＩの両方を認識したが、還元されたＦＸａＩに対する抗体は、還元されたＦＸａＩのみを認識した。何れの抗体も、無関係のタンパクを認識することはなかった。実施例１５：ＦＸａＩの生物学的活性実験は、実施例１３に記載したようにして産生された、２つのバッチのＦＸａＩで行なわれた。１．インビトロ（in vitro）ＡＰＴＴＦＸａＩ−ＡＰＴＴ用量応答曲線を、ヒト、ネズミ、ウサギ、ラットおよびヒヒの血漿を使用して作成した。70-250ｎＭに等しい1-3.3μｇ／ｍｌの濃度のＦＸａＩ（表６）によって、ＡＰＴＴの倍増が引き起こされた。ラットの血漿を使用すると、ヘパリンおよび低分子量のヘパリン（ＬＭＷＨ）のＡＰＴＴの倍増濃度は、夫々1.3および3.3ＩＵ／ｍｌ、つまり8.1および13.2μｇ／ｍｌであった。 II．種々の動物におけるＦＸａＩの薬物動態学および薬力学下記に記載するように、ＦＸａＩの薬物動態学および薬力学が、マウス、ラット、ウサギおよびヒヒで評価された。薬物動態学は、種々の動物の血漿からの、放射線標識されたＦＸａＩの消滅速度を基づいているのに対して、薬力学は、 ex-vivoでのＡＰＴＴの経時減少に基づいている。（ｉ）薬学動態ＦＸａＩを、ボルトン・ハンター試薬（BoltonおよびHunter,（1973）），B iochem．J．133:529-539）と反応させてヨウ素化した。無標識物（特異活性0.13 ｘ106ｃｐｍ／μｇ）と混合し、マウスに注入（１０μｇ／マウス）した。３時間の血漿サンプルの分析から、標識物は、ＴＣＡでいつでも十分沈殿可能であり、そのレベルは４１分の半減期（ｔ1/2）をもって減少した事がわかった。投与後５分以内に、約４０％の放射活性が肝臓で発見された。肝臓中の量は、それから血漿中の量と平行して徐々に減少した。付随して、¹²⁵Ｉ標識された物質が小腸に蓄積された。これによって、ＦＸａＩが多分、タンパク過水分解され、続いて分解物が小腸に排出された事がわかった。標識されたＦＸａＩが、更にラットおよびウサギに注射された。ラットにおいて、血漿放射活性の半減期は約７６分であり、ウサギにおいては約９４分であった（図１６）。（ii）薬力学ＦＸａＩを投与すると、研究に供された全ての動物において、生理食塩水またはＰＢＳ対照についてのex vivo ＡＰＴＴが長くなった。ＡＰＴＴ値は、ＦＸａＩが排泄されるにつれて、時間に依存して減少する。この薬力学の結果は、表６に要約されている。マウスに対して腹腔内投与、皮下投与および筋肉内投与を行った後、ＦＸａＩの薬効が更に研究された。これら三つの投与ルートにおいて、６０−９０分間に最大のＡＰＴＴが達成され、その生物学的利用率は３５−５０％であった。 III．静脈血栓症モデルにおける抗血栓活性ステンレス鋼コイルに誘導される、ラットにおける血栓モデルを使用して、静脈血栓形成におけるＦＸａＩの阻害効果を研究した。使用されたモデルは、マフランドら［（thrombosis and Haemostasis 59；225-230（1988）］により記載された通りである。ウイスター系由来の雌ラット（200-250ｇ）を、ケタミンＨＣｌ＋キシラジンＨＣｌによって麻酔した。腹腔を中央切開し、下大静脈を露出させた。ステンレス鋼ワイヤコイル（歯科用ペーストキャリア、細さ番号31、長さ21ｍｍ）を、静脈の内腔の接合部の真下部位に挿入し、切口を縫合した。挿入する前に、挿入される各装置は個々に秤量され、各重量を記録した。次に、ラットを致死させた。コイルを担持している静脈部を除去し、静脈断片を縦に切開し、血栓が付着しているコイルを注意深く除去し、秤量した。各コイルの初期重量を、その最終重量から差し引いた。このモデルを使用して、ＦＸａＩの抗血栓活性をヘパリンの抗血栓活性と比較した。２−３時間以内で成熟した凝血が形成されることが、このモデルの特徴である。抗血栓剤の血漿レベルの継続的な維持を達成するために、複数回の静脈内（i.v.）注射レジメを使用して、薬力学的研究が行なわれた。血漿レベルは、ex vivo ＡＰＴＴ測定によって推定さた。時間０の時点で初期静脈内投与一回行ない、初期投与量の３５％を４５分の間隔をおいて２回投与することによって、ヘパリンおよびＦＸａＩの両者で充分な血漿プロフイル（±２０％の変動）が得られた（図１８）。このレジメにおいて、種々の投与レベルを使用し、初期注入後５分してコイルを挿入して凝血の形成を調べ、三回目の注入後４５分して凝血測定を行なった。ＩＤ₅₀は、形成される凝血量の５０％減少を引き起こすＦＸａＩの投与量である。ＦＸａＩの２投与で見られる抗血栓効果は、（ＰＢＳ対照と比べて）図１９に示される。これらの結果は、本モデルにおけるヘパリンの抗血栓効果と比較され、下記表７に要約されている。 IV．マウスの尾部出血に対するＦＸａＩにおよびヘパリンの効果出血時間を、ペントバルビトンで麻酔されたマウスで測定した。出血は、尾部先端を標準化された横切断によって誘発された。皮下出血時間は、尾部を等張生理食塩水中に３７℃で垂直浸漬させた後測定された。ＦＸａＩおよびヘパリン両者のマイナス効果、すなわち出血を評価するために比較研究がなされた。この効果を評価するために、ＦＸａＩおよびヘパリンを静脈内注射されたマウスにおいて注射後５分して尾部出血時間を測定した。ＦＸａＩおよびヘパリンについて出血時間の延長、すなわち対照を凌ぐ増加がそれぞれ図２０および２１に示される。Ｖ．ＦＸａＩおよびヘパリンの有益効果 vs 危害効果表７には、ＦＸａＩおよびヘパリンについて、静脈血栓モデルにおける時間の二倍延長に必要とされる投与量およびＩＤ₅₀値が示されている。これら二つの値の割合は、有益効果 vs 危害効果の直接的な尺度となる。ＦＸａＩについては、こ割合が２．６と計算された。しかるに、ヘパリンは一桁低い値（０．２）を示した。結論として、ＦＸａＩはヘパリンを凌ぐ、優れた有効／危害率を持つ非常に効果的な抗血栓剤であることがわかった。実施例１６：ＦＸａＩよる受精チキン卵のインフルエンザウイルスの増殖阻害受精チキン卵におけるＦＸａＩの薬学動態挙動の確立受精チキン卵中で実施例１３に記載のようにして産生されたＦＸａＩの薬学動態挙動は、ex vivo ＡＰＴＴが経過時間に依存して減少することによって決定された。ＦＸａＩ（300μｇ／卵）を、受精チキン卵の漿尿膜液（ＣＡＦ）中に注入した。ＣＡＦのアリコットを様々な時点で採取し、ラットのクエン酸塩化（３．８％、ｖ／ｖ１：１０）血漿中でのＡＰＴＴの延長について分析した。ＡＰＴＴ延長活性は、一次的反応速度で、２４時間の半減期で減少することが分かった。この知見は、ウイルス増殖研究において、４時間間隔の注入養生法を採用する基盤となった。受精卵におけるインフルエンザウイルス増殖におけるＦＸａＩの効果Ａ型インフエルエンザウイルス（ＰＲ−８）が、卵１個あたり0.1ｍｌ生理食塩水中の１０^-2ＥＩＤ₅₀で、受精卵に注入された。卵は３つのグループにわけられた。１グループ（Ａ群）には、0.2ｍｌ生理食塩水中のＦＸａＩ（20μｇ／卵）を時間０の時点で注入し、次いで、その注入後４、８、１２、１６時間目に、１０μｇ／卵（0.1ｍｌ）を注入した。第二番目のグループ（Ｂ群）は、ＦＸａＩ（20μｇ／卵）を時間０の時点で注入され、４時間の時点で10μｇ／卵の注入を受けた。第三のグループは、0.2ｍｌの生理食塩水を時間０の時点で、続いて４、８、１２、１６時間の時点で0.1ｍｌの生理食塩水の注入をうけ、対照として使用された。卵は３７℃において、回転モードで保持した。注入後、２４、３２、４８時間目に、4-10個の卵を各グループより採取し、ＣＡＦを除去して、インフルエンザウイルスのレベルを赤血球凝集分析（１９）にて調べた。その結果は表８に提示されている。上記の結果は、ＦＸａＩがチキンの胚細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖を阻害することを示している。更に、これらの結果によって、ＦＸａＩが真核細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖を阻害し、インフルエンザウイルスに罹患している患者、或いはインフルエンザと接触する危険のある対象者の感染を治療または予防をする事を示している。実施例１７：ラットにおけるＦＸａＩによる急性動脈血栓の阻害急性動脈血栓におけるＦＸａＩの阻害効果を、ラットにおける急性動脈血栓モデルにおいてテストした。使用したモデルは、バーナトら（Bernat A．et al.thromb．Haemostas.，70，812-816（1993））の記載に下記に記載の若干の改良を加えて行った。血栓形成は、ラットの頸動脈を電気的刺激することによって誘導された。ウイスター由来の雄ラット（250-350ｇ）をケタミンＨＣｌ＋キシラジンＨＣｌによって麻酔し、暖めた毛布の上に載置した。右頸動脈（長さ約10mm）部分を露出させ、回りの組織から切離した。絶縁フィルム（パラフィルム）小片および二つのステンレス鋼の電極を動脈下に挿入した。一定のd.c．電力を供給して、動脈を0 .98ｍＡで４分間刺激した。電気的刺激部位から頭側（下流）の局所動脈温度を測定することにより、血栓閉塞を追跡調査した。体温および動脈温度を６０分にわたり２０分間隔で測定した。、電気刺激を開始する５分前に、生理食塩水（対照動物に対し）またはＦＸａＩ（種々の濃度で）の静脈内注射（0.5ｍｌ）をラットに投与した。これらの実験に使用したＦＸａＩのバッチは、実施例１３に記載したようにして製造された。しかしながら、ＦＸａＩのこのバッチが、色素産生分析において以前のＦＸａＩバッチと同様の活性を本質的に有していたとしても、ＡＰＴＴ分析においては、その可能性の約６５％しか示さなかった。すなわち、ＡＰＴＴの倍増を起こすＦＸａＩの濃度は、前のＦＸａＩバッチにおけるよりも５０％高かった。対照動物（n=12）および３つの異なるＦＸａＩの投与量［0.133mg/kg（n=7）、0.266mg/kg（n=9）および0.4mg/kg（n=4）］の結果を図２２に示す。この結果により、ＦＸａＩの高投与量の二つでは、動脈血栓に伴う温度低下を停止させるが、一番低い投与量では、効果は部分的である事がわかった。実施例１８：ヒヒにおけるＦＸａＩによる血栓の阻止実施例１３に記載のようにして産生されたＦＸａＩによるヒヒでの血栓形成の阻害を、種々の血液せん断率（blood shear rate）の条件下で、基本的には、特にCadroy et al.，blood 75（11）：2185-2193（1990）；kelly et al.，（19 91），Blood 77:1006-1012，Cadroy et al．（1991），P.N.A.S．88：1177-1181 に記載の様にして、図２５に示すような若干の変更を加えることで、高血漿板、高フィブリンの血栓を産するダクロン血栓装置を使用して測定した。３匹のヒヒの各々に、ＦＸａＩを、10、40、200μｇ／ｋｇ／ｈｒの３つの異なる投与量で注入した。全投与量の半分を丸薬として与え、他の半分を１時間にわたって注入した。ヒヒに¹¹¹Ｉｎ血漿板を注入し、その蓄積をガンマカメラで測定した。定常状態の血漿レベルは：最低投与量では検出不可、中程度の投与量では0.6 μｇ／ｍｌ、最高投与量では3.6μｇ／ｍｌであった。ヒヒの血漿におけるＦＸａＩの半減期は約２時間であった。動脈血栓に対応するダクロングラフト上の血漿板の沈殿は、これらの量の投与において、夫々平均で３０、５０、８０％減少した（図２３）。更に、これらの各投与量において、静脈血栓に対応する低せん断静脈タイプの血流の「チャンバー」領域における血栓の形成は、殆どなくなった（図２４）。更に、一匹のヒヒにＰＢＳを注入し、対照として使用した。このヒヒには、最高レベルの動脈および静脈血漿版が蓄積っされた。この結果により、ＦＸａＩが、ヒヒにおいて動脈および静脈両者の血栓を阻害したことがわかる。更には、ＦＸａＩの静脈血栓に及ぼす影響は、最低濃度のＦＸａＩ（１０μｇ／ｋｇ／ｈｒ）でにおいても既に観察され得る。更に、ヒヒにおけるダクロン動脈血漿板血栓の沈殿を殆ど停止させるために必要なＦＸａＩの量は、そのような効果を得るために必要なデサルファト・ヒルジン（Dessulfato hirudin）の量よりも約２桁小さい（Kelly et al．（1991）,Bl ood 77：1006-1012、特に図ＩＣ、20 nmolデサルファト−ヒルジン／kg／min（7 mg ヒルデイン／kg／時間に匹敵）。ヒヒにおける静脈血漿板沈着を停止させるのに必要なＦＸａＩの量は、この様な結果を得るに必要なＨ−ペプチド（Hirulo g）の量よりも、約２桁小さい（Cadroy et al.（1991），P.N.A.S 88：1177-118 1,特に図１Ａ）。更に、ヒヒにおいてダクロン動脈血漿板沈着をほぼ停止させるのに必要なＦＸａＩの量は、このような効果を得るのに必要なチック（Tick）抗凝集ペプチド（ＴＡＰ）の量の約５分の１である（Kelly et al.，第65回合衆国心臓協会の科学分会、ニューオーリンズ、ルイジアナ、合衆国、１１月16-19，1992，循環86（4 ，suppl.1）1992，I-411）。参照文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/99 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/64 ＡＣＢ 21/08 9455−4Ｃ 37/50 ＡＤＹ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者レバノン、アビグドアイスラエル国、レボホット、モーリバー・ストリート８

Claims

【特許請求の範囲】１．下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド。上記において、Ｘは、ＭＥＴまたは不存在を意味する；Ｙは、下記配列ＬＹＳ−ＭＥＴ・ＣＹＳ−ＴＲＰ・ＡＳＮ・ＬＹＳ・ＧＬＹ・ＣＹＳ・ＰＲＯ・ＣＹＳ・ＧＬＹ・ＧＬＮ・ＡＲＧ・ＣＹＳ・ＡＳＮ・ＬＥＵ・ＨＩＳ・ＡＲＧ・ＡＳＮ・ＧＬＵ・ＣＹＳ・ＧＬＵ・ＶＡＬ・ＩＬＥ・ＡＬＡ・ＧＬＵ・ＡＳＮ・ＩＬＥ・ＧＬＵの０〜２９アミノ酸である。但し、該配列の一部のみ存在するならば、それは該配列のカルボキシ末端部分であり、Ｖａｌ²⁴ はＧｌｙによって先行されている；Ｚは、不存在であるか、或いは図７に示した配列Ｐｒｏ¹¹⁰−Ｌｙｓ¹⁵⁶の全部または一部である。但し、該配列の一部のみ存在するならば、それは該配列のアミノ末端部分である。２．請求項１に記載のポリペプチドであって、アミノ酸配列Ｙ−Ｌｙｓ²−Ｌｙｓ¹⁵⁶を有し、Ｌｙｓ²−Ｌｙｓ¹⁵⁶は図７に示した配列と同一であり、ＹはＭＥＴまたは不存在であるポリペプチド。３．請求項１に記載のポリペプチドであって、アミノ酸配列Ｙ−Ｉｌｅ²⁹−Ｌｙｓ¹⁵⁶を有し、Ｉｌｅ²⁹−Ｌｙｓ¹⁵⁶は図７に示した配列と同一であり、ＹはＭＥＴまたは不存在であるポリペプチド。４．請求項１に記載のポリペプチドであって、アミノ酸配列Ｙ−Ｖａｌ²⁴−Ｌｙｓ¹⁵⁶を有し、Ｖａｌ²⁴−Ｌｙｓ¹⁵⁶は図７に示した配列と同一であり、ＹはＭＥＴまたは不存在であり、Ｖａｌ²⁴はＧｌｙによって先行されているポリペプチド。５．グリコシル化されていない請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチド。６．請求項１のポリペプチドをコードするＤＮＡ。７．請求項４のポリペプチドをコードするＤＮＡ。８．請求項６のＤＮＡを含むプラスミドであって、ｐＳＰ６５−ＦＸａＩ−１３と命名され、ＡＴＣＣ受付け番号第69134号の下に寄託されたプラスミド。９．請求項６のＤＮＡを含む発現プラスミド。１０．請求項９に記載の発現プラスミドであって、ｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ” と命名され、ＡＴＣＣ受付け番号第69135号の下に寄託されたプラスミド。１１．請求項９に記載の発現プラスミドであって、ｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ” −Ｔ₁Ｔ₂と命名されたプラスミド。１２．請求項９に記載の発現プラスミドであって、ｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−１３“ｆ”と命名され、ＡＴＣＣ受付け番号第69137号の下に寄託されたプラスミド。１３．請求項７のＤＮＡを含む発現プラスミド。１４．請求項１３に記載の発現プラスミドであって、ｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ ”−05Ｍと命名されたプラスミド。１５．請求項１３に記載の発現プラスミドであって、ｐλ−ＸａＩ−１３“ｍ ”-05Ｍ−Ｔ₁Ｔ₂と命名されたプラスミド。１６．ホスト細胞中に請求項９，１０，１１，１２，１３，１４または１５の発現プラスミドを含むホスト／プラスミド系。１７．請求項１６に記載のホスト／プラスミド系であって、前記ホスト細胞がバクテリア細胞であるホスト／プラスミド系。１８．請求項１７に記載のホスト／プラスミド系であって、前記バクテリア細胞がE．coli細胞であるホスト／プラスミド系。１９．請求項１のポリペプチドを製造する方法であって、当該ポリペプチドをコードする発現プラスミドでホスト細胞を形質転換する工程と、この形質転換されたホスト細胞を、該細胞が前記プラスミドによってコードされるポリペプチドを産生するように培養する工程と、こうして産生されたポリペプチドを回収する工程とを具備した方法。２０．請求項１９に記載の方法であって、前記ホスト細胞がバクテリア細胞であり、また前記回収工程は、（a）前記細胞を破壊して、前記ポリペプチドを含む溶解物を製造する工程と、（b）前記溶解物を処理して、前記ポリペプチドを含む包接体を得る工程と、（c）該包接体を処理して、可溶形の前記ポリペプチドを得る工程と、（d）得られた可溶性ポリペプチドを処理して、生物学的に活性なポリペプチドを形成する工程と、（e）こうして形成された生物学的に活性なポリペプチドを回収する工程と、（f）こうして回収された生物学的に活性なポリペプチドを精製する工程とを具備する方法を提供する。２１．請求項２０に記載の方法であって、工程（c）の処理には、更に変性剤の添加が含まれる方法。２２．請求項２１に記載の方法であって、前記変性剤が塩化グアニジニウムまたは尿素である方法。２３．請求項２０に記載の方法であって、工程（d）の処理には、前記ポリペプチドを、チオール含有化合物およびジスルフィドの混合物に接触させることが含まれる方法。２４．請求項２３に記載の方法であって、前記チオール含有混合物がグルタチオン、チオレドキシン、β−メルカプトエタノールまたはシステインであり、前記ジスルフィドは酸化されたグルタチオン、シスチンまたはメルカプトエタノールの空気酸化生成物である方法。２５．請求項２０に記載の方法であって、工程（f）の精製工程にはカラムクロマトグラフィーが含まれる方法。２６．請求項２５に記載の方法であって、前記カラムクロマトグラフィーには、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーおよびヘパリン−セファロースクロマトグラフィーの何れか一方もしくは両方、またはＱ−セファロースクロマトグラフィーおよびＳ−セファロースクロマトグラフィーの何れか一方もしくは両方が含まれる方法。２７．当該生物学的に活性なポリペプチドからもたらされる望ましい治療効果を得るために有効な量の、請求項１〜４および５２の何れかのポリペプチドと、適切なキャリアとを含有する組成物。２８．請求項２７に記載の組成物であって、前記望ましい治療効果には、血液凝固の程度を低下させることが含まれる方法。２９．血液凝固の程度を低下させる方法であって、血液を、血液凝固の程度を低下させるのに有効な量の請求項１に記載のポリペプチドと接触させることを具備する方法。３０．請求項２９に記載の方法であって、前記の接触が患者においてイン・ビボで行われる方法。３１．請求項３０に記載の方法であって、前記患者は、過剰な血液凝固に罹患している方法。３２．請求項３１に記載の方法であって、前記過剰な血液凝固に罹患している患者は、血管疾患、術後外傷、肥満、妊娠、経口避妊薬の副作用および続持性運動抑制（prolonged immobilization）からなる群から選択される症状を有している方法。３３．請求項３２に記載の方法であって、前記過剰な血液凝固には脳血管障害が含まれる方法。３４．請求項３３に記載の方法であって、前記脳血管障害が卒中である方法。３５．請求項３１に記載の方法であって、前記過剰な血液凝固に血栓症が含まれる方法。３６．請求項３５に記載の方法であって、前記血栓症が静脈血栓症である方法。３７．請求項３６に記載の方法であって、前記静脈血栓症が深静脈血栓症である方法。３８．請求項３６に記載の方法であって、前記静脈血栓症が散在性血管内凝血である方法。３９．請求項３５に記載の方法であって、前記血栓症が動脈血栓症である方法。４０．請求項３９に記載の方法であって、前記動脈血栓症が冠動脈の血栓症である方法。４１．請求項３５に記載の方法であって、前記血栓症は血栓溶解に続いて発生する方法。４２．請求項４１に記載の方法であって、前記血栓症が血栓溶解剤で生じる方法。４３．請求項４２に記載の方法であって、前記血栓溶解剤が組織プラスミノーゲン活性化剤またはストレプトキナーゼである方法。４４．請求項４２に記載の方法であって、前記ポリペプチドは血栓溶解剤と共に投与される方法。４５．請求項４２に記載の方法であって、前記ポリペプチドは前記血栓溶解剤の前または後で投与される方法。４６．請求項４２に記載の方法であって、前記ポリペプチドは前記血栓溶解剤に結合される方法。４７．Ｘａ因子の活性を阻害する方法であって、Ｘａ因子を、Ｘａ因子の活性を阻害するのに有効な量のポリペプチドと接触させることを具備した方法。４８．請求項１のポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体。４９．請求項４８に記載のモノクローナル抗体。５０．請求項４８の抗体の特異的な反応を拮抗的に阻害するポリペプチド。５１．請求項９に記載の発現プラスミドであって、ｐλＳＯＤ−ＮＧＥ−ＸａＩ−１３“ｍ”と命名され、ＡＴＣＣ受付け番号第69269号の下に寄託された発現プラスミド。５２．請求項１に記載のポリペプチドであって、アミノ酸配列Ｇｌｕ²³−Ｌｙｓ¹⁵⁶を有し、Ｇｌｕ²³−Ｌｙｓ¹⁵⁶は図７に示した配列と同一であるポリペプチド。５３．グリコシル化されていない、請求項５２に記載のポリペプチド。５４．インフルエンザを治療または予防する方法であって、インフルエンザに罹患した患者またはインフルエンザと接触する危険がある対象に対して、インフルエンザを治療または予防するために有効な量のＦＸａの阻害剤を投与することを具備した方法。５５．請求項５４に記載の方法であって、ＦＸａの前記阻害剤が、スーパーオキシドジスムターゼと組み合わせて投与される方法。５６．インフルエンザを治療または予防する方法であって、インフルエンザに罹患した患者またはインフルエンザと接触する危険がある対象に対して、インフルエンザを治療または予防するために有効な量の請求項１または４のポリペプチドを投与することを具備した方法。５７．請求項５６に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、スーパーオキシドジスムターゼと組み合わせて投与される方法。５８．Ｘａ因子阻害活性を有する、請求項１，２，３，４または５に記載のポリペプチド。