JPH08511692A

JPH08511692A - アポプトシス阻害剤

Info

Publication number: JPH08511692A
Application number: JP7526031A
Authority: JP
Inventors: クラマー，ペーター; ヴェステンドルプ，ミカエル; シェルツェオストフ，クラウス; デバーティン，クラウスミカエル; フランク，ライネル; ダイン，イェンス; ヴァルツァック，ヘニング; クニッピング，エカルト; ストリッケル，キルスティン
Original assignee: ドイチェスクレプスフォルシュングスツェントルムシュティフトゥングデスエフェントリッヒェンレヒツ
Priority date: 1994-04-08
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 1996-12-10
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: JP2004215669A; ATE255129T1; EP0705278A1; JP3811745B2; WO1995027735A1; ES2211899T3; DE4447484C2; DE4447484A1; US20070207160A1; EP0705278B1; DK0705278T3; JP3778453B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アポプトシス阻害のための組成物であって、（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド、（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害するコンパウンド、および、（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンド、から成る群より選択される成分を１以上含有し、該成分が個体内の異物とも、従来の賦形剤ともみなされない組成物に関するものである。さらに本発明は、アポプトシス阻害に適したコンパウンドであって、個体内で異物とみなされない１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび個体内で異物とみなされない担体を有しているコンパウンドに関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】アポプトシス阻害剤本発明はアポプトシスを阻害する組成物に関するものである。さらに、本発明は、アポプトシスの阻害に好適なコンパウンド（compound；混合物またはその成分、以下同様）並びにその製造方法に関するものである。アポプトシスは、計画された細胞死を意味する用語である。アポプトシスは例えば、器官の発達、変態、隆形成、および腫瘍の後退等においてみられる。アポプトシスは、細胞質の濃縮、原形質膜毛の喪失、核の分節化、および染色体ＤＮＡのはなはだしい放壊によって達成される（Oehm，A．等、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ２６７，Ｎｏ．１５，１９９２，ｐｐ１０７０９−１０７１５）。アポプトシス陽性細胞はしばしば、ＡＰＯ−１と呼ばれる細胞表面のタンパク質を含んでいる。この糖タンパク質は、腫瘍壊死因子／神経成長因子レセプター群に分類されている。ＡＰＯ−１が抗ＡＰＯ−１抗体と架橋結合することにより、前述の細胞中でアポプトシスが誘発される（Oehm，A．等、前出を参照）。同じ現象が、ＡＰＯ−１リガンドと呼ばれる可溶性または膜結合性タンパク質がＡＰＯ−１に結合することにより生じると思われる（ＳｕｄａＴ，ａｎｄＮａｇａｔａ，Ｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ＴｈｅＲｏｃｋｆｅｌｌｅｒ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｖｏｌ，１７９，１９９４，ｐｐ８７３−８７９）。しかしながら、アポプトシスの阻害については何も知られてはいない。しかし、出願人の最近の研究により、アポプトシスは、例えばエイズや自己免疫疾患等のさまざまな病気でも起こることが明らかとなったため、この阻害は必要であろう。エイズの場合には、アポプトシスはＣＤ４−Ｔ細胞の激減に対する反応であると考えられている。故に、本発明はアポプトシスを阻止しうる組成物を提供することを目的とするものである。本発明に従って、（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンドから成る群より選択される成分を１以上含み、該成分が個体内の異物とも、従来の賦形剤ともみなされないことを特徴とする組成物を供与することにより、この目的を達成する。「ＡＰＯ−１阻害コンパウンド」という表現は、ＡＰＯ−１を阻害するのに適したいかなるコンパウンドをも含む。好ましくは、これは非細胞毒性の抗ＡＰＯ −１阻止抗体またはＦｃ部分（例えば抗ＡＰＯ−１抗体のＦ（ａｂ），Ｆ（ａｂ）₂またはＦｖ断片）を有さない抗ＡＰＯ−１抗体である。このような断片は普通の当業者が行っている方法によって、（例えば根拠として、Oehm等、前出に記載されている抗ＡＰＯ−１抗体、またはDhein，J．等、The Journal of Immunol ogy Vol．149，No.10，1992，pp.3166-3173に記載されている抗ＡＰＯ−１Ｆ（ａｂ）₂断片を用いて調製される。後者は直接的に用いることができる。上述の抗体でのＦｃ部分の欠如は、結合したＡＰＯ−１の架橋を防ぎ、従ってアポプトシスの誘発を防ぐ。驚いたことに、ＡＰＯ−１はこのような抗体によって阻害される。ＡＰＯ−１リガンドのアナログが、別の好ましい「ＡＰＯ−１−阻害コンパウンド」として言及されるべきである。このアナログはＡＰＯ−１と結合はするが、もはや細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を誘導はしない。このようなアナログは、例えば根拠としてSuda，T.およびNagata，S.前出に記載されているＡＰＯ−１リガンド等を用いて、当業者によって普通に調製できる。「ＡＰＯ−１リガンドをそれそれ阻害および捕捉するコンパウンド」という表現は、ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉するのに好適ないかなるコンパウンドをも含む。好ましくは以下のコンパウンドの一つである。・抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、・ＡＰＯ−１、・細胞外ＡＰＯ−１ドメイン、・少なくとも１つの細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体を有するコンパウンド・ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有するペプチド、および・ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有する少なくとも１つのペプチドおよび担担体からなるコンパウンドこのようなコンパウンドは通常の方法で調製できる。抗ＡＰＯ−１リガンド抗体の作成には、当業者は例えば前出のSuda，T.およびNagata，S.に記載されているＡＰＯ−１を基礎として用いる。当業者は、抗体のＦｃ部分は個体中で異物とされない事実に注目している。当業者はこれを可能にしている工程をよく知っている。さらに当業者は、例えばＥＰ−９２１０７０６０．３に記載されているＡＰＯ−１およびそのＡＰＯ−１細胞外ドメインを、ＡＰＯ−１およびＡＰＯ −１細胞外ドメイン作成の基礎としてそれぞれ利用する。加えて、当業者は例えば、前述のＡＰＯ−１リガンドおよび前述のＡＰＯ−１およびその細胞外ドメインそれぞれの組合せも、ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有するペプチドの作成のために利用する。少なくとも１つのＡＰＯ−１細胞ドメインおよび担体を有するコンパウンドの作成方法が以下の実施例に記載されている。ＡＰＯ−１リガインド結合サイトを有する少なくともひとつのプペチドおよび担体を有するコンパウンドを類似に（ａｎａｌｏｇｏｕｓｌｙ）作成することが可能である。「細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンド」という表現は、細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を適切に阻害しうるいかなるコンパウンドをも含む。以下のコンパウンドのひとつが好ましい。・「インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）」阻害剤、特に、３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）、ＩＣＥ特異的テトラペプチドであるＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ワクシニアウイルスタンパク質であるＣｒｍＡまたはそれらそれぞれの誘導体。ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＣｒｍＡまたはそれらそれぞれの誘導体を、発現可能な核酸として使用するのが好適である。さらに、ＩＣＥ−アンチセンス核酸およびそれらそれぞれの誘導体を、ＩＣＥ阻害剤として用いるのもまた好ましい。・構造的にＩＣＥに関連しているプロテアーゼ群、特にＮｅｄｄ−２／Ｉｃｈ −１またはｐｒｉＣＥ、の阻害剤このような阻害剤コンパウンドは普通に調製できる。ＤＣＩおよびその誘導体それぞれの製造において、当業者は、例えばＨａｒｐｅｒ，J.，W.等、Biochemi stry，24，1831-1841，1985.の研究に戻るであろう。さらに当業者は、Ｔｈｏｎｂｅｒｒｙ，N.，A．等、Nature 356，768-774 1992、の、ＹＶＡＤ−ＣＨＯおよびその誘導体それぞれについての研究を考慮するであろう。加えて、当業者は、例えば、Ｒａｙ，C.，A.等、Cell 69，597-604，1994の、ＣｒｍＡまたはそれらの誘導体についての研究を考慮するであろう。そのうえ、当業者は、例えば、Ｃｅｒｒｅｔｔｉ等，Science 256，97-100，1992、の、ＩＣＥアンチセンス核酸およびその誘導体それぞれに関する研究を参考にするであろう。さらに、Ｗａｎｇ，L.等、Cell 78，739-750，1994およびＬａｚｅｐｎｉｋ，Y．A．等、Natu re 371，346-347，1994の研究に、プロテアーゼＮｅｄｄ−２／Ｉｃｈ−１およびｐｒｉＣＥそれぞれに関して戻るであろう。本発明に従って、前述の組成物（composition）は、特に，ＨＩＶ感染に関する疾患におけるアポプトシスの阻害に用いられる。この関係において、本発明の組成物が、さらに１以上またはすべての以下の成分を含んだ場合、特に有用であることが証明される。（ａ）ＴＡＴレセプター阻害コンパウンド（ｂ）ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド（ｃ）細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド（ｄ）ＣＤ４レセプターを阻害するコンパウンド（ｅ）ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド、および、（ｆ）個体内で成分が異物として認識されない、細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路阻害コンパウンド「ＴＡＴレセプターを阻害するコンパウンド」という表現は、ＴＡＴレセプターを阻害するのに適当ないかなるコンパウンドをも含む。これは好ましくは、抗ＴＡＴレセプター抗体である。この抗体は通常の方式により調製される。当業者は抗体のＦｃ部分が個体内で異物とみなされない点に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程を熟知している。ＴＡＴアナログもまた、別の好適な「ＴＡＴレセプター阻害コンパウンド」として言及されるべきである。これはＴＡＴレセプターに結合するがもはや細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を誘導しない。このようなアナログは通常の方法で当業者が、例えば、Ａｒｙａ，S.，K.等、Scicence，Vol．229，1985，pp.69- 73、等を基本として用いて調製できる。「ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド」という表現は、ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉するのに好適ないかなるコンパウンドをも含む。これは、好ましくは以下のコンパウンドのひとつである。・抗ＴＡＴ抗体・ＴＡＴレセプター・細胞外ＴＡＴレセプタードメイン・１以上の細胞外ＴＡＴレセプタードメインおよび担体を有するコンパウンド・ＴＡＴ結合サイトを有するペプチド・ＴＡＴ結合サイトを有する１以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンド・核酸ベースのＴＡＴ結合サイトおよび・トランスドミナント（transdominant）ＴＡＴ変異体このようなコンパウンドは通常の方法により調製できる。抗ＴＡＴ抗体の作成のために、当業者は、例えば、前出のＡｒｙａ，S.,K．らに記載されているＴＡＴを基礎として用いるであろう。当業者は、抗体のＦｃ部分が個体内で異物とされないという事実に注意を払うであろう。当業者はこれを可能にする工程に精通している。さらに、当業者は、例えば、Ｆｅｎｇ，S.およびＨｏｌｌａｎｄ，E. , C.，Nature，Vol．334，1988，pp．165-167、に記載されているＴＡＴ−ＬＴＲ配列を、核酸塩基上のＴＡＴ結合サイトに関する基礎として用いるであろう。その上、当業者は、例えば、Ｅｃｈｅｔｅｂｕ，C.，O.およびＲｉｃｅ，A.，P. , J．Acquir．Immune Def，Syndrome，Vol．6，1993，pp．550-557、に記載されている変異体を、トランスドミナントＴＡＴ変異体に関する基礎として用いるであろう。「細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド」という表現は、細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するために適当ないかなるコンパウンドをも含む。「ＣＤ４レセプターを阻害するコンパウンド」という表現は、ＣＤ４レセプターの阻害のために適当ないかなるコンパウンドをも含む。これは好ましくは抗ＣＤ４レセプター抗体である。それは、当業者が例えば、Ｃａｐｏｎ，D.，J.およびＷａｒｄ，R.，H.，R.，Annu，Rev．Immunol，9，1991，pp．649-678に記載されているＣＤ４レセプターを基礎として用いて普通に調製できる。当業者は抗体のＦｃ部分が個体内で異物とされないという事実に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程を熟知している。ｇｐ１２０アナログが別の好ましい「ＣＤ４レセプターを阻害するコンパウンド」として言及されなねばならない。それはＣＤ４レセプターに結合するが、もはや細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を誘導はしない。このようなアナログは、当業者が、例えば前出のＣａｐｏｎ，D.，J.およびＷａｒｄ，R.，H.，R.，に記載されているｇｐ１２０を基礎として用いる通常の方法により調製できる。「ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド」という表現は、ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉するために適当ないかなるコンパウンドをも含む。これは好ましくは、以下のコンパウンドのひとつである。・抗ｇｐ１２０抗体・ＣＤ４レセプター・細胞外ＣＤ４レセプタードメイン・１以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメインおよび担体を有するコンパウンド・ｇｐ１２０結合サイトを有するペプチド、および・ｇｐ１２０結合サイトを有する１以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンドこのようなコンパウンドは通常の方法により調製できる。抗ｇｐ１２０抗体の作成のために、当業者は、例えば、前出のＣａｐｏｎ，D.，J.およびＷａｒｄ， R.，H.，R.，に記載されているｇｐ１２０を基礎として利用するであろう。当業者は抗体のＦｃ部分が個体内で異物として認識されないという事実に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程に精通している。さらに当業者は、前出のＣａｐｏｎ，D.，J.,およびＷａｒｄ，R.，H.，R.，に記載されているＣＤ４レセプターおよびその細胞外ＣＤ４レセプタードメインをそれぞれ、ＣＤ４レセプターおよび細胞外ＣＤ４レセプタードメインをそれぞれの作成に関する基礎として利用するであろう。加えて、当業者は、例えば上述のｇｐ１２０およびＣＤ４レセプターおよびその細胞外ドメインの組合せをそれぞれ、ｇｐ１２０結合サイトを有するペプチドの作成に利用するであろう。１以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメイン、および１以上のｇｐ１２０結合サイトを有するペプチドそれぞれおよび担体からなるコンパウンドの作成は、以下に記載された、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体からなるコンパウンドの場合のようにアナログ的に実行できる。細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド」という表現は、細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害するために適当ないかなるコンパウンドをも含む。上述の組成物（composition）は、１種類から数種類の個別の成分のコンパウンドを有していても差支えないと解する。本発明に従って、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体からなるコンパウンドが供与され、そのドメインおよび担体は個体内で異物とはみなされない。「担体」という表現は、１つ以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインが結合しても差支えないいかなるコンパウンドをも含む。より好適な実施例において、担体は、例えば血清アルブシンヘモグロビン、フィブリノーゲン、コラーゲンなどのタンパク質または抗体のＦｃ部分であり、後者が好ましい。特に好ましい実施例では、本発明のコンパウンドは融合タンパク質である。本発明のコンパウンドは通常の方法で調製できる。融合タンパク質の場合は、以下の作成工程が好ましいことが判明している。（ａ）１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよびそれ自身の３’末端へ取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを、公知のＰＣＲ技術により増幅し、（ｂ）タンパク質担体およびタンパク質担体の５’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを、公知のＰＣＲ技術により増幅し、（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）により増幅されたＤＮＡを組み合わせ、さらにそれを公知のＰＣＲ技術によりＤＮＡを増幅し、ここでＡＰＯ−１領域の５ ’末端ＤＮＡに相当するプライマーおよびタンパク質担体の３’末端ＤＮＡに相当するプライマーが、融合した両方のＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得るために用いられており、（ｄ）工程（ｃ）のＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入し、通常の方法でＤＮＡ断片を発現させる。好ましい実施例において、（ａ）および（ｂ）の結合領域は、抗体ヒンジ領域あるいはその一部分である。さらには、それはトロンビン分解部位であってもよい。前述の産生工程において、さまざまなＤＮＡが公知のＰＣＲ技術により増幅される。当業者は、例えば前出のＥＰ−９２１０７０６０．３記載のＤＮＡを、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインをコードするＤＮＡとして、基礎として利用するであろう。当業者は、その３’末端に結合領域をコードするＤＮＡを取り付けるであろう。ヒト抗体のヒンジ領域またはその一部分をコードするＤＮＡの場合は、当業者は、例えば、Dubel，S.,等、Method in Molecular and Cellular Biology，Vol.3，1992，pp.47-52へと戻るであろう。タンパク質担体、例えば、ヒト抗体のＦｃ領域、をコードしているＤＮＡに関しては、当業者は、前出の Dubel，S.等に記載されているＤＮＡへと戻るであろう。動物の細胞中での発現にはｐＣＤＮ８３，ｐＣＥＶ４，およびｐＣＤＭ８等の公知のベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用にはｐＧＥＭＥＸおよびｐＵＣ等の公知のベクターを用いて、並びに酵母での発現用にはｐＹ１００およびＹＣｐＡＤ１等の公知のベクターを用いて増幅したＤＮＡ断片を発現する。ＬＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、動物細胞として特に適切である一方、Ｅ．ｃｏｌｉは原核生物として特に、サッカロミセスおよびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）は酵母細胞として特に適切であることを言及しておかねばならない。本発明のコンパウンドはアポプトシスの阻害に非常によく適している。この目的のため、以下のような成分であって個体内で異物とは見なされない成分の１以上からすべての成分の組合せを用いることができる。（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害し捕捉する他のコンパウンド（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンド個々の成分の記述については（ａ），（ｂ）および（ｃ）についてはすでに言及してある。これらの記述はここでも一致して適用される。本発明のコンパウンドは、ＨＩＶ感染に関連した疾患におけるアポプトシスの阻害に特に適している。この目的のため、本発明のコンパウンドは以下のような成分であって個体内で異物とは見なされない成分の１以上あるいはすべての成分の組合せを用いることができる。（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉する別のコンパウンド（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンド（ｄ）ＴＡＴレセプターを阻害するコンパウンド（ｅ）ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド（ｆ）細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド（ｇ）ＣＤ４レセプターを阻害するコンパウンド（ｈ）ｇｐ１２０をそれぞれ阻害または捕捉するコンパウンド、および（ｉ）細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド個々の成分（component）（ａ）から（ｉ）については、前記のように言及されており、成分（ｄ）−（ｉ）は前述した（ａ）−（ｆ）のように言及される。前の記述はここでもそれに応じて適用される。本発明は、アポプトシスが重要な役割を果たす疾患の新しい治療法を供与するものである。本発明は、特に、エイズ治療の突破口となることを想定している。図面の簡単な説明第１図は、ｈｕＡＰＯ−１−Ｉｇおよび抗−ＡＰＯ−ＩＦ（ａｂ’）₂それぞれによるアポプトシスの阻害を示している。第２ａ図は、抗ＡＰＯ−１抗体による、ＩＣＥのタンパク質分解活性への影響を示している。第２ｂ図は、ＤＣＩによるアポプトシスの阻害を示している。第２ｃ図は、ＹＶＡＤ−ＣＨＯによるアポプトシスの阻害を示している。そして、第２ｄ図は、アンチセンスＩＣＥおよびＣｒｍＡ−ｃＤＮＡそれぞれによるアポプトシスの阻害を示している。以下の実施例により本発明を説明する。実施例１：細胞外ＡＰＯ−１ドメインがヒト抗体Ｆｃ部分に抗体ヒンジ領域を介して融合された融合タンパク質の作成前述の融合タンパク質の調製のため、細胞外ＡＰＯ−１ドメインをコードするｃＤＮＡ（Oehm，A.ら、前出を参照）およびヒト抗体のＦｃ部分（Dubel，S．et al.,前出）をコードするｃＤＮＡについて、公知のＰＣＲ増幅を実施した。細胞外ＡＰＯ−１ドメインのｃＤＮＡ用に用いられたプライマーは、５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣ３’であり、開始メチオニンをとりまく完全コザツク・コンセンサス（Ｋｏｚａｋ−Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）領域の上流にＨｉｎｄIIIサイトが導入されているもの、および５’ＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣ３’であり、細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよびヒンジ領域の最初の１８ｂｐをコードするものである。Ｆｃ部分のｃＤＮＡ用に用いられたプライマーは、５’ＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣ３’でヒンジ領域の最初の１８ｂｐおよびＦｃ部分の５’末端領域をコードするもの、並びに５’ＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ３’で、Ｆｃ部分の３’末端をコードし、停止コドンの下流にＸｂａＩサイトを導入するものである。その結果生成されたＰＣＲ産物を、低融点アガロースゲルにより分離し、適当な分子量のＤＮＡ分子を含むゲル小片を集めた。そのサンプル自体について別にＰＣＲ増幅を行った。用いたプライマーは、それぞれ細胞外ＡＰＯ−１ドメインの５’末端およびＦｃ部分の３’末端に相当するもののみであった。このように、細胞外ＡＰＯ−１ドメインを、共通ヒンジ領域を介してＦｃ部分に融合することが可能であった。「融合」ＤＮＡ断片を得た。この断片をＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで切断し、アガロースゲルにより精製しベクターｐＣＤＭ８内にクローン化した。ｐＣＤＭ８のインサートの塩基配列はジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法により決定された。実施例２：ｈｕＡＰＯ−１−Ｉｇおよび抗ＡＰＯ−１Ｆ（ａｂ’）₂それぞれによるアポプトシスの阻害ＳＫＷ６．４細胞（前出のOehm，A.らを参照）は、アポプトシス陽性細胞であり、即ち、その内部で、例えば、抗ＡＰＯ−１抗体の結合によりアポプトシスが誘導され得る。ＳＫＷ６．４細胞を、さまざま量の実施例１のタンパク質（ｈｕＡＰＯ−１ −Ｉｇ）および抗ＡＰＯ−１−Ｆ（ａｂ）₂（上記を参照）それぞれの存在下で抗ＡＰＯ−１抗体とともに２４時間保温した。アポプトシスの阻害を測定した（第１図参照）。実施例１の融合タンパク質および抗ＡＰＯ−１−Ｆ（ａｂ）₂は、強力なアポプトシス阻害効果を有していることが判明した。融合タンパク質においては特に強力であった。実施例３：ＤＣＩ、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、アンチセンスＩＣＥ、およびＣｒｍＡ− ｃＤＮＡ、それぞれによるアポプトシスの阻害Ｌ９２９−ＡＰＯ−１細胞（Schulze-Osthoff，K．等、ENBO J．13，4587-4 59，1994を参照）は、実施例２のＳＫＷ６．４の細胞のようにアポプトシス陽性である。（ａ）抗ＡＰＯ−１抗体によるＩＣＥのタンパク質分解活性の刺激Ｌ９２９−ＡＰＯ−１細胞（○）およびＳＫＷ６．４細胞（●）を培養し、抗ＡＰＯ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）とともに第２ａ図に示した期間にわたり処理した。細胞を回収する１０分前に、細胞を０．０５％ジギトキシンを用いて透過性化（permeabilize）し、２０μＭの発蛍光性ＩＣＥ基質、ＤＡＢＣＹＬ−ＹＶＡＤＡＰ−ＥＤＡＮＳ（Bachem，Bubendorf,スイス）とともに保温した。細胞を回収し、励起波長３６０ｎｍ、放出波長４８８ｍｎのＦＡＣＳ分析により分析した。その結果、ＩＣＥのタンパク質分解活性は抗ＡＰＯ−１抗体により刺激され得ることが判明した。（ｂ）抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポプトシスのＤＣＩを用いた阻害Ｌ２９ＡＰＯ−１細胞をＤＣＩ存在下（●４５μＭ、▲１５μＭ）または不在下（○）で保温した。１時間後、抗ＡＰＯ−１抗体を第２ｂ図に示した量だけ添加し、細胞とともに７時間にわたり放置した。細胞死のパーセンテージを、ジフェニルテトラゾリウム塩からのホルマザンの生成により決定した（ＭＴＴアッセイ）。その結果、抗ＡＰＯ−１抗体により誘導されるアポプトシスはＤＣＩによって阻害されることが判明した。（ｃ）抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポプトシスのＹＶＡＤ−ＣＨＯを用いた阻害Ｌ２９−ＡＰＯ−１細胞（○）およびＳＫＷ６．４細胞（●）を低張ショックにより透過性化し、第２ｃ図に示されたＹＶＡＤ−ＣＨＯ濃度で３０分間にわたり保温した。細胞を抗ＡＰＯ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）とともに６０分間にわたり保温した。アポプトシスは、Ｈｏｅｃｈｓｔｄｙｅ３３３４２（モレキュラープローブスユージーン，ＯＲ）を用いたＤＮＡの断片化により測定した。特異的細胞死（抗ＡＰＯ−１抗体の存在下での細胞死から抗体なしでの細胞死を引く）のデータを、ＦＡＣＳバンテッジ７Ｄ−サイトメーターを用いた三連での測定により得た。抗ＡＰＯ−１抗体不在下での自発細胞死は７％以下であった。この結果、抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポプトシスはＹＶＡＤ−ＣＨＯにより阻害されることが判明した。（ｄ）抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポプトシスの、アンチセンスＩＣＥおよびＣｒｍＡ−ｃＤＮＡそれぞれを用いた阻害以下の発現プラスミドを調製した：ｐＣＡＧＧＳ−ＩＣＥ第１ストランド合成用のＥＬ４／ＣｍＲＮＡおよびオリゴｄＴプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりネズミＩＣＥｃＤＮＡを単離した。１３２２ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマー５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧ−３’および５’−ＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＴＧＧＣ−３’のペアを用いて作成した。このペアは、ｐＣＡＧＧＳ中にクローン化されたＥ１４／１３ｃＤＮＡ発現コロニーバンクのスクリーニングのための試料として用いられた（Ｎｉｗａ，H.等、Gene 108，193-200，1994.を参照）。１３８７ｂｐのＩＥＣｃＤＮＡクローンを得、その配列をＤＮＡの配列決定により決定した。このクローンをｐＣＡＧＧＳ−ＩＣＥと呼ぶ。ｐＣＡＧＧＳ−アンチセンスＩＣＥ前出のＩＣＥｃＤＮＡの３２０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をｐＣＡＧＧＳ中に逆向きでクローン化した。断片は４８ｂｐの５’ＵＴＲおよびＩＣＥ−オープンリーディングフレームの最初の２５５ｂｐを含んでいる。ｐＣＡＧＧＳ−アンチセンスＩＣＥ発現プラスミドを得た。ｐＳＶ２５Ｓ−ＣｒｍＡプライマーのペア５’−ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＡＴＴＡＣＴＡ−３’および５’−ＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧＴＣＧＧＡＧＡＧ−３’を用いてＣｒｍＡをコードするｃＤＮＡを、公知のＰＣＲによってワクシニアウイルスＤＮＡから得た。このｃＤＮＡを、公知のプラスミドｐＳＶ２５Ｓ中にＨｉｎｄ III／ＫｐｎＩ断片としてクローン化した。このようにｐＳＶ２５Ｓ−ＣｒｍＡ発現プラスミドを得た。前記の発現プラスミドを、Ｌ９２９−ＡＰＯ−１細胞の移入に用いた。この目的のために、細胞をＴＢＳバッファーに入れ、氷上で１０分間にわたり平衡化した。前述の発現プラスミドをそれぞれ２０μｇずつ、バイオラッドエレクトロポレータ（９６０μＦＤ、２２０Ｖ）を用いて細胞内に移入させた。電気穿孔（エレクトロポレーション）の後、細胞を培養用プレートに接種する前に、さらに３０分間にわたり氷上に置いた。死んだ細胞を１６時間後に洗浄工程により除いた。生細胞を抗ＡＰＯ−１抗体（１μｍ／ｍｌ）で、第２ｄ図に示した時間にわたり処理した。前述のように、アポプトシスをＨｏｅｃｈｓｔｄｙｅ３３３４２を用いたＦＡＣＳ分析により測定した。２連の実験による細胞死のパーセンテージのデータを得た。その結果、抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポプトシスは、アンチセンスＩＣＥおよびＣｒｍＡそれぞれによって阻害されることが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/28 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ (72)発明者シェルツェオストフ，クラウスドイツ連邦共和国 69221 ドッセンハイムゲーテストラーセ 66 (72)発明者デバーティン，クラウスミカエルドイツ連邦共和国 69120 ハイデルベルグウーフェルストラーセ 22エイ (72)発明者フランク，ライネルドイツ連邦共和国 69120 ハイデルベルグハンストーマストラーセ 76 (72)発明者ダイン，イェンスドイツ連邦共和国 68535 エディンゲンナーエステーエンヴィッヒェルストラーセ８ (72)発明者ヴァルツァック，ヘニングドイツ連邦共和国 69124 ハイデルベルグハーゲラッハストラーセ 35 (72)発明者クニッピング，エカルトドイツ連邦共和国 69120 ハイデルベルグツェッペリンストラーセ 66 (72)発明者ストリッケル，キルスティンドイツ連邦共和国 69120 ハイデルベルグツェッペリンストラーセ 66

Claims

【特許請求の範囲】１．アポプトシスを阻害する組成物であって、（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド、（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害するコンパウンド、および、（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンドから成る群より選択される成分を１以上含有し、該成分が個体内での異物とも、従来の賦形剤ともみなされないことを特徴とする組成物。２．前記成分（ａ）が、非細胞毒性抗ＡＰＯ−１阻止抗体、Ｆｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体、および、ＡＰＯ−１リガンドのアナログ、から成り、前記成分（ｂ）が、抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、ＡＰＯ−１、細胞外ＡＰＯ−１ドメイン１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体を有するコンパウンド、ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有するペプチド、および、ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有する一以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンド、から成り、前記成分（ｃ）が、ＩＣＥ阻害剤、および、ＩＣＥに構造的に関連しているプロテアーゼの阻害剤から成ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。３．前記成分（ｃ）のＩＣＥ阻害剤が、それぞれ、ＤＣＩ、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＣｒｍＡまたはそれらそれぞれの誘導体であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の組成物。４．前記成分（ｃ）のＩＣＥに構造的に関連するプロテアーゼが、Ｎｅｄｄ−２／Ｉｃｈ−１またはｐｒｉＣＥであることを特徴とする請求の範囲第２項記載の組成物。５．ＨＩＶ感染に関連する疾患でのアポプトシスを阻害する組成物であって、（ａ）ＴＡＴレセプターを阻害するコンパウンド、（ｂ）ＴＡＴをそれぞれ捕捉および阻害するコンパウンド、（ｃ）細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド、（ｄ）ＣＤ４レセプターを阻害するコンパウンド、（ｅ）ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド、および、（ｆ）細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害するコンパウンドから成る群より選択される成分を１以上含有してもよく、該成分が個体内で異物とみなされないことを特徴とする請求の範囲第１項から第４項いずれか１項記載の組成物。６．前記成分（ａ）が、抗ＴＡＴレセプター抗体、およびＴＡＴアナログ、から成り、前記成分（ｂ）が、抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴレセプター、細胞外ＴＡＴレセプタードメイン、１以上の細胞外ＴＡＴレセプタードメインおよび担体を有するコンパウンド、ＴＡＴ結合サイトを有するペプチド、ＴＡＴ結合サイトを有する１以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンド、核酸ベースのＴＡＴ結合サイト、およびトランスドミナントＴＡＴ変異体、から成り、前記成分（ｄ）が、抗ＣＤ４レセプター抗体、および、ｇｐ１２０アナログ、から成り、前記成分（ｅ）が、抗ｇｐ１２０抗体、ＣＤ４レセプター、細胞外ＣＤ４レセプタードメイン、１以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメインおよび担体を有するコンパウンド、ｇｐ１２０結合サイトを有するペプチド、および、ｇｐ１２０結合サイトを有する１以上のペプチドを有するコンパウンド、から成ることを特徴とする請求の範囲第５項記載の組成物。７．１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体を有し、該ドメインおよび該担体が、個体内で異物としてみなされないことを特徴とするコンパウンド。８．前記担体がタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第７項記載のコンパウンド。９．前記タンパク質が抗体のＦｃ部分であることを特徴とする請求の範囲第８項記載のコンパウンド。１０．前記コンパウンドが融合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第８項または第９項記載のコンパウンド。１１．請求の範囲第１０項記載のコンパウンドを製造する方法であって、（ａ）１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよびその３’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを公知のＰＣＲ技術により増幅し、（ｂ）担体タンパク質および該担体タンパク質の５’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを公知のＰＣＲ技術により増幅し、（ｃ）前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）により増幅されたＤＮＡを組み合わせ、更にそれらを公知のＰＣＲ技術により増幅し、ここでＡＰＯ−１ドメインの５’末端に相当するプライマー、および担体タンパク質の３’末端に相当するプライマーが、両方のＤＮＡを融合して含む増幅されたＤＮＡ断片を得るように用いられており、（ｄ）前記工程（ｃ）のＤＮＡ断片を発現ベクター内に挿入し、該ＤＮＡ断片を通常の方法により発現させる各工程より成ることを特徴とする方法。１２．前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）の前記結合領域が、抗体ヒンジ領域またはその一部であることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の方法。１３．請求の範囲第７項から第１０項のいずれか１項記載のコンパウンドの、アポプトシス阻害のための薬学的調製物の製造への使用。１４．（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド、（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害するコンパウンド、および、（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンド、から成る群より選択される成分であって、個体内で異物とみなされない成分１以上を薬学的調製物の製造に用いることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の使用。１５．前記成分（ａ）が、非細胞毒性抗ＡＰＯ−１阻止抗体、Ｆｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体、および、ＡＰＯ−１リガンドのアナログ、から成り、前記成分（ｂ）が、抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、ＡＰＯ−１、細胞外ＡＰＯ−１ドメインＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有するペプチド、および、ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有する一以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンド、から成り、前記成分（ｃ）が、ＩＣＥ阻害剤、および、ＩＣＥに構造的に関連しているプロテアーゼの阻害剤から成ることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の使用。１６．前記成分（ｃ）のＩＣＥ阻害剤が、ＤＣＩ、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＣｒｍＡまたはそれらそれぞれの誘導体であることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の使用。１７．前記成分（ｃ）のＩＣＥに構造的に関連するプロテアーゼが、Ｎｅｄｄ− ２／Ｉｃｈ−１またはｐｒｉＣＥであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の使用。１８．請求の範囲第７項から第１０項のいずれか１項記載のコンパウンドの、ＨＩＶ感染に関連した疾患でのアポプトシスの阻害のための薬学的調製物の製造への使用。１９．（ａ）ＡＰＯ−１阻害コンパウンド、（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害するコンパウンド、（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害するコンパウンド、（ｄ）ＴＡＴレセプターを阻害するコンパウンド、（ｅ）ＴＡＴをそれぞれ捕捉および阻害するコンパウンド、（ｆ）細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するコンパウンド、（ｇ）ＣＤ４レセプターを阻害するコンパウンド、（ｈ）ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉するコンパウンド、および、（ｉ）細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害するコンパウンドから成る群より選択される成分であって、個体内で異物とみなされない成分を１以上薬学的調製物の製造に用いることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の使用。２０．前記成分（ａ）が、非細胞毒性抗ＡＰＯ−１阻止抗体、Ｆｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体、および、ＡＰＯ−１リガンドのアナログ、から成り、前記成分（ｂ）が、抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、ＡＰＯ−１、細胞外ＡＰＯ−１ドメインＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有するペプチド、および、ＡＰＯ−１リガンド結合サイトを有する一以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンド、から成り、前記成分（ｄ）が、抗ＴＡＴレセプター抗体、およびＴＡＴアナログ、から成り、前記成分（ｅ）が、抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴレセプター、細胞外ＴＡＴレセプタードメイン、１以上の細胞外ＴＡＴレセプタードメインおよび担体を有するコンパウンド、ＴＡＴ結合サイトを有するペプチド、ＴＡＴ結合サイトを有する１以上のペプチドおよび担体を有するコンパウンド、核酸ベースのＴＡＴ結合サイト、およびトランスドミナントＴＡＴ変異体、から成り、前記成分（ｇ）が、抗ＣＤ４レセプター抗体、および、ｇｐ１２０アナログ、から成り、前記成分（ｈ）が、抗ｇｐ１２０抗体、ＣＤ４レセプター、細胞外ＣＤ４レセプタードメイン、１以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメインおよび担体を有するコンパウンド、ｇｐ１２０結合サイトを有するペプチド、および、ｇｐ１２０結合サイトを有する１以上のペプチドを有するコンパウンド、から成ることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の使用。