JPH08511805A

JPH08511805A - 化合物

Info

Publication number: JPH08511805A
Application number: JP7502974A
Authority: JP
Inventors: バーネット，メアリー・エス; トーフィ，セオドア・ジェイ; クリステンセン，ジークフリート・ビー，ザ・フォース
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1996-12-10
Also published as: PT710109E; WO1995000139A1; EP1466598A2; EP0710109A4; ES2229221T3; AU7174794A; SI0710109T1; ATE275951T1; HK1012255A1; DE69433997T2; DE69433997D1; DK0710109T3; US6143782A; EP1466598A3; EP0710109A1; EP0710109B1

Abstract

(57)【要約】本発明は望ましい治療指数を有するＰＤＥ IV阻害剤の選択方法、およびこれらの特性を有する化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】化合物発明の範囲本発明は、一の形態のIVと称されるホスホジエステラーゼイソ酵素（以下、ＰＤＥ IVという）を選択的に阻害するかまたは結合し、その一方で別形態の該酵素に対して、同等、好ましくはより小さな結合または阻害を示す化合物に関する。これらの形態は、立証されているわけではないが、同一酵素の相互に転換しない構成の異なる形態であると考えられており、典型的なＰＤＥ IV阻害剤であるロリプラム（rolipram）とのその結合親和力により区別される。ロリプラムは一の形態の触媒部位に高親和力で結合するが、他の形態の触媒部位に対しては低親和性である。本明細書にて、一の形態を高親和性ロリプラム結合部位と称し、他の形態を低親和性ロリプラム結合部位とする。さらに、ＰＤＥ IVイソ酵素における低親和性形態の触媒部位を選択的に阻害することと関連付けられる疾患の選択的治療方法を開示する。さらに、低親和性結合部位と選択的に結合する化合物を投与することを特徴とするある種の疾患の治療方法を開示する。発明の分野サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、細胞間に偏在する第２メッセンジャーである、アデノシン３',５'−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）およびグアノシン３',５'−モノホスフェート（ｃＧＭＰ）を、その対応する不活性な５'−モノホスフェート代謝物に加水分解する一連の酵素である。少なくとも５種のＰＤＥイソ酵素が存在しており、各々が独特な物理的かつ速度論的特徴を有し、異なる遺伝子群の産生物であると考えられている。これらはローマ数字ＩないしＶを用いて区別される。本発明の標的とする酵素は、あらゆる細胞中、その種々の形態にある、その分布が十分な領域にあるＰＤＥ IVイソ酵素である。該酵素はｃＧＭＰに対してほとんど活性を有しない（Ｋm＞１００μＭ）、低Ｋm（ｃＡＭＰＫm＝１〜５μＭ）ｃＡＭＰ−選択性酵素である。この種のイソ酵素の構成酵素は、ロリプラムおよび別個のランクオーダー効能を有する他のＰＤＥ IV阻害剤と結合する、２またはそれ以上の相互転換性のないまたはゆっくりと相互に転換する形態にて存在するという興味ある特徴を有する。すなわち、同一の遺伝子産生物が１以上の触媒的活性な構成状態にて存在しうる。種々の結合形態の相対的割合が組織細胞の型に依存して変化することは重要なことである。例えば、炎症細胞はロリプラムと低親和力で結合する形態を相対的に高割合で有するが、一方、脳および壁細胞はロリプラムと高親和力で結合する形態を相対的に高割合で有する。本発明において特に興味のあるのは、このクラスのイソ酵素が炎症および気道平滑筋において果たす役割である。研究によって、該酵素が広範囲の炎症細胞（すなわち、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球および単球）および気道平滑筋にてｃＡＭＰを調整するのに顕著な役割を果たすことが示唆されている。本発明は、特に炎症細胞および気道平滑筋に適用でき；ヒト単球中に発現される型のイソ酵素が特に関心のある酵素である。というのも、サイクリックＡＭＰは炎症細胞の化学走性および活性化を阻害する別のメッセンジャーとして機能するからである。加えて、ｃＡＭＰは気道平滑筋の弛緩を媒介する。このことはｃＡＭＰを代謝するＰＤＥ IVの主たる役割と結びつき、白血球および気道平滑筋中のｃＡＭＰ含量を増加させるその能力により、ＰＤＥ IV阻害剤は抗炎症および気管支拡張活性を有するかもしれないとする、ＰＤＥ IV阻害剤を研究するための基盤を提供する。炎症の治療にて、および気管支拡張剤、テオフィリンおよびペントキシフィリン様薬剤として用いられる一般的ＰＤＥ阻害剤は、すべての組織にてＰＤＥイソ酵素を無差別に阻害する。これらの化合物は、すべての組織にて５種すべてのＰＤＥイソ酵素を非選択的に阻害するため、副作用を示すのは明らかである。これら化合物の治療特性を評価する際にこの作用は問題である。標的とする症状はこのような化合物により効果的に治療されるが、望ましくない別の効果が現れ、それらの効果を回避できるかまたは最小限とできるならば、ある症状を治療するこの方法による治療効果は全体的に増加するであろう。集合的に捕らえれば、この情報は、問題の組織または細胞中にある優勢的なＰＤＥに関する新規なイソ酵素 −選択的阻害剤を対象とすることで、通常の非選択的ＰＤＥ阻害剤の使用に伴う副作用が減少することを示唆している。イソ酵素−選択的ＰＤＥ阻害剤は理屈では非選択的阻害剤よりも優れた特性を有するが、今日まで試験されている選択的阻害剤は、不適当または非標的組織中にある問題のイソ酵素を阻害することにまで及ぶ結果生じる副作用を欠くものではない。例えば、抗うつ剤として開発された、選択的ＰＤＥ IV阻害剤であるロリプラムを用いる臨床実験は、該化合物が向精神活性を有し、胃腸作用、例えば、胸焼け、吐き気および嘔吐をもたらすことを示唆する。多発性梗塞痴呆症の治療を目的とする別のＰＤＥ IV阻害剤であるデンブフィルリン（denbufylline）の副作用もまた、胸焼け、吐き気および嘔吐を包含するものである。これらの副作用は、ＣＮＳおよび胃腸系のある領域にてＰＤＥ IVを阻害する結果として生じると考えられる。１９８６年に、シュナイダー（Schneider）らは、ラットの脳ホモジネート中の高親和性立体選択的［³Ｈ］−ロリプラム結合部位の存在および特徴を記載した。これらの結合部位はラットの脳「非カルモジュリン−依存性ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ」（すなわち、ＰＤＥ IV）の触媒部位を表わすと考えられたが、明らかに異常であることはデータより明らかであった。同一でないとしても類似する実験条件下、データはロリプラムがＫd＝１ｎＭを有することを示しており、それに対してロリプラムはラットの脳ＰＤＥ IV活性をＫi＝１μＭで阻害した。すなわち、結合部位についてのロリプラムの親和力ｖｓ.触媒活性におけるその効果にて１０００倍の違いがあった。ＰＤＥ阻害についての包括的な構造活性相関（ＳＡＲ）および［³Ｈ］−ロリプラム結合についての競合性は確立されていなかったが、ＰＤＥ IV阻害剤としてのロリプラムの効能をその結合部位での効能と比較した場合に実質的に相違することから、両方の活性が同一分子座に含まれるとする仮説を正当とするのは問題であると思われる。この問題のため、いくつかの実験が開始された。ある実験はロリプラムの高親和性結合部位がｃＡＭＰ触媒部位と同じタンパク質上に存在するかどうかを測定しようとした。別の実験はＰＤＥ IVの阻害に関するＳＡＲが高親和性ロリプラム結合部位との競合性に関するＳＡＲと同じであるかどうかを測定しようとした。３番目の実験は、生物学的有意性がこれらの知見にあるとすれば、特に、その有意性が新規医薬治療剤の開発に関連している場合、どのような有意性であるかを解明しようとした。いくつかの検定からデータを収集すると、阻害剤が結合するヒト単球組換えＰＤＥ IV（ｈＰＤＥ IV）上に少なくとも２種の結合形態があることが明らかになった。これら観察結果に対する一の説明は、ｈＰＤＥ IVが２種の形態にて存在するというものである。一の形態はロリプラムおよびデンブフィルリンのようなものと高親和力で結合し、その一方、他の形態はこれら化合物と低親和力で結合する。本明細書において、これら形態を、高親和性ロリプラム結合形態（ＨＰＤＥ IV）と、低親和性ロリプラム結合形態（ＬＰＤＥ IV）と称することにより区別する。この知見の重要性は、高親和性ロリプラム結合形態（ＨＰＤＥ IV）について拮抗する化合物は、ＬＰＤＥ IV（低親和性ロリプラム結合形態）について拮抗する化合物よりも、さらなる副作用またはより大きな副作用があるという発見にある。さらなるデータは化合物が低親和性結合形態のＰＤＥ IVを標的とすることができ、この形態はロリプラムが高親和性結合剤である場合の結合形態と異なることを示唆する。低親和性ロリプラム結合形態に対して高親和性ロリプラム結合形態で作用する阻害剤について、別個のＳＡＲが存在することが判明した。加えて、これら２種の形態は異なる機能的役割を有するようである。すなわち、低親和性ロリプラム結合形態と相互作用する化合物は抗炎症活性を有し、それに対して高親和性ロリプラム結合形態と相互作用する化合物は副作用を生じさせるか、またはより強力となった副作用に示す。これらの知見に対する明確な説明はない。しかし、ＰＤＥ IVが２つの異なる第３または第４の状態で存在しうることが提案されている。両方の形態は、触媒的に活性であると考えられる。ロリプラムは、高親和力（本明細書にて１０ナノモルよりも小さいＫiを有すると定義される）で、一の形態のある結合部位に結合し、低親和力（１００ナノモルよりも大きいＫiを有すると定義される）で他の形態に結合する。これら知見についての結論は、酵素がロリプラムと低親和力で結合する形態にある場合のｃＡＭＰ触媒活性を選択的に阻害する化合物を同定し、それにより、ロリプラムと高親和力で結合する形態が阻害されることと明らかに関連付けられる副作用を減少させることができることにある。これは副作用に対して抗炎症および＼または気管支拡張活性に関して優れた治療指数を提供する。発明の要約第１の態様にて、本発明はロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀を、ロリプラムと低親和力で結合する形態についてのＩＣ₅₀ で割ると、約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比を有する化合物に関する。さらなら態様において、本発明は胃腸および向精神作用を最小とする一方で、白血球および気道平滑筋中のｃＡＭＰを向上させる方法であって、ロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀を、ロリプラムと低親和力で結合する形態についてのＩＣ₅₀で割ると約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀ 比を有する有効量の化合物を、ｃＡＭＰ向上を必要とする対象に投与することからなる方法に関する。もう一つ別の態様において、本発明はロリプラムと低親和力で結合するＰＤＥ IV形態を選択的に阻害することによって炎症を治療または気管支を拡張する方法であって、ロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀を、ロリプラムと低親和力で結合する形態についてのＩＣ₅₀で割ると、約０ .１またはそれ以上のＩＣ₅₀比を有する治療上有効量の化合物を、炎症治療または気管支拡張を必要とする対象に投与することからなる方法に関する。発明の詳説本発明では、ロリプラムと低親和力で結合するｃＡＭＰ触媒部位を、「低親和性」結合部位（ＬＰＤＥ IV）と称し、ロリプラムと高親和力で結合する他の形態のこの触媒部位を「高親和性」結合部位（ＨＰＤＥ IV）と称する。最初の実験にて［³Ｈ］−ロリプラム結合検定を確立し、確認した。この実験の詳細を以下の実施例１に示す。高親和性結合活性および低親和性結合活性が共に同じ遺伝子産生物に存するかどうかを測定するために、酵母を公知方法により形質転換し、組換え型ＰＤＥ I Vの発現を６時間の醗酵期間で生じさせた。ＰＤＥ IVに対抗する抗体を用いるウェスタンブロット分析は、発現したＰＤＥ IVの量は時間と共に増加し、増殖後、３時間で最高に達することを示した。加えて、免疫反応生成物の９０％より多くは、酵母溶解物の高速（１００,０００ｘｇ）上澄中にあった。［³Ｈ］−Ｒ− （−）一ロリプラム結合およびＰＤＥ活性をタンパク質発現と一緒にモニター観察した。ＰＤＥ IV活性がロリプラム結合活性と同時に発現され、それは両方の機能が同一の遺伝子産生物上に存在することを示唆する。ウェスタンプロット分析の結果と同様に、８５％以上のロリプラム−阻害性ＰＤＥ活性および［³Ｈ］ −ロリプラム結合活性が酵母上澄フラクション中にあることが判明した。この系にて発現した組換え型ＰＤＥ IVの大部分は、ＬＰＤＥ IVとして存在し、ほんのわずかなフラクションがＨＰＤＥ IVとして存在する。したがって、組換え型ＰＤＥ IV触媒活性の阻害は、主に、ＬＰＤＥ IVでの化合物の作用に反映している。ＰＤＥ IV触媒活性の阻害は、このように、ＬＰＤＥ IVでの化合物の効能の指数として用いることができる。ＨＰＤＥ IVでの化合物の効能は、［³Ｈ］−ロリプラムについて競合するその能力を試験することにより評価できる。低親和性および高親和性ロリプラム結合部位についてのＳＡＲを明らかにするために、選択された化合物の効能を２つの検定系にて測定した。標準化合物を用いる実験結果を表にした。予想どおり、ある種の化合物は、ロリプラムが低親和性結合剤である他の部位と比較した場合、ロリプラムが高親和性結合を示した部位で［³Ｈ］−ロリプラムと明らかにより強く競合した。高親和性結合と低親和性結合の間にＳＡＲ相関性はほとんどなく、高親和性［³Ｈ］−ロリプラム結合の阻害に関するＳＡＲは、低親和性ロリプラム結合部位に対する結合に関するＳＡＲと異なると結論付けられる。表Ｉにて、このＳＡＲ実験の結果を示す。デンブフィルリンはスミスクライン・ビーチャム製造の７−アセトニル−１, ３−ジブチルキサンチンである。パパベリンは１−［（１,３−ジメトキシフェニル）メチル］−６,７−ジメトキシイソキノリンである。トレクインシンは２, ３,６,７−テトラヒドロ−２−（メシチルイミノ）−９,１０−ジメトキシ−３ −メチル−４Ｈ−プリミド［６,１−ａ］イソキノリン−４−オンである。ジピリマゾールは２,２',２",２"'−［（４,８−ジピペリジノピリミド［５,４−ｄ］ピリミジン−２,６−ジイル）ジニトリロ］テトラエタノールの一般名である。これらの結果は、いくつかの化合物が高親和性形態と比較していわゆる低親和性形態を選択的に阻害しうること、またその逆であることを示す。この知見の有意性は、一の部位を選択的（優先的）に阻害する化合物をデザインまたは選択し、それにより所望の応答を作用させ、別の望ましくない応答を排除することにより副作用を最小とするか、または少なくとも目的としない応答を、意図する療法で許容できる範囲で干渉しているような程度にまで最小とすることが可能であることである。この研究にもかからわず、ＰＤＥ IVイソ酵素における高親和性ロリプラム結合および低親和性ロリプラム結合に関する本質的に異なるＳＡＲの基準は定義されなかった。しかし、高親和性ロリプラム結合形態についてのＩＣ₅₀をロリプラムと低親和力で結合する形態についてのＩＣ₅₀で割った比率として計算し、化合物が０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比を示す場合、その化合物は許容しうる治療指数を有することが見いだされた。すなわち、他の生理学的現象に全く影響しないか、または許容できる程度であるならば、現在、ある化合物は種々の免疫および炎症疾患の治療に用いることができる。本明細書において、最も好ましい具体例は、炎症およびアレルギー疾患を治療する手段として低親和性ロリプラム結合部位を阻害することである。化合物本発明は、約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比（高／低結合）を有する化合物を包含するものである。これは本明細書において記載した試験にてＰＤＥ IV阻害剤であり、これらまたはその同様の検定にて、明記した範囲内にある比率を示す、いずれかまたはすべての化合物を包含する；特に、権利が存在する状態であり、および／または本願出願日の前にＰＤＥ IV阻害剤であると試験されていないかまたは知られていない化合物にて有用である。ＩＣ₅₀比の基準に合致する化合物を、例えば、前記の表１ならびに係属米国特許出願第８６２,０８３号（１９９２年１０月３０日付け出願）；第８６２,１１１号（１９９２年１０月３０日付け出願）；第８６２,０３０号（１９９２年１０月３０日付け出願）；および第８６２,１１４号（１９９２年１０月３０日付け出願）に列挙する。これら出願を出典明示によりそのすべての内容を本明細書の一部とする。本発明の好ましい化合物は、０.５より大きいＩＣ₅₀比を有する化合物、特に１.０より大きい比率を有する化合物である。好ましい化合物は、ドレクインシン（trequinsin）、ジピリダモール（dipyridamole）およびパパベリン（papave rine）である。シス−［シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート］、２−カルボメトキシ− ４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オン、およびシス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１− オール］のような化合物が、例えば、低親和性結合部位に選択的に結合し、０. １またはそれ以上のＩＣ₅₀比を有する化合物である。以下の実施例は本発明の製法および使用を説明するものである。その実施例はいかなる場合にも本願発明の範囲を制限するものではない。実施例約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比の選択を支持するデータを作成するのに、５種類の検体の間で８つの異なる検定を用いた。該検定は以下のとおりである：ウサギの単離した壁腺からの酸産生物の刺激；ヒト好中球におけるＦＭＬＰ誘発の脱顆粒（ミレオペルオキシダーゼ放出）の阻害；モルモット好酸球におけるＦＭＬＰ関連のＯ₂形成の阻害；ヒト単球におけるＬＰＳ誘発のＴＮＦ_α産生の阻害；イヌにおける嘔吐の発生；モルモットにおける抗原誘発の気管支収縮の阻害；マウスにおけるレセルピン誘発の低体温症の逆転；およびマウスにおける選定的に変形されたヒト単球由来のＬＰＳ誘発のＴＮＦ_α産生の阻害。これらの検定およびデータを以下に示す。統計学的分析低親和性部位のＰＤＥ IVの阻害がこの一連の化合物の抗炎症性作用と関連し、それに対して高親和性部位の阻害がある種の副作用の発生と関連しているとする仮説を考察するために、in vitroおよびin vivoにおける炎症細胞機能を遮断する種々のＰＤＥ IV阻害剤の能力およびこれらの化合物のin vitroおよびin vi vo実験における副作用を形成する能力を測定した。所定の治療作用または副作用を惹起するＰＤＥ IV阻害剤の能力と、ＰＤＥ IVの高親和性部位を阻害する能力に対して低親和性結合部位を阻害する能力を比較するために、in vitroまたはin vivo検定におけるこれら化合物の効能を、（ｒ²）の線状相関性またはランクオーダー相関性（スペアーマン（Spearman）のＲho）により、単離した酵素触媒活性または高親和性部位に対する効能と比較した。この線状相関性は、低親和性部位または高親和性部位のいずれかを阻害する化合物の効能が、所定の抗炎症性または副作用を惹起する能力を予測するのに用いることができるかどうかを試験する。ランクオーダー相関性は、所定の抗炎症作用または副作用の生成におけるランクオーダー効能が低親和性または高親和性部位の阻害におけるランクオーダー効能と同様であるかどうかを試験する。ｒ²およびスペアーマンＲhoは共に、マッキントッシュのＳＴＡＴＶiewIIコンピュータープログラムを用いて算定した。ロリプラム高親和性結合に対するＰＤＥ IV 実施例１-- ホスホジエステラーゼおよびロリプラム結合検定単離したヒト単球ＰＤＥ IVおよびＨＰＤＥ IVは主に低親和性形態にて存在することがわかった。かくして、試験化合物のＰＤＥ IVの低親和性形態に対する活性は、基質として１μＭの［³Ｈ］ｃＡＭＰを用いるＰＤＥ IV触媒活性についての標準検定を用いて評価できる（トルフィー（Torphy）ら、１９９２）。タンパク質の供給源としてラット脳の高速上澄を用い、［³Ｈ］−ロリプラムの両方のエナンチオマーを、比活性２５.６Ｃi／ミリモルに調製した。標準検定条件を、ｃＡＭＰの量を除いて、ＰＤＥ検定条件と同じであるように一般的操作より修飾した：５０ｍＭトリスＨＣl（pＨ７.５）、５ｍＭＭgＣl₂、５０μＭ５'−ＡＭＰおよび１ｎＭ［³Ｈ］−ロリプラム（トルフィーら、１９９２）。該検定を３０℃で１時間行った。反応を停止し、結合リガンドをブランデル（Bran del）細胞収穫器を用いて遊離リガンドより分離した。高親和性部位についての競合性を、［³Ｈ］−ｃＡＭＰが不在であることを除いて、低親和性ＰＤＥ活性を測定するのに用いた条件と同じ条件下で評価した。実施例２-- アミノピリン蓄積ある種のメチルキサンチンおよび他の非選択性ＰＤＥ阻害剤は、種々の種類における酸分泌を亢進させる。ある種の選択性ＰＤＥ IV阻害剤、例えば、ロリプラムおよびＲo−１７２４は、特にヒスタミンのようなアデニラート・サイクラーゼのアクチベーターと組み合わせて投与した場合、ラットにおける酸分泌を促進する。この酸分泌における促進は、ヒスタミン誘発のｃＡＭＰ蓄積の増加を伴う。この報告されている情報について試験し、その現象があるかどうかを測定した。化合物の酸分泌誘発能は低親和性部位または高親和性部位に対するその能力と相関関係にあった。この研究では、酸分泌の増加についての生物学的マーカーとして作用すると報告されている弱塩基の放射標識化されたアミノピリンの蓄積を検定した。該検定は以下のとおりである：胃腺調製物雄雌両方のウサギを頸部脱臼により殺し、胃を摘出した。粘膜を体から切り離し、胃の頭方部および洞部を捨てた。胃腺をベルリンドおよびオブリンク（Berg lindhおよびObrink）（１９７６）およびサックおよびスペンニー（SackおよびS penney）（１９８２）に記載の方法を変形して単離した。ついで、該粘膜を切り刻み、コラゲナーゼで消化し、胃腺を単離した。その消化した腺を濾過し、洗浄し、以下の組成のインキュベート培地中、１：１５（容量：容量）にて再懸濁させた：ＮaＣl,１３２.４ｍＭ；ＫＣI,５.４ｍＭ；Ｎa₂ＨＰＯ₄,５.０ｍＭ；Ｎa Ｈ₂ＰＯ₄,１.０ｍＭ；ＭgＳＯ₄,１.２ｍＭ；ＣaＣl₂,１.０ｍＭ；ＮaＨＣＯ₃,１２.０ｍＭ；ウサギ血清アルブミン,２ｍｇ／ｍｌ；デキストロース,２ｍｇ／ｍｌ（pＨ７.４）。アミノピリン蓄積酸分泌を測定するのに、胃腺を［¹⁴Ｃ］−アミノピリン、種々の濃度の選択性ＰＤＥ IV阻害剤、および閾値濃度のヒスタミン（０.３−１.０μＭ）と組み合わせ、サックおよびスペンニー（１９８２）の操作に従って、水平振盪器（１１０サイクル／分）上、３７℃で２０分間インキュベートした。ついで、サンプルを遠心分離に付し、上澄フラクションのアリコートおよびペレット中の放射活性を測定した。アミノピリンの割合を、サックおよびスペンニー（１９８２）の記載に従って算定した。データを最大濃度のヒスタミン（１００μＭ）により生じる応答のパーセントとして表した。ＥＣ₅₀値を、各化合物について得られる最大応答を用いるリニアー・インターポレーションにより測定した。実施例３-- イヌにおける選択性ＰＤＥ阻害剤の嘔吐性の評価雄雌両方の雑種イヌ（ｎ＝５、各実験について）を動物群より得た。一夜絶食させた後、実験の少なくとも３０分前に、イヌに１／２缶のドッグフード（BigB et）を与えた。カニューレを前足の橈側皮脈に挿入し、薬剤を投与した。実験用化合物を投与する前に、カニューレを等張セイライン（０.９％）１ｍｌでフラッシュした。化合物をポリエチレングリコールおよびセイラインの混合液または１００％ポリエチレングリコールのいずれかに溶かし、１.０−２.０ｍｌ／１０ｋｇの容量で投与した。全用量を確実に循環系に入れるために、該カニューレをさらに０.５−１.０ｍｌのセイラインでフラッシュした。動物を１時間の観察期間の間、ケージに戻した。各動物をレッチングおよび嘔吐の徴候について観察し、この行動の発生についての化合物投与後の時間を記録した。観察期間の最後に、動物をその元のケージに戻した。各実験日を７日で区切った。嘔吐作用が観察されるまで、各イヌに連続的実験にて各化合物を上昇用量にて投与した。この時点で、特有のイヌを該実験から外し、まだ応答しなかったイヌだけにより高用量を投与して評価した。データを用量応答曲線に関する文献に記載されているように各用量で応答するイヌの累積的パーセントとして表した。実施例４-- モルモット好酸球検定好酸球単離および精製雌（ハートレー系（Hartley）、ハゼルトン・ラボ（Hazelton Labs））モルモットに、使用前の４〜６週間、毎週、ウマ血清（１ｍｌ）を注射した。ウマ血清を注射した少なくとも２４時間後に、動物をケタミン／キシラジンの混合物（８８ｍｇ；１２ｍｇ／ｍｌ；０.４ｍｌ／ｋｇ）で麻酔した。麻酔誘発の後、腹膜腔を加温滅菌セイライン（０.９％）（５０ｍｌ）で洗浄した。洗浄流体を１４Ｇカテーテルを用いて５０ｍｌのプラスチック製円錐形の遠心分離管に集めた。モルモットを麻酔から回復させ、該モルモットは２週間の静養期間後に再び用いることができた。細胞を遠心分離（４００ｘｇ、１０分間）により洗浄流体から単離し、リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）（３５ｍｌ）中に再懸濁させ、等張パーコール（Perc ol）（１.０７５ｇ／ｍｌ）（１０ｍｌ）を下層とした。この懸濁液を３００ｘｇで３０分間遠心分離に付した。主に好酸球および赤血球を含有するペレットをＰＢＳで洗浄し、赤血球を溶解させた。これらの細胞を２０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ１６４０培地に再び懸濁させ、加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃ で一夜インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、細胞生存率（トリパンブルー色素排除）および純度を測定するのにＰＢＳに再懸濁させた。スーパーオキサイドアニオン生成（Ｏ₂ ^-）精製した好酸球（生存率＞９５％、純度＞９０％）を、１−２ｘ１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（pＨ７.４）および０.１％ゼラチンを含むＰＢＳに再懸濁させた。好酸球（１ｘ１０⁵）を９６ウェルプレートに加え、３７℃で約１時間インキュベートした。ＰＤＥ IV阻害剤を反応開始の１０分前に加えた。スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）（６０単位）の不在または存在下、シトクロムＣ（１６０μＭ）およびホルミルＭet-Ｌeu-Ｐhe（ｆＭＬＰ）（３０ｎＭ）を添加して反応を開始した。シトクロムＣ還元を、種々の時間、６３０ｎｍのリファレンスを用い、５５０ｎｍでダイナテック（Dynate ch）ＭＲ７０００プレート・リーダーでモニターした。Ｏ₂ ^-生成速度を、幾つかの時点で、ＳＯＤの不在または存在下、ウェルの純吸光度を用いる線状回帰分析で決定した。結果を基線リリースについて修正したＯ₂ ^-の対照生成のパーセントとして表した。観察される最大阻害は６０％であったため、３０％をブラケットする濃度をリニアー・インターポレーションに付し、logＩＣ₃₀を算定した。実施例５-- モルモットの気管支収縮雌ハートレー系モルモット（２００−２５０ｇ／４週齢、ハゼルトン・リサーチ（Hazelton Research）、デンバー、ペンシルベニア州）を、５％（ｗ／ｖ）オボアルブミン／セイライン溶液（０．３５ｍｌ）を各腿部（合計０.７ｍｌ）に第１日および第４日にＩ.Ｍ.注射することで感作させた。実験操作オボアルブミンに対して積極的に感作した、雄ハートレー系モルモット（６００−８００ｇ、ハゼルトン）を、手術の約１０−１５分前に、ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ.Ｐ.）で麻酔処理した。頸静脈、頸動脈および気管に、薬剤投与、血圧モニターおよび通気を行うためのカニューレを挿入した（Deseret Intracath Vialon polymer resin radiopaque catheter （Deseret Medical,Inc.Sandy,UT）、各々、22GAおよび19GA、およびPEチューブ260）。コリン作動性干渉を最小とするために左右迷走神経切断術を行った。動物を麻痺させ（臭化パンクロニウム、０.１ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｖ.）およびハーバード・ロデント・レスピレーター（Harvard Rodent Respirator）（モデル６８３、ハーバード・アパラタス（Harverd Apparatus）、サウス・ナティック、マサチューセッツ州）を介して通気した（４５呼吸／分）。気道圧変化をエルコマティック・トランスデューサー（ブクスコ・エレクトロニックス（Buxco Electronics）、シャーロン、コネチカット州）を用い、気管用カニューレの側腕を介して測定した。通気ストローク容量をＨ₂Ｏ８ｃｍ（約５ｃｃ大気）の側腕圧を生成するようにセットした。Statham Ｐ２３ＸＬフィジカル・プレッシャー・トランスデューサー（ビッゴ・スペクトラヌド（Viggo Spectramed）、オックスナード・カリフォルニア州）を用いて血圧を測定した。グラス・モデル・７Ｄ・ポリグラフ（グラス・インスツルメント・コーポレイション（Grass Instrument Co.），クインンシー、マサチューセッツ州）に圧力を記録した。動物は実験中を通して加熱テーブル上で暖かくし、体温を維持させた。試験化合物およびビヒクルを、抗原攻撃の１０分前、ｉ.ｖ.経路を介して投与した。０時点で、０.１ｍｇ／ｋｇのオボアルブミンをｉ.ｖ.経路を介して投与する。抗原応答がピークとなる時点で、さらなる用量の抗原、０.２ｍｇ／ｋｇのオボアルブミンをｉ.ｖ.投与した。累積した０.３ｍｇ／ｋｇのオボアルブミンに対して最大抗原応答が得られた後、飽和ＫＣl溶液（１ｃｃ／ｋｇ、ｉ.ｖ. ）を投与し、最大気管支収縮を生じさせた。実施例６-- ヒト単球におけるＬＰＳ誘発のＴＮＦ_αの阻害 In Vitro研究ＴＮＦ_α阻害がＬＰＤＥ IVまたはＨＰＤＥ IVの阻害に関連しているかどうかを測定するために、ＬＰＤＥ IVおよびＨＰＤＥ IVに対してある範囲の効能を有する一連のＰＤＥ IV阻害剤を、in vitroにてリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で刺激したヒト単球におけるＴＮＦ_α産生を阻害するその能力についてスクリーンした。このスクリーンについて一次ヒト細胞の使用は、異なる種類で、炎症細胞中のｃＡＭＰ加水分解に対するＬＰＤＥ IVおよびＨＰＤＥ IVの相対的寄与が劇的に異なっている場合、非常に重要であると思われた。方法ＴＮＦ_α阻害を、正常なヒト供給者に由来する血液の新たに得られたバフィコートまたは血漿瀉血残渣より精製した（Collata）ヒト末梢血液単球にて評価した。単球を１ｘ１０⁶細胞／ｍｌ培地／ウェルの密度で２４−ウェルのマルチ皿に置いた。細胞を１時間付着させ、その後、上澄をアスピレートし、新鮮な培地（１％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを１０Ｕ／ｍｌで含有するＲＰＭＩ−１６４０）１ｍｌを加えた。細胞を、１ｎＭないし１ｍＭの範囲にある濃度の試験化合物の存在または不在下、ＬＰＳを添加する前に４５分間インキュベートし（イー・コリ０５５：Ｂ５、シグマ・ケミカルズ）、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌを得た。単球培養培地の最終溶媒濃度が０.５％ジメチルスルホキシドおよび０.５％エタノールであるように、試験化合物をジメチルスルホキシド／エタノール（５０：５０濃度）中に可溶化させ、希釈した。３７℃／５％ＣＯ₂で１４〜１６時間インキュベートした後、培養上澄を単球より除去し、１００ｘｇで遠心分離に付し、細胞残骸を除去した。サイトカイン検定を直ちに行うか、または検定するまで培養上澄を−７０℃で貯蔵した。ＴＮＦ_αのレベルを、捕獲抗体としてネズミモノクローナル抗ヒトＴＮＦ_α抗体（以下、参照）および第２抗体としてポリクローナルウサギ抗ヒトＴＮＦ_αを使用するＥＬＩＳＡ（Winston）により測定した。検出する場合、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、カタログ番号６０５２２２）を、つづいてペルオキシダーゼに対する基質を加えた（０.１％過酸化尿素を含むオルトフェニレンジアミン１ｍｇ／ｍｌ）。サンプル中のＴＮＦ_αレベルを、イー・コリにて産生した組換えヒトＴＮＦ_αで作成した標準曲線より算定した。ヒトＴＮＦ_αに対するモノクローナル抗体を、コーラーおよびミルスタイン（KohlerおよびMillstein）（ネイチャー（Nature），ｖｏ.２５６、ｐ４９５−４９７、１９７５）の方法を変形し、組換えヒトＴＮＦ_αで免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓より調製した。ポリクローナルウサギ抗ヒトＴＮＦ_α抗体は、ニュージーランド系白ウサギを完全フロイントアジュバントに乳化させた組換えヒトＴＮＦ_αで免疫処理を繰り返すことにより調製した。選定腹膜炎モデルにおけるヒトＴＮＦ_α産生のin vivo抑制方法１.５単位のヘパリン処理した静脈全血を、いずれの薬物処理も受けていない健康な従業者から採取した。多形核白血球を、Histopaque-１０７７上、８００ｘｇで３０分間、２５℃で遠心分離に付すことにより血液を層状化することにより分離した。リンパ球／単球部を収穫し、１０００ｒｐｍで１０分間、２５℃でＣa²⁺およびＭg²⁺不含のＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝セイライン）で２回洗浄した。ペレットをＣa²＋およびＭg²⁺不含のＤＰＢＳ（５ｍｌ）に再懸濁させ、２５℃で血清のないＲＰＭＩ１６４０培地中にて調製した５ｍｌのパーコール溶液上に層を形成させ、５５０ｘｇで３０分間、２５℃で遠心分離に付した。単球の浮揚性層を除去し、１０００ｒｐｍで１０分間、２５℃でＣa²⁺およびＭg²⁺ 不含のＤＰＢＳで２回洗浄した。最終の洗浄単球単離物を６−１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌでＣa²⁺およびＭg²⁺不含のＤＰＢＳ中に２５℃で懸濁させた。単球もまたSo urce Leukocyte packより同じ操作により単離した。該単球調製物は６５〜９０％の単球の範囲にあり、細胞の生存率は＞９７％であった（トリパンブルー色素排除）。４または５群のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールス・リバー・ラボラトリース（ Charles River Laboratories）、ウイルミントン、マサチューセッツ州）を、バリアー・サステインド・ファシリティーに維持した。単球が最小の剪断力およびストレスに暴露されるように、２３ｇａ針のシリンジで軽圧を用いて、体重１８〜２５ｇ、同齢のマウスに、６〜１０ｘ１０⁶単球／ｍｌ（０.５ｍｌ）を腹膜注射した。単球を投与した２分以内に、マウスにビヒクルまたは化合物を１５分間経口投与することで処理した。ついで該動物に、Ｃa²⁺およびＭg²⁺不含のＤＰＢＳに溶かした１２５ｍｇ／ｍｌのエンドトキシン（イー・コリ、タイプＷ、ディフコ）（０.２ｍｌ）を腹腔内（ｉ.ｐ.）注射した。２時間後、該動物を二酸化炭素で窒息させて殺し、Ｃa²⁺およびＭg²⁺不含のＤＰＢＳ（１.５ｍｌ）（４℃ ）をｉ.ｐ.注射した。腹膜を穏やかにマッサージし、洗浄液を取り出し、氷浴中のポリエチレンチューブに入れた。サンプルを遠心分離（１２，５００ｘｇ、５分間、４℃）に付して清澄化した。上澄を新たなチューブ（−２０℃で貯蔵されていてもよい）にデカントし、ＥＬＩＳＡによりヒトおよびマウスＴＮＦ_αについて検定した。ＥＤ₅₀値を標準操作により算定した。実施例７-- ヒト好中球方法単離および精製好中球（ＰＭＮ）を、Ficoll（Histopaque １０７７）を用いて勾配遠心分離、つづいてデキストラン沈降分離によりヘパリン処理した血液から単離し、赤血球を除去した。残りの赤血球をいずれも水に３０秒間溶解させ、１０ＸＤＢ− ＰＢＳ（ｗ／ｏＣa²⁺またはＭg²⁺）を用いて等張性を元通りにした。ＰＭＮを遠心分離により単離し、細胞数および生存率（トリパンブルー色素排除）を測定する前に、ＩＸＤＢ−ＰＢＳでもう一度洗浄した。細胞数は、個々のドナーに依存して０.７５−１.５ｘ１０⁶細胞／ｍｌに調整した。脱顆粒（ミエロペルオキシダーゼの放出）前記した細胞懸濁液のアリコート（０.１ｍｌ）を、サイトカラシン（cytocha lasin）Ｂ（５μｇ／ｍｌ）の存在下、アール平衡塩溶液（Earles Balanced Sal t Solution）（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（pＨ＝７.４）および０.１％ゼラチン含有）中、振盪水浴中、３７℃で５分間インキュベートした。ｆＭＬＰ（３０ｎＭ）を添加する前に、細胞を種々の濃度の選択性ＰＤＥ IV阻害剤およびＰＧＥ₂（３〜１０ｎＭ）と一緒にさらに５分間、前処理した。ｆＭＬＰを加え、インキュベートをさらに３０分間続けた。サンプルを氷上にのせ、つづいて遠心分離に付すことにより反応を止めた。上澄フラクションを除去し、ミエロペルオキシダーゼ活性について検定するまで凍結貯蔵（−３０℃）した。ミエロペルオキシダーゼ活性の測定基質としてｏ−ジアニシジンおよび標品としてホースラディッシュペルオキシダーゼを用いてミエロペルオキシダーゼ活性を測定した。上澄のアリコート（５０μｌ）を１００μｌの基質（ｏ−ジアニシジン、０.５３ｍＭ；Ｈ₂Ｏ₂、０.１４７ｍＭ；最終濃度）と一緒に５０ｍＭＮａリン酸塩緩衝液（pＨ６.０）中でインキュベートした。４ＭＨ₂ＳＯ₄（５０μＬ）を添加することで反応を止めた。４１０ｎｍで吸光度を測定することにより産生物形成を測定し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを用いる基準曲線と比較することにより活性を測定した。データを対照（ＰＧＥ₂単独の存在下で放出されるミエロペルオキシダーゼの量）のパーセントとして表した。大部分の化合物について観察される最大阻害は３０％であるため、１５％をブラケットする濃度をリニアー・インターポレーションに付してlog（ＩＣ₁₅）を算定した。実施例８-- マウスにおけるレセルピン誘発の低体温症の逆転雄ＣＦ−１またはＢＡＬＢ／ｃマウスを、個々に、ワイヤー製ケージに隔離した。レセルピンで前処理（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）する前に、各マウスの直腸内温度を記録した。レセルピン処理した４時間後、直腸内温度を記録し、個々の動物に、種々の用量の試験化合物、ビヒクルまたはロリプラム（１０ｍｇ／ｋｇ）を（経口）投与した。ついで、直腸内温度を３０分毎に２時間記録した。データをレセルピン処理の４時間後に観察された温度からの温度変化として表した（温度が基線レベルから約１０−１５℃低下した）。処理後、９０または１２０分に記録された温度変化を用いて用量−応答曲線を作成した。６〜９匹の動物の平均をプロビット分析または線状回帰分析に付し、ＥＤ₅₀値を測定した。レセルピン誘発低体温症を逆転する化合物の能力を低親和性結合または高親和性結合を阻害するその能力と比較するために、ＥＤ₅₀およびＩＣ₅₀値を、−log（数値）として表した。実施例９-- ＰＤＥ IVの生物学的機能と阻害の間の関係ＰＤＥ IV阻害のある種の生物学的効果がＬＰＤＥ IVまたはＨＰＤＥ IVの阻害と関連しているかどうかを決定するために、作用を生成する化合物の能力と、ＬＰＤＥ IVまたはＨＰＤＥ IVを阻害する化合物の能力の比較を、リニアーおよびランクオーダー相関関係を用いて決定した。これらの相関性には数種の要因が影響しうる：１）化合物の安定性；２）化合物の細胞侵入能；３）in vivo実験における、化合物の生物学的利用能；４）相関関係の値；特にリニアー相関関係が、効能の違いに対して敏感であり、効能値の範囲が大きくなればなるほど、有意なリニアー相関関係の測定が容易となる。種々の検定系にてＬＰＤＥ IVまたはＨＰＤＥ IVの阻害と生物学的機能の間の相関関係を分析および要約する場合、これらのことが考慮された。単離された炎症細胞を用いた場合、モルモット好酸球中の単球ＴＮＦ_α産生の抑制およびスーパーオキサイド生成の阻害は、ＨＰＤＥ IVではなく、ＬＰＤＥ IVの阻害とより相関関係にあった。さらには、in vivoにおける抗原誘発の気管支収縮の防止はＨＰＤＥ IVよりもＬＰＤＥ IVの阻害とより相関関係にあった。このin vivoモデルにおいて、ＰＤＥ IV阻害剤は明らかに肥満細胞の脱顆粒を阻害することで機能している（アンダーウッド（Underwood）ら、プレスにて）。しかし、炎症細胞の機能の阻害は常にＬＰＤＥ IVの阻害を伴うものではない。というのは、好中球脱顆粒の阻害がＬＰＤＥ IVよりもＨＰＤＥ IVの阻害とより相関関係にあることが判明している。かくして、すべてではないが、炎症細胞活性の抑制はいくらかＬＰＤＥ IVの阻害と関連しているようである。反対に、酸分泌の促進、嘔吐の発生およびレセルピン誘発の低体温症の逆転（ＰＤＥ IV阻害剤の向精神強度の測定）がＬＰＤＥ IVではなく、ＨＰＤＥ IVの阻害とより相関関係にあった。すなわち、この種の化合物の副作用の大部分はＨＰＤＥ IVの阻害と関連した。かくして、これらの知見は、選択的にＬＰＤＥ IVを阻害する化合物が、望ましくない副作用を惹起する可能性の減少した、効果的な抗炎症作用を生成するであろうことを示唆する。このように、ロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ I Vの触媒形態についてのＩＣ₅₀を、ロリプラムと低親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀で割る（ＨＰＤＥ IV／ＬＰＤＥ IV）と、約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比を有する化合物を選択すれば、その結果、治療指数は増加し、すなわち、望ましい効果が最大となり、有害な効果が最小となる。この選択指針が実際に改良された治療指数を有する化合物であるかどうかを測定するために、治療作用を副作用と比較する３つのモデルを評価した。これらは、単離されたヒト単球からＴＮＦ_α産生を抑制する化合物の能力と単離されたウサギ壁腺における酸分泌を剌激する能力の間のin vitro比較、およびモルモットにおける化合物の抗原誘発の気管支収縮を防止する能力、イヌにおける嘔吐の誘起能、マウスにおける選定移動モデルにてＴＮＦ_αを抑制する化合物の能力およびマウスにおけるレセルピン誘発の低体温症の逆転能を試験する２つのin vivo 比較を包含する。０.１またはそれ以上の選択比（ＨＰＤＥ IV／ＬＰＤＥ IV）を有するＰＤＥ IV阻害剤は、治療指数にて著しい改良を示した。例えば、≧０.１の選択比を有するシス−［４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボキシラ一ト］、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オン、およびシス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オール］はすべて、典型的なＰＤＥ IV阻害剤であるＲ−ロリプラムと比較して、１００倍優れた治療指数を示す。すなわち、これは、ＨＰＤＥ IV ＩＣ₅₀／ＬＰＤＥ I V ＩＣ₅₀≧０.１の選択指針を用いることは、in vitro比較にて治療指数の増大した化合物を用いることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者トーフィ，セオドア・ジェイアメリカ合衆国ペンシルベニア州19096、ウィンウッド、ショートリッジ・ドライブ 421番 (72)発明者クリステンセン，ジークフリート・ビー, ザ・フォースアメリカ合衆国ペンシルベニア州19103、フィラデルフィア、レイス・ストリート 2216番

Claims

【特許請求の範囲】１．ロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀ を、ロリプラムと低親和力で結合する形態でのＩＣ₅₀で割ると、約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比を有する化合物。２．本出願の出願日前にＰＤＥ IV阻害剤であることが知られていなかった請求項１記載の化合物。３．胃腸作用および向精神作用を最小とする一方で、白血球および気道平滑筋中のｃＡＭＰを増加させる方法であって、ロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀をロリプラムと低親和力で結合する形態でのＩＣ₅₀で割ると、約１またはそれ以下のＩＣ₅₀比を有する有効量の化合物を、そのｃＡＭＰの増加を必要とする対象に投与することからなる方法。４．ロリプラムと低親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態を選択的に阻害することによる炎症の治療または気管支の拡張方法であって、ロリプラムと高親和力で結合するＰＤＥ IV触媒形態についてのＩＣ₅₀をロリプラムと低親和力で結合する形態でのＩＣ₅₀で割ると、約０.１またはそれ以上のＩＣ₅₀比を有する治療上有効量の化合物をその治療または拡張を必要とする対象に投与することからなる方法。